PRACTICA No.

ESTRUCTURA DE LOS MICROORGANISMOS

IDENTIFICACION MICROBIANA
OBJETIVO
Dar a conocer al estudiante los diferentes mtodos de laboratorio para la identificacin
bacteriana, medios de cultivos, morfologa macroscpica, morfologa microscpica y tcnicas
para la realizacin de frotis directos (extendidos de muestras clnicas), frotis indirectos
(extendidos a partir de cultivos), coloraciones simples y compuestas.

Paciente

Historia clnica y exploracin

Localizacin de la infeccin

Estudio hematolgico y
Bioqumico
Imgenes diagnosticas:
RX, TC, RM

Exmenes microbiolgicos
Mtodos directos
Examen microscpico
Cultivo, identificacin y antibiograma
Deteccin de antgenos especficos
Deteccin de DNA, RNA especifico
Mtodos Indirectos
Pruebas serolgicas en suero

DIAGNOSTICO ETIOLOGICO

Morfologa macroscpica. Medios de cultivo

Las bacterias para su crecimiento deben tener las condiciones necesarias para desarrollar un
nuevo protoplasma, estos requerimientos estn dados por:
-

Medios de cultivo
Atmosfera
pH especifico
Temperatura
Tiempo suficiente para su reproduccin

Todo material en el cual los microorganismos puedan reproducirse es un medio de cultivo, estos
medios se preparan sobre una sustancia o base llamada agar que se extrae de algas marinas al
que se puede adicionar sustancias nutritivas como Sangre de cordero, vitaminas, extracto de
levadura, cloruro de sodio, colorantes e indicadores,
Tipos de medios de cultivos:
-

1. Segn la consistencia dada por la cantidad de agar:

Solidos
Lquidos y
Semislidos
2. Segn el aporte nutritivo y la utilidad en el laboratorio:

Bsicos: Diseados para el crecimiento y el mantenimiento de poblaciones bacterianas.

Los ms comunes son: Tripticasa soya, agar nutritivo y Mueller Hinton.
Enriquecidos: Medios altamente nutritivos compuestos por un medio bsico y
suplemento nutritivo como sangre o hemoglobina.
Selectivos: Especficos para bacterias que se desarrollan en presencia de compuestos
agregados al medio de cultivo, inhibiendo el crecimiento de otros.
Selectivos diferenciales: A estos medios se adicionan colorantes o sustancias qumicas,
ms un indicador de pH, permitiendo la diferenciacin de distintos tipos de bacterias y
la seleccin de diferentes gneros.
Medios diferenciales: o pruebas bioqumicas. Son medios con diferentes sustratos
utilizados para conocer el comportamiento metablico de las bacterias y poderlos
clasificar en gnero y especie.

Morfologa microscpica. Coloraciones

Principales coloraciones utilizadas en microbiologa

-

Coloraciones simples: Tincin de las bacterias por la aplicacin de una sola solucin
colorante. Se utiliza para observar morfologa.
Coloracin compuesta o diferencial: Pone de manifiesto diferencias entre varias
clulas bacterianas o las partes de una bacteria, se utilizan varios colorantes. Ej.:
coloracin de Gram, coloracin de Ziehl Neelsen.
Tincin negativa: Tcnica por la cual las clulas bacterianas o fngicas sin teir se
hacen visibles sobre una pelcula oscura como la tincin de tinta china

Coloraciones compuestas: Coloracin de GRAM

Los mtodos de coloracin de los extendidos de diferentes muestras, fueron inicialmente

descritas por Paul Erlich y Robert Koch, quienes al aplicarlos, observaron numerosas
estructuras que no haban sido vistas anteriormente. En 1884, Christian Gram ideo una de las
coloraciones ms importantes, la cual le permiti distinguir bacterias que tenan morfologa
similar, pero que se coloreaban diferente.
En 1921 Hucker propuso una modificacin a la coloracin propuesta por Gram, esta
modificacin presento ventajas tales como, una mejor estabilidad de los reactivos y una mejor
diferenciacin de los microorganismos, y esta modificacin es la que se utiliza hoy en da, en la
gran mayora de los laboratorios de microbiologa
. Es la prueba de laboratorio de microbiologa ms simple y con el mejor costo efectividad, lo
que representa un beneficio tanto para el paciente, como para el clnico y el laboratorio..
Con la coloracin de Gram se tien casi todas las bacterias, levaduras y parsitos, excluyndose
solo aquellos que tienen una pared muy delgada como Mycoplasmas o las que no la tienen
como Chlamydia sp. Tambin se colorean clulas epiteliales y los leucocitos lo que permite
determinar, la calidad de la muestra y la respuesta inflamatoria del hospedero.
Al colorear los microorganismos con la coloracin de GRAM, podemos apreciar su tamao y
forma y adems clasificarlas en Gram positivas o negativas, parmetro muy importante para el
diagnstico presuntivo de infecciones bacterianas, el cual permite el rpido inicio del

tratamiento adecuado y los subsecuentes procedimientos de identificacin.

FUNDAMENTO:

La coloracin de Gram se basa en las diferencias existentes en la composicin qumica de la

pared celular de las bacterias, lo que les confiere o no la capacidad de retener el cristal violeta,
colorante inicial del procedimiento..
La pared celular de las bacterias Gram positivas, est compuesta en un 50-60% por el
peptidoglucano y en un 40.50% por cidos teicoicos y polisacridos. El peptidoglucano
(llamado tambin mureina, capa de glicopeptido o mucopeptido) est compuesto de Nacetilglusamina y N-acetil muramico.
En las bacterias Gram positivas, el cristal violeta se fija a la pared celular y con la adicin del
lugol que acta como mordiente, se produce el complejo cristal violeta.iodo, el cual es resistente
a la decoloracin
La pared celular de las bacterias Gram negativas est compuesta por una delgada capa de
petidoglucano el cual constituye el 5-10% de la pared celular, recubriendo esta capa se
encuentra una membrana externa compleja, constituida por fosfolpidos (20.30%),
lipopolisacaridos (30%) y protenas (40-50%),
El decolorante acta como un solvente, sobre los lpidos presentes en las membranas de las
bacterias Gram negativas, los poros se aumentan de tamao y se libera el complejo cristal
violeta-iodo y la bacteria toma el colorante secundario o de contraste (safranina).
Otros microorganismos como las levaduras se colorean rpidamente de color violeta cuando se
aplica la coloracin de Gram a una preparacin seca; las clulas inflamatorias (leucocitos)
aparecen de color rosado y las clulas epiteliales de color rosado o violeta dependiendo de lo
grueso del extendido y del fibringeno presente en el moco y los glbulos rojos se colorean de
rosado.
1. Primer colorante: cristal violeta. Es un colorante bsico que en contacto con las
clulas cargadas negativamente, reacciona con ella colore3andolas de color violeta.
2. Solucin mordiente, lugol: Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y
las clulas.
3. Agente decolorante, alcohol acetona: Es un disolvente orgnico
4. Colorante de contraste, safranina: Es un colorante bsico.
Procedimiento de la coloracin de Gram
1. Preparar un frotis delgado a partir de cultivos (utilizar solucin salina estril), o de
especmenes clnicos (abscesos, esputos, secreciones, lquidos etc.,) en una lmina
portaobjetos nueva y limpia.
2. Dejar secar al medio ambiente
3. Fijar al calor
4. Colocar cristal violeta sobre el portaobjetos y dejar actuar por un minuto
5. Enjuagar con agua y escurrir
6. Agregar la solucin de lugol y dejar actuar por un minuto
7. Escurrir la solucin y enjuagar con agua
8. Decolorar con alcohol-acetona por 8 segundos y enjuagar con agua
9. Agregar la solucin de safranina y dejar actuar por 30 segundos, enjuagar,
escurrir y secar al aire
Una vez teido se observa con lente de inmersin (100X), usando aceite de inmersin.

En extendidos directos de material orgnico (muestras clnicas o especmenes) se evala las

clulas bacterianas, su morfologa y comportamiento frente al Gram, su disposicin o
agrupacin y otros elementos como leucocitos, hemates y clulas epiteliales.
Clasificacin de las bacterias
La coloracin de Gram es usada en el laboratorio de microbiologa para clasificar las bacterias
con base en su:
-

FORMA
TAMAO
DISPOSICION O ARREGLO
REACCION AL GRAM

Forma: Las bacterias pueden tener forma de:

-

Esfrica denominadas cocos

Cilndrica o en forma de barras denominadas bacilos o cocobacilos
En espiral o helicoidales

Tamao: Este parmetro est relacionado con el dimetro de los cocos o la longitud de los
bacilos. Estos ltimos pueden observarse cortos, largos o como filamentos.

Disposicin o arreglo: Se refiere a la agrupacin o arreglo de las bacterias.

Los cocos pueden estar dispuestos en:

-

Pares (diplococos)
Cadenas, caractersticas del genero Streptococcus
Racimos, caractersticas del genero Staphylococos
Ttradas, (dispuestas en cuatro)

Los bacilos no se agrupan con la variedad de modelos de los cocos, pero pueden presentarse en
forma de empalizadas, letras chinas o cadenas cortas .
Las bacterias de forma helicoidal se presentan como clulas individuales, las diversas especies
ofrecen notables diferencias en longitud, en el nmero y amplitud de las espirales y en la rigidez
de las paredes celulares.

Reaccin al Gram
Segn la reaccin al Gram, las bacterias se dividen en Gram positivas, las que se tien de color
violeta, y en Gram negativas, las que se tien de color rosado,
La divisin de las bacterias en Gram positivas y en Gram negativas est dada por las diferencias
fsicas qumicas en la composicin de la pared celular.,

UTILIDAD
ESTE EXAMEN TIENE VALOR DIAGNOSTICO Y ES DE INFORME INMEDIATO EN
LAS SIGUIENTES MUESTRAS:
-

LCR
ESPUTO
ORINA
SANGRE
ABSCESOS
SECRECIONES

NO TIENE VALOR DIAGNOSTICO EN:

MUESTRAS FARINGEAS
NASOFARINGEAS
ES DE USO LIMITADO EN MUESTRAS DE MATERIA FECAL.(Solo en el Gram
modificado, para el diagnstico presuntivo de infecciones por Campylobacter sp.)

PROCEDIMIENTO:
Es importante estandarizar los mtodos de coloracin para obtener resultados confiables
y reproducibles.
Elementos
Laminas portaobjetos, ,lavadas y desengrasadas
Solucin salina estril (0.86%)
Pipetas pasteur o aplicadores de algodn estril
Asas microbiolgicas
Mecheros
Aceite de inmersin

NOTA: Las lminas portaobjetos utilizadas para la coloracin de Gram, deben ser nuevas, sin
rayas y limpias. Es recomendable mantener las lminas portaobjetos en alcohol y antes de
usarlas dejarlas secar al aire.

Preparacin del extendido para colorear con Gram

Los extendidos para colorear con Gram pueden ser:
-

Muestras clnicas
Cultivos en caldo
Colonias crecidas en medios solidos

Extendidos de muestras clnicas

Se toman con escobilln, rtelo suavemente sobre la lmina portaobjeto, en forma circular,
empezando del centro hacia afuera, para evitar daar las celulas y la disposicin de
las bacterias.
Extendidos a partir de cultivos en caldo
-

Mezcle el cultivo
Con una pipeta pasteur, transfiera una gota o dos a una lmina portaobjeto.
Extienda la gota para formar una pelcula delgada.

Extendidos a partir de colonias en medios de cultivos solidos

-

Incinere el asa a la llama colocndola en forma vertical

Enfrela en una parte del agar donde no haya crecimiento bacteriano
Tome una colonia con el asa y extindala sobre un portaobjeto al que previamente ha
colocado una gota pequea de solucin salina, Mezcle por movimientos circulares.
Evite hacer preparaciones muy gruesas.
Deje secar al aire y fjela por el calor pasndola suavemente por la llama.
Anote la morfologa y tincin de las bacterias observadas
.
Frotis indirecto
Gram positivos

Frotis indirecto
Gram negativos

Examen directo

Notas:
10. Maneje el asa como si fuera un lpiz. Esto le deja dos dedos libres para manipular
tapones de algodn u otras funciones.
11. Cuando esterilice el asa contaminada con lquidos o particular de cultivos, hgalo
con mesura, pasando poco a poco por encima de la llama, hasta que quede al rojo.
De esta manera se evita que partculas mal incineradas caigan en su mesa de
trabajo, contaminndola.
Coloraciones negativas; Tinta china
Coloracin utilizada para visualizar capsulas.
La capsula es una estructura externa que presentan algunas bacterias, compuesta por una
sustancia viscosa que forma una cubierta o envoltura alrededor de la clula aumentando su
capacidad infecciosa (virulencia)
Importantes microorganismos formadores de capsula: Gnero, Klebsiella
Genero Streptococcus Especie pneumoniae
Procedimiento

1. Sobre una lmina portaobjetos nuevo y limpio colocar una gota china y hacer una
suspensin de la muestra clnica del microorganismo. Las partculas de carbn y de la
tinta no pueden penetrar en la capsula de manera que solo se ennegrece el fondo.
2. Dejar secar la preparacin, fijarla al calor y aplicar cristal violeta durante 1 minuto para
visualizar el microorganismo.
3. Lavar y dejar secar.
4. Observar al microscopio la capsula como una zona clara alrededor de la bacteria.
Dibuje la capsula y la morfologa bacteriana
Diplococos encapsulados

Bacilos encapsulados

Coloracin de Scheuffer Fulton para esporas

Algunas bacterias Gram positivas como Bacillus y Clostridium bajo condiciones adversas tales
como alta temperatura, baja humedad, radiaciones y agentes qumicos pueden pasar de su estado
vegetativo aq un estado latente o de espora (endospora) permitiendo la supervivencia del
microorganismo durante largo tiempo.
La forma y localizacin de la espora dentro del bacilo son criterios importantes para la
clasificacin taxonmica.
Procedimiento
-

Realizar una suspensin colocando una gota de solucin salina en una lmina
portaobjetos nueva y limpia y una pequea cantidad de la colonia a partir de cultivo
viejo (mnimo (48 horas) de Bacillus, de esta manera aseguramos la presencia de
endosporas bacterianas.
Dejar secar al medio ambiente.
Fijarla al calor
Agregar solucin de verde de malaquita al 5%.
Utilizando un mechero, calentar durante 3 minutos, hasta que salgan vapores pero
evitando que se seque el colorante, dejar enfriar.
Lavar con abundante agua y aplicar safranina como colorante de contraste durante 1
minuto.
Observar al microscopio las endosporas de color verde y el bacilo de color rosado.
Dibuje la espora y la morfologa bacteriana.

Autoevaluacin
Mencione las estructuras de las bacterias Gram positivas y la funcin de cada una
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_________________________________________

Mencione las estructuras de las bacterias Gram negativas y la funcin de cada una
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

Complete el siguiente cuadro segn las caractersticas descritas.

Caractersticas
Pared celular

Gram positivos

Gram negativos

Sensibilidad a la penicilina
Resistencias a los medios
fsicos

Sensibilidad a la lisozima
Inhibicin por colorantes
Formacin de esporas

MATERIALES: Para cada grupo de 4-5 estudiantes

Medios de cultivo con diferentes crecimientos de colonias bacterianas(Agar): 1

Medios de cultivo bsicos, enriquecidos y diferenciales : 1 de cada uno
Medios de cultivo liquido( Caldo): 1
Solucin salina estril. 1 frasco
Laminas portaobjetos: 2
Asas microbiolgicas: 1
Mechero
Aceite de inmersin: 1
Microscopio: 1
Coloracin de Gram

CONSULTA
1. Escriba el fundamento de las siguientes coloraciones tambin aplicadas
en el campo de la
microbiologa.
Coloracin Ziehl Neelsen y Gram
GIEMSA
Tinta china.