ELECTROFORESIS.

Elizabeth lvarez Castro1 Merlys velilla Pacheco2

Universidad de Sucre, Facultad de Educacin y Ciencias, Programa de Biologa, Biologa
molecular.

MARCO TEORICO
La electroforesis consiste en la separacin de molculas (protenas, isoenzimas, cidos
nucleicos) a travs de una matriz tamponada (agarosa, acrilamida, almidn). La matriz
funciona como un filtro, separando las molculas en un campo elctrico, de acuerdo al
tamao y la carga neta que poseen. En el caso de los cidos nucleicos, el grupo fosfato es el
responsable por la fuerte carga negativa en condiciones de pH neutro, haciendo que los
fragmentos migren hacia el polo positivo (nodo) durante la electroforesis. Es el
responsable por la fuerte carga negativa en condiciones de pH neutro, haciendo que los
fragmentos migren hacia el polo positivo (nodo) durante la electroforesis.
La resolucin y velocidad de separacin de fragmentos de ADN por electroforesis son
reguladas a travs de la concentracin de agarosa (o acrilamida) en el gel y el voltaje
aplicado durante esta. La agarosa funciona como un filtro en el que los fragmentos de
menor tamao migran rpidamente hacia el nodo que aquellos de mayor tamao. Al
aumentar la concentracin de agarosa se dificulta el movimiento de los fragmentos a lo
largo del gel, permitiendo obtener una mayor resolucin en los fragmentos de menor
longitud. El incremento del voltaje aumenta proporcionalmente la velocidad de migracin
de los fragmentos en el gel.
OBJETIVOS
Realizar electroforesis de molculas de DNA a travs de gel de agarosa.

METODOLOGIA

Se realizo el ensamblaje
del plato de electroforesis,
verificando que la bandeja
se encuentre situada sobre
una superficie plana y
nivelada

Se preparo 50 ml
del gel de agarosa
en tampn TBE
0.5x al 0.8%

Para servir las muestras se

uso 3l de orange G x
cada 7l de la muestra de
ADN

Se Llen la
cmara de
electroforesis con
el bfer de corrido
TBE 0.5X, hasta
superar el nivel
del gel.

|Se instalaron los electrodos

en la cmara y sometieron
las muestras a corrido
durante 40 minutos a 85 v

Se licuo la agarosa a altas T C

en estado lquido, con mucho
cuidado se deposit el gel en
estado lquido dentro del plato
de
electroforesis
y
posteriormente se dej enfriar
hasta una temperatura de 45C
al 60 C.

Luego se sirvi en el porta

molde teniendo cuidado de
no formar burbujas, y
dejar enfriar la mezcla
hasta que se solidifique el
gel

Posteriormente, se retir el gel y se coloc sobre el

transiluminador. Luego se encendi la luz U.V. y visualizando
la presencia de cidos nucleicos en cada uno de los carriles
donde sembr las muestras. Comparando la intensidad de la
seal en cada caso.

RESULTADOS
.
Imagen # 1: preparacion del gel de
agarosa
en
un
AGITADOR

CALENTADOR MAGNETICO (Marca

CORNING, Modelo PC-420D). Se
introduce un magneto en el recipiente que
contiene
la
muestra
(agarosa),
continuando con el sistema de agitacin,
donde se define la velocidad que se
requiera evitando el salpique o prdida de
muestra o que el imn pierda su rotacin
normal. Al lograr una estabilidad se
prosigue a colocar calor definiendo la
temperatura de menor a mayor hasta que
se disuelva el contenido. Se sigue
tomando la temperatura hasta que baje a
55C, se le agrega el colorante para teir
ADN y se vierte en el molde.

Imagen # 3: nivelacin del porta moldes

con un nivel de burbujas, necesario para
realizar una buena electroforesis.

Imagen # 4: esta imagen muestra cmo

se agrega el gel de agarosa en el porta
moldes, evitando la formacin de
burbujas.

Imagen # 2: despus de bajar el gel

teniendo una alta temperatura, se deja en
reposo hasta obtener 45C a 60 C.

Imagen # 5: se muestra cuando se agreg

el bfer de corrido TBE 0.5X, hasta
superar el nivel del gel.

Imagen # 8: se observa la cabina de

electroforesis pequea. Modelo: mini- sub
cell GT. Marca: Bio Rad. Cubetas
especiales donde se estudian molculas
principalmente de la separacin de
proteinas, ADN o cidos nucleicos
pequeos.

Imagen # 6: se observa cmo se sirven

las muestras teniendo en cuenta la
utilizacin de Orange G (3 ul) y
mezclarlo con el ADN (8 ul), antes de
servir en los posos. Utilizando una
micropipeta. Modelo: Transterpett

Imagen # 7: Mediante el uso de las

micropipeta. Modelo: Transterpett, se
procede a cargar cuidadosamente la
muestra en los posos.

imagen # 9: se observa la fuentes de

poder de electroforesis. Modelo. power
pve basic, la cual fue encendida y
seleccionado de 75 a 120 voltios
necesarios al peso molecular de ADN.

Imagen # 10: TRANSILUMINADOR.

Modelo: PHOTODOC-IT IMAGIN.
Marca: UVP. Encargado de irradiar con
rayos UV las muestras en un gel
permitiendo
hacer
anlisis
para
documentacin en genes.

Imagen # 11: Corrido de las muestras

de ADN en el gel de agarosa, observada
en el transiluminador, se muestra que hay
mayor presencia de cidos nucleicos en
la posicin # 3.

DISCUSIN
La electroforesis es el movimiento de partculas cargadas en un campo elctrico. A
diferencia de las protenas, las cuales pueden tener una carga positiva o negativa, los cidos
nucleicos estn cargados de forma negativa debido a su esqueleto de grupos fosfato. Por lo
tanto, en una electroforesis, los cidos nucleicos migrarn hacia el polo positivo, es decir,
el nodo. Adems de la poliacrilamida, la agarosa puede ser utilizada como soporte para la
corrida electrofortica. La agarosa es un polisacrido extrado de algas marinas que tiene la
propiedad de mantenerse en estado slido a temperatura ambiente pero que a altas
temperaturas se torrna lquida. Esta caracterstica permite una fcil preparacin de una
matriz porosa para ser usada en electroforesis: simplemente se pesa la cantidad de agarosa
requerida, se disuelve en un amortiguador adecuado, se calienta y se chorrea sobre un
molde particular. Una ventaja que posee la agarosa sobre la acrilamida es que no es un
compuesto txico y adems permite el anlisis de cidos nucleicos con pesos moleculares
muy variados. Sin embargo, su poder de resolucin es menor que el de los geles de
poliacrilamida y por ese motivo fue que se utilizo en esta prctica de laboratorio.
La concentracin de agarosa tpicamente utilizada para electroforesis est entre el 0.5 % y
el 2%. La concentracin a usar se escoge segn el tamao del cido nucleico a analizar.
Esto porque la concentracin de agarosa define el tamao de los poros de la matriz, a
mayor concentracin, menor el tamao de los poros y viceversa. Durante la electroforesis,
los cidos nucleicos lineales con un alto peso molecular migrarn al nodo ms lentamente
que cidos nucleicos lineales con un menor peso molecular. La razn de esto es que los
cidos nucleicos de alto peso tardan ms tiempo en atravesar los poros de agarosa. En el
caso de cidos nucleicos no linealizados, como plsmidos circulares en conformacin
nativa, la migracin no solo depender del peso molecular sino tambin de otros aspectos
como el grado de sper- enrollamiento que ste posea. Lo amortiguadores de corrido como
el TBE (Tris-Borato-EDTA) son utilizados en el proceso de electroforesis en gel de agarosa
ya que la migracin del DNA se ve afectada tanto por la composicin como por la fuerza

inica del amortiguador empleado, de manera que se debe establecer un balance de iones
que genere una fuerza inica suficiente para lograr la conductancia elctrica, sin excederse
y ocasionar en el peor de los casos un calentamiento excesivo con funcin de la agarosa y
desnaturalizacin del DNA, en pocas palabras para mantener un pH constante.
Una de los aspectos negativos, a pesar que se obtuvieron los datos deseados en esta
practica, est relacionada con una obtencin reducida de muestras en el corrido de
electroforesis observado en el transiluminador, ya que al disponer de gran cantidad de
muestras se va a asegurar mayor confiabilidad de los resultados.

CONCLUSION

La electroforesis en gel de agarosa es el mtodo ms comn y ms utilizado. Es un

mtodo de separacin frecuentemente utilizado para analizar fragmentos de ADN
generados por enzimas de restriccin, PCR, etc. Tambin puede ser utilizado para
separar otras biomolculas como colorantes, ARN y protenas. Las separaciones de
molculas e la electroforesis se da a partir de su peso molecular (tamao), siendo las
de menor peso las que ms corren en el gel.

Terminado todo el protocolo, luego de haber puesto las muestras en el

transiluminador, se not que haba presencia de cidos nucleicos (ADN), pero en
mayor cantidad en la muestra 3 Como se muestra en la fotografa # 11, es decir se
hizo un buen procedimiento ya que se obtuvieron los resultados esperados.

En esta practica se pudo aprender a reconocer muestras de ADN a travs de la

electroforesis en gel de agarosa de una forma sencilla, la cual es empleada para
separar molculas biolgicas especialmente ADN, ARN y protenas.

CUESTIONARIO
A. Problema forense.
ADN de tres sospechosos:
El jardinero de la casa,
La esposa del empresario

El vicepresidente de la compaa.
1. Abdomen mosquito.
2. Ala mosquito.
3. Vctima.
4. Jardinero.
5. Mujer de la vctima.
6. Vicepresidente

El asesino es (El vicepresidente) ya que el mosquito pudo picar a la vctima y al

sospechoso dentro del coche, justifique su respuesta.
La sangre contenida en el abdomen de un mosquito contiene la sangre de varias personas
las cuales ha picado. En este caso, la electroforesis revela que el ADN contenido en el
abdomen revela bandas equivalentes (las cuales estn resaltadas) a las encontradas en
muestras de sangre de la victima y el vicepresidente. En la muestras de sangre de las otras
personas no hay ninguna banda que se parezcan a la del abdomen del mosquito, lo que
demuestra que el vicepresidente estaba con la victima el dia del asesinato.
B. En que esta fundamentada una electroforesis?
La electroforesis es la migracin de solutos inicos bajo la influencia de un campo
elctrico; estas partculas migran hacia el ctodo o nodo (electrodos - y +), en dependencia
de una combinacin de su carga, peso molecular y estructura tridimensional.
Es de destacar que a escala analtica, los mtodos electroforticos son de alta sensibilidad,
poder de resolucin y versatilidad, y sirven como mtodo de separacin de mezclas
complejas de cidos nucleicos, protenas y otras biomolculas, donde aportan un potente
criterio de pureza. Se pueden conocer tambin mediante estas tcnicas, las caractersticas

cido-bsicas de las protenas presentes en un extracto crudo, lo que da la informacin

necesaria si se pretende realizar una separacin cromatogrfica basada en diferencias de
carga. Es til adems para determinar otros parmetros como peso molecular, punto
isoelctrico y nmero de cadenas polipeptdicas de las protenas.
La velocidad de migracin (v) de la partcula es directamente proporcional al producto de
su carga efectiva (q) y el gradiente de potencial elctrico (E) e inversamente proporcional al
coeficiente de friccin (f) relativo a la talla y forma de la molcula, o sea, a la resistencia
que le ofrece el medio.

C. Cules son los metodos electroforeticos mas usados y en que consisten?

Electroforesis en gel de poliacrilamida
Los geles de poliacrilamida se forman por polimerizacin de la acrilamida por accin de
un agente entrecuzador, es qumicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser
preparado de forma rpida y reproducible. Forma, adems, geles transparentes con
estabilidad mecnica, insolubles en agua, relativamente no inicos y que permiten buena
visualizacin de las bandas durante un tiempo prolongado. Adems tiene la ventaja de que
variando la concentracin de polmeros, se puede modificar de manera controlada en el
tamao del poro, lamentablemente cada vez se emplea menos en diagnostico debido a su
neurotoxocidad.
Electroforesis en geles de gradientes
El uso de geles de poliacrilamida que tienen un gradiente creciente de concentracin de
archilamida + bisacrilamida, y en consecuencia un gradiente decreciente en el tamao del
poro, pueden tener ventajas sobre los geles de concentraciones uniformes de acrilamida. En
un gel en gradiente la protena migra hasta alcanzar una zona donde el tamao de poro
impida cualquier avance. Una vez se alcanza el limite del poro no se produce una migracin
apreciable aunque no se detiene completamente. Una de las ventajas de este tipo de geles es
que resuelve mejor las bandas pues las concentra en regiones mas estrechas, adems de
incrementar el rango de pesos moleculares que se pueden resolver en un mismo gel
comparado con los de una concentracin fija.
Electroforesis en geles de agarosa.
La agarosa es un polisacrido (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero de
composicin homognea), cuyas disoluciones (tpicamente de 0.5 a 2 %) poseen la
propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 grados C y formar un gel, semislido al
enfriarse. Este gel esta constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras
polimricas embebida en gran cantidad de medio lquido, que retarda el paso de las

molculas, se usa usualmente para separar molculas grandes de alrededor 20.000

nucletidos.
Electroforesis capilar.
La electroforesis capilar se basa en los mismos principios de las tcnicas electroforticas
convencionales, pero utiliza condiciones y tecnologa distinta que nos permiten obtener una
serie de ventajas al respecto, Esta separacin de pptidos realizada sobre un capilar de silica
fundida a potenciales elevados 20 a 30 Kv en un campo de 400 a 500 v/cm refrigerados por
aire.
La corriente electroendosmtica (FEO) generada por los grupos silanol de la superficie
interna del capilar da como resultado una corriente plana del frente del lquido que
contrasta con el frente parablico de la cromatografa lquida de alta resolucin.
La ventaja de esta tcnica es que el capilar de silica fundida que generalmente se cubre con
una capa de polimina para darle mayor rigidez y resistencia, tiene una ventaja a travs de
ella que permite el pasaje de la luz UV de tal manera que la visualizacin es on-line.
Con esta tcnica descripta es posible separar cationes, aniones, protenas, macromolculas y
sustancias no cargadas en forma simultnea.
Isoelectroenfoque.
Esta tcnica, habitualmente denominada electroenfoque se basa en el desplazamiento de
las molculas en un gradiente de pH. Las molculas amfotricas, como los aminocidos, se
separan en un medio en el que existe una diferencia de potencial y un gradiente de pH. La
regin del nodo es cida y la del ctodo es alcalina. Entre ambos se establece un gradiente
de pH tal que las molculas que se han de separar tenga su punto isoelctrico dentro del
rango. Las sustancias que inicialmente se encuentran en regiones de pH inferior a su punto
isoelctrico estarn cargadas positivamente y migraran hacia el ctodo, mientras aquellas
que se encuentran en medios con pH ms bajos que su punto isoelctrico tendrn carga
negativa y migraran hacia el nodo. La migracin les conducir a una regin dnde el pH
coincidir con su punto isoelctrico, tendrn una carga neta nula y se detendrn. De esta
forma las molculas amfotricas se sitan en estrechas bandas donde coincide su punto
isoelctrico con el pH.

Electroforesis bidimensional.
La electroforesis bidimensional se basa en separar las protenas en una mezcla segn sus
dos propiedades moleculares, una en cada dimensin. El procedimiento ms usado se basa
en la separacin en una primera dimensin mediante Isoelectroenfoque y la segunda
dimensin segn peso molecular mediante electroforesis en poliacrilamida.
D. Cules son las principales fuentes de errores que se cometen el realizar una
electroforesis?

La electroforesis es una tcnica muy sensible y puede ser afectada por muchos errores
experimentales, como la temperatura durante la polimerizacin y la corrida del gel,
velocidad de la polimerizacin, niveles de catalizador, pureza del reactivo, tiempo de
corrida y preparacin de las muestras.
E. Los cidos nucleicos, se pueden separar por medio de electroforesis en geles
de poliacrilamida?
Si, la electroforesis en geles de poliacrilamida es utilizada para ver secuencias de ADN de
bajo peso molecular, entre 80pb y 300pb. Ha sido ampliamente utilizada para el trabajo con
microsatlites o SSR en la construccin de mapas de ligamiento, estudios poblacionales y
en la seleccin asistida por marcadores moleculares (MAS). Adicionalmente es una
herramienta til para el aislamiento de pequeas secuencias cuyo trabajo se dificulta en
geles de menor resolucin, geles de agarosa.
La tcnica consiste en la elaboracin de una fina capa de gel de acrilamida adherida a una
lmina de vidrio por la cual migra el ADN. Al igual que en un gel de agarosa, la migracin
responde a la carga negativa neta de la molcula de ADN y la concentracin del gel. Las
secuencias de ADN ms pequeas migran a mayor velocidad mientras que las grandes se
quedan atrs.
BIBLIOGRAFAS

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