Dialnet UtilizacionDeSenalesFluorescentesParaElAnalisisYCa 18504

MEN
SALIR
DEPARTAMENTO DE QUMICA ANALTICA

FACULTAD DE CIENCIAS
UNIVERSIDAD DE EXTREMADURA
TESIS DOCTORAL
MENCIN DOCTOR EUROPEO
UTILIZACIN DE SEALES FLUORESCENTES PARA EL

ANLISIS Y CARACTERIZACIN DE VINOS. MEJORA DE LA
SENSIBILIDAD Y SELECTIVIDAD MEDIANTE
DERIVATIZACIN FOTOQUMICA
USEFULNESS OF FLUORESCENCE SIGNALS FOR ANALYSIS

AND CLASSIFICATION OF WINES. IMPROVEMENT OF
SENSITIVITY AND SELECTIVITY BY MEANS OF
PHOTOCHEMICAL DERIVATIZATION
Diego Airado Rodrguez

Badajoz, 2008
MEN
SALIR
Edita: Universidad de Extremadura

Servicio de Publicaciones
Caldereros 2. Planta 3
Cceres 10071
Correo e.: publicac@unex.es
http://www.unex.es/publicaciones
MEN
SALIR
UTILIZACIN DE SEALES FLUORESCENTES PARA EL

ANLISIS Y CARACTERIZACIN DE VINOS. MEJORA DE LA
SENSIBILIDAD Y SELECTIVIDAD MEDIANTE
DERIVATIZACIN FOTOQUMICA
USEFULNESS OF FLUORESCENCE SIGNALS FOR ANALYSIS
AND CLASSIFICATION OF WINES. IMPROVEMENT OF
SENSITIVITY AND SELECTIVITY BY MEANS OF
PHOTOCHEMICAL DERIVATIZATION
por
Diego Airado Rodrguez
VISADO en Badajoz a 30 de Abril de 2008
Dra. D Teresa Galeano Daz

Profesora Titular
Dpto. de Qumica Analtica
Facultad de Ciencias
Universidad de Extremadura
Dra. D Isabel Durn Martn-Mers

Profesora Titular
Dpto. de Qumica Analtica
Facultad de Ciencias
Universidad de Extremadura
Memoria de Investigacin presentada para optar al Grado de Doctor Europeo,

dentro del Programa de Doctorado Ciencias Qumicas, Bienio 2004-2006, y
realizada en el Departamento de Qumica Analtica de la Universidad de
Extremadura.
Fdo.: Diego Airado Rodrguez
MEN
SALIR
MEN
SALIR
DEPARTAMENTO DE QUMICA ANALTICA
Campus Universitario
Avda. de Elvas, s/n
06071-BADAJOZ (ESPAA)
Telfono (+34 924) 28.93.00 y 28.93.75
FAX (+34 924) 28.93.75
ARSENIO MUOZ DE LA PEA CASTRILLO, Catedrtico y Director del

Departamento de Qumica Analtica de la Facultad de Ciencias de la Universidad
de Extremadura
I N F O R M A:
Que el trabajo que se presenta en esta TESIS DOCTORAL, con el ttulo de
"UTILIZACIN DE SEALES FLUORESCENTES PARA EL ANLISIS Y
CARACTERIZACIN DE VINOS. MEJORA DE LA SENSIBILIDAD Y
SELECTIVIDAD MEDIANTE DERIVATIZACIN FOTOQUMICA", ha sido
realizado bajo la direccin de las Dras. D Teresa Galeano Daz y D Isabel Durn
Martn-Mers, en el Departamento de Qumica Analtica de la Facultad de Ciencias
de la Universidad de Extremadura y rene todos los requisitos para poder optar al
Grado de Doctor Europeo en Ciencias Qumicas.
Badajoz, 30 de Abril de 2008
MEN
SALIR
MEN
SALIR
OBJETO DE LA TESIS DOCTORAL

El objeto de esta Memoria de Investigacin es doble:
-
Por una parte se centra en el desarrollo de nuevos mtodos

analticos para la determinacin en vino de resveratrol y sus
derivados, compuestos con importantes implicaciones en la
salud humana y que han despertado un gran inters en la
sociedad en los ltimos aos. Se pretende mejorar los
mtodos anteriormente propuestos para la determinacin de
estos compuestos, fundamentalmente en lo referido a su
sensibilidad, rapidez y sencillez. Para ello nos basaremos
en la fotorreaccin que sufren estos compuestos
estilbenoides, la cual, probablemente es una reaccin de
ciclacin en la cual se originan derivados del fenantreno,
molcula altamente fluorescente.
Otro objetivo de este trabajo es aportar nuevas

metodologas para facilitar la tipificacin de muestras de
vino y la deteccin de fraude en la industria del vino, para lo
que se pretende hacer uso de seales fluorescentes de tres
vas, en combinacin con herramientas quimiomtricas.
MEN
SALIR
MEN
SALIR
DOCTORAL THESIS OBJECTIVE

The purposes of this Report of Investigation are:
-
On the one hand, the development of new analytical

methods for the determination of resveratrol derivatives in
wine samples. It has been demonstrated that these
compounds have beneficial effects on human health, and a
great interest has been aroused in society in recent years.
The main objective is improving the previously proposed
methods for the analysis of these compounds, in terms of
sensitivity, speed and simplicity. For that, we will use the
photoreaction that stilbenoids compounds suffer, which is
probably a cyclation reaction in which phenanthrene
derivatives are originated.
On the other hand, new methodologies for wine

classifications and fraud detection will be developed. Threeway fluorescence signals will be used, in combination with
chemometric tools.
MEN
SALIR
MEN
SALIR
NDICE
CAPTULO I: Introduccin
Parte I: Resveratrol. El Compuesto3
Resveratrol en vino...10
Efectos biolgicos de resveratrol14
Los compuestos fenlicos de la uva..18
Parte II: Antecedentes bibliogrficos para el anlisis de resveratrol........................28
Aparatos, reactivos y software utilizados en este trabajo de investigacin...55
Captulo II: Determinacin de resveratrol en vino mediante fluorescencia
fotoinducida de segunda derivada y extraccin lquido-lquido
ANTECEDENTES...73
RESULTADOS Y DISCUSIN
Estudio bsico sobre las propiedades de inters analtico de trans-resveratrol...76
Efecto de la irradiacin ultravioleta externa sobre las propiedades absorbentes y
fluorescentes de trans-resveratrol....87
Estudio extracto-espectrofluorimtrico de trans-resveratrol. Aplicacin al anlisis de
muestras de vino.98
Perspectivas de futuro..109
MEN
SALIR
Captulo III: Anlisis de piceido en vinos mediante fluorescencia fotoinducida

aplicando segunda-derivada a los espectros de emisin
ANTECEDENTES.113
Estudio bsico sobre las propiedades de inters analtico de trans-piceido...115
Efecto de la irradiacin ultravioleta externa sobre las propiedades absorbentes y
fluorescentes de trans-piceido.......124
Estudio extracto-espectrofluorimtrico de trans-piceido. Aplicacin al anlisis de
muestras de vino...135
Captulo IV: Determinacin de resveratrol y piceido totales en vino, sin tratamiento
previo, mediante derivatizacin fotoqumica off line-HPLC
ANTECEDENTES.153
Estudios fluorescentes previos...156
Estudios cromatogrficos previos..158
Optimizacin quimiomtrica de la composicin de la fase mvil para el anlisis de
vino..165
Determinacin de las cantidades totales de resveratrol y piceido en muestras de
vino..171
MEN
SALIR
Captulo V: Anlisis de los ismeros de resveratrol y piceido en vinos mediante

HPLC isocrtica, con deteccin fluorescente previa derivatizacin post-columna en
lnea
ANTECEDENTES.181
Estudios fluorescentes previos...186
Estudios cromatogrficos previos..187
Optimizacin quimiomtrica de las condiciones cromatogrficas para el anlisis
isocrtico de trans-resveratrol y trans-piceido en muestras de vino.190
Foto-isomera cis-trans. Evidencia de la presencia de cis-ismeros de resveratrol y
piceido en vinos.205
Aplicacin: Anlisis de los ismeros de resveratrol y piceido en vinos...219
Captulo VI: Utilizacin de seales fluorescentes de tres vas (matrices de
excitacin-emisin) para caracterizacin de vinos
ANTECEDENTES.229
Muestras de vino incluidas en el modelo..235
Matrices de excitacin-emisin de fluorescencia.237
Construccin del modelo PARAFAC.242
Anlisis de componentes principales de los valores de PARAFAC-score..249
Identificacin de los fluorforos presentes en vino..258
Utilizacin de las seales de autofluorescencia total del vino en combinacin con
herramientas quimiomtricas para asegurar la pertenencia del vino a una DO.267
MEN
SALIR
Captulo VII: Anlisis de resveratrol en vinos tintos mediante voltamperometra de

redisolucin adsortiva de onda cuadrada
ANTECEDENTES.277
Puesta a punto del procedimiento.....281
Parmetros analticos de calidad...304
Anlisis de trans-resveratrol en muestras de vino..306
Seguimiento cromatogrfico de las etapas de limpieza.311
MEN
SALIR
CAPTULO I
INTRODUCCIN
MEN
SALIR
CAPTULO I. Introduccin
MEN
SALIR
PARTE I: RESVERATOL. EL COMPUESTO

Se conocen hasta 30 estilbenoides y estilben-glucsidos, que se
encuentran naturalmente en diversas especies del reino vegetal, dentro de las
espermatofitas1. Como su propio nombre indica, el esqueleto estructural de todos
ellos consta de un puente vinlico, que sirve de unin a dos anillos aromticos
(esqueleto estilbenoide). A partir de esta estructura qumica, relativamente sencilla,
la naturaleza ha sido capaz de crear una gran variedad de compuestos, variando
entre ellos tanto el nmero como la posicin de grupos hidroxilos, la extensin en
que dichos grupos hidroxilos se encuentran a su vez sustituidos por azcares, por
grupos metilo, metoxi u otros residuos y la configuracin estrica de molculas
qumicamente idnticas. Otra causa de variacin que aumenta mucho ms el
nmero de sustancias integrantes de esta familia es su habilidad para existir como
dmeros, trmeros o polmeros mayores.
Uno de los compuestos ms conocidos dentro de este grupo de
estilbenoides es la molcula en la que se centra gran parte del trabajo que se
describe en esta memoria, el resveratrol, 3,4,5-trihidroxiestilbeno, cuya frmula
estructural es la siguiente:
OH
HO
4'
OH
Figura 1.- Frmula estructural de trans-resveratrol
MEN
SALIR
Respecto al origen del nombre resveratrol, el profesor Yutaka Ebizuka, de

la Universidad de Tokio, propone lo siguiente2:
res: puede estar relacionado con la clase de molculas a las que

pertenece el resveratrol: los resorcinoles
veratr: abreviatura del nombre de la planta Veratrum grandiflorum,

en la que se encontr resveratrol por primera vez en 1940.
ol: indicativo de la presencia de grupos hidroxilo.
La sntesis de resveratrol en el laboratorio, puede llevarse a cabo a travs

de una reaccin de Witting, uniendo dos anillos fenlicos, apropiadamente
sustituidos, a travs de un doble enlace de estireno, como describen inicialmente
Moreno-Maas y Pleixats3. Cuando la sntesis se lleva a cabo mediante esta ruta,
se parte de precursores metilados, para proteger los grupos hidroxilos, los cuales
son posteriormente liberados mediante tribromuro de boro. El producto final de esta
ruta sinttica es el trans-resveratrol, que es el nico ismero del resveratrol que
existe en la naturaleza y el nico que se comercializa (Sigma-Aldrich).
Como ocurre con otros estilbenoides, el trans-resveratrol se produce de
forma natural en un amplio nmero de familias vegetales, encontrndose en 72
especies vegetales (distribuidas en 31 gneros y 12 familias) y est ampliamente
distribuido tanto en gimnospermas como en dicotiledneas1, algunas de las cuales
constituyen productos empleados en la dieta humana, como los cacahuetes o las
moras.
El resveratrol es identificado en 1940 por primera vez en la raz del elboro
blanco (Veratrum Grandiflurum O. Loes), y despus en las races secas de la
planta Poligonum Cuspidatum, llamada Ko-jo-kon en japons, siendo sta una de
las fuentes ms ricas de resveratrol. La planta es ampliamente empleada en la
4
MEN
SALIR
medicina tradicional china y japonesa en el tratamiento de enfermedades tales

como dermatitis supurativa, gonorrea, tia favosa, pie de atleta ehiperlipidemia4-7.
En 19768 se descubri la existencia de este compuesto en la vid, Vitis vinifera.
El trans-resveratrol es una fitoalexina producida en las plantas, a nivel
celular y para tratar de ubicar dicha molcula, debe considerarse en primer lugar
cmo y por qu se genera.
El metabolismo celular de las plantas puede definirse a travs de la suma
de todas las reacciones enzimticas que tienen lugar en la clula, pudindose
diferenciar dos fases claramente diferenciadas:
la fase en la que intervienen todos los procesos degradativos y que es

conocida como catabolismo, y
la fase constructiva o biosinttica del metabolismo conocida como

anabolismo.
Bajo este punto de vista, puede decirse que el trans-resveratrol es un
anabolito, ya que esta molcula se genera en las clulas de las plantas, con el
objetivo de cumplir una misin especfica: ser un pesticida natural, a travs del cual
y junto con otros anabolitos, la plata se defiende de agresiones externas.
Cuando una planta es infectada por un agente patgeno, la primera
respuesta est localizada en las clulas con las que dicho agente entra en contacto
directo. Estas clulas reconocen la estructura del patgeno, o alguna de las
molculas fundamentales para el desarrollo de su actividad, siendo la respuesta
primaria ms frecuente de la planta la reaccin por necrosis, en la que las clulas
infectadas por el agente patgeno mueren, fenmeno conocido como muerte
celular programada (PCD). Adems, estas clulas, directamente afectadas por el
5
MEN
SALIR
patgeno, producen una serie de molculas que alertan a las clulas adyacentes
de la infeccin, y que reciben el nombre de molculas elicitadoras9,
desarrollndose en dichas clulas adyacentes la conocida como respuesta
secundaria, al reconocer a las molculas elicitadoras producidas en la interaccin
primaria. Estas vas de defensa implican que las clulas de las plantas poseen
sistemas permanentes de vigilancia, capaces de detectar los estmulos generados
por el agente patgeno, elicitando de este modo la respuesta defensiva en la
planta10. El tercer tipo de respuesta defensiva es inducida hormonalmente en la
planta11, y es a travs de la cual la planta forma compuestos conocidos como
fitoalexinas, que tratarn de frenar la actividad patgena.
Muchas plantas producen metabolitos secundarios (no implicados en las
reacciones metablicas vitales para la planta) con funciones antifngicas. Estos
compuestos antifngicos pueden encontrarse en plantas saludables que no han
sufrido infeccin patgena alguna, actuando como mecanismo de barrera frente a
las mismas y recibiendo en este caso el nombre de fitoancipinas. Se reserva la
denominacin de fitoalexinas para los metabolitos secundarios antifngicos que
son sintetizados en respuesta al ataque patgeno, con el fin de cesar su invasin12.
En general, las fitoalexinas pueden definirse como molculas antimicrobianas de
bajo peso molecular, acumuladas en las plantas como resultado de una infeccin
patgena o tras haber sido sometidas a condiciones de estrs13.
Entre los efectos desencadenantes de la produccin de trans-resveratrol en
plantas, se pueden citar los siguientes:
Infecciones fngicas como la Botrytis Cinerea14, la Plasmopara Vitcola15, la

Phomopsis Vitcola16 o la Rhizopus Stonifer17.
Dao de la planta
Tratamiento con sales como tricloruro de aluminio18.
MEN
SALIR
Tratamiento con ozono19.
Radiacin Ultravioleta
Como se ve en la Figura 2, los precursores inmediatos de resveratrol son el
p-cumaril-CoA y el malonil-CoA, en una relacin molar de 1:3.
Figura 2.- Ruta biosinttica desde p-cumaril-CoA hasta resveratrol
El p-cumaril-CoA se genera a partir de la fenilalanina, la cual, en las

plantas, es sintetizada a partir de azcares mediante la ruta del cido shikmico20:
en primer lugar se produce la prdida del grupo amino de la fenilalanina mediante
deaminacin oxidativa, catalizada por la enzima especfica fenilalanina-amonioliasa, dando lugar a cido cinmico, el cual es hidroxilado a cido p-cumrico por
7
MEN
SALIR
accin de la enzima cinamato-4-hidroxilasa, y finalmente transformado en pcumaril-CoA, por accin de una CoA-ligasa. Sobre este sustrato, pueden entrar en
accin dos enzimas clave: la calcona-sintasa (CHS) o la estilbeno-sintasa (STS).
En ambos casos, tal y como se indica en la ruta biosinttica representada en la
Figura 2 (las tres condensaciones son las marcadas en color), se produce la
condensacin de p-cumaril-CoA con tres molculas de malonil-CoA, dando lugar a
una tetracetona. Hasta este punto, ambas enzimas actan de manera idntica.
A continuacin se produce la ciclacin de la tetracetona lineal, y es
precisamente la manera en la que esta ciclacin se lleva a cabo la principal
diferencia entre ambas enzimas. En el caso de la CHS, se liberan 3 molculas de
CO2 en el proceso, y el producto final de esta ruta es la calcona, el cual es el
precursor comn de la familia de los flavonoides, familia a la que pertenece la
quercetina. Cuando la enzima que acta es la STS, el producto final de la reaccin
es el trans-resveratrol, liberndose cuatro moles de CO2, por mol de resveratrol
formado.
La mayora de las especies de la familia Vitaceae poseen ambos enzimas.
Como dato curioso puede citarse el siguiente: Hain et al21 aslan el gen de la STS
de la vid, y lo transfirieron al tabaco, encontrando que las plantas de tabaco
transgnicas resultantes son mucho ms resistentes a la infeccin por Botrytis
cinerea. Las fitoalexinas, dado su carcter antifngico, son candidatos idneos para
ser utilizados como pesticidas naturales. Dichos pesticidas naturales se plantean
como una buena alternativa a los sintticos, teniendo en cuenta la inmunidad
desarrollada por ciertas especies patgenas, la toxicidad y los grandes tiempos
necesarios para la degradacin de estos ltimos.
MEN
SALIR
El tratamiento post-cosecha de la uva con luz ultravioleta (concretamente

UVC) produce un estrs en la uva que hace que sta, en respuesta a dicho dao,
induzca la sntesis de resveratrol. Esta misma tecnologa se est aplicando
actualmente a uvas de mesa y a uvas de vinificacin para obtener nuevas frutas
funcionales22, 23 y vinos enriquecidos en resveratrol24.
Las fuentes de resveratrol en la naturaleza no son muchas, y menos an
las plantas y vegetales de consumo humano conteniendo este compuesto. En la
Figura 3 se representan las fuentes naturales ms importantes de aporte de
resveratrol y no existe duda acerca de que las fuentes que ms aportan a la dieta
humana son los productos derivados de la vid, esto es, la uva y el vino25.
Figura 3.- Fuentes de resveratrol en la naturaleza
MEN
SALIR
En la uva, los mayores niveles de resveratrol se encuentran en las pieles,

estando prcticamente ausente en la pulpa y en las pepitas del fruto26. Otras
fuentes de resveratrol son: el cacahuete27,
28,
los arndanos29, la Reynoutria
Japonica, las moras y en especies herbceas (Poaceae incluyendo Festuca,

Hordeum, Poa, Stipa, y Lolium spp.)
Respecto a la existencia de este compuesto en rboles, merece la pena
destacar su presencia en eucalipto, pcea y pino, as como en el rbol tropical de
hoja caduca Bauhinia racemosa.
Son pocas las plantas florales en las que se encuentra resveratrol. Las dos
nicas que se conocen son la ya mencionada Veratrum Grandiflurum, en la que se
encuentran altas concentraciones de resveratrol en las hojas cuando la planta es
daada por tratamiento con agentes qumicos30, y la Veratrum formosanum, cuya
raz y rizomas son relativamente ricos en resveratrol, tanto que ha sido empleada
en Oriente como tratamiento alternativo para la hipertensin31. Tambin est
descrita la presencia de resveratrol en Pterolobium hexapetallum, una legumbre no
comestible32.
Recientemente, Counet et al33 describen la presencia de trans-resveratrol y
trans-piceido, por primera vez, en chocolate negro (al menos 0.4 gmL-1 de transresveratrol y 1.0 gmL-1 de trans-piceido) y licor de cacao (al menos 0.5 gmL-1
de trans-resveratrol y 1.2 gmL-1 de trans-piceido).
Resveratrol en vino
La identificacin de resveratol en vinos es relativamente reciente y data de
1992, ao en que el ismero trans es identificado por Siemman y Creasy34. Estos
10
MEN
SALIR
autores llevan a cabo la cuantificacin de este compuesto en vinos tintos y blancos,

encontrando que las concentraciones varan entre 0.66 gmL1 y 0.68 ngmL1, en
vinos tintos y desde 100 ngmL1 a menos de 0.23 ngmL1, para vinos blancos.
Justifican los menores niveles encontrados en vinos blancos en base al hecho de
que, en la uva, el resveratrol se encuentra en las pieles y no en la pulpa, y el
proceso de elaboracin del vino blanco implica un prensado ms ligero del fruto y
un menor tiempo de contacto entre el mosto y los hollejos. Se pone de manifiesto
en este primer trabajo una gran variabilidad en el contenido de resveratrol en vino,
y su dependencia de factores tales como la casta de la uva, el origen geogrfico, la
cosecha y las tcnicas de vinificacin. Entre las variables que ms influyen en el
contenido de los cuatro compuestos en vino, adems de las ya mencionadas, se ha
encontrado que son muy importantes ciertos aspectos de las tcnicas de
vinificacin, como por ejemplo la maceracin con hollejos35.
Un ao ms tarde, Jeandet et al36, describen la presencia del ismero cis
en vino. En 1994, Waterhouse y Lamuela-Ravents37 publican la existencia de
resveratrol-3--D-glucsido (piceido) en uvas. Ese mismo ao Roggero y Archier38,
basndose en su espectro de absorcin en el ultravioleta, describen la existencia
de un glucsido indefinido del resveratrol en vino. Posteriormente, en el ao 1995,
Lamuela-Ravents et al39 identifican este glucsido en vino tinto como piceido,
utilizando un estndar de piceido extrado de la raz del Poligonum Cuspidatum, y
proponen un mtodo para el anlisis de los ismeros trans y cis del glucsido y la
aglicona (Figura 4) en vino.
11
MEN
SALIR
HO
OH
HO
OH
HO
OH
trans - Resveratrol
cis -Resveratrol
HO
OH OH
HO
OH
H
H
HO
OH
H
O
HO
OH
H
O
OH
HO
trans-Piceido
OH
cis-Piceido
Figura 4.- Estructuras qumicas de las formas de resveratrol objeto de esta tesis
Los mismos autores40 proponen en 1996 un mtodo para la cuantificacin

de los cuatro analitos en vinos blancos y rosados, siendo en este caso necesario
una etapa de preconcentracin, dados los menores niveles encontrados en estos
vinos.
Fremot, en el ao 2000 publica un trabajo de recopilacin donde se
recogen las cantidades de resveratol y/o piceido encontradas en vinos de
diferentes pases y en distintos tipos de vino. Los resultados se muestran en la
Tabla 1.
12
MEN
SALIR
Tabla 1.- Concentraciones de resveratrol y/o piceido en vinos tinto41
Origen
USA
Francia
Francia
(Burgundy)
USA
(California)
Comparacin
entre vinos de
Norte Amrica,
Australia y
Europa
USA
(California)
Francia
Francia
USA
(California)
Espaa
Europa
(1)
Concentracin de Resveratrol (g.mL-1) (1)

Chardonnay, hasta 0.1
Los vinos de California presentan concentraciones
ms bajas que los de New York
Burdeaux, entre 0.3 - 0.6
Ref
Pinot noir, entre 0.4 - 2
36
Pinot noir, entre 0.2 - 0.7

Cabernet Sauvignon, < 0.09
42
Todos contienen entre 0.1 - 12

Los procedentes de California, Australia e Italia
presentan concentraciones ms bajas que los de
Oregn, Canad y Francia
43
< 0.02-1.7 (mximas concentraciones en Pinot noir, 5)
44
Beaujolais (Gamay), entre 3.2 - 3.6

Resveratrol: 0.5 - 5; piceido: 0 - 14.5
Vinos procedentes de uvas Cabernet franc, Gamay y
Grenache presentan concentraciones menores que los
procedentes de Pinot noir, Mourvdre y Cabernet
Sauvignon
Ismeros del resveratrol entre 0.3 3
Resveratrol total (aglicona+glucsido) entre
2.5 - 13.8 (trans>cis).
Cantidades totales segn el tipo de uva :
Pinot noir, 5.1; Merlot, 4; Grenache, 2.4; Cabernet
Sauvignon, 1.4; Tempranillo, 1.3
Ismeros de la aglicona (trans>cis),
Contenido medio segn pas: Francia, 3.7 - 7.1;
Italia, 1.2; Espaa, Portugal, 2.8; Europa central, 3.1;
Suiza, 6.9.
34
44
38
39
45
concentracin de trans-resveratrol donde no se indique otra cosa
13
MEN
SALIR
Tabla 1.- Concentraciones de resveratrol y/o piceido en vinos tinto (continuacin)
Origen
Amrica
Comparacin
entre vinos de
Italia
USA (Sureste)
Japn
USA
(California)
(1)
Concentracin de Resveratrol (g.mL-1) (1)

Contenido medio segn el origen: Amrica del Sur, 1.8
< California, 3 < Oregon, 6.3
Ref
Reccioto y Amarone (area de Verona), entre 0.05 - 0.8
25
Ismeros de la aglicona, 0.1-42, concentraciones mximas en Muscadine: trans, hasta 13.4; cis hasta 31.9
Presencia de Tetrahidroxiestilbeno.
Estilbenos totales, 0.8-13.4; aglicona (media 1.8, trans
> cis), piceido (media 2.5, cis > trans); concentraciones
mximas en los tipos de uva Pinot Noir y Merlot.
Contenido segn el tipo de uva :
Cabernet Sauvignon, 0.4-2;
Pinot noir, 1.2;
Merlot, 3.5
45
46
47
48
concentracin de trans-resveratrol donde no se indique otra cosa
Debido a la generalmente alta razn entre las concentraciones de trans a

cis ismeros encontradas en vino, se sugiere que el nico ismero sintetizado en la
uva es el trans, proviniendo el cis de la exposicin a la luz del mosto durante el
proceso de elaboracin del vino, o del vino durante el almacenamiento39.
Efectos biolgicos de resveratrol
Ya se ha comentado el carcter antifngico de las fitoalexinas. No
obstante, debe tenerse en cuenta que un compuesto natural no tiene por que estar
exento de riesgos toxicolgicos para el ser humano, ya que los mayores venenos
son productos naturales producidos por plantas o animales. Sin embargo, en el
caso concreto de algunas fitoalexinas, como el trans-resveratrol no slo se ha
demostrado la ausencia de dicho carcter txico, sino que adems presenta
grandes beneficios para la salud.
14
MEN
SALIR
Este compuesto, como otros polifenoles, es un antioxidante muy efectivo

por derecho propio, por lo que ha atrado la atencin particular como solucin
potencial a la denominada paradoja francesa. Este es el trmino usado para
describir el fenmeno, que ha sido por mucho tiempo un rompecabezas para la
ciencia mdica, de que los ndices de la enfermedad cardiovascular en Francia son
muy bajos con respecto al resto del mundo desarrollado, a pesar del elevado
consumo de grasa animal y colesterol, y un hbito firmemente atrincherado del
tabaco. Por supuesto Francia tambin goza de muchas de las ventajas de la dieta
mediterrnea, pero hay buenas razones para pensar que es el consumo de vino
tinto, y en gran medida el resveratrol contenido en ste, el que puede ser la
explicacin verdadera de la paradoja evidente.
"La paradoja francesa" y "el resveratrol" han abierto las puertas a nuevas
investigaciones, pero no se puede olvidar que las bondades del vino ya las
prescribi Hipcrates, padre de la medicina moderna, quien afirmaba que "el vino
es cosa admirablemente apropiada al hombre, tanto en el estado de salud como en
el de enfermedad, si se le administra oportunamente y con justa medida, segn la
constitucin individual".
El resveratrol contribuye al efecto cardioprotectivo del vino tinto, ya que
este compuesto ha demostrado inhibir la oxidacin del LDL, la peroxidacin de
lpidos, la agregacin plaquetaria, y la sntesis de eicosanoides49, etapa inicial de la
patognesis de la arteriosclerosis.
Actualmente se estn realizando numerosos estudios sobre las propiedades
del resveratrol, de los cuales se le han atribuido diversas propiedades in vitro e in
vivo como son:
15
MEN
SALIR
Proteccin de las lipoprotenas de baja densidad (LDL) frente a la

oxidacin50-52.
Inhibicin de la agregacin plaquetaria y la sntesis de eicosanoides31, 53.
Proteccin del hgado de peroxidacin de lpidos54.
Estudios recientes en ratones han demostrado que ratones obesos cuya

dieta estaba suplementada con resveratrol no slo son ms longevos, sino
adems ms activos, presentando en menor medida los efectos negativos
de una dieta hipercalrica55.
Reduccin de la muerte celular por estrs oxidativo56.
Propiedades antiinflamatorias debido a su efecto inhibidor sobre la

ciclooxigenasa57.
Regulacin del metabolismo de los lpidos34.
Proteccin cardiovascular como fitoestrgeno.
Efectos citoprotectores sobre el rin58.
Propiedades anticancergenas, puesto que inhibe la actividad de la enzima

protein-tirosina kinasa, enzima implicada en la alteracin de las clulas
tumorales59, 60.
Previene enfermedades como el Parkinson y el Alzheimer.

An no se han estudiado con profundidad las acciones benficas del
resveratrol en funcin de la dosis y no se sabe si los efectos observados in vitro e

in vivo se pueden extrapolar al ser humano. En los estudios en animales y en los
limitados estudios en humanos, se ha observado que el resveratrol se absorbe en
el aparato gastrointestinal. Sin embargo, la eficacia de su absorcin, as como su
distribucin, metabolismo y excrecin, no est bien definida. Hasta la fecha, son
escasos los estudios que se han realizado sobre el metabolismo del resveratrol en
humanos, si bien se ha puesto de manifiesto recientemente que el resveratrol se
16
MEN
SALIR
metaboliza en el hgado para producir metabolitos resveratrol-glucurnido y

resveratrol-sulfato52.
Actualmente, el resveratrol se comercializa para la investigacin mdica;
adems, tambin est disponible como complemento nutricional (no como un
agente teraputico) en forma de extracto seco purificado cuya fuente principal son
las uvas tintas. En cuanto a las precauciones de uso, se desaconseja para las
personas que padecen trastornos mentales y hepticos graves y en mujeres
embarazadas y en periodo de lactancia, adems es un producto reservado a los
adultos.
El ismero cis y los ismeros trans y cis del piceido son fisiolgicamente
tan importantes como el trans-resveratrol. cis-Resveratrol posee una actividad
similar a la del ismero trans inhibiendo a la enzima protein-tirosina kinasa61 y la
agregacin plaquetaria62. Los ismeros de piceido tienen propiedades similares a
los de resveratrol inhibiendo la agregacin plaquetaria31 y la oxidacin del LDL en
humanos63. Por otra parte, de una manera menos activa que el trans-resveratrol, el
trans-piceido reduce la elevacin de los niveles lipdicos64 e inhibe la sntesis de
eicosanoides53.
En los estudios llevados a cabo con Poligonum Cuspidatum, se ha
comprobado que la actividad biolgica de piceido es bastante diferente que la de la
aglicona, no obstante, el tracto digestivo humano tiene actividad glucosidasa65, de
manera que es probable la liberacin de la aglicona a partir del glucsido durante la
digestin.
17
MEN
SALIR
Los compuestos fenlicos de la uva

Dado que la gran mayora de los mtodos que se ponen a punto en este
trabajo estn basados en fluorescencia molecular, y muchos de los integrantes de
este grupo de sustancias presentan fluorescencia nativa o fotoinducida, el ltimo
apartado de esta introduccin general se dedica a la descripcin del grupo de los
compuestos fenlicos en vino, en el cual se engloba el resveratrol. No obstante,
aparte de los compuestos fenlicos, merece la pena nombrar tambin como
potenciales fluorforos del vino los aminocidos fluorescentes triptfano, tirosina y
fenilalanina, as como algunas vitaminas.
Los constituyentes fenlicos revisten una gran importancia en enologa
debido al papel que juegan directa o indirectamente sobre la calidad de los vinos.
En efecto, son el origen del color y de la astringencia, siendo atribuida esta ltima
en particular a la presencia de taninos. Adems, segn su naturaleza, pueden tener
un inters nutricional y farmacolgico.
Desde el punto de vista qumico, los compuestos fenlicos estn
caracterizados por un ncleo bencnico que lleva uno o varios grupos hidroxilos.
Los compuestos fenlicos se clasifican en no flavonoides y flavonoides. Estos
ltimos tienen un esqueleto en C6-C3-C6. Los polifenoles incluyen tambin a los
derivados (steres, metil steres, glucsidos, etc) que resultan de las sustituciones
de la estructura base. La reactividad de este tipo de molcula es debida tanto a la
presencia de la funcin fenol que presenta un carcter cido, como al ncleo
bencnico que puede sufrir sustituciones electroflicas.
Los compuestos polifenlicos estn distribuidos en las distintas partes de la
uva: pulpa, hollejos, pepitas y raspones. De esta manera, la transformacin
18
MEN
SALIR
tecnolgica adoptada condiciona la extraccin de los polifenoles a partir de las

diferentes partes del racimo, contribuyendo as de manera esencial a la
composicin polifenlica de los vinos. Un conocimiento profundo de las diversas
estructuras polifenlicas presentes en la uva y de los mecanismos de su evolucin
durante el transcurso de la vinificacin es una base indispensable en la evaluacin
de su papel en enologa y en el desarrollo de los procesos tecnolgicos adaptados
a la vez a la materia prima y al tipo de producto deseado.
Compuestos no flavonoides
Esta denominacin abarca a los cidos fenlicos, divididos en cidos
benzicos (C6-C1) y cidos cinmicos, portadores de una cadena lateral insaturada
(C6-C3), pero tambin a otros derivados fenlicos, como los estilbenos.
cidos fenlicos
En la uva, los cidos fenlicos son principalmente cidos hidroxicinmicos
que se encuentran en las vacuolas de las clulas del hollejo y de la pulpa, bajo la
forma de steres tartricos. En el vino, se pueden encontrar en forma libre,
procediendo de la hidrlisis de otros polifenoles, especialmente de los antocianos,
que se degradan en presencia de oxgeno y calor, lo que supone un mecanismo de
la destruccin del color; o bien en forma combinada, parcialmente esterificados,
especialmente con el cido tartrico o con cidos hidroxicinmicos, destacando
entre ellos los cidos cafeoil tartrico (cido caftrico), p-cumaroil tartrico (cido
cutrico) y feruloil tartrico (cido fertrico), Figura 5. La forma natural es la trans,
pero los ismeros cis, largo tiempo confundidos con los derivados glucosilados,
tambin existen aunque en dbil cantidad. Slo el derivado glucosilado del cido
trans-cutrico ha podido ser identificado.
19
MEN
SALIR
COOH
HC
C
C
HO
CH
OH
O
H
COOH
Figura 5.- steres hidroxicinmicos: cido trans-cafeoil tartrico (R = OH),

trans- p-cumaroil tartrico (R = H) y trans-feruloil tartrico (R = OCH3)
En lo que concierne a los cidos benzicos, la uva contiene principalmente

cido glico (Figura 6).
OH
HOOC
OH
OH
Figura 6.- cido glico
Estilbenos
Es de destacar la presencia en la uva de otros compuestos fenlicos como
el ismero trans del resveratrol, como aglicona o 3--D-glucsido (piceido).
Compuestos Flavonoides
Los flavonoides estn caracterizados por un esqueleto de base de 15
tomos de carbono (C6-C3-C6) de tipo 2-fenil benzopirona (Figura 7).
20
MEN
SALIR
5'
4'
6'
1'
3'
2'
6
10
5
Figura 7.- 2-Fenil benzopirona
Esta gran familia se divide en varias subclases, que se distinguen por el

grado de oxidacin de su ncleo pirano. Los flavonoides en sentido estricto,
basados en su estructura fenil-2-benzopirona, estn principalmente representados
en la uva por los flavonoles, mientras que los flavonoides en sentido amplio
comprenden igualmente los flavanos 3-ol (3-flavanoles) y los antocianos. Las
estructuras generales de las subclases ms frecuentes en el vino se encuentran en
la Figura 8:
Figura 8.- Estructuras qumicas de las subclases de flavonoides ms usuales en el vino
21
MEN
SALIR
Flavonoles
Estos flavonoides en sentido estricto estn nicamente presentes en los
hollejos, bajo forma de glicsidos en posicin 3. En la Figura 9 se representan los
cuatro flavonoles principales de la uva, bajo su forma aglicona.
R
OH
HO
O
R'
OH
OH
Figura 9.- Flavonoles de la uva: kaempferol

(R = H; R = H), quercetol (R = OH; R = H),
miricetol (R = OH; R = H) e isoramnetol (R =
OCH3; R = H)
Las formas glucosiladas son las ms abundantes, pero se encuentran

igualmente cantidades importantes de glucurnidos.
Flavanos 3-oles (3-Flavanoles)
Los flavanos 3-oles (3-flavanoles) estn presentes en la uva en estado de
monmeros y bajo formas ms o menos polimerizadas que constituyen los taninos
catquicos. En el seno de la baya de uva, se localizan principalmente en las
semillas, aunque se han detectado tambin trazas de monmeros y dmeros en la
pulpa.
Los principales 3-flavonoles monmeros de la uva son la (+)-catequina y su
ismero la (-)-epicatequina, pudiendo ser encontrado este ltimo bajo forma de
22
MEN
SALIR
ster glico (3-galato de epicatequina). Las estructuras de los flavanoles

monmeros de la uva estn representadas en la Figura 10.
R3
OH
HO
O
OH
R1
6
4
R2
OH
Figura 10.- Estructura de los flavanoles

monmeros de la uva: catequina (R1= H; R2=
OH; R3= H), galocatequina (R1= H; R2= OH;
R3= OH), epicatequina (R1= OH; R2= H; R3= H)
y epigalocatequina (R1= OH; R2= H; R3= OH)
Flavanonoles y flavonas
Los compuestos pertenecientes a esta familia han sido identificados en el
hollejo de uva blanca. Estos son la astilbina (3-ramnsido del dihidroquercetol) y la
engelatina (3-ramnsido del dihidrokaempferol), cuyas estructuras se recogen en la
Figura 11.
R
OH
HO
O
OH
Ramnosil
Figura 11.- Flavanonoles de la

engeletina (R = H) y astilbina (R = OH)
uva:
23
MEN
SALIR
En cuanto a las flavonas se han identificado hasta 7-glucsidos de apigenol

y luteolina en las hojas de Vitis vinifera.
Antocianos
Los antocianos representan una parte importante tanto a nivel cualitativo
como cuantitativo de los flavonoides de la baya de uva tinta. Contribuyen de
manera preponderante al color de las especies tintas. Desde un punto de vista
general, los antocianos se corresponden con unos glicsidos de ncleo flavilium
polihidroxilado y/o metoxilado. Las formas agliconas, que responden a la frmula
general, son denominados antocianidinas (o antocianidoles), Figura 12, y las
formas heterosdicas se denominan antocianinos, siendo estas ltimas ms
estables.
3'
4'
2'
1'
5'
6'
6
5
Figura 12.- Estructura de los antocianidinas

(forma flavilium)
Los antocianos se diferencian por sus niveles de hidroxilacin y de

metilacin, por la naturaleza, el nmero y la posicin de las osas unidas a la
molcula, y tambin por la naturaleza y el nmero de los cidos que esterifican los
azcares. Los antocianos del gnero Vitis son: cianidol, peonidol, delfinidol y
malvidol (Figura 13); pero el contenido y la composicin en antocianos en la uva
vara enormemente en funcin de la especie y de la variedad.
24
MEN
SALIR
R
3'
2'
HO
5'
1'
7
2
6'
A
6
OH
4'
R'
3
5
OH
OH
Figura 13.- Antocianidinas de la uva en forma

de catin flavilium: cianidol (R = OH; R = H),
peonidol (R = OCH3; R = H), delfinidol (R =
OH; R = OH), petunidol (R = OCH3; R = OH)
y malvidol (R = OCH3; R = OCH3)
La V. vinifera presenta la particularidad de contener nicamente 3glucsidos de antocianidoles, mientras que otras especies del gnero Vitis
contienen 3,5 diglucsidos. Las numerosas posibilidades de sustitucin del ncleo
B y las funciones hidroxilo confieren a los antocianos propiedades especficas,
concretamente color y estabilidad, que estn directamente ligadas a la estructura.
As, el aumento del nmero de hidroxilos sobre el ncleo B conduce al
desplazamiento del mximo de absorcin hacia longitudes de onda ms altas
(efecto batocrmico), lo que se traduce en una modificacin del color de la
molcula. Por otra parte, la presencia de sustituyentes osdicos se traduce en un
ligero efecto hipsocrmico y aumenta la estabilidad de las molculas antocinicas.
Por ltimo, la esterificacin de los azcares, concretamente por cidos
hidroxicinmicos, estabiliza la molcula y sus capacidades colorantes, debido al
establecimiento de interacciones hidrfobas intramoleculares (copigmentacin
intramolecular).
El color de los antocianos en solucin depende del medio. En efecto, los
antocianos existen en solucin bajo diversas formas en equilibrio, de colores
diferentes. Estos equilibrios estn regidos por el pH de la solucin. A pH inferior a
25
MEN
SALIR
2, la forma flavilium coloreada en rojo, estabilizada por resonancia, domina

ampliamente. Adems, las interacciones de los antocianos entre ellos y con los
otros constituyentes del medio (copigmentacin) y la formacin de complejos con
los iones metlicos, se traducen en modificaciones del color.
Taninos
Bajo el nombre genrico de taninos se agrupan una serie de sustancias
fenlicas que pueden contener los vinos; se clasifican en hidrolizables y
condensados. Los primeros se basan en fenoles no flavonoides y generalmente se
encuentran en forma de steres, y los taninos condensados son polmeros ms o
menos complejos derivados de los 3-flavanoles, especialmente de la (+)-catequina,
y de la (-)-epicatequina. Estas molculas presentan la propiedad de liberar
antocianidinas, en medio cido y en caliente, de donde toman el nombre de
procianidinas o proantocinidinas.
Los taninos condensados ms sencillos son las procianidinas dmeras, que
se agrupan en dos categoras: procianidinas tipo A (C30H26O12) y las procianidinas
tipo B (C30H24O12), Figura 14. Del mismo modo tambin existen procianidinas
trmeras, agrupadas en los tipos C y D.
Figura 14.- Estructuras de procianidinas dmeras
26
MEN
SALIR
Otros taninos ms complejos son las procianidinas oligmeros, formados

por 3 a 10 unidades de flavanoles, as como las procianidinas condensadas,
formadas por ms de 10 unidades de flavanoles, alcanzando un peso molecular
superior a 3.000, o proantocianidoles.
En definitiva, las formas polmeras cuya estructura general viene dada en
la Figura 15, representan la mayor parte de los 3-flavanoles tanto de la uva como
de los otros vegetales.
R3
OH
HO
O
OH
R1
6
4
R2
OH
Figura 15.- Proantocianidoles de tipo B
Se localizan en el hollejo, especialmente en las capas externas de la

hipodermis, en forma libre dentro de las vacuolas de las clulas, o en forma
combinada, estando ligados a los polisacridos de las paredes celulares. Se
encuentran tambin de forma abundante en las pepitas, localizados en la envoltura
externa situada inmediatamente por debajo de la epidermis, y tambin en la
envoltura interna que rodea al albumen. La pulpa no contiene apenas taninos,
mientras que el raspn posee una buena cantidad de estas sustancias.
En general, los contenidos en flavanoles de las semillas son siempre
superiores a los de los hollejos, ya se trate de monmeros, oligmeros o de
polmeros.
27
MEN
SALIR
PARTE II: ANTECEDENTES BIBLIOGRFICOS PARA EL ANLISIS DE

RESVERATROL
La prctica totalidad de los mtodos encontrados en la bibliografa para el
anlisis de resveratrol y compuestos relacionados hacen uso de tcnicas
separativas, fundamentalmente cromatografa de lquidos de alta eficacia (LC),
cromatografa de gases (GC) y electroforesis capilar (CE).
As, estas tcnicas se han utilizado para analizar dichos compuestos en
muestras muy diversas tales como alimentos, entre ellos fundamentalmente
uvas21,66-71, cacahuetes79, 72, arndanos73 o chocolate32 o bien en hojas de parra74,
grnulos de lpulo75, 76 y plantas77-80 usadas con fines medicinales.
En general, en las etapas previas de aislamiento y limpieza se utilizan
diferentes tcnicas separativas tales como extraccin slido-lquido (SPE),
extraccin lquido-lquido (LLE) y extraccin con fluidos supercrticos (SFE), para
obtener finalmente una disolucin de resveratrol y los restantes compuestos de
inters que se analiza mediante cromatografa.
En cuanto a los mtodos encontrados para anlisis de estos compuestos
en vino, en la Tablas 2, 3 y 4, se recogen los antecedentes encontrados acerca de
los mtodos mediante cromatografa lquida, electroforesis capilar y cromatografa
de gases, respectivamente. En este ltimo caso la separacin se acopla
generalmente a la espectrometra de masas.
En cromatografa de lquidos se utiliza ms frecuentemente cromatografa
en fase inversa y los detectores usuales son el detector de serie de diodos (DAD),
el detector fluorescente (FLD) o el espectrmetro de masas (MS). Tambin se han
usado, en algunos casos, detectores electroqumicos (ECD).
28
MEN
SALIR
Tambin se encuentran algunos mtodos de cromatografa en capa fina,

en concreto el desarrollado por Chen et al81 que muestran la utilidad del anlisis de
resveratrol y piceido para distinguir rpidamente entre vinos naturales y falseados y
el de Kiraly-Veghely et al82 que utilizan cromatografa en placa a elevada presin y
encuentran mayores contenidos de piceido que de aglicona.
29
30
trans- y cisresveratrol y
piceido y otros
polifenoles
trans-resveratrol,
epicatequina y
catequina
cis y transresveratrol
Analito(s)
Sistema cromatogrfico: Columna;

F. Mvil; Sistema de Deteccin
ODS2 (35 C)
Gradiente de cido actico 6% a
agua:acetonitrilo:actico, 65:30:5
DAD (290 nm; barridos 250 a 600 nm)
FLD (exc/em = 300/392 nm; barridos
de emisin y excitacin)
MS (APCI, modo full scan) con elucin
isocrtica acetonitrilo:agua, 30:70
C18
Gradiente de acetonitrilo:
cido actico acuoso al 5%, 9:91 a
acetonitrilo:cido actico acuoso al
5%, 25:75
FLD (exc/em = 280/315nm, 10 min, y
324/370 nm en adelante)
ODS2 (35 C)
Gradiente de agua:acetonitrilo:cido
actico,
DAD (280 nm)
FLD ((exc/em = 300/392 nm)
85
84
Observaciones
Referencia
Muestra / Tratamiento
Estudio de los procesos de
transformacin fotoqumica con luz
UV de diferente y con luz solar
Transformacin cuantitativa de trans
83
en cis con irradiacin de 360 nm
Identificacin de otro fotoproducto no
ismero de resveratrol, de menor PM
Centrifugacin e inyeccin directa

Identificacin de analitos, por
comparacin de sus tR y espectros
UV en el pico con los de patrones
20 min por cromatograma
Aumento de la concentracin de los
tres desde el mosto hasta el vino
a
RSD intra-da e inter-da Inyeccin directa de la muestra
(n=6) entre 0.4 % y 4 % Cuantificacin de cis partir de la
LODb 0.02 gmL-1 para disminucin de trans
trans- y cis- resveratrol y
trans-piceido
Parmetros analticos
de calidad
Tabla 2.- Anlisis de resveratrol en vino y otras bebidas mediante cromatografa de lquidos
MEN
SALIR

C18
Compuestos
fenlicos: cidos Gradiente de 100 % A a 100 % B: A
fenlicos, estilbe- (cido frmico 0.5 % o cido fosfrico
nos (ismeros
0.1 %), B (A:acetonitrilo: agua,
trans y cis de
5:400:595). 0.7 mLmin-1.
resveratrol y
MS (Modo full scan); DAD (200-800
piceido), flavonm); FLD: ex/em 280/320, 260/400 (cisnoles como la
resve-ratrol y cis-piceido) y 300/390
quercetina
(trans-resve-ratrol y trans-piceido);
(aglicona y
ECD (integracin de voltamperograma
glucsido)
entre -1. y 1 V)
Polifenoles,
Fase inversa y elucin gradiente
antocianos y trans- DAD (280 y 520 nm polifenoles y
resveratrol
306 nm trans-resveratrol)
Derivados de res- Fase inversa y elucin gradiente
veratrol: resvera- DAD (310 nm para trans-ismeros y
trol y piceido,
286 nm para cis-ismeros)
ismeros
Analito(s)
31
88
87
Observaciones
Referencia
DAD y MS: Extraccin con acetato
de etilo, evaporacin a sequedad y
reconstitucin en metanol:agua
DAD, FLD y ECD: Filtrado del vino y
anlisis directo.
86
Contenido fenlico total por el
mtodo de Folin-Ciocalteu
Los dos ismeros de resveratrol y
piceido presentan propiedades
electroqumicas.
El contenido en trans-resveratrol
depende en gran medida de la
variedad y del ao de cosecha.
No se detecta ningn
Filtracin de las muestras e
derivado por debajo de 3 inyeccin directa en el sistema
ngmL-1
cromatogrfico
Contenido total de polifenoles por el
mtodo de Folin-Ciocalteu.
Capacidad antioxidante: TEAC-test
Parmetros analticos
de calidad
Tabla 2.- Anlisis de resveratrol en vino y otras bebidas mediante cromatografa de lquidos (continuacin)
MEN
SALIR
32

Compuestos
C18
fenlicos, entre
Gradiente de cido frmico en agua,
ellos trans y cispH 3 (A) y cido frmico en
resveratrol
acetonitrilo, pH 3 (B) a 0.2 mLmin-17
DAD (200- 600 nm. 305 y 285 nm para
trans- y cis-resveratrol,
respectivamente)
MS (ESI, SCAN m/z 50-700; modo SIM
trans-resveratrol C18 (40C)
Gradiente de agua:metanol, 5:5, a
agua:acetonitrilo, 7:3, 0.6 mLmin-1
DAD (308 y 288 nm)
trans-resveratrol Fase inversa columnas monolticas
Elucin isocrtica 30 % (cido actico
0.1 % en metanol) 70 % (cido
actico 0.1 % en agua) 5 mLmin-1
FLD ex/em 310/403 nm; DAD 310 nm
trans- y cis-resve- C18
ratrol
Gradiente de cido actico, pH 2.4 a
cido actico:acetonitrilo, 20:80, 1.5
mLmin-1
DAD (285 y 306 nm, para cis y trans)
Analito(s)
Observaciones
Vinos almacenados a 4 C en la
oscuridad. Botellas abiertas
inmediatamente antes del anlisis.
Filtrado e inyeccin directa de las
muestras
trans-resveratrol 0.32 4.44 y 0.12

2.80 gmL-1 en tintos y rosados,
respectivamente. cis-resveratrol 0.20
5.84 y 0.02 3.17 gmL-1 en
tintos y rosados, respectivamente
Recta de Calibrado entre Cantidades encontradas en vinos

tintos (0.352-1.99 gmL-1) mayores
0.5 y 16 gmL-1
que en blancos (5-570 ngmL-1)
Anlisis cualitativo de cis-resveratrol
Uvas
Rango lineal 0.11-2.75
Acoplamiento entre SPE con
gmL-1
sistemas de extraccin con lquidos
LOD 3 ngmL-1
c
-1
a presin (PLE)
LOQ 4 ngmL
Parmetros analticos
de calidad
LOD (S/N = 3) 1 y 4
ngmL-1 para trans- y cisresveratrol,
respectivamente
91
66
90
89
Referencia
MEN
SALIR

Estilbenos : C18
viniferina, transGradiente de cido actico en agua,
astringina, trans- pH 2.4 a cido actico en agua, pH
piceido, cis- y
2.4: acetonitrilo 20:80, 0.5 mLmin-1
trans-resveratrol y UV (280, 286, 306 y 321 nm)
-viniferina
20 compuestos
XDB-C8
fenlicos, entre
Gradiente de metanol y cido actico 1
ellos trans% DAD (306 nm para trans-resveratrol)
resveratrol
CLD (Ce(IV) rodamina 6G
compuesto fenlico en medio cido
sulfrico)
Ismeros cis y
C18 monoltica (Chromolith
trans de
Performance RP-18e)
resveratrol y
Gradiente de agua:cido actico, 94:6,
piceido
a agua:acetonitrilo:cido actico,
65:30:5, 7 mLmin-1
DAD (285 y 306 nm para cis- y transresveratrol, respectivamente)
trans- y cis- resve- Fase inversa
ratrol y piceido
Analito(s)
Estudia la influencia de la variedad

del la levadura en la concentracin
de los cuatro compuestos en vino
33
95
94
Observaciones
Referencia
Extraccin con acetato de etilo
limpieza con resina intercambiadora
de cationes y mediante
92
cromatografa de particin
(centrifugal partition chromatography) y HPLC semipreparativa
Inyeccin directa de muestras
filtradas
Deteccin CL altamente sensible
93
(LOD de 1 a 2 rdenes de magnitud
menores que los lmites en DAD)
trans-Resveratrol:
Rango lineal 0.03- 150
gmL-1
LOD (S/N=3) 84.7 y 6.6
ngmL-1 en DAD y CLD,
respectivamente
El empleo de una columna
LOD 32 y 34 ngmL-1 y
-1
LOQ 0.10 y 0.11 gmL monoltica implica bajas presiones y
para tran- y ciscortos tiempos de anlisis.
resveratrol,
respectivamente
Parmetros analticos
de calidad
LOD 0.2 gmL-1, 0.2
gmL-1 y 0.32 gmL-1
para trans-piceido, transy cis-resveratrol,
respectivamente
MEN
SALIR
Sistema cromatogrfico: Columna; Parmetros analticos

de calidad
34
cidos hidroxibenzoicos, cidos

hidroxicinmicos y
derivados, estilbenos (ismeros de
resveratrol y
piceido), alcoholes
fenlicos y compuestos relacionados, flavanoles
y flavonoles.
trans-resveratrol y
trans-piceido
cis- y trans- resve- Hypersil C18
ratrol y piceido
Gradiente lineal acetonitrilo- agua
DAD (288 y 306 nm para cis- y transismeros
Analito(s)
SPE
98
97
96
Observaciones
Referencia
Se sigue el patrn de evolucin de
estos compuestos en el vino durante
el envejecimiento en botella
MEN
SALIR
cis- y trans- resve- Fase inversa

ratrol y piceido
DAD

C8
Elucin isocrtica con methanol:agua
35:65, 1 mLmin-1
DAD (306 nm)
CLD (Eluato + luminol + K3Fe(CN)6)
Parmetros analticos
de calidad
trans-resveratrol
Linealidad 0.075-10
gmL-1 y 0.5-750
respectivamente.
LOD(S/N=3) 25 y 0.166
respectivamente.
cis- y trans-resve- C18
Linealidad 0.01-10
ratrol
Elucin isocrtica con 25 %
gmL-1 trans-resveratrol.
acetonitrilo, 0.1 % de H3PO4 y NaCl (5 LOD (S/N=3) menores de
30 y 100 ngmL-1 (306
mmolL-1), 1 mLmin-1
DAD (306 nm para ambos ismeros) nm) y 3 y 15 ngmL-1
ECD (electrodo de carbn vitrificado a (0.75 V) para trans- y cis+0.75 V)
resveratrol,
respectivamente.
Resveratrol total DAD (287 y 307 nm para cis- y transismeros)
Analito(s)
Hidrlisis enzimtica (-glucosidasa)

de resveratrol-glucsidos
SPE
Se encuentra del 82 al 91% de
resveratrol como glucsido en estos
vinos espaoles de uvas Monastrell.
Vino. Filtrado e inyeccin directa

Uvas y hojas. Maceracin con etanol
al 80%.
Equilibrio entre los dos ismeros tras
5 horas de exposicin a la luz del
da. Equilibrio no influenciado por la
temperatura
35
102
101
100
Observaciones
Referencia
Inyeccin directa de muestras
filtradas
Contiene una revisin importante de
99
mtodos entre 1996 y 2002.
Encuentra entre 0 y 1.607 gmL-1
en vinos tintos chinos
MEN
SALIR
36
Polifenoles
cis- y trans- resveratrol y piceido
cidos orgnicos y
polifenoles ((-)-epicatequina,
quercetina y
resveratrol)
Flavonoles,
antocianinas,
cidos fenlicos y
trans-resveratrol.
Screening de
polifenoles, entre
ellos transresveratrol
Analito(s)
ECD (deteccin coulomtrica

multielectrodo)
Fase inversa (en silica modificada con Linealidad resveratrol

grupos fenilo)
0.025-0.4 mgmL-1
Gradiente de cido trifluoactico al 0.2
% en agua y acetonitrilo. 1.5 mLmin-1
DAD a 210 y 280 nm
C18
Gradiente de cido actico al 5 % en
agua y acetonitrilo, 1 mLmin-1
DAD (313 nm para trans-resveratrol y
cidos fenlicos)

de calidad
Fase inversa
DAD - MS/MS
Estudian el efecto de distintos

mtodos de maceracin sobre la
concentracin de estos cuatro
estilbenos
107
106
105
104
Observaciones
Referencia
Pieles y pepitas de uvas blancas y
tintas
Se encuentran hasta 13 antocianos,
103
11 cidos hidroxibenzoicos e
hidroxicinmicos y 13 catequinas y
flavanoles, as como 2 estilbenos en
pieles y pepitas
MEN
SALIR
27 compuestos
fenlicos, incluyendo derivados
de los cidos benzoico y cinmico,
flavonas, y nuevos
glucsidos
relacionados
cis- y trans- resveratrol y piceido
Resveratrol,
piceido y
flavonoides.
Analito(s)
Hidrlisis con -glucosidasa para

liberacin de agliconas
contenidos de cis- y trans- resveratrol antes y despus de la hidrlisis
Resveratrol total 0.84-7.33 y 0.12-6
gmL-1 en vinos tintos y zumos,
respectivamente
Linealidad para los cuatro
ismeros 0.2-50 gmL-1
LOD 0.81, 1.20, 0.40 y
0.46 ng para cis- y transresveratrol y cis- y transpiceido, respectivamente
C18
Elucin isocrtica etanol:cido actico
al 0.05 %, 23:77, 1 mLmin-1
DAD a 306 nm
Deteccin electroqumica multicanal

con detector coulomtrico
Observaciones
Vinos experimentales de uvas
sometidas a diferentes tratamientos
con pesticidas
Contenido fenlico total por el
mtodo de Folin-Ciocalteu
Cerveza

de calidad
37
110
109
108
Referencia
MEN
SALIR
C18
Gradiente de agua y acetonitrilo
conteniendo ambos 1% de cido
actico, 0.6 mLmin-1
PDAD/API-MS
Fase inversa
Antocianos DAD (520 nm)
Estilbenos FLD (ex/em 330/374 nm)

de calidad
NMR
NMR/MS
38
Estilbenos (resve- DAD-MS/MS

ratrol, piceido,
piceatannol)
Antocianinas y
estilbenos (cis- y
trans- resveratrol y
piceido)
32 Polifenoles de
bajo peso
molecular, entre
ellos cis- y transresveratrol y
piceido
Estilbenos
(resveratrol)
Compuestos
aromticos, entre
ellos transresveratrol
Analito(s)
Influencia de diferentes tcnicas de

maceracin en el contenido en
estilbenos
Induccin de estilbenos mediante
irradiacin UV post-cosecha
Observaciones
Vino: preparacin de extracto
fenlico con acetato de etilo.
Cerveza: degasificacin y
concentracin a 2/3 del volumen
inicial
Zumo de uva: dilucin con agua
115
114
113
112
111
Referencia
MEN
SALIR
cis- y transresveratrol y
piceido
trans-resveratrol
Flavanoles,
antocianinas, y 6
derivados de
resveratrol: transastringina, trans- y
cis-piceido, transy cis-resveratrol y
pallidol (dmero de
resveratrol)
Analito(s)

C18
Gradiente de 1 % cido trifluoroactico
a acetonitrilo:1 %, cido trifluoroactico, 80:20, 1 mLmin-1
DAD (290 nm)
FLD (ex/em 290/390, 290/390, 260/400,
300/390, 260/400 y 260/400 nm para
trans-astringina, trans-piceido, cispiceido, trans-resveratrol, cisresveratrol y pallidol
C18
Gradiente de metanol : cido actico :
agua, 10:2:88 a metanol:cido actico
:agua 90:2:8, 1 mLmin-1
DAD (280 nm)
FLD ex/em 360/374 nm
ODS Hypersil
Elucin isocrtica, acetonitrilo:cido
frmico acuoso 0.5 %, 1 mLmin-1,
25:75
DAD (307 nm)
Parmetros analticos
de calidad
Linealidad 0.5-10, 0.1-10,
1-10, 0.5-10, 1-10 y 0.510 gmL-1 y
LOD (FLD) 0.01, 0.01,
0.03, 0.01, 0.02 y 0.02
gmL-1, para transastringina, trans-piceido,
cis-piceido, transresveratrol, cisresveratrol y pallidol
LOD en muestras reales
20 y 3 ngmL-1 en DAD y
FLD, respectivamente
Vinos, uvas, cacahuetes, manteca

de cacahuete y t
Uvas, cacahuetes y t contienen
fundamentalmente trans-piceido.
Vinos tintos son fuente de agliconas
SPE-C18
Nivel medio encontrado en vinos
tintos embotellados 2.89 gmL-1
39
29
117
Observaciones
Referencia
Filtrado e inyeccin directa de las
muestras
Se aportan por primera vez datos
sobre contenido de pallidol en vinos
tintos y no se encuentra en vinos
116
blancos
Contenidos de los ismeros de
resveratrol ms elevados en vinos
tintos
MEN
SALIR
40
Polifenoles,
incluyendo estilbenos como trans- y
cis-resveratrol
Resveratrol y
piceido
Columna monoltica C18

Gradiente de metanol:agua 2.5:97.5 a
50:50, pH 3 con H3PO4, 2.1 mLmin-1
DAD (256, 324 y 365 nm)
Observaciones
Primer informe sobre contenidos de
viniferina y pallidol en diferentes
tipos de vino
Vino, jugo de uva y jugo de

arndanos
Hidrlisis de vino con -Dglucosidasa, extraccin con acetato
de etilo, evaporacin y redisolucin
con metanol : agua
Filtracin e inyeccin directa de la
LOD (S/N=3) 10 y 30
-1
ngmL , para trans- y cis- muestra
resveratrol,
respectivamente.
La concentracin de piceido y
resveratrol en el vino y zumo de uva
depende del tiempo de extraccin de
la piel. Los niveles mayores se
encuentran en vinos tintos por estar
ms tiempo en contacto con la piel
durante la fermentacin
Mosto. Variabilidad en el contenido
de resveratrol segn el proceso de

de calidad
Oligmeros de es- DAD
tilbenos (viniferina
y pallidol) y
estilbina
Resveratrol total Hypersil ODS
Linealidad en el rango
Gradiente de metanol con cido fr0.52-2260 pmol de transmico al 0.5 % en agua,.0.25 mLmin-1 resveratrol
APCI-MS (SIM m/z 229)
Analito(s)
121
79
120
119
118
Referencia
MEN
SALIR
fermentacin
Polifenoles, entre
ellos, trans- y cisresveratrol y
piceido.
Linealidad 0.72-18
gmL-1
LOD 2 ngmL-1
trans-resveratrol
ODS-Hypersyl
Gradiente de cido perclrico (0.6
mLL-1) en agua y acetonitrilo, 1
mLmin-1
DAD a 310 nm
RP-18
Gradiente de cido actico al 1 y 6 %
en agua y cido actico : agua :
acetonitrilo, 5:65:30, 0.5 mLmin-1
DAD 280 y 313 nm
Linealidad transresveratrol 0.02-40

gmL-1

de calidad
Combinacin de NP-HPLC y RP-HPLC
trans-resveratrol y C18
otros polifenoles Gradiente de metanol : cido actico :
agua 10:2:88 a 90:2:8, 1 mLmin-1
DAD 280 nm
Resveratrol
Analito(s)
41
Observaciones
Referencia
Efecto de las condiciones
meteorolgicas y de maduracin en
122
la concentracin de resveratrol en
vinos tintos
Preparacin de muestra: mejores
resultados extrayendo con ter
etlico a pH 2
123
Valores medios de 2.26, 3.10 y 3.80
-1
gmL de trans-resveratrol en
vinos de Gran Canaria, Lanzarote y
Tenerife, respectivamente
SPE-C18: lavado a pH 8, elucin de
trans-resveratrol con acetato de etilo,
124
evaporacin y reconstitucin en
metanol
Niveles entre 0.55 y 2.534 gmL-1
Un pool de 14 polifenoles y 25 vinos
se someten a un test en fluidos
125
gstricos e intestinales. Se determina la concentracin de polifenoles
antes y despus del tratamiento
piceido
MEN
SALIR
42
Catequina, cido
vanllico, cido
sirngico,
epicatequina y
trans-resveratrol
C18
Gradiente de metanol : cido actico :
agua, 10:2:88 a 90:2:8, 1 mLmin-1
DAD 280 nm
FLD

Flavonoides y
Fase inversa
estilbenos (trans- y ESI-MS/MS
cis-resveratrol)
DAD (320 y 377 nm para estilbenos y
flavonoides, respectivamente)
FLD
cido glico,
ODS Hypersyl
trans-resveratrol, Gradiente entre cido actico, metanol
quercetina y rutina y agua
DAD (306 nm para trans-resveratrol)
trans- y cisC18
resveratrol y
gradiente de agua a pH 2.5 con cido
piceido
sulfrico y acetonitrilo, 0.2 mLmin-1
DAD (280 y 305 nm para cis y trans
respectivamente)
SIM a m/z 228
Analito(s)
129
Extraccin con ter etlico a pH 2
LOD 20 y 3 ngmL-1 en
DAD y FLD,
respectivamente
127
128
Filtrado e inyeccin directa de la

muestra
0.1 a 15 gmL-1
126
Referencia
LOD 1.202, 0.948, 2.558

y 0.834 gmL-1 para
trans- y cis-resveratrol en
MS y DAD
Observaciones
Deteccin fluorescente altamente
sensible para resveratrol
Parmetros analticos
de calidad
Linealidad 50 ngmL-1
50 gmL-1
MEN
SALIR
Compuestos
fenlicos con
propiedades
antioxidantes,
entre ellos transresveratrol
Resveratrol
Polifenoles
trans-resveratrol
Analito(s)
FLD exc/em 270/372 nm
C18 (40 C)
Gradiente de agua:acetonitrilo, 95:5 a
50:50, a pH 1.8, de 95:5 a 55:45.
DAD (280, 350 y 520 nm)

de calidad
C18
Elucin isocrtica agua:acetonitrilo
75:25 DAD a 306 nm
43
Observaciones
Referencia
Comparacin RP-HPLC-MS y
130
CE-MS
Niveles entre 0.82 y 5.75 gmL-1
Extractos etreos
Mayor eficacia de la separacin en
CE, pero mayor poder de elucidacin
131
estructural en LC. 22 compuestos
identificados mediante LC-MC y solo
13 mediante CE-MS
Vino y Uva. Inyeccin directa de
vinos y extractos de uva
Dado el bajo pH de la fase mvil, los
132
antocianos son detectados en forma
de catin flavilium y ello no refleja
su situacin en la muestra real
Transformacin de resveratrol en un
compuesto altamente fluorescente
con irradiacin ultravioleta intensa
133
con luz
En vino, generacin de un compuesto similar proveniente de piceido, as como uno desconocido, F-3.
MEN
SALIR
44
Estilbenoides
(trans-piceido,
trans-resveratrol,
trans-astringina,
cis-piceido, cisresveratrol)
C18 (30 C)
Gradiente de 100 % A (cido actico
en agua a pH 2.40) hasta 100 % B
(A:metanol 20:80).
DAD 286 nm.

trans- y cisODS-2
resveratrol,
Gradiente de acetonitrilo:cido actico
catequina,
al 5% de 9:91 a 70:30.
epicatequina,
DAD (280, 300 y 360 nm)
quercetina y rutina FLD (exc/em 280/315 para catequina y
epicatequina, 324/370 para transresveratrol y 260/370 para cisresveratrol)
Analito(s)
Observaciones
Referencia
Obtencin de cis-resveratrol por
irradiacin a 254 nm durante 20 min
de trans-resveratrol
Inyeccin directa de las muestras
Catequina y epicatequina presentes
en todos los vinos analizados,
niveles de la primera
134
considerablemente superiores
Altos niveles de quercetina en
muchas muestras, rutina se detecta
slo en mosto
Niveles de resveratrol menores que
los del resto de polifenoles, predominando siempre su forma trans
LOD (25 L): 8, 8, 5, 5 y Extraccin con acetato de etilo,
8 ng, para transevaporacin a sequedad y
astringina, cis-resveratrol, redisolucin en metanol-agua
135
trans-resveratrol, trans- Limpieza en resina intercambiadora
piceido y cis-piceido,
de cationes
respectivamente.
Parmetros analticos
de calidad
300 nm: LOD 0.06 y 0.21
gmL-1 para trans- y cisresveratrol
FLD: Rango de linealidad
de 0.01 1 y 0.01 0.1
gmL-1 y LOD de 3 y 1
ngmL-1 para trans- y cisresveratrol
MEN
SALIR
trans-resveratrol
piceido
Analito(s)
C18 (40 C)
Gradiente lineal de cido frmico 50
mM:metanol, 80:20, a cido frmico 50
mM:metanol, 20:80
FLD (exc/em 330/374 nm)

de calidad
C18 (40 C)
Gradiente de cido actico en agua y
acetonitrilo
45
Observaciones
Referencia
Muestras de jugo de uva blanca y
tinta. Inyeccin directa de la muestra
sin tratar
Obtencin de cis- ismeros por
exposicin de los trans- a la luz
solar. 90 % de conversin en 10 min
136
y cuantificacin de cis-ismeros
Niveles en jugos de uva tinta 10 veces superiores a los de uva blanca.
Cantidades de resveratrol como
glucsido superiores a las de
aglicona
Pieles de uva, jugo de uva y vino
Vino: SPE-C18
Concentraciones de trans-resveratrol
en vinos japoneses blancos
137
(Chardonnay) y tintos (Cabernet
Sauvignon) bajas, del orden de las
encontradas en vinos de las mismas
variedades, de California, Suiza,
Francia y Nueva York
MEN
SALIR
46

Diversas
C18
fitoalexinas de la Elucin en gradiente con acetonitrilo y
vid
agua, desde el 10 al 85 % de
acetonitrilo.
FLD a exc/em 330/374 nm para transresveratrol, trans-pterostilbeno y transH-viniferina.
DAD a 285 nm para cis-resveratrol
trans- y cisODS Hipersil.
Elucin en gradiente entre actico,
resveratrol y
piceido, catequina, metanol y agua, desde 5:15:80 hasta
epicatequina,
5:45:50.
DAD: 265, 280, 306, 317 y 369 nm.
quercetina y
rutina.
Analito(s)
Observaciones
Referencia
Cuantificacin de trans-piceido a
travs de la recta de calibrado de
trans-resveratrol, ya que ambos
compuestos presentan semejantes
138
propiedades fluorescentes
Cuantificacin de cis-piceido
utilizando la recta de calibrado de
cis-resveratrol a 285 nm
LOD oscilando entre 30 40 minutos por cromatograma.
ngmL-1 para transRecuperaciones en torno al 100 %
resveratrol y 1.5 gmL-1 para todos los analitos en vinos
para catequina (48, 75 y blanco, tinto y rosado
139
135 ngmL-1 para trans- Niveles estables una vez abierta la
piceido, cis-piceido y cis- botella durante una semana, pero
resveratrol,
prdidas que oscilan entre el 10 y el
respectivamente).
40 % a las seis semanas
Parmetros analticos
de calidad
MEN
SALIR
Ismeros de
resveratrol y
piceido
Ismeros de
resveratrol
trans- y cisresveratrol como

aglicona y
glucsido.
Analito(s)
ODS Hipersil (40 C).

Gradiente de agua:metanol, 100:0 a
0:100 en 15 minutos.
DAD (306 y 286 nm, mximos de
absorcin de trans- y cis-resveratrol,
respectivamente)
LOD (S/N = 3) de 0.6

molL-1 para ambos
analitos a 286 nm.

de calidad
C18.
Gradiente entre cido actico en agua
(pH 2.40):acetonitrilo
47
Observaciones
Referencia
Obtencin de cis-ismeros por
exposicin a la luz del sol de los
trans. Cuantificacin de los ismeros
de piceido asumiendo idnticos
que para trans- y cis-resveratrol a
140
306 y 285 nm, respectivamente
Anlisis de vinos tintos y rosados sin
tratamiento previo. Concentracin
por evaporacin de vinos blancos
para la cuantificacin de los cisismeros
Se comprueba la transformacin de
trans en cis-resveratrol por
irradiacin con luz UV a 254 nm
141
Se aportan valores de 288 nm y 308
nm de cis y trans
Isomerizacin de cis a la forma
trans- ms estable, en medio cido
Al igual que otros polifenoles, son
buenos marcadores quimiotaxa142
nmicos del vino, permitiendo la
distincin entre variedades de vino
blanco de diferentes D.O.y bodegas
MEN
SALIR
48
Ismeros de
resveratrol y
piceido
Resveratrol
trans-resveratrol
Analito(s)
Observaciones
Referencia
Se concluye que el secado de las
uvas no es una prctica que induzca
la sntesis de resveratrol
25
Niveles en vinos de uvas secas
(Recioto y Amarone) entre 0.05 y 0.8
mgL-1.
C18
Se estudia la influencia del proceso
Elucin isocrtica con agua:acetonitrilo
de vinificacin y el nivel de
55:45.
podredumbre por Botritis en la uva,
143
DAD (307 nm, trans-resveratrol), 280
sobre el contenido en resveratrol
nm, cis-resveratrol)
Vinos macerados presentan
cantidades10 superiores
C18 (40 C)
LOD y LOQ para trans- Obtencin de cis ismeros por
Gradiente de cido actico en agua
resveratrol 3 y 10 ngmL-1 exposicin de los trans a la luz solar.
(pH 2.40) y acetonitrilo
Produccin de estilbenoides en uva
DAD (306 nm, trans, y 285 nm, cis)
parece depender de la variedad,
posible control gentico de su
biosntesis
39
Elevados valores de la relacin
trans/cis, que apoyan al trans como
nico ismero natural naturalmente
es el, originndose el cis por
exposicin a la luz del mosto o vino

de calidad
C18
Elucin isocrtica con
agua:actico:acetonitrilo 75:5:20.
DAD (306 nm)
MEN
SALIR
49
Analito(s)
Sistema cromatogrfico: Columna; Parmetros analticos Observaciones
Referencia
de calidad
C18
Estudian los efectos de la irradiacin
Elucin en gradiente desde
de resveratrol y sus derivados en
Resveratrol
actico:agua 1:99, a actico:agua 6:94,
pieles de uva
144
y actico:agua:acetonitrilo 5:65:30.
En primer lugar se produce la
DAD (306 y 262 nm)
isomerizacin de trans a cis,
FLD (exc/em 270/372 nm)
generndose a continuacin
derivados altamente fluorescentes
Ismeros de
Lichrosphere 100 CN.
LOD 0.11 y 0.16 molL-1 Generacin de cis-resveratrol por
resveratrol y
Elucin isocrtica con
para trans-resveratrol y irradiacin de trans-resveratrol a 254
piceido
agua:actonitrilo:metanol , 90:5:5
piceido, respectivamente; nm durante 5-10 minutos
UVD (306 nm)
0.20 y 0.30 molL-1 para Cuantificacin de cis-resveratrol
cis-resveratrol y piceido, basada en la cada del trans
145
respectivamente.
Transformacin de cis en transresveratrol a 70 C durante 30
minutos
Identificacin de glucosidos
mediante hidrlisis enzimtica con glucosidasa
Resveratrol y
C18
Inyeccin directa de la muestra sin
piceido.
Gradiente de cido actico:agua 1:99,
tratamiento previo
a cido actico:agua 6:94, y cido
38
actico:agua:acetonitrilo 5:65:30.
DAD (entre 230 y 450 nm)
MEN
SALIR
50
Analito(s)
Sistema cromatogrfico: Columna; Parmetros analticos Observaciones
Referencia
de calidad
trans-resveratrol y C18
No es necesario tratamiento previo
trans-pterostilbeno Gradiente de metanol:cido frmico
de la muestra de vino, gracias a la
146
DAD (305.6 y 306.4 nm para
especificidad de la FLD
resveratrol y pterostilbeno)
FLD (exc/em 330/374 nm para ambos)
Piceido
Describen el primer procedimiento
de extraccin de piceido de P.
37
Cuspidatum
trans-resveratrol C18
trans-resveratrol sintetizado
Elucin con: A (cido fosfrico 0.2 M a
Vino: preconcentracin en el
pH 1.5 por adicin de amoniaco) y B
rotavapor, limpieza con cloroformo,
(A:acetonitrilo 20:80), al 23.5 % B.
extraccin con acetato de etilo,
42
DAD a 306, 316, 280 y 250 nm.
lavado con agua saturada en cloruro
sdico. La fase orgnica es
evaporada a sequedad y se
redisuelve en agua:acetonitrilo 1:1
Resveratrol
Columna de slice Lichrosorb.
Vino: Extraccin con acetato de etilo,
Elucin isocrtica con metanol:cloruro
se renen los extractos orgnicos y
de metileno 3:97.
se lavado con agua destilada.
34
Evaporacin a sequedad se
redisuelve en metanol.
MEN
SALIR
Desviacin estndar relativa; b Lmite de deteccin; c Lmite de cuantificacin
Sistema electrofortico: Modalidad; Parmetros analticos

Inyeccin; Deteccin
de calidad
trans- y cisCromatografa electrocintica micelar.
resveratrol
Inyeccin electrocintica (2 kV; 5s)
306 nm
Resveratrol
CZE.
Inyeccin hidrodinmica (4 s; 50 mbar)
305 nm
trans-resveratrol, Deteccin electroqumica.
(-)-epicatequina y Electrodo de disco de carbn a +0.85
(+)-catequina
V
Resveratrol y
CZE
piceido
Polifenoles, entre NACE.
LOD 2.5 molL-1
ellos, resveratrol Capilares recubiertos a elevado pH y resveratrol
metanol
UV (214 y 223 nm)
Polifenoles, entre CZE
LOD 18 y 50 ngmL-1 paellos trans- y cis- DAD
ra cis- y trans-resveratrol
resveratrol
Analito(s)
Tabla 3.- Anlisis de resveratrol mediante electroforesis capilar
SPE
Valores de pKa de resveratrol 9.22,
10.55, 11.16
Optimizacin del proceso SPE

mediante redes neuronales
artificiales y diseo de experimentos
Observaciones
51
152
151
150
149
148
147
Referencia
MEN
SALIR
Ultra-low-temperature NACE-77K FLD
NACE-77K
FLD
trans- y cisresveratrol
52
Parmetros analticos
de calidad
LOD 0.04 gmL-1 transresveratrol.
Inyeccin electrocintica (10 kV; 6s)

Rango lineal 0.5-100
Deteccin electroqumica. Electrodo de gmL-1
disco de carbn a +0.85 V
LOD 59.6 ngmL-1
DAD
Sistema electrofortico: Modalidad;

Inyeccin; Deteccin
CZE
DAD a 305 nm
Resveratrol y
piceido
trans-resveratrol
trans-resveratrol
trans-resveratrol
y cido srbico
Analito(s)
Tabla 3.- Anlisis de resveratrol mediante electroforesis capilar (continuacin)
Determinacin mediante CE, sntesis

y estabilidad de resveratrol y piceido
Identificacin on-line de los
fotoproductos de trans-resveratrol.
Se propone un esquema de
fotorreaccin para resveratrol similar
al de estilbeno:
trans-resveratrol cis-resveratrol
2,4,6-trihidroxifenantreno
Incluye estudio de fotoestabilidad de
resveratrol
157
156
155
154
Observaciones
Referencia
SPE-C18 para resveratrol e inyeccin directa para cido srbico
Utiliza la misma recta de calibrado
153
de trans-resveratrol para cisresveratrol, dividiendo la pendiente
entre la razn de los coeficientes de
absorcin trans/cis a 305 nm (2.69)
MEN
SALIR
trans-resveratrol
trans-resveratrol
Resveratrol total
libre
Analito(s)

Caractersticas; In para deteccin
HP Innowax (30 m x 0.25 mm x 0.25
m)
Metano como gas portador. Analizador
de trampa de iones. Para la cuantificacin se selecciona el in m/z 135
HP-5MS (30 m x 0.25 mm x 0.25 m)
Helio como gas portador. Gradiente de
temperatura desde 100 hasta 300 C.
Ionizacin mediante impacto
electrnico. Se trabaja en modo full
scan en un intervalo de m/z entre 35 a
550 amu
HP-5MS (30 m x 0.25 mm x 0.25 m)
Helio como gas portador. Ionizacin
mediante impacto electrnico. Se
trabaja en modo SIM. Gradiente de
temperatura desde 110 hasta 300 C,
seleccionando para cuantificar el in
de masa molecular 444 y para identificar los iones de masa 443 y 446.
Linealidad entre 10
pgmL-1 y 1 gmL-1
LOD: 5 pgmL-1
Linealidad entre 0.02

2.0 gmL-1
Parmetros analticos
de calidad
Linealidad entre 12.5 y
250 gmL-1
Tabla 4.- Anlisis de resveratrol en vino y otras bebidas mediante cromatografa de gases-masas
53
Observaciones
Referencia
5 mL de vino se diluyen con agua
(1:3) y la disolucin se pasa por un
158
cartucho C18. El resveratrol se eluye
con metanol. El contenido en vinos
oscila entre 11.8 y 17.2 mg.L-1
Microextraccin en fase slida
realizando posteriormente, y en la
misma fibra, una derivatizacin con
159
bis-[trimetilsilil]-trifluoro-acetamida o
con anhdrido actico
Se realiza una comparacin con
cromatografa bidimensional
Microextraccin en fase slida
realizando posteriormente, y en la
misma fibra, una sililazin con bis[trimetilsilil]-trifluoro-acetamida. La
160
desorcin se realiza a 280 C
durante 7 min
MEN
SALIR
54
trans-resveratrol
trans-resveratrol
Analito(s)
DB-17(15 m x 0.25 mm x0.15 m)

Gradiente de 150 hasta 305 C.
Detector de masas de cuadrupolo. Los
datos se adquieren en modo SIM (in
de masa molecular 228) iones de
masa 227 y 229 para identificar
DB-5 (30 m x 0.25 mm x 0.25 m)
Detector de masas de cuadrupolo.
Gradiente de temperatura desde 150
hasta 305 C. Se selecciona para
cuantificar el in de masa molecular
228.

Caractersticas; In para deteccin
DB-5HT (30 m x 0.25 mm x 0.10 m)
Gradiente de 110 hasta 300 C. SIM,
(in de masa molecular 444); iones de
masa 445 y 446 para identificar.
DB-5
Gradiente de temperatura desde 190
hasta 315 C. Para cuantificar in de
masa molecular 228, iones cualitativos
de 229 y 227 de masa.
Linealidad hasta 10
gmL-1
LOD: 0.05 gmL-1
LOD: 10 ngmL-1
Linealidad hasta 10
gmL-1
Parmetros analticos
de calidad
LOD: 10 ngmL-1
SPE-C18, elucin con acetato de

etilo e introduccin directa del
extracto en el cromatgrafo (1l del
1er ml eluido)
43
Observaciones
Referencia
SPE-C18, elucin con acetato de etilo y evaporacin a sequedad. Deri161
vatizacin con bis-[trimetilsilil]-trifluoo-acetamida a 70 C durante 60 min
extracto en el cromatgrafo. Se ana162
lizan vinos de los principales pases
productores. El contenido en vinos
blancos es inferior a 0.1 g.mL-1
extracto en el cromatgrafo
45
Tiempos de retencin de cis y trans:
4.3 y 5.7 min respectivamente
Tabla 4.- Anlisis de resveratrol en vino y otras bebidas mediante cromatografa de gases-masas (continuacin)
MEN
SALIR
MEN
SALIR
APARATOS, REACTIVOS Y SOFTWARE UTILIZADOS EN ESTE TRABAJO DE

INVESTIGACIN
Se recoge a continuacin el instrumental, as como los reactivos,
disoluciones y los programas informticos, utilizados para la realizacin de esta
memoria
a) Aparatos
Espectrofluormetro Perkin Elmer, LS-50B, equipado con una
lmpara de descarga de Xenon equivalente a 20 KW durante 8 s
de duracin y conectado a travs de una interfase RS-232 a un PC
IBM PS/2. La adquisicin de datos se lleva a cabo con el software
de Perkin-Elmer Fluorescence Data Manager, versin 2.70.
Espectrofluormetro Varian, Modelo Cary Elipse equipado con
una lmpara contina de Xenon. Est conectado a un PC va una
interfase IEE. El paquete de sofware Cary Eclipse Versin 1.0 se
utiliz para la adquisicin e interpretacin de datos.
Espectrofotmetro UV-Visible Varian, modelo Cary 50 Bio con
lmpara de Xenon, ordenador DELL Optiplex GX 280, Intel
Pentium 4 incorporado y software propio de Varian
Cromatgrafo Agilent 1100 Series (Agilent Technologies Inc.,
Palo Alto, CA, USA) compuesto por una bomba cuaternaria Agilent,
un desgasificador de disolventes G1322A Agilent, un detector de
fotodiodos G1315B Agilent UV-Vis, y un detector fluorescente
55
MEN
SALIR
G1321A Agilent. El sistema cromatogrfico est controlado por el

HP ChemStation para LC 3D software (Agilent Technologies Inc.).
Cromatgrafo Agilent 1100 Series (Agilent Technologies,
Waldbronn, Alemania) equipado con un inyector automtico
termostatizado a 6 C y un espectromtro de masas de trampa
inica (MSD XCT) conectados a travs de una interfase de
ionizacin mediante electrospray (ESI). Se realiza un barrido desde
m/z 100 hasta 2200, con una velocidad de 27000 amu/s
Potenciostato Autolab PSTAT 10 y stand Metrohm 663VA
dotado de una celda con tres electrodos, uno de Ag/AgCl
(electrodo de referencia), otro de platino (electrodo auxiliar) y el
tercero de carbn vitrificado (electrodo de trabajo, Metrohm
6.1204.040), estando controlado todo el sistema por un PC 486/66
MHz, equipado con el paquete de software GPES 3.4.
Espectrmetro de resonancia magntica nuclear Broker AM 400
(400 MHz para protones y 100 MHz para 13C).
pH-metro Crison 2001 con electrodo combinado de vidriocalomelanos saturado.
Lmpara de mercurio HBO Osram de 200 W, con una fuente de
energa Oriel, modelo 8500, protegida con una carcasa metlica.
56
MEN
SALIR
Fotoreactor (Softron, Gynkotek HPLC, Alemania), equipado con

una lmpara de Xenon de 4 W y un tubo de tefln enrollado
alrededor.
Bao termosttico Frigiterm 6000382, marca p-Selecta
Balanza analtica ER-60A, marca AND, con una sensibilidad de
0.1 mg.
Sistema de obtencin de agua ultrapura, Milli-Q equipado con un
mdulo RIOs/Elix y un A-10.
b) Reactivos
trans-Resveratrol (3,4' ,5-trihidroxi-trans-estilbeno), suministrado
por Sigma-Aldrich; nmero CAS: 501-36-0.
trans-Piceido
(3,4',5-trihidroxiestilbeno-3--D-glucopiranosa)
suministrado por Aldrich Chem Co; nmero CAS: 65914-17-2.

Fenantreno 98%, suministrado por Aldrich Chem .
trans-Estilbeno, suministrado por Aldrich Chem .
cis-Estilbeno, suministrado por Aldrich Chem.
cido glico, suministrado por Sigma-Aldrich.
cido p-cumrico, suministrado por Sigma-Aldrich.
cido eglico, suministrado por Sigma-Aldrich.
cido ferlico, suministrado por Sigma-Aldrich.
Quercetina, suministrado por Sigma-Aldrich.
Rutina, suministrado por Sigma-Aldrich.
57
MEN
SALIR
Catequina, suministrado por Sigma-Aldrich.

Epicatequina, suministrado por Sigma-Aldrich.
cido vanillico, sumistrado por Fluka.
cido cafeco, sumistrado por Fluka.
cido sinpico, sumistrado por Fluka.
Tartrato disdico dihidratado, suministrado por Scharlau.
Perclorato sdico monohidratado, suministrado por Merck.
cido perclrico 70%, suministrado por Merck.
cido fosfrico suministrado por Panreac.
cido clorhdrico, suministrado por Panreac.
Reactivo de Folin-Ciocalteu, suministrado por Panreac.
c) Disoluciones
Disolucin etnolica de trans-resveratrol de 100 g.mL-1,
conservada en la obscuridad y a 4 C.
Disolucin etnolica de trans-piceido de 100 g.mL-1,
conservada en la obscuridad y a 4 C.
Disolucin reguladora tartrato monosdico/ tartrato disdico, de
pH 5.0, preparada a partir de la sal disdica dihidratada (0.26 M) y
aadiendo HCl hasta conseguir el pH deseado.
d) Disolventes
Etanol, suministrado por Panreac (Espaa).
N,N-Dimetilformamida, suministrado por Panreac (Espaa).
Dimetilsulfxido, suministrado por Panreac (Espaa).
58
MEN
SALIR
Cloroformo, suministrado por Panreac (Espaa).

Metanol, suministrado por Panreac (Espaa).
Acetonitrilo, grado HPLC , suministrado por Merck (Alemania).
ter dietlico, grado HPLC, suministrado por Merck (Alemania).
Acetato de etilo, suministrado por Panreac (Espaa).
Hexano, grado HPLC, suministrado por Merck (Alemania).
e) Programas informticos
Grapher 3.0, 2-D Graphing System. Golden Software Inc.
Colorado, Usa 2001
PLS Toolbox (Eigenvector Research Inc., WA, USA)
MATLAB ver. 7.1.0; The MathWorks Inc., MA, USA.
Software THE UNSCRAMBLER Versin 6.11 (Camo A/S Olav
Tryggvasonsgt N-7011, Trondheim, Norway), utilizado tanto para el
diseo de experimentos, permitiendo la optimizacin a travs de
las superficies de respuesta como para el tratamiento de datos
multivariantes, permitiendo entre otros mtodos aplicar Anlisis de
Componentes Principales (PCA) con fines clasificatorios.
ACOC V 2.0 163: Herramienta estadstica para Qumica Analtica
en entorno MATLAB 5.3, programa realizado en el Departamento
de Qumica Analtica de la UEX que permite realizar todos los
clculos de la calibracin univariante, calcular los distintos
59
MEN
SALIR
parmetros estadsticos y de calidad de las rectas de calibrado, as

como para aplicar diversos test de comparacin.
HyperChem versin 7.5 para Windows. Molecular modeling
system. 2002, Hypercube, inc.
60
MEN
SALIR
Bibliografa
1
J. Gorham The Stilbenoids en Progress in Phytochemistry; L. Reinhold, J.B. Harborne,
T. Swain Eds.; Pergamon Press, Oxford UK 203 (1980).

2
www.biologie.uni-freiburg.de/data/bio2/schoroeder/Resveratrol
Moreno-Maas M., Pleixats R., Anal. Quim., 1985, 81:157-161
Takaoka M. J., J. Faculty Sci. Hokkaido Imperial U, 1940, 3:1-16
Vastano B.C., Chen Y., Zhu N., Ho C.T., Zhou Z., Rosen R.T., J. Agric. Food Chem.,
2000, 48:253-256
6
Lee S.K., Mbwambo Z.H., Chung H., Luyengi L., Gamez E.J., Mehta R.G., Kinghorn A. D.,
Pezzuto J.M., Comb. Chem. HighThroughput Screen, 1998, 1:35-46

7
Cichewicz R.H., Kouzi S.A., J. Nat. Prod. Chem., 2002, 26:507-579
Langcake P., Price R.J., Physiol. Plant Pathol. 1976, 9:77-86
Hahn M.G., Ann. Rev. Phytopathol., 1996, 34:387-412
10
Keen N.T., Plant Mol. Biol. 1992, 19:09-122
11
Sticher L., Mauch-Mani B., Mtraux J. P., Annu. Rev. Phytopathol., 1997, 35:325-370
12
Osbourn A.E., Fungal Genet. Biol., 1999, 26:163-168
13
Kuc J., Ann. Rev. Phytopathol. 1995, 33:275-297
14
Stein U., Hoos G., Vitis, 1984, 23:179-194
15
Dercks W., Creasy L.L., Physiol. Mol. Plant Pathol., 1989, 34:189-202
16
Hoos G., Blaich R., J. Phytopathol., 1990, 129:102-110
17
Sarig P., Zutkhi Y., Monjauze A., Lisker N., Ben-Arie R., Phys& Mol. Plant Pathol., 1997,
50:337-347
18
Adrian M., Jeandet P., Bessis R., Joubert J. M., J. Agric. Food Chem. 1996, 44:1979-
1981
19
Schubert R., Fischer R., Hain R., Schreier R., Bahnweg G., Ernst D., Sandermann H.,
Plant. Mol. Biol., 1997, 34:417-426

20
21
Hrazdina G., Parsons G.F., Mattick L.R., Am. J. Enol. Vitic., 1985, 35:220-227
Hain R., Reif H.J., Krause E., Langebartels R., Kindl H., Vornam B., Wiese W.,
Schmelzer E., Schreier H., Stocker R. H., Nature, 1993, 361:153-156

22
Cantos E., Espn J.C., Toms-Barbern A., J. Agric. Food Chem., 2001, 49:5052-5058
61
MEN
SALIR
23
Cantos E., Espn J.C., Toms-Barbern A., J. Agric. Food Chem., 2002, 50:6322-6329
Cantos E., Espn J.C., Fernndez M.J., Oliva J., Toms-Barbern F., J. Agric.Food
24
Chem., 2003 51:12081214

25
Celotti E., Ferrarini R., Zironi R., Conte L. S., J. Chromatogr. A, 1996, 730:47-52
26
Creasy L.L., Coffee M., J. Am. Soc. Hortic. Sci., 1988, 113:230-234
27
Chen R.S., Wu P.L., Chiou R. Y., J. Agric. Food Chem., 2002, 50:1665-1667
28
Sobolev V.S., Cole R.J., J. Agric. Food Chem., 1999, 47:1435-1439
29
Burns J., Yokota T., Ashihara H., Lean M.E., Crozier A., J. Agric. Food Chem., 2002,
50:3337-3340
30
Hanawa F., Tahara S., Mizutani J., Phytochemistry, 1992, 31:3005-3007
31
Chung M.I., Teng C.M., Cheng K.L., Ko F.N., Lin C.N., Planta Med., 1992, 58:274-276
32
Kumar R.J., Jyostna D., Krupadanam G.L., Srimannarayana G., Phytochemistry, 1988,
27:3625-3626
33
Counet C., Callemien D., Collin S., Food Chem., 2006, 98:649-657
34
Siemann E.H., Creasy L.L., Am. J. Enol. Vitic., 1992, 43:49-52
35
Jaendet P., Bessis R., Maume B.F., Meunier P., Trollat P., J. Agric. Food Chem., 1995,
43:316-319
36
Jeandet P., Bessis R., Maume B.F., Sbagui M., J. Wine Res., 1993, 4:79-85
37
Waterhouse A.L., Lamuela-Ravents R.M., Phytochemistry, 1994, 37:571-573
38
Roggero J.P., Archier P., Sciences des Aliments, 1994, 14:99-107
39
Lamuela Ravents R.M., Romero Prez A.I., Waterhouse A.L., de la Torre Boronat M.C.,
J. Agric. Food Chem., 1995, 43:281-283

40
Romero Prez A.I., Lamuela Ravents R.M., Waterhouse A.L. de la Torre Boronat M.C.,
J. Agric. Food Chem., 1996, 44 :2124-2128

41
Frmont L., Life Sciences, 2000, 66:663-673
42
Lamuela-Ravents R.M., Waterhouse A.L., J. Agric. Food Chem., 1993, 41:521-523
43
Goldberg D.M., Yan J., Diamandis E.P., Karumanchiri A., Soleas G., Waterhouse A.L.,
Anal. Chem., 1994, 66:3959-3963

44
McMurtrey K.D., Minn J., Pobanz K., Schultz T.P., J. Agric. Food Chem., 1994, 42:2077-
2080
62
MEN
SALIR
45
Goldberg D.M., Karumanchiri A., Ng E., Yan J., Diamandis E.P., Soleas G.J., J. Agric.
Food Chem., 1995 43:1245-1250

46
Lamikanra O., Grimm C.C., Rodin J.B., Inyang I.D., J. Agric. Food Chem. 1996, 44:1111-
1115
47
Sato M., Suzuki Y., Okuda T., Yokotsuka K., Biosci. Biotech. Biochem., 1997, 61:1800-
1805
48
Chu Q.Y., Dwyer M.O., Zeece M.G., J. Agric. Food Chem., 1998, 46:509-513
49
Pervaiz S., FASEB J., 2003, 17:1975-1985
50
Frankel E.N., Waterhouse A.L., Kinsella J.E., Lancet, 1993, 341:1103-1104
51
Belguendouz L., Fremont L., Linard A., Biochem. Pharmacol., 1997, 53:1346-1355
52
Urp Sard M., Juregui O., Lamuela Ravents R.M., Jaeger W., Miksits M., Cobas M.I.,
Andrs Lacueva C., Anal. Chem., 2005, 77:3149-3155

53
Kimura Y., Okuda H., Arichi S., Biochim. Biophys. Acta, 1985, 834:275-278
54
Kimura Y., Ohminami H., Okuda H., Baba K., Kozawa M., Planta Med., 1983, 49:51-54
55
Baur J.A., Pearson K.J., Price N.L., Jamieson H.A., Lerin C., Kalra A., Prabhu V.V.,
Allard J.S., Lpez-Lluch G., Lewis K., Pistell P.J., Poosala S., Becker K.G., Boss O., Gwinn
D., Wang M., Ramaswamy S., Fishbein K.W., Spencer R.G., Lakatta E.G., Le Couteur D.,
Shaw R. J., Navas, P., Puigserver P., Ingram D.K., de Cabo R., Sinclair D.A., Nature, 2006,
444:337-342
56
Chantavitayapongs S., Draczynska Lusiak B., Sun A.Y., Neuroreport, 1997, 8:1499-1502
57
Shin N.H., Ryu S.Y., Lee H., Min K.R., Kim Y., Planta Medica, 1998, 64:283-284
58
Giovannini L., Migliori M., Longoni B.M., Das D.K., Bertelli A.A., Panichi V., Filippi C.,
Bertelli A., J. Cardiovascular Pharm., 2001, 37:262-270

59
Jang M., Cai L., Udeani G.O., Slowing K.V., Thomas C.F., Beecher C.W.W., Fong
H.H.S., Farnsworth N.R., Kinghorn A.D., Mehta R.G., Moon R.C., Pezzuto J.M., Science,
1997, 275:218-220
60
Mgbonyebi O.P., Russo J., Russo I.H., Int. J. Oncol., 1998, 12:865-869
61
Jayatilake G.S., Jayasuriya H., Lee E.S., Koonchanok N.M., Geahlen R.L., Ashendel
C.L., McLaughlin J.L., Chang C.J., J. Nat. Prod., 1993, 56:1805-1810
63
MEN
SALIR
Bertelli A.A.E., Giovannini L., De Caterina F., Miglioni M., Bernini W., Fregoni M.,
62
Bavaresco J., Trevisan M., Antiplatelet Activity of cis-resveratrol; Feuillet Bleu 25; Office
International de la Vigne et du Vin: Paris, France, 1996
63
Mrillon J.M., Fauconneau B., Waffo P., Barrier L., Decendit A., Huguet F., Antioxidant
activity of wine phenolic compounds in hinhibiting oxidation of human low-density

lipoproteins. Presented at the 18th International Conference on Polyphenols; Polyphenols
Communications 96, Bordeaux (France), July, 1996
64
Arichi H., Kimura Y., Okuda H., Baba K., Kozawa M., Arichi S., Chem. Pharm. Bull. 1982,
30:1766-1770
65
Hackett A.M., The metabolism of flavonoid compounds in mammals. En Plant Flavonoids
in Biology and Medicine; Cody V., Middleton E., Harborne J. B., Eds.; Liss: New York,
1986; pp 177-194
66
Pieiro Z., Palma M., Barroso C.G., J. Chromatogr. A, 2006, 1110:61-65
67
Chafer A., Pascual-Marti M.C., Salvador A., Berna A., J. Sep. Sci., 2005, 28:2050-2056
68
Roldn A., Palacios V., Caro I., Prez L., J. Agric. Food Chem., 2003, 51:1464-1468
69
Cantos E., Espn J.C., Toms-Barbern F.A., Agric. Food Chem,. 2002, 50:5691-5696
70
Schmandke H., Ernhrungs-Umschau, 2002, 49:349-352
71
Romero-Prez A.I., Lamuela-Ravents R.M., Andrs-Lacueva C., de la Torre-Boronat,
M.C., J. Agric. Food Chem, 2001, 49:210-215

72
Rudolf J.L., Resurreccion A.V.A., Food Chem., 2005, 89:623-638
73
Lyons M., Chongwoo Y., Toma R., Cho S., Reiboldt W., Lee J., van Breemen R., J. Agric.
Food Chem., 2003, 51:5867-5870

Jimnez Snchez J.B., Crespo Corral E., Santos Delgado M.J., Orea J.M., Gonzlez
74
Urea A., J. Chromatogr. A, 2005, 1074 :133-138

75
Jerkovik V., Callemien D., Collin S., J. Agric. Food Chem., 2005, 53:4202-4206
76
Callemien D., Jerkovic V., Rozenberg R., Collin S., J. Agric. Food Chem., 2005, 53:424-
429
77
Jandera P., kekov V., ehov L., Hjek T., Baldrinov L., kopov G., Kellner V.,
Horna A., J. Sep. Sci., 2005, 28 :1005-1022

78
Zhao R.Z., Shaojun L., Zhou Li-Lin, Chromatographia, 2005, 61: 311-314
64
MEN
SALIR
79
Yang F., Zhang T., Ito Y., J. Chromatogr. A , 2001, 919:443-448
80
Chen L., Han Y., Yang F., Zhang T., J. Chromatogr. A, 2001, 907:343-346
81
Chen M., Shu Y.Q., He J.G., Chinese J. Anal. Chem., 2005, 33:635-638
82
Kiraly-Veghely Z., Katay G., Tyihak E., Merillon J.M., J. Planar Chromatogr., 2004, 17:4-8
83
Lpez-Hernndez J., Paseiro-Losada P., Sanches-Silva A., Lage-Yusty, M.A., Eur Food
Res. Technol., 2008 D.O.I. 10.1007/s00217-006-0483-x

84
Gurbuz O., Gomen D., Dagdelen F., Gursoy M., Aydin S., Sahin I., Buyukuysal L., Usta
M., Food Chem., 2007, 100:518-525

85
Rodrguez-Bernaldo de Quirs A., Lpez-Hernndez J., Feraces-Casais P., Lage-Yusty,
M.A., J. Sep. Sci., 2007, 30:1262-1266

86
Bravo M.N., Silva S., Coelho A.V., Vilas Bolas L., Bronze M.R., Anal. Chim. Acta, 2006,
563:84-92
Nikfardjam M.S.P., Mark, L., Avar, P., Figler, M., Ohmacht, R., Food Chem., 2006,
87
98:453-462
88
Nikfardjam M.S.P., Laszlo G., Dietrich H., Food Chem., 2006, 96:74-79
89
Loredana La Torre G., Saitta M., Vilasi F., Pellicano T., Dugo G., Food Chem., 2006,
94:640-650
Gerogiannaki-Christopoulou M., Athanasopoulo P., Kyriakidis N., Gerogiannaki I.A.,
90
Spanos M., Food Control , 2006, 17:700-706

91
Abril M., Negueruela A. I., Prez C., Juan T., Estopan G., Food Chem., 2005, 92:729-
736
92
Vitrac X., Bornet A., Vanderlinde R., Valls J., Richard T., Delaunay J.C., Mrillon J.M.,
Teissdre P.L., J. Agric. Food Chem., 2005, 53 :5664-5669

93
Zhang Q., Cui H., Aung M., Lian M., Liu L., J. Chromatogr. A, 2005, 1095 :94-101
94
Abert Vian M., Tomao V., Gallet S., Coulomb P.O., Lacombe J.M., J. Chromatogr. A,
2005, 1085 :224-229

95
Clare S.S., Skurray G.R., Shalliker R.A., Australian J. Grape and Wine Res., 200, 11:9-
14
96
Monagas M., Bartolome B., Gmez-Cordoves C., European Food Res. Tech., 2004,
220:331-340
65
MEN
SALIR
97
Mark L., Nikfardjam M.S.P., Avar P., Ohmacht R., J. Chromatogr. Sci., 2005, 43:445-449
98
Qin S., Min C., Yun D.Q., Feng L., Chinese J. Chromatog., 2005, 23:88-91
99
Zhou J., Cui H., Wan G., Xu H., Pang Y., Duan C., Food Chem., 2004, 88:613-620
100
Kolouchov Hanzlkov I., Melzoch K., Filip V., Smidrkal J., Food Chem., 2004, 87:151-
158
101
Loredana La Torre G., Lagan G., Bellocco E., Vilasi F., Salvo F., Dugo G., Food
Chem., 2004, 85:259-266

102
Moreno Labanda J.F., Mallavia R., Perez-Fons L., Lizama V., Saura D., Micol V., J.
Agric. Food Chem., 2004, 52:5396-5403

103
Kammerer D., Claus A., Carle R., Scheiber A., J. Agric. Food Chem., 2004, 52:4360-
4367
104
Kerem Z., Bravdo B., Shoseyov O., Tugendhaft Y., J. Chromatogr. A, 2004, 1052:211-
215
105
Gambelli L., Santaroni G.P., J. Food Comp. Anal., 2004, 17:613-618
106
Clare, S.S., Skurray, G. Shalliker, R.A., Am. J. Enol. Vitic., 2004, 55:401-406
107
Skerikova V., Grynova L., landera P., Chem. List., 2004, 98:343-348
108
Dugo G., Saitta M., Giuffrida D., Vilasi F., La Torre G.L., Italian J. Food Sci., 2004,
16:305-321
109
Rehova L., Skerkova V., Jandera P., J. Sep. Sci., 2004, 27:1345-1359
110
Xiaoging Z., Jiang Y., Zhiuru X., Chinese J. Chromatog., 2004, 22:424-427
111
Gil A.M., Duarte I.F., Godejohann M., Braumann U., Maraschin M., Sprau M., Anal.
Chim. Acta, 2003, 488:35-51

112
Ali A., Strommer J.N., J. Agric. Food Chem., 2003, 51:7246-7251
113
Pozo Bayn M., Hernndez, M., Martn-lvarez, P., Polo, M.C., J. Agric. Food Chem.,
2003, 51:2089-2095
114
Poussier M., Guilloux-Benatier M., Torres M., Heras E., Adrian M., Am. J. Enol. Vitic.,
2003, 54 :261-266
115
Cantos E., Toms-Barbern, F.A., Martnez, A., Espn, J.C., Europ. Food Res.Tech.,
2003, 217:253-258
66
MEN
SALIR
116
Vitrac X., Monti J.P., Vercauteren J., Deffieux G., Mrillon J.M., Anal. Chim. Acta, 2002,
458:103-110
117
Rodrguez Delgado M.A., Gonzlez, G., Prez-Trujillo, J.P., Garca-Montelongo, F.J.,
Food Chem., 2002, 76:371-375

118
Landrault N., Larronde F., Delaunay J.C., Castagnino C., Vercauteren J., Merillon J.M.,
Gasc F., Cros G., Teissedre P.L., J. Agric. Food Chem., 2002, 50:2046-2052
119
Wang Y., Catana, F., Yang, Y., Roderick, R., van Breeman, R., J. Agric. Food Chem.,
2002, 50:431-435
120
Castellari, M., Sartini, E., Fabiani, A., Arfelli, G., Amati, A., J. Chromatogr. A, 2002,
973:221-227
121
Franco, M., Coloru, G.C., Del Caro, A., Emonti, G., Farris, G., Manca, G., Massa, T.G.,
Pinna G., Europ. Food Res. Technol., 2002, 214:221-225

122
Yoshihiro Y., Keita Y., Akihiko N., Masanori K., Masao O., J. Japanese Soc. Food
Sci. Technol., 2002, 49:220-227

123
Malovan S., Garca Montelongo F.J., Prez J.P., Rodrguez-Delgado M.A., Anal. Chim.
Acta, 2001, 428:245-253

124
Kallithraka S., Arvanitoyannis I., El-Zajouli A., Kefalas P., Food Chem., 2001, 75 :355-
363
125
Martnez-Ortega M.V., Garca-Parrilla M.C., Troncoso A.M., Food Chem., 2001, 73 :11-
16
126
Stecher G., Huck C.W., Popp M., Bonn G.K., Fresenius J. Anal. Chem., 2001, 371:73-80
127
Lpez M., Martnez F., Del Valle C., Orte C., Mir M., J. Chromatogr. A, 2001, 922:359-
363
128
Domnguez C., Guilln D.A., Barroso C.G., J. Chromatogr. A, 2001, 918:303-310
129
Rodrguez Delgado, M.A., Malovan, S., Prez, J.P., Borges, T., Garca Montelongo
F.J., J. Chromatogr. A, 2001, 912:249-257

130
Souto A.A., Carneiro M.C., Seferin M., Senna M.J.H., Conz A., Gobbi K.,J. Food Comp.
Anal., 2001, 14:441-445

131
Vanhoenacker G., De Villiers A., Chromatographia, 2001, 54:309-315
132
Revilla E., Ryan J. M., J. Chromatogr. A, 2000, 881:461-469

67
MEN
SALIR
133
134
Roggero J.P., J. Food Comp. Anal., 2000, 13:93-97

Vias P., Lpez-Erroz C., Marn-Hernndez J.J., Hernndez-Crdoba M., J.
Chromatogr. A, 2000, 871:85-93

135
Ribeiro de Lima M.T., Waffo Tguo P., Teissedre P.L., Pujolas A., Vercauteren J.,
Cabanis J.C., Mrillon J.M., J. Agric. Food Chem., 1999, 47:2666-2670

136
Romero Prez A.I., Ibern Gmez M., Lamuela Ravents R.M., de la Torre Boronat M.C.,
J. Agric. Food Chem., 1999, 47:1533-1536

137
Okuda T., Yokotsuka K., Am. J. Enol. Vitic., 1996, 47:93-99
138
Jeandet P., Breuil A.C., Adrian M., Weston L.A., Debord S., Meunier P., Maume G.,
Bessis R., Anal. Chem., 1997, 69:5172-5177

139
Goldberg D.M., Tsang E., Karumanchiri A, Diamandis E.P., Soleas G., Ng E., Anal.
Chem., 1996, 68:1688-1694

140
Romero Prez A.I., Lamuela Ravents R.M., Waterhouse A.L., de la Torre Boronat M.
C., J. Agric. Food Chem., 1996, 44:2124-2128

141
Trela B.C., Waterhouse A.L., J. Agric. Food Chem., 1996, 44:1253-1257
142
Romero Prez A.I., Lamuela Ravents R.M., Buxaderas S, de la Torre Boronat M.C., J.
Agric. Food Chem., 1996, 44:1975-1978

143
Jeandet P., Bessis R., Maume B. F., Meunier P., Peyron D., Trollat P., J. Agric. Food
Chem., 1995, 43:316-319

144
145
Roggero J.P., Garca Parrilla C., Sci. Aliments, 1995, 15:411-422

Goldberg D.M., Ng E., Karumanchiri A., Yan J., Diamandis E.P., Soleas G.J., J.
Chromatogr. A, 1995, 708:89-98

146
Pezet R., Pont V., Cuenat P., J. Chromatogr. A, 1994, 663:191-197
147
Fan E., Zhang K., Chromatographia, 2005, 62:289-294
148
Spanil M., Pazourek, J., Farkov, M., Havel, J., J. Chromatogr. A, 2005, 1084:180-185
149
Peng Y., Chu Q., Liu F., Ye J., J. Agric. Food Chem., 2004, 52:153-156
150
Peng Y.Y., Chu Q.C., Ye J.N., Am. Lab., 2004, 36:40-44
151
Demianov Z., Siren, H., Kuldvee, R., Riekkola, M.L., Electrophoresis, 2003, 24:4264-
4271
68
MEN
SALIR
152
Minussi R., Rossi M., Bologna L., Cordi L., Rotilio D., Pastore G.M., Duran N., Food
Chem., 2003, 82:409-416

153
Dobisov Z, Pazourek J, Havel J., Electrophoresis, 2002, 23:263-267
154
Gao L., Chu Q., Ye J., Food Chem., 2002, 78:255-260
155
Brandolini V., Maietti A., Tedeschi P., Durini E., Vertuani S., Manfredini S., J. Agric.
Food Chem., 2002, 50:7407-7411

156
Chen Y.H., Chung Y.L., Lin C.H., J. Chromatogr. A, 2002, 943:287-294
157
Lin C.H., Chen Y.H., Electrophoresis, 2001, 22:2574-2579
158
Flamini R., Dall Vedova A., Rapid Commun. Mass Spectrom., 2004, 18:1925-1931
159
Shao, Y., Marriot, P., Hgel, H., Chromatographia, 2003, 57:S349-S353
160
Luan T., Li G., Zhang Z., Anal. Chim. Acta, 2000, 424:19-25
161
Soleas G.J., Goldberg D.M., Diamandis E.P., Karumanchiri A., Yan J., Ng E., Am. J.
Enol. Vitic., 1995, 46:346-352

162
Goldberg D.M., Yan J., Ng E., Diamandis E.P., Karumanchiri A., Soleas G.J.,
Waterhouse A.L., Am. J. Enol. Vitic., 1995, 46:159-165

163
Espinosa-Mansilla A., Muoz de la Pea A., Gonzlez Gmez D., Chem. Educator,
2005, 10:1-9
69
MEN
SALIR
MEN
SALIR
CAPTULO II
DETERMINACIN DE RESVERATROL EN VINO
MEDIANTE FLUORESCENCIA FOTOINDUCIDA
DE SEGUNDA DERIVADA Y EXTRACCIN
LQUIDO-LQUIDO
MEN
SALIR
CAPTULO II. Determinacin fluorimtrica de resveratrol en vino
72
MEN
SALIR
ANTECEDENTES
Como ya se explicado en la introduccin general de esta memoria, el
resveratrol (3,4,5-trihidroxiestilbeno) es un estilbenoide producido por ciertas
plantas como respuesta a infecciones fngicas o a un estrs abitico producido, por
ejemplo, por iones metlicos. Aparece en moras, cacahuetes y uvas.
Concretamente en uvas, forma parte del amplio grupo de compuestos polifenlicos
presentes en la piel, pulpa y semilla, que se extraen parcialmente en la elaboracin
del vino y son responsables de caractersticas sensoriales de stos como color,
sabor, astringencia o dureza.
El rango en que se puede encontrar la concentracin del resveratrol en los
vinos es muy amplio, As, en la bibliografa se encuentran valores comprendidos
entre 0.66 gmL1 a menos de 0.68 ngmL1, para vinos tintos, y desde 100 a
menos de 0.23 ngmL1, para vinos blancos1, y segn los datos ms recientes2, el
vino tinto contiene una media de 1.9 1.7 g trans-resveratrol/mL siendo no
detectable esta compuesto en algunos vinos, y el comportamiento es similar
respecto a los niveles de cis. No se puede decir que exista una regin o variedad
que produzca vinos con contenidos significativamente diferentes del resto.
La diferente concentracin en vinos est motivada tanto por factores
relacionados con el cultivo, variedad de uva, factores ambientales en la via,
tiempo de vendimia, como por factores relacionados con la elaboracin del vino3.
Tambin se ha explicado en la introduccin que el resveratrol presenta un
equilibrio cis-trans, y que cuando el trans-resveratrol en disolucin alcohlica se
Siemann E.H., Creasy L.L., Am. J. Enol. Vitic., 1992,43:4952
Stervbo U., Vang O., Bonnesen C., Food Chem., 2007, 101:449 457
3 Kallithraka S., Arvanitoyannis I., El-Zajouli A., Kefalas P., Food Chem., 2001, 75:355363
1
2
73
MEN
SALIR
somete a irradiacin con luz UV intensa se induce, primero, la isomerizacin a cisresveratrol y, posteriormente, la formacin de un compuesto muy fluorescente4, 5. El
cis-resveratrol no est presente en las uvas pero s lo est en los vinos6.
En cuanto a los mtodos de anlisis de resveratrol encontrados en la
bibliografa, se han utilizado ampliamente las tcnicas de separacin, como
cromatografa de lquidos o gases y electroforesis capilar7,8, en diferentes
alimentos.
As, en los ltimos aos, la mayora de los mtodos publicados para el
anlisis de trans-resveratrol en vinos, son mtodos de cromatografa lquida de alta
eficacia (HPLC) y muchos de ellos se recogen en un artculo publicado en el ao
20059, que realiza una extensa revisin de los mtodos de HPLC para el anlisis
de este compuesto en diferentes producto alimenticios. En esta revisin se pone de
manifiesto que la mayora son mtodos de fase inversa (RP), utilizando metanol o
acetonitrilo como disolventes orgnicos y cido actico para modificar la acidez de
la fase acuosa. En muchos casos se hace uso de una elucin en gradiente y, en lo
referente a la deteccin, se utilizan sobre todo detectores de serie de diodos y las
longitudes de onda seleccionadas son 300-308 nm para trans-resveratrol y 285-286
nm para cis-resveratrol. En algunos casos tambin se utilizan otros detectores que
proporcionan mejor sensibilidad como detectores fluorescentes o electroqumicos.
En el caso de la deteccin fluorescente, las longitudes de ondas utilizadas son 324330/370 y 260/370 nm para trans- y cis-resveratrol, respectivamente. Ms
Roggero J.P, Garcia-Parrilla C., Sci. Aliments, 1995, 15:411422

Roggero J.P., J. Food Comp. and Anal., 200, 13:93-97
6 Trela B.C., Waterhouse A.L., J. Agric. Food Chem., 1996, 44:1253-1257
7 Orea J.M., Montero C., Jimnez J.B., Gonzlez Urea A., Anal. Chem. 2001, 73:59215929
8 Gu X., Chu Q., ODwyer M., Zeece M., J Chromatogr A, 2000, 881:471481
9 Rudolf J.L., Resurreccion V.A., Saalia F.K., Phillips R.D., Food Chem., 2005, 89:623-638
4
5
74
MEN
SALIR
recientemente, X. Vitrac et al10 utilizan los pares 300/390 para el trans y 260/400
nm para el cis y Z. Pieiro et al11 llevan a cabo la deteccin de trans-resveratrol a
310/403 nm, en un medio cido actico al 0.1 % en 70/30 agua/metanol, aportando
los espectros fluorescentes de ambos compuestos en dicho medio.
Segn los resultados anteriormente expuestos, las caractersticas
fotomtricas y fluorimtricas de estos compuestos se recogen en diferentes
artculos. Podemos mencionar el publicado por Trela y Waterhouse6, que comparan
los espectros UV y los valores de absortividad molar que obtienen para ambos
ismeros, en etanol, con los resultados reportados por otros autores y hacen un
estudio del proceso de isomerizacin inducido fotoqumicamente. Segn estos
autores, las disoluciones de trans-resveratrol en etanol/agua, 50/50, son estables al
menos 28 das (CV < 4.7 %), a pH entre 1 y 7, si se protegen de la luz, pero si se
irradian se degradan a cis en un 90.6 % en dos horas, si bien valores bajos de pH
causan de nuevo la isomerizacin del cis a trans, estricamente ms estable. Estos
autores, sin embargo, no hacen referencia alguna al comportamiento fluorescente
de trans-resveratrol, que s es descrito anteriormente por Roggero y Garca
Parrilla4. Segn sus resultados, mientras que tanto trans como cis-resveratrol son
dbilmente fluorescentes, pero al irradiarlos con luz UV intensa, no slo se
isomeriza el trans a cis sino que aparece un compuesto muy fluorescente, en cuyo
espectro UV, la de mxima absorcin, 260 nm, coincidiendo dicho espectro con el
atribuido por Siemann y Creasy1 al cis-resveratrol.
A pesar de los datos existentes acerca de las propiedades
espectroscpicas del trans-resveratrol, y de la influencia de la irradiacin sobre este
compuesto, no se han encontrado antecedentes acerca de la determinacin
Vitrac X., Monti J.P., Vercauteren J., Deffieux G., Mrillon J.M., Anal. Chim. Acta, 2002, 458:103
110
11 Pieiro Z., Palma M., Barroso C.G., J. Chromatogr. A, 2006, 1110:6165
10
75
MEN
SALIR
fotomtrica o fluorimtrica de este compuesto en vino. Ello, unido al hecho de que

an existen, en los artculos citados, resultados discrepantes o no totalmente
explicados nos anim a realizar estudios sobre las propiedades espectrales de
trans-resveratrol y su modificacin mediante irradiacin UV, con el objetivo ltimo
de llegar a proponer un mtodo fluorimtrico de determinacin de este compuesto
en vino.
Estudio bsico sobre las propiedades de inters analtico de trans-resveratrol
Caracterizacin absorbente y luminiscente en distintos disolventes
Los estudios bsicos se han iniciado con el estudio del comportamiento
absorbente y luminiscente del trans-resveratrol en distintos disolventes. Para ello,
en matraces de 10.0 mL se preparan disoluciones que contienen 1.02 gmL-1 de
trans-resveratrol (0.20 mL de la disolucin etanlica de trans-resveratrol de 51.0
gmL-1). Los disolventes ensayados son agua y disolventes orgnicos de distintas
polaridades
como
metanol,
etanol,
acetonitrilo,
dimetilsulfxido,
N,N-
dimetilformamida, 1,4-dioxano, ciclohexano y hexano, as como mezclas

hidroetanlicas de diferente composicin.
En la Figura 1, se representa el espectro de absorcin de una disolucin
acuosa de trans-resveratrol. Presenta una banda de absorcin centrada a 310 nm
con un ancho de banda de 20 nm, en la que se distinguen dos mximos centrados
a 306 y 319 nm, respectivamente. La forma del espectro, la situacin de los
mximos y la absortividad molar no se ven afectados por la naturaleza del
76
SALIR
disolvente.
0.12
Absorbancia
MEN
0.08
0.04
0
240
280
320
(nm)
360
400
Figura 1.- Espectro de absorcin de una disolucin acuosa (2.0 % v/v etanol) conteniendo
1.02 gmL-1 de trans-resveratrol
Este compuesto presenta una dbil fluorescencia nativa y los espectros de

excitacin y emisin de fluorescencia, registrados en algunos de los disolventes
ensayados se recogen en la Figura 2. En la mayora de los disolventes ensayados
(acetonitrilo, etanol, agua o mezclas hidroetanlicas), los espectros de excitacin
presentan dos mximos centrados a 225 y 318 nm, y un nico mximo de emisin
centrado a 390 nm. En dimetilformamida se observa un aumento del rendimiento
cuntico de fluorescencia del analito, as como la desaparicin del primer mximo
de excitacin. En hexano, ciclohexano y 1,4-dioxano, el espectro de emisin se
desplaza hipsocrmicamente hasta 373 nm.
77
MEN
SALIR
Intenisidad de Fluorescencia
120
80
40
0
200
250
300
(nm)
350
400
450
Figura 2.-Espectros de excitacin y emisin de disoluciones conteniendo 1.02 gmL-1 de

trans-resveratrol en distintos disolventes: () etanol:agua 40:60, v:v (exc/em 318/390 nm),
() dimetilformamida (2.0 % etanol) (exc/em 318/390 nm), () hexano (2.0 % etanol)
(exc/em 310/373 nm)
Influencia de la acidez del medio. Clculo de constantes de ionizacin

de trans-resveratrol
Una vez estudiado el efecto que ejerce el disolvente sobre las propiedades
absorbentes y fluorescentes del analito, se procede a estudiar la influencia de la
acidez del medio.
Dicho estudio se ha llevado a cabo tanto en medio acuoso como en medio
hidroetanlico conteniendo el 40 % (v/v) de etanol. Se preparan disoluciones que
en un volumen final de 100.0 mL contienen 2.28 gmL-1 de trans-resveratrol,
fijndose la fuerza inica del medio con KCl 0.10 M. La variacin del pH se efecta
por adicin de pequeos volmenes de disoluciones diluidas de HCl y NaOH. Dado
que en principio no se sabe nada acerca de la reversibilidad de los equilibrios en
78
SALIR
los que el analito participa, se toma la precaucin de utilizar alcuotas

independientes de la disolucin, una para acidular y otra para alcalinizar.
En las Figuras 3 y 4 se recogen los espectros de absorcin ms
representativos en ambos medios, registrados a distintos valores de pH, as como
la variacin de la absorbancia a las longitudes de onda de mxima variacin.
0.3
0.3
2.0 - 6.0
12.1
306 nm
0.2
Absorbancia
Absorbancia
10.2
0.1
0.2
343 nm
0.1
0
250
300
(nm)
350
400
pH
10
12
14
Figura 3.- (A) Espectros de absorcin correspondientes a trans-resveratrol (2.28 gmL-1) en medio
etanol:agua 40:60, v:v, a distintos valores de pH. (B) Variacin de la absorbancia, medida a 306 y
343 nm, con el pH
0.25
0.25
12.2
1.0 - 7.0
0.2
10.0
0.15
9.2
0.1
0.2
Absorbancia
Absorbancia
MEN
0.05
0.15
0.1
0.05
306 nm
343 nm
0
250
300
(nm)
350
400
8
pH
10
12
14
Figura 4.- (A) Influencia del pH sobre los espectros de absorcin de trans-resveratrol (1.52 gmL-1)
en medio acuoso. (B) Variacin de la absorbancia, medida a 306 y 343 nm, con el pH
79
MEN
SALIR
En los dos medios de trabajo, se observa un comportamiento similar, no

producindose cambios en el espectro de absorcin para pH inferiores a 7.0. Para
pH superiores se observa una disminucin en la absorbancia a 306 nm, a medida
que la banda de absorcin sufre un desplazamiento batocrmico, centrndose a
343 nm en medio fuertemente alcalino (pH > 12).
En la Figura 3B, se detecta un cambio brusco de la seal en el intervalo de
pH 9.0-12.0, correspondiente a la ionizacin del analito. El valor de pKa de este
equilibrio, se ha calculado mediante los mtodos de Stenstrm y Goldsmith12 y de
Wilson y Lester13. Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla 1.
El caso del estudio en medio acuoso, es algo ms complejo, porque, como
se aprecia en la Figura 4B, en la variacin de la absorbancia medida a 343 nm se
pueden observar dos tramos diferentes, correspondientes a dos disociaciones muy
cercanas entre si, uno en el intervalo de pH 8.0-9.0 y otro en el intervalo 10.0-12.0,
con una pequea meseta intermedia en el intervalo de pH 9.0-10.0. Debido a la
proximidad de ambos equilibrios, los mtodos de clculo anteriores no pueden ser
aplicados para el clculo de los valores de pKa, ya que no existe una meseta
claramente definida entre ambos equilibrios, no pudiendo relacionar los valores de
absorbancia correspondientes a la regin de pH 9.0-10.0, con la concentracin de
la especie intermedia.
En este caso, los valores de pKa se han calculado mediante el uso de
diagramas de absorbancia (diagramas-A). Un diagrama-A es una representacin
de la absorbancia a una longitud de onda frente a la absorbancia a una segunda
longitud de onda, de manera que el diagrama refleja los cambios relativos de
12
13
Stenstrm W., Goldsmith N., J. Phys. Chem., 1926, 30:1683-1687

Wilson R.F., Lester G.W., Talanta, 1963, 10:319-322
80
SALIR
absorbancia a ambas longitudes de onda, en funcin del pH. Para un sistema en el

que est implicado un nico equilibrio, la absorbancia a cualquier longitud de onda,
debe ser proporcional a la absorbancia a cualquier otra longitud de onda, de
manera que los diagramas sern lineales. No obstante, cuando un sistema est
gobernado por dos o ms equilibrios, los diagramas de absorbancia cambiarn de
direccin cada vez que un nuevo equilibrio domine el sistema14. Estos diagramas
son particularmente tiles para sistemas en los que los espectros no revelan
claramente el nmero de equilibrios implicados.
0.24
Absorbancia (306 nm)
MEN
0.2
H3Re
0.16
HRe2-
0.12
H2Re-
0.08
0.04
0.04
0.08 0.12 0.16

0.2
Absorbancia (343 nm)
0.24
Figura 5.- Diagrama de absorbancia A306 nm vs A343 nm de

trans-resveratrol en medio acuoso. Rango de pH 7.5-11.5
En este caso, se han empleado los valores de absorbancia a 306 y 343

nm, como longitudes de onda caractersticas de sus formas cida y bsica,
respectivamente, para construir el diagrama-A, representado en la Figura 5. En
dicho diagrama se pueden distinguir dos tramos rectos, lo que sugiere la presencia
de dos equilibrios. La primera ionizacin predomina en el rango de pH 7.5-8.9
(primer tramo lineal) y la segunda en el rango 10.0-11.5 (segundo tramo lineal). El
14 Polster J., Lachmann H., Spectrometric Titration, Analysis of Chemical Equilibria; VCH,
Weinheim, 1989
81
MEN
SALIR
punto del diagrama correspondiente a pH 7.5 se encuentra sealado como H3Re

(resveratrol en forma neutra, como especie predominante) y el correspondiente a
pH 11.5 como HRe2- (resveratrol-difenxido, como especie predominante). En el
punto de interseccin entre los dos tramos lineales, la especie resveratrolmonofenxido coexiste en equilibrio, por ello este punto se ha etiquetado como
H2Re-. Los valores de pKa calculados, son 8.2 y 9.7, respectivamente.
El estudio de la influencia de la acidez del medio sobre la fluorescencia del
trans-resveratrol se ha llevado a cabo igualmente en medio acuoso y en medio
hidroetanlico 60:40 (agua:etanol), preparando disoluciones que en un volumen
final de 25.0 mL contienen 0.98 gmL-1 de analito y KCl 0.1 M.
En las Figuras 6 y 7 se recogen, los espectros de excitacin y emisin a
distintos valores de pH, en cada uno de los medios de trabajo ensayados, as como
la variacin de la seal de fluorescencia, a las longitudes de onda correspondientes
a las formas cida y bsica, con el pH.
600
< 6.0
Intensidad de Fluorescencia
600
400
200
> 10.0
I.F.(exc 318 nm) (385 nm)
400
200
I.F.(exc 342 nm) (459 nm)
0
200
300
400
(nm)
500
600
pH
10
12
14
Figura 6.- (A) Espectros de excitacin y emisin correspondientes a una disolucin conteniendo 0.98
gmL-1 de trans-resveratrol en etanol:agua 40:60, v:v, en medio cido (exc/em = 318/385 nm) y
bsico ( exc/em = 342/459 nm). (B) Variacin de las seales de fluorescencia a exc/em = 318/385 nm y
342/459 nm, con el pH
82
SALIR
250
< 6.0
250
MEN
200
150
> 10.0
100
50
0
I.F.(exc 318 nm) (404 nm)
200
150
100
50
I.F.(
exc 341 nm
) (460 nm)
0
200
300
400
(nm)
500
600
pH
10
12
14
Figura 7.- (A) Espectros de excitacin y emisin correspondientes a una disolucin conteniendo 0.98
gmL-1 de trans-resveratrol en agua, a pH cido (exc/em = 318/404 nm) y bsico (exc/em = 341/460
nm). (B) Variacin de las seales de fluorescencia a exc/em = 318/404 nm y 341/460 nm, con el pH
Al disminuir la acidez, se produce un desplazamiento batocrmico en los

espectros de excitacin de 318 a 342 nm y de 318 a 341 nm, y de emisin de 385 a
459 nm y de 404 a 460 nm, en medio hidroetanlico y acuoso, respectivamente,
adems de una disminucin del rendimiento cuntico de fluorescencia, en ambos
casos. En base a las curvas de variacin de la seal de fluorescencia con el pH, se
han calculado valores de pKa, cuyos resultados se encuentran en la Tabla 1.
Los valores de las constantes de ionizacin del trans-resveratrol se
encuentran recogidos en dos artculos. En el primero de ellos15, se describen
valores de pKa de pKa1= 8.01, pKa2= 9.86 y pKa3= 10.5 en medio acuoso, obtenidos
fotomtricamente por extrapolacin de los valores obtenidos en distintos medios
hidrometanlicos. Estos valores de pKa1 y pKa2 son bastante coincidentes con los
calculados fotomtricamente en nuestro caso, mediante el mtodo del diagrama-
15 Takagai Y., Kubota T., Kobayashi H., Tashiro T., Takahashi A., Igarashi S., Anal. Sci., 2005,
21:183-186
83
MEN
SALIR
A14, para trans-resveratrol en medio acuoso. En el segundo trabajo16, se describe la

obtencin de las constantes de disociacin de primer orden de trans-resveratrol y
trans-piceido, en medio acuoso, mediante datos electroforticos, proporcionando
valores de pKa1= 9.49 y 9.40, respectivamente. El valor de pKa1 calculado en este
trabajo para trans-resveratrol es bastante cercano al valor de pKa2 calculado por
nosotros fotomtricamente, mediante el mtodo del diagrama-A.
FLUORESCENCIA
FOTOMETRA
Tabla 1.- Valores de pKa calculados para el trans-resveratrol en diferentes medios, mediante
fotometra y fluorescencia, utilizando diferentes mtodos de clculo
Mtodo de Clculo
pKa trans-resveratrol
Etanol:Agua
40:60, v:v
Stenstrm y Goldsmith*
10.4 0.1
Wilson y Lester
10.4
Agua
Diagrama-A
pKa1= 8.2
pKa2= 9.7
Etanol:Agua
40:60, v:v
Agua
9.1 0.5
Wilson y Lester
9.2
8.5 0.1
Wilson y Lester
8.5
* Valor medio Desviacin Estndar
Para estudiar la reversibilidad de los equilibrios en que se encuentra

involucrado el trans-resveratrol, al variar el pH, se alcaliniza una muestra, en las
mismas condiciones en las que se ha llevado a cabo el estudio de la influencia del
pH, hasta un pH en torno a 12, y se acidula a continuacin, hasta un pH prximo al
inicial. Se encuentra que el espectro correspondiente a la muestra original y el
16 Cao J., Chen G.H., Du Y.S., Hou F.F., Tian Y.L., J. Liquid Chromatogr. and Rel. Technol., 2006,
29:1457-1463
84
MEN
SALIR
registrado una vez que se alcaliniza y acidula posteriormente son idnticos, de

donde se deduce que se trata de un equilibrio cido-base reversible.
Rectas de calibrado y parmetros analticos de calidad
Se procede a estudiar la relacin entre la concentracin de transresveratrol y las seales fotomtrica y fluorescente, y al establecimiento de las
correspondientes rectas de calibrado.
Para obtener las seales fotomtricas se procede aadiendo directamente
en la cubeta de medida 2.00 mL de agua ultrapura y volmenes crecientes,
comprendidos entre 0.020 y 0.25 mL, de una disolucin etanlica de transresveratrol de 49 gmL-1. Los espectros de absorcin se registran en un rango de
longitudes de onda comprendido entre 240 y 360 nm.
Las medidas de fluorescencia se realizan aadiendo directamente en la
cubeta de medida 1.80 mL de agua y 1.20 mL de etanol absoluto, con el objetivo de
mantener la composicin ptima del medio de trabajo, ya que la emisin
fluorescente depende del % de etanol en el medio. Sobre esta mezcla
hidroetanlica, una vez desgasificada por ultrasonidos, se aaden volmenes
sucesivos de una disolucin etanlica de trans-resveratrol, de 49 gmL-1, en
incrementos de 5.0 L, hasta llegar a 0.050 mL. Tras cada nueva adicin, se
registran los espectros de emisin (exc = 318 nm) en las siguientes condiciones
instrumentales: 20C, rendijas de excitacin y emisin 5 nm respectivamente,
voltaje del tubo fotomultiplicador 800 V.
85
MEN
SALIR
Las ecuaciones de las rectas obtenidas mediante ambas tcnicas, as

como los parmetros analticos de calidad, se encuentran recogidos en la Tabla 2.
Tabla 2.- Parmetros analticos de calidad para la determinacin fotomtrica y fluorimtrica de
trans-resveratrol
trans-resveratrol
17
18
Fotometra
Fluorescencia
Seal Analtica
A306 nm
I.F.318/385 nm
Rango Lineal (gmL-1)
0.50 5.00
0.080 0.80
Ordenada en el Origen (a sa)
-0.0037 0.0025
12.8 5.5
Pendiente (b sb) (mLg-1)
0.127 0.001
938 13
Desviacin Estndar de la Regresin (sy/x)
0.0077
13.1
Coeficiente de Correlacin (r)
0.999
0.999
Coeficiente de Determinacin (r2)
0.999
0.997
% Linealidad
99.3
98.6
Resolucin Analtica (-1) (gmL-1)
0.0604
0.0140
LOD, Long y Winefordner17 (gmL-1)
0.0583
0.0179
LOD, Clayton18 (==0.05) (gmL-1)
0.135
0.0345
Long G.L., Winefordner J.D., Anal. Chem., 1983, 55:712724

Clayton C.A., Hines J.W., Elkins P.D., Anal. Chem., 1987, 59:25062514
86
MEN
SALIR
Repetitividad de los mtodos

Para llevar a cabo este estudio se siguen los procedimientos que se
describen a continuacin:
Mtodo fotomtrico: Para realizar el estudio de la repetitividad se preparan,
segn el mtodo anteriormente descrito, 11 rplicas de una muestra que contiene
1.43 gmL-1 de trans-reveratrol y se miden las absorbancias correspondientes a
306 nm. Aplicando el clculo estadstico a los datos obtenidos, la desviacin
estndar relativa resulta ser del 2.2 %.
Mtodo fluorimtrico: Mediante fluorescencia, el estudio de la repetitividad
del mtodo se lleva a cabo con 11 rplicas de una muestra que en este caso
contiene 0.32 gmL-1 de trans-reveratrol. Las seales obtenidas a 385 nm (exc =
318 nm) se tratan estadsticamente obtenindose un valor para la desviacin
estndar relativa del 4.7 %.
Efecto de la irradiacin ultravioleta externa sobre las propiedades
absorbentes y fluorescentes de trans-resveratrol
En esta seccin se describe el estudio realizado sobre la fotorreaccin que
sufre el analito, en distintos disolventes. Se ha investigado el efecto de diversas
variables, como la composicin y la acidez del medio, tanto sobre el proceso de
fotodescomposicin como sobre las propiedades del fotoproducto.
87
MEN
SALIR
Influencia del disolvente

En primer lugar, se procede a estudiar la influencia de la composicin del
medio en el desarrollo de la fotorreaccin que tiene lugar cuando las disoluciones
de trans-resveratrol son irradiadas bajo una lmpara de mercurio de alta presin.
Para ello, se preparan disoluciones de trans-resveratrol por dilucin de una
disolucin madre concentrada con disolventes orgnicos de diferentes polaridades,
as como agua y mezclas hidroetanlicas. Se examinan las propiedades
absorbentes y fluorescentes de estas disoluciones, previa irradiacin de las mismas
durante distintos intervalos de tiempo, en diferentes medios de trabajo.
Absorcin molecular.- Se comprueba que el porcentaje de etanol en el
medio no influye sobre el espectro de absorcin de trans-resveratrol, como se
explic anteriormente, siendo ste exactamente igual, en intensidad y fisonoma, en
etanol, en agua y en mezclas hidroetanlicas de diferente composicin. Sin
embargo, s lo hace sobre los espectros de absorcin de los fotoproductos que se
van generando durante la irradiacin de las respectivas disoluciones bajo una
lmpara de mercurio de alta presin, as como sobre la cintica de la fotorreaccin.
Para realizar este estudio, se preparan disoluciones, conteniendo todas
ellas 2.04 gmL-1 de trans-resveratrol, en etanol absoluto y en mezclas
hidroetanlicas de composicin variable. En la Figura 8 se recoge la evolucin de
los espectros de absorcin de cuatro de estas disoluciones, con el tiempo de
irradiacin bajo una lmpara de mercurio de alta presin.
88
SALIR
0.3
0.2
Absorbancia
Absorbancia
0.3
0.1
0.3
0.2
0.1
0
240
280
(nm)
320
360
240
0.3
0.2
Absorbancia
Absorbancia
MEN
0.1
280
(nm)
320
360
320
360
0.2
0.1
0
240
280
(nm)
320
360
240
280
(nm)
Figura 8.- Influencia del tiempo de irradiacin sobre disoluciones de trans-resveratrol en etanol
absoluto (A) y en etanol:agua 60:40, v:v (B), 40:60, v:v (C) y 4:96, v:v, (D), sin irradiar () e
irradiadas durante 5 segundos (), 30 segundos (), 60 segundos () 120 segundos ()
y 300 segundos (). [trans-resveratrol] = 2.04 gmL-1
Como se observa, al irradiar las disoluciones de resveratrol en etanol, agua

o en cualquier medio hidroetanlico, la fisonoma del espectro cambia totalmente,
desapareciendo en todos los casos la banda ancha de absorcin caracterstica del
trans-resveratrol y observndose un nuevo mximo de absorcin centrado a 290
nm, correspondiente, segn aparece descrito en la bibliografa, a cis-resveratrol6.
La intensidad de este mximo prcticamente no vara con el tiempo de irradiacin.
89
MEN
SALIR
Cuando el porcentaje de etanol est comprendido entre 40 % y 60 % y las

disoluciones son irradiadas durante 120 segundos, se observa la aparicin de un
segundo mximo de absorcin centrado a 260 nm, tanto o ms importante que el
anterior, que sin embargo a penas se aprecia en etanol puro, o con elevados
contenidos de agua. En etanol absoluto, dicho mximo se observa de una forma
muy tenue para tiempos de irradiacin en torno a 60 segundos. En cualquier caso,
la irradiacin de las disoluciones durante tiempos mayores implica la destruccin de
este ltimo fotoproducto, como puede observarse en los espectros registrados para
las disoluciones irradiadas durante cinco minutos.
Por ltimo, es importante destacar que se ha comprobado que el tiempo de
irradiacin necesario para la obtencin de los fotoproductos est directamente
relacionado con el rango de concentraciones de la disolucin inicial del analito, en
su forma trans original.
Fluorescencia molecular.- Con el objetivo de evaluar la influencia de
la irradiacin ultravioleta externa sobre las propiedades fluorescentes de los
fotoproductos en diferentes disolventes, se prepara, en primer lugar, una disolucin
conteniendo 57 ngmL-1 de trans-resveratrol, en etanol:agua 40:60, v:v, y se
registran los espectros de excitacin y emisin, de la disolucin recin preparada, y
tras ser irradiada durante 60 segundos bajo una lmpara de mercurio de alta
presin. Dichos espectros se recogen en la Figura 9, y como puede observarse, se
comprueba que la irradiacin ultravioleta externa de disoluciones hidroetanlicas de
trans-resveratrol tiene como consecuencia la generacin de fotoproductos
altamente fluorescentes. Los espectros de estos fotoproductos se caracterizan por
presentar un intenso y agudo mximo de excitacin centrado a 260 nm, y dos
mximos de emisin, en torno a 364 y 382 nm respectivamente.
90
SALIR
Se han ensayado otros disolventes, concretamente metanol, etanol,

acetonitrilo, dimetilsulfxido, N,N-dimetilformamida, 1,4-dioxano, ciclohexano y
hexano, encontrndose que la naturaleza del fotoproducto es independiente del
disolvente, como puede deducirse de los espectros prcticamente idnticos
obtenidos en todos disolventes ensayados. De dicho estudio, se deduce tambin
que la velocidad de las fotorreacciones est altamente influida por el disolvente,
siendo mayor en medios puramente orgnicos que en medios hidroorgnicos. Por
otra parte, se encuentra que el rendimiento cuntico de fluorescencia de los
fotoproductos es mximo en medios hidroetanlicos en los que las proporciones de
etanol y agua son similares, por lo que elegimos este medio para posteriores
estudios.
300
MEN
200
100
0
200
300
(nm)
400
500
Figura 9.- Espectros de excitacin y emisin

correspondientes a una disolucin conteniendo 57
ngmL-1 de trans-resveratrol, en etanol:agua 40:60, v:v,
aislada de la luz () (exc/em 318/390 nm), e irradiada
durante 60 segundos (), bajo una lmpara de
mercurio de alta presin (exc/em 260/364 nm)
91
MEN
SALIR
Con el objetivo de encontrar la composicin del disolvente en el que se

obtengan las mayores seales, en pro de la sensibilidad de los mtodos, se
preparan una serie de disoluciones, conteniendo todas ellas 2.28 gmL-1 de transresveratrol, en etanol, en agua, y en diferentes proporciones de ambos disolventes.
En cada caso, se lleva a cabo el estudio de la fotorreaccin, por irradiaciones
acumulativas de la misma disolucin bajo la lmpara de mercurio de alta presin,
registrando los espectros de excitacin y emisin de la disolucin que est siendo
irradiada, a las longitudes de onda de mxima seal de los fotoproductos. En la
Figura 10A se encuentra representada la evolucin de la seal de fluorescencia
fotoinducida, con el tiempo de irradiacin de las disoluciones de trans-resveratrol,
en los distintos medios de trabajo ensayados. En todos los casos, se observa un
aumento de la seal de fluorescencia fotoinducida con el tiempo de irradiacin,
hasta alcanzar un mximo, seguido por un decaimiento de la seal, probablemente
debido a la destruccin de los fotoproductos y a la generacin de otros fragmentos
no fluorescentes.
500
I. F. (364 nm) (exc = 260 nm)
I. F. (364 nm) (exc = 260 nm)
500
400
300
200
100
0
400
300
200
100
0
50 100 150 200 250

Tiempo de Irradiacin (s)
300
20
40
60
% v. Etanol
80
100
Figura 10.- (A) Evolucin de la intensidad de fluorescencia a 364 nm (exc= 260 nm) con el tiempo
de irradiacin de disoluciones conteniendo 2.28 gmL-1 de trans-resveratrol en etanol absoluto
(), agua (), y etanol:agua 80:20, v:v (), 60:40, v:v (), 40:60, v:v () y 20:80,
v:v (). (B) Influencia del porcentaje de etanol en el medio sobre la seal de fluorescencia a
364 nm (exc= 260 nm) para un tiempo de irradiacin de 120 segundos
92
MEN
SALIR
En disoluciones puramente etanlicas, el tiempo de irradiacin ptimo est

en torno a 25 segundos y la fluorescencia de los fotoproductos es muy dbil. A
medida que disminuye el porcentaje de etanol en el medio aumenta el tiempo de
irradiacin necesario para lograr la mxima seal, as como las seales de
fluorescencia fotoinducida. En la Figura 10B se representa la intensidad de
fluorescencia obtenida para cada una de las disoluciones al irradiarlas durante 120
segundos. Se observa que, en este caso, la mxima seal se obtiene en medios
con un porcentaje de etanol comprendido entre el 30 % y el 50 %. Por ello, para
futuras experiencias se elige como medio de trabajo ptimo una mezcla
etanol:agua 40:60, v:v.
No obstante, se encuentra que el tiempo de irradiacin ptimo es
dependiente de la concentracin de trans-resveratrol inicial, siendo necesario
optimizar dicho parmetro una vez establecido el rango de concentraciones de
trabajo.
Influencia de la acidez del medio sobre las propiedades absorbentes y
fluorescentes del fotoproducto de resveratrol
Una vez establecidas las condiciones ptimas para la obtencin del
fotoproducto fluorescente de resveratrol, y caracterizado el mismo fotomtrica y
fluorimtricamente, se procede a estudiar la influencia de la acidez del medio sobre
sus propiedades espectroscpicas.
En todos los casos se fija la fuerza inica del medio por adicin de KCl, en
una concentracin final de 0.10 M. Se obtiene el fotoproducto y estas disoluciones
se dividen en dos porciones, de las cuales una ser alcalinizada y la otra acidulada
93
MEN
SALIR
mediante la adicin de pequeos volmenes de disoluciones diluidas de NaOH y

HCl, respectivamente, ya que inicialmente no se tienen datos acerca de la
reversibilidad de los procesos que ocurren.
El estudio fotomtrico se lleva a cabo sobre una disolucin conteniendo
1.20 gmL-1 de trans-resveratrol, en etanol:agua 40:60, v:v, irradiada durante 60
segundos. En la Figura 11 se han recogido los espectros ms significativos a
distintos valores de pH, as como la variacin de la seal fotomtrica a las
longitudes de onda caractersticas de las formas cida y bsica.
0.12
8.4
9.8
0.08
11.0
Absorbancia
Absorbancia
0.12
10.7
0.04
3.5
261 nm
0.08
303 nm
0.04
240
260
280
300 320
(nm)
340
360
pH
10
12
14
Figura 11.- (A) Influencia del pH sobre los espectros de absorcin del fotoproducto del transresveratrol en medio etanol:agua 40:60, v:v. (B) Variacin de la absorbancia a 261 y 303 nm con el
pH, [trans-resveratrol ]inicial = 1.20 gmL-1
El espectro de absorcin del fotoproducto, en medio neutro y cido, est

caracterizado por un mximo centrado a 261 nm, y otro de menor importancia
centrado a 287 nm. Para valores de pH superiores a 10, el primer mximo
desaparece y el segundo se desplaza batocrmicamente hasta 303 nm.
94
SALIR
El estudio de la influencia del pH sobre la fluorescencia del fotoproducto se

lleva a cabo sobre una disolucin conteniendo 98 ngmL-1 de trans-resveratrol, en
etanol:agua 40:60, v:v, irradiada durante 60 segundos. En la Figura 12A se
representan los espectros de excitacin y emisin a diferentes valores de pH. La
curva de variacin de la seal de fluorescencia con el pH, Figura 12B, muestra una
meseta para valores de pH inferiores a 7.0, y un decaimiento drstico de la seal
para valores de pH superiores a 7.0, obtenindose una seal inapreciable para pH
superiores a 11.0. Se comprueba que el producto resultante de la degradacin
alcalina del fotoproducto de resveratrol no es fluorescente.
800
A
I. F. (364 nm) (exc= 260 nm)
800
MEN
< 7.0
600
400
9.9
200
600
400
200
> 12.0
0
0
200
250
300
350
(nm)
400
450
pH
10
12
14
Figura 12.- (A) Espectros de excitacin y emisin del fotoproducto de trans-resveratrol a distintos
valores de pH. (B) Variacin de la intensidad de fluorescencia con el pH. [trans-resveratrol] =
98 ngmL-1, exc= 260 nm, em= 364 nm
Adicionalmente,
se
estudia
fotomtrica
fluorimtricamente
la
reversibilidad de los equilibrios en que se encuentra involucrado el fotoproducto de

resveratrol, al alcalinizar. Para ello, se alcalinizan muestras en las mismas
condiciones en las que se ha llevado a cabo el estudio de la influencia del pH,
hasta un pH en torno a 12, y se acidulan a continuacin, hasta un pH prximo al
inicial. Por comparacin de los espectros correspondientes a las muestras neutras
originales y los registrados tras la variacin del pH, se deduce que la
95
MEN
SALIR
transformacin que sufre el fotoproducto del resveratrol en medio alcalino no es

reversible. Por ello, no ha sido posible calcular el valor de pKa correspondiente al
fotoproducto de resveratrol, por no tratarse de un equilibrio cido-base, sino de una
hidrlisis alcalina irreversible.
Una vez establecida la influencia de las variables qumicas, y determinados
sus valores ptimos, y dada la mejora de sensibilidad y selectividad que supone, en
general, utilizar seales fluorimtricas, se procede a estudiar la relacin entre la
concentracin de trans-resveratrol puesta y la seal de fluorescencia fotoinducida,
as como al establecimiento de la correspondiente recta de calibrado.
Para ello, se preparan muestras conteniendo entre 6.6 y 66 ngmL-1 de
analito en etanol:agua 40:60, v:v, y se irradian durante 60 segundos. A
continuacin, se registran los espectros de emisin de las disoluciones irradiadas,
en las siguientes condiciones experimentales: 20C, rendija de excitacin 5 nm,
rendija de emisin 5 nm, voltaje del tubo fotomultiplicador 750 V y exc = 260 nm.
En la Tabla 3 se recogen los parmetros analticos de calidad
correspondientes a la determinacin de resveratrol mediante fluorescencia
fotoinducida, utilizndose como seal analtica la intensidad de fluorescencia a 365
nm.
96
MEN
SALIR
Tabla 3.- Parmetros analticos para la determinacin de trans-resveratrol
mediante fluorescencia fotoinducida (exc/em = 260/365 nm)
Rango Lineal (ngmL-1)
6.6 66
21.1 3.5
Pendiente (b sb) (mL ng -1)
7.77 0.12
10.5
0.998
0.996
% Linealidad
98.5
Resolucin Analtica (-1) (ngmL-1)
1.35
LOD, Long y Winefordner (ngmL-1)
1.56
LOD, Clayton (==0.05) (ngmL-1)
3.08
Repetitividad del mtodo

Para determinar la repetitividad del mtodo, se prepara una serie de once
disoluciones independientes, conteniendo 19.2 ngmL-1 de trans-resveratrol, se
irradian en las mismas condiciones utilizadas para el establecimiento de las rectas
de calibrado, y se registran sus espectros de emisin, manteniendo igualmente las
condiciones instrumentales empleadas en dicha experiencia. La desviacin
estndar relativa calculada sobre las seales medidas resulta ser 3.6%.
97
MEN
SALIR
Estudio extracto-espectrofluorimtrico de trans-resveratrol. Aplicacin al

anlisis de muestras de vino
Los mtodos de anlisis de resveratrol en muestras de vino, descritos en la
bibliografa, siempre hacen uso de tcnicas separativas, bien cromatogrficas o
bien electroforticas, pero no se han encontrado antecedentes sobre mtodos
espectroscpicos de anlisis de este analito en muestras de vino.
Por ello, en este apartado se describen los estudios encaminados a
proponer un nuevo mtodo de anlisis de resveratrol en vino, en presencia de su
principal interferencia, su glucsido, mediante fluorescencia fotoinducida.
Como paso previo a la determinacin mediante fluorescencia fotoinducida,
es necesaria una etapa de limpieza de la muestra para reducir la seal de fondo de
la matriz. Con este objetivo se lleva a cabo el estudio extracto-espectrofluorimtrico
del analito, con objeto de optimizar las condiciones para la extraccin lquidolquido que se usar en dicha etapa.
Influencia de la naturaleza del disolvente orgnico en la extraccin

En primer lugar se realizan ensayos mediante absorcin molecular, con
diferentes disolventes, y se comprueba que los mayores rendimientos de extraccin
se obtienen empleando ter etlico o acetato de etilo, y que, sin embargo, al
emplear cloroformo, prcticamente el 100 % del analito permanece en fase acuosa.
Por otra parte, el rendimiento cuntico de fluorescencia del fotoproducto de
resveratrol en ter etlico o en acetato de etilo est muy por debajo del observado
en el medio hidroetanlico anteriormente optimizado, por lo que ser necesario
98
MEN
SALIR
evaporar a sequedad los extractos orgnicos y reconstituir el residuo con la mezcla

hidroalcohlica. En base a estos estudios previos, se elige ter etlico como agente
extractante por dos motivos fundamentales: las recuperaciones del analito estn en
torno al 100 % y la elevada volatilidad del disolvente facilita su eliminacin, lo que
acortar sustancialmente el tiempo de anlisis.
Antes de optimizar las variables que influyen en la extraccin, se realizan
pruebas de extraccin en la matriz del vino, ya que ste va a ser el objeto final de
nuestro anlisis. Se aprecia una importante contribucin de la matriz en la seal de
fluorescencia, en las condiciones necesarias para la obtencin del espectro de
emisin del fotoproducto del trans-resveratrol. Sin embargo, se ha comprobado que
esta contribucin se reduce en gran medida, por obtencin de las seales
derivadas, fundamentalmente de la segunda derivada.
Por ello, a partir de estos resultados previos, para evaluar la recuperacin
del trans-resveratrol en ter, se sigue el siguiente procedimiento: se preparan 10.0
mL de disolucin acuosa de trans-resveratrol conteniendo 57 ngmL-1 y se extraen
con 10.0 mL de ter etlico, agitando vigorosamente durante dos minutos. Se
recoge el extracto orgnico, que se evapora a sequedad por paso de una corriente
de nitrgeno a temperatura ambiente. El residuo se redisuelve en 4.0 mL de etanol
y se aade agua ultrapura hasta completar un volumen final de 10.0 mL. Se
registran los espectros de fluorescencia y se obtiene la segunda derivada,
mediante el algoritmo de Savitzky-Golay19 ( = 5 nm). Los espectros sin derivar y
derivados, correspondientes a la disolucin reconstituida, sin irradiar e irradiada
durante 60 segundos en la lmpara de mercurio de alta presin, se recogen en la
Figura 13. Por comparacin del espectro segunda derivada de fluorescencia
fotoinducida correspondiente al extracto evaporado y reconstituido, con el espectro
19
Savitzky A., Golay M.J.E., Anal. Chem., 1964, 36:16271639
99
MEN
SALIR
segunda derivada correspondiente a un patrn de la misma concentracin en

etanol:agua 40:60 (v:v) e irradiado durante 60 s, se comprueba que la recuperacin
es prcticamente del 100 %. Por otra parte, como puede observarse en la misma
figura, la seal procedente de las muestras sin irradiar prcticamente se hace cero
en todo el intervalo de longitudes de onda al emplear la segunda derivada.
400
600
800
200
-4
-8
330
360
390
em (nm)
420
450
330
360
390
em (nm)
420
450
Figura 13.- A) Espectros de fluorescencia (exc= 261 nm) correspondientes al extracto etreo
evaporado y reconstituido con etanol:agua 40:60 (v:v) () y a un patrn de idntica concentracin
en el mismo medio disolvente (), sin irradiar () e irradiadas () durante 60 s. B) Segunda
derivada de los espectros de fluorescencia
Se procede a continuacin a estudiar la influencia de distintas variables

experimentales sobre la extraccin de resveratrol con ter etlico.
Influencia del pH en la extraccin
Para fijar el pH de la fase acuosa, se ensayan diversos tampones y
finalmente se decide utilizar tampones cido tartrico/tartrato monocido de sodio o
tartrato monocido de sodio/tartrato disdico, ya que no producen quenching de la
seal de fluorescencia, y adems son tampones presentes en el vino de forma
natural.
100
MEN
SALIR
Se preparan una serie de muestras conteniendo 57 ngmL-1 de resveratrol

y una concentracin 0.10 M de tampones cido tartrico/tartrato monocido de
sodio o tartrato monocido de sodio/tartrato disdico de distintos valores de pH, en
un volumen final de 10.0 mL de fase acuosa. Las muestras se extraen con 10.0 mL
de ter etlico, agitando durante dos minutos y dejando decantar las fases. Se
recoge la fase orgnica y se evapora a sequedad por paso de una corriente de
nitrgeno a temperatura ambiente; el residuo se redisuelve en 4.0 mL de etanol y
se aade agua ultrapura hasta completar un volumen final de 10.0 mL. Se registran
los espectros de fluorescencia de estas muestras tras irradiarlas durante 60
segundos y se calculan los espectros segunda derivada, mediante el algoritmo de
Savitzky-Golay ( = 5 nm). Tambin se registran los espectros de fluorescencia, y
se calculan los espectros segunda derivada, en idnticas condiciones, de
disolucines patrn conteniendo la misma concentracin de resveratrol en
etanol:agua 40:60 (v:v), a los distintos valores de pH e irradiadas durante 60
segundos.
La recuperacin se calcula por comparacin de la amplitud de los
espectros segunda derivada de fluorescencia fotoinducida, entre 364 y 374 nm
(2D364-374), con la seal correspondiente al patrn. En la Figura 14 se muestra el
porcentaje de recuperacin para cada uno de los valores de pH ensayados y se
observa que las recuperaciones son mximas y prximas al 100 % para valores de
pH comprendidos entre 4.5 y 6.0.
101
SALIR
120
100
% Recuperacin
MEN
80
60
40
20
0
2
pH
Figura 14.- Influencia del pH de la fase

acuosa sobre el porcentaje de recuperacin
en la extraccin
Para posteriores experiencias, se fija el pH por adicin de tampn tartrato

monocido de sodio/tartrato disdico de pH 5.0. Se procede a continuacin a
optimizar la concentracin de la disolucin reguladora de pH en la fase acuosa.
Para establecer la influencia de la concentracin de disolucin reguladora
se preparan disoluciones conteniendo 57 ngmL-1 de resveratrol, volmenes
variables de tampn tartrato monocido de sodio/tartrato disdico 0.26 M de pH 5.0
y agua desionizada hasta 10.0 mL. Estas disoluciones se extraen con 10.0 mL de
ter etlico agitando durante dos minutos. Cuando la separacin de fases es
completa, se recogen los extractos orgnicos y se opera como en el caso anterior.
La recuperacin est prxima al 100 % cuando la concentracin de tampn en fase
acuosa es de 0.15 M, que se selecciona como concentracin de tampn ptima
para futuras experiencias.
102
MEN
SALIR
Influencia del tiempo de agitacin

Para este estudio se preparan cuatro muestras acuosas conteniendo 57
ngmL-1 de resveratrol, cuyo pH se fija por adicin de 5.0 mL de tampn tartrato
monocido de sodio/tartrato disdico 0.30 M de pH 5.0 en un volumen final de 10.0
mL. Dichas muestras, tras la adicin de 10.0 mL de ter etlico se agitan durante
tiempos variables comprendidos entre 30 y 120 segundos. Una vez separadas las
fases, se recoge en cada caso la fase orgnica y se procede como en experiencias
anteriores.
El tiempo de agitacin no influye apreciablemente en la extraccin del
analito, y para posteriores experiencias se fija un minuto como tiempo de agitacin
adecuado.
Influencia de la relacin de fases

Para establecer la influencia de la relacin de fases se opera sobre
disoluciones acuosas conteniendo 0.57 g de resveratrol, el volumen necesario de
etanol absoluto para que el porcentaje de etanol en la fase acuosa sea del 3 %,
volmenes variables de disolucin reguladora tartrato monocido de sodio/tartrato
disdico 0.30 M de pH 5.0, tales que la concentracin final de tampn sea 0.15 M y
volmenes variables de agua desionizada. Todas ellas se extraen con 10.0 mL de
ter etlico, agitando durante un minuto. Se dejan en contacto ambas fases hasta
su completa separacin y se toma la fase orgnica, sobre la que se aplica el
tratamiento anteriormente descrito.
La relacin de fases no afecta prcticamente a la extraccin del analito, al
menos hasta un valor 4:1 (fase acuosa:fase orgnica), ya que en todos los casos la
103
MEN
SALIR
recuperacin est en torno al 100 %. Para posteriores experiencias se fija como

relacin de fases 2:1, ya que para mayores valores de dicha relacin se dificulta
mucho la recogida cuantitativa del extracto etreo.
Dada la necesidad de recurrir a la tcnica de derivadas para minimizar la
seal de la matriz del vino, se procede a comprobar la linealidad entre la
concentracin de trans-resveratrol en la muestra original y la amplitud del espectro
segunda derivada.
Para ello, se preparan disoluciones conteniendo entre 6.6 y 66 ngmL-1 de
trans-resveratrol, en etanol:agua 40:60, v:v, y se irradian durante 60 segundos. Se
registran los espectros de fluorescencia de las disoluciones irradiadas, en las
siguientes condiciones experimentales: 20C, rendija de excitacin 5 nm, rendija de
emisin 5 nm, voltaje del tubo fotomultiplicador 750 V y exc= 260 nm. Por ltimo, se
obtienen los correspondientes espectros segunda derivada, mediante el algoritmo
de Savitzky-Golay ( = 5 nm).
La mxima sensibilidad se obtiene al emplear como seal analtica la
amplitud de la derivada entre 356 y 364 nm (2D356-364 nm). En la Tabla 4 se recogen
los parmetros analticos de calidad para la determinacin de resveratrol mediante
fluorescencia fotoinducida segunda derivada.
104
MEN
SALIR
Tabla 4.- Parmetros analticos para la determinacin de trans-resveratrol
mediante fluorescencia fotoinducida segunda derivada

6.6 66
-0.0904 0.1310
0.182 0.004
0.397
0.995
0.991
% Linealidad
97.6
2.18
2.20
4.98

Se preparan once disoluciones conteniendo 19.2 ngmL-1 de transresveratrol, en etanol:agua 40:60, v:v, y se irradian durante 60 segundos. Se
registran sus espectros de emisin de fluorescencia, manteniendo las condiciones
experimentales empleadas en el establecimiento de la recta de calibrado, y se
obtienen los espectros segunda derivada, mediante el algoritmo de Savitzky-Golay
( = 5 nm).
La desviacin estndar relativa (n = 11) calculada sobre 2D356-364nm,
es 4.8 %.
105
MEN
SALIR
Determinacin de resveratrol en vino mediante fluorescencia

fotoinducida de segunda derivada
El procedimiento de extraccin y posterior medida de la fluorescencia
fotoinducida, anteriormente optimizado, se aplica al anlisis de trans-resveratrol en
muestras de vino. Dicho procedimiento se puede enunciar como sigue: en un
embudo de decantacin se aaden 0.10 mL de vino tinto 0.5 mL de vino blanco,
5.0 mL de disolucin reguladora tartrato monocido de sodio/tartrato disdico 0.30
M, de pH 5.0, y se diluye hasta un volumen final de 10.0 mL con agua ultrapura. La
solucin acuosa resultante se extrae con 5.0 mL de ter etlico, agitando durante 1
minuto. Se asla la fase etrea y se evapora a sequedad por paso de una corriente
de nitrgeno a temperatura ambiente. El residuo se redisuelve con 4.0 mL de
etanol absoluto y se aade agua ultrapura hasta completar 10.0 mL. Esta
disolucin es irradiada durante 60 segundos, bajo una lmpara de mercurio de alta
presin. Se registra el espectro de fluorescencia (exc= 260 nm) del fotoproducto
generado y se calcula su espectro segunda derivada, mediante el algoritmo de
Savytzki-Golay ( = 5 nm). Se toma como seal analtica la amplitud de dicho
espectro derivado entre 356 y 364 nm (2D356-364 nm).
En la Figura 15 se recogen los espectros de fluorescencia fotoinducida, as
como los espectros de primera y segunda derivada, correspondientes a una
muestra de vino tinto sin resveratrol aadido, y a otra a la que se le ha aadido
trans-resveratrol, sometidas al procedimiento de extraccin anteriormente
optimizado. Puede observarse cmo la seal fluorescente correspondiente a la
matriz del vino queda totalmente atenuada en el espectro segunda derivada.
106
SALIR
800
MEN
600
400
200
0
320
1
20
360
400
em (nm) (exc= 260 nm)
440
360
400
(nm) (exc= 260 nm)
440
360
400
em (nm) (exc= 260 nm)
440
10
0
-10
320
em
1.5
1
0.5
0
-0.5
-1
320
Figura 15.-Espectros de fluorescencia (exc = 260 nm) y espectros primera y segunda derivada,
correspondientes a una mezcla de vinos tintos de crianza sin resveratrol aadido (-----) y con 1.57
gmL-1 de trans-resveratrol (), extradas con ter etlico, y sometidas a una dilucin final de
100 veces
107
MEN
SALIR
El mtodo propuesto se aplica entonces al anlisis de distintas muestras de

vino de la regin. Las muestras de que se dispone se dividen en tres grandes
grupos:
-Vinos tintos jvenes
-Vinos tintos de crianza
-Vinos blancos
y se prepara, dentro de cada grupo, una mezcla, conteniendo volmenes idnticos
de todos lo vinos que integran ese grupo, con el objetivo de que estn
representadas las interferencias ms comunes en el anlisis de cualquier muestra
de vino.
Se aplica el mtodo de adicin patrn por triplicado, en cada mezcla de
vinos, y se construyen las correspondientes curvas seal medida vs concentracin
de trans-resveratrol aadida. Se aplica el test de comparacin de pendientes entre
las rectas obtenidas y la de calibrado, comprobndose que no existen diferencias
significativas entre las pendientes de ninguna de las rectas de adicin patrn y la
recta de calibrado, pudindose concluir, por tanto, que no existe efecto de matriz.
Se comprob mediante cromatografa de lquidos de alta resolucin
(HPLC)20 que las concentraciones de resveratrol en las muestras analizadas estn
por debajo de los lmites de deteccin de la tcnica. Los porcentajes medios de
recuperacin para cada mezcla de vinos y para cada nivel de concentracin, se
han resumido en la Tabla 5, observndose que son muy satisfactorios en todos los
casos.
20
Galeano Daz T., Durn Mers I., Airado Rodrguez, D., J. Sep. Sci., 2007, 30:3110-3119
108
MEN
SALIR
Tabla 5.- Resultados obtenidos en la determinacin de trans-resveratrol en mezclas de vinos tintos
jvenes y de crianza y blancos
VINO
Aadido (gmL-1)
Tinto
Blanco
% Recuperacin (% RSD)
Tinto Joven
Tinto Crianza
0.63
107 (5);
109 (4)
0.94
110 (4);
108 (8)
1.6
104 (2);
111 (3)
3.1
98 (4);
105 (3)
4.7
104 (3);
101 (3)
0.13
100 (8)
0.19
94 (7)
0.31
102 (4)
0.63
96 (5)
0.94
102 (3)
Se ha analizado tambin un vino tinto comercial (vino tinto de mesa

Carrefour), conteniendo una cantidad mayor de resveratrol, y el resultado obtenido
(1.12 gmL-1 (8 % RSD)) ha sido tambin satisfactoriamente validado mediante
HPLC.
Perspectivas de futuro
Se ha comprobado la retencin de trans-resveratrol sobre membranas de
nylon, de manera que las principales perspectivas de futuro pasaran por el
desarrollo de mtodos de determinacin sobre soporte slido.
109
MEN
SALIR
MEN
SALIR
CAPTULO III
ANLISIS DE PICEIDO EN VINOS MEDIANTE
FLUORESCENCIA FOTOINDUCIDA
APLICANDO SEGUNDA-DERIVADA A LOS
ESPECTROS DE EMISIN
MEN
SALIR
CAPTULO III. Determinacin fluorimtrica de piceido en vino
112
MEN
SALIR
ANTECEDENTES
El piceido es el principal derivado glucosilado del resveratrol e igual que l
presenta los ismeros trans y cis. Este compuesto ha recibido la misma atencin
que el resveratrol, porque en los productos derivados de la uva, la concentracin de
la forma glucosada es significativamente mayor que la de la forma aglicona1, 2, y la
relacin entre las dos formas depende entre otros factores de la fermentacin y de
las condiciones ecolgicas2.
La tcnica ms utilizada para su determinacin en vinos es mediante
HPLC, efectuando en casi todos los casos una elucin en gradiente utilizando
como disolvente menos activo una disolucin reguladora de carcter cido y
llevando a cabo la deteccin mediante sistema de diodos3-6, fluorescencia7,
combinacin en lnea de diodos y fluorescencia8 y mediante acoplamiento con
Lamuela Ravents R.M., Romero Prez A.I., Waterhouse A.L., de la Torre Boronat M.C., J. Agric.
Food Chem., 1995 43:281-283
2 Moreno-Labanda J.F., Mallavia R., Prez-Fons L., Lizama V., Saura D., Mico V., J. Agric. Food
Chem., 2004, 52:5396-5403
3 Ribeiro de Lima M.T., Waffo-Tguo P., Teissedre P.L., Pujolas A., Vercauteren J., Cabanis J.C.,
Mrillon J.M., J. Agric. Food Chem., 1999, 47:2666-2670
4 Burns J., Yokota T. , Ashihara H. , Jean M.E.J., Crozier A. , J. Agric. Food Chem., 2002, 50:33373340
5 Vitrac X., Bornet A.,Vanderline R., Valls J., Richard T., Delaunay J.C., Mrillon J.M., Teissdre
P.L., J. Agric. Food Chem. 2005, 53:5664-5669
6 Abert Vian M., Tomao V., Gallet S., Coulomb P.O., Lacombe J.M., J. Chromatogr. A, 2005,
1085:224-229
7 Vitrac X., Monti J.P., Vercauteren J., Deffieux G., Mrillon J.M., Anal. Chim. Acta, 2002, 458:103110
8 Jeandet P., Breuil A.C., Adrian M., Weston L.A., Debord S., Meunier P., Maume G., Bessis R.,
Anal. Chem.,1997, 69:5172-5177
1
113
MEN
SALIR
espectrometra de masas9-11. La electroforesis capilar con deteccin de diodos

tambin ha sido empleada para su anlisis12.
Con respecto a las etapas previas de tratamiento las muestras de vino para
su posterior anlisis, lo mas usual es realizar una extraccin lquido-lquido con
acetato de etilo, seguida de una evaporacin y redisolucin del residuo en la fase
mvil utilizada9, 11. Tambin se han propuesto realizar una etapa de limpieza a
travs de una columna de intercambio inico3. La extraccin en fase slida es otra
posibilidad muy utilizada tanto en cromatografa como en electroforesis10, 12. En
algunos casos, las muestras de vino son introducidas directamente en el sistema
cromatogrfico, previa filtracin a travs de un filtro de celulosa 4, 6, 7.
En cuanto a sus propiedades espectroscpicas, este compuesto no
presenta fluorescencia nativa pero se ha comprobado que la irradiacin con luz UV
provoca la conversin del trans al cis-ismero13, 14, el cual rpidamente evoluciona
hasta formar un compuesto que presenta elevada fluorescencia. Este hecho es lo
que nos ha permitido explorar la posible determinacin mediante fluorescencia
fotoinducida del piceido en muestras de vino.
Bravo M.N., Silva S., Coelho A.V., Vilas Boas, L., Bronze M.R., Anal. Chim. Acta, 2006, 563: 84-92
Domnguez C., Guilln D.A., Barroso C.G., J. Chromatogr. A, 2001, 918:303-310
11 Pozo-Bayn M.A., Hernndez M.T., Martn-lvarez P.J., Polo M.C., J. Agric. Food Chem., 2003,
51: 2089-2095
12 Brandoline V., Maietti A., Tedeschi P., Durini E., Vertuani S., Manfredini S., J. Agric. Food Chem.,
2002, 50:7407-7411
13 Roggero J.P., J. Food Comp. Anal., 2000, 13:93-97
14 Roggero J.P., Garca-Parrilla C., Sci. Aliments 1995, 15, 411-422
9
10
114
MEN
SALIR
Estudio bsico sobre las propiedades de inters analtico de trans-pieido
Caracterizacin absorbente y luminiscente en distintos disolventes
Con el objetivo de caracterizar fotomtricamente y fluorimtricamente el
trans-piceido, se preparan disoluciones de dicho analito, por dilucin de alcuotas
de 0.50 mL de una disolucin de 57 gmL-1 de analito en etanol con distintos
disolventes, hasta un volumen final de 25.0 mL. El porcentaje de etanol (2 %) en
estas disoluciones es suficientemente pequeo para no modificar las propiedades
de los mismos. Los disolventes empleados son agua y disolventes orgnicos de
distintas polaridades como metanol, etanol, acetonitrilo, dimetilsulfxido, N,Ndimetilformamida, 1,4-dioxano, ciclohexano y hexano, as como mezclas
hidroetanlicas de diferente composicin.
En todos los casos se registran los espectros de absorcin utilizando como
blanco el correspondiente disolvente, igualmente con un 2 % de etanol. En la
Figura 1 se recoge el espectro en medio acuoso observndose una banda de
absorcin centrada a 312 nm con un ancho de banda de 20 nm, en la que se
distinguen dos mximos centrados a 306 y 318 nm, respectivamente. La fisonoma
del espectro no se ve afectada por la naturaleza del disolvente.
115
MEN
SALIR
0.08
Absorbancia
0.06
0.04
0.02
0
240
280
320
(nm)
360
400
Figura 1.- Espectro de absorcin correspondiente a una disolucin acuosa (2.0 % v/v etanol)
conteniendo 1.14 gmL-1 de trans-piceido
Los espectros fluorescentes de excitacin y emisin, en algunos de los

disolventes utilizados, se recogen en la Figura 2. Se observa que en todos los
medios ensayados este compuesto es dbilmente fluorescente, y que en
acetonitrilo, etanol, agua o mezclas hidroetanlicas presenta dos mximos de
excitacin, centrados a 225 y 318 nm, y un nico mximo de emisin centrado a
390 nm. En dimetilformamida se observa un aumento de su rendimiento cuntico
de fluorescencia, as como la desaparicin del primer mximo de excitacin. Por
otra parte, el espectro de emisin se desplaza hipsocrmicamente hasta 373 nm en
hexano, ciclohexano y 1,4-dioxano.
116
SALIR
16
MEN
12
8
4
0
200
300
(nm)
400
500
Figura 2.- Espectros de excitacin y emisin de disoluciones de trans-piceido en diferentes

medios: etanol:agua 40:60, v:v (exc/em 318/390 nm) (), dimetilformamida (2.0 % etanol)
(exc/em 323/390 nm) () y hexano (2.0 % etanol) (exc/em 315/373 nm) (). [trans-piceido]
= 1.14 gmL-1
Influencia de la acidez del medio y clculo de contantes de ionizacin

de trans-piceido
Una vez caracterizado el analito espectroscpicamente en distintos
disolventes, se procede al estudio de la influencia de la acidez del medio sobre sus
propiedades absorbentes y fluorescentes.
El estudio se lleva a cabo en medio acuoso y en medio hidroetanlico,
conteniendo un 40 % (v/v) de etanol. La fuerza inica se fija en todos los casos por
adicin de KCl, en una concentracin final de 0.10 molL-1. La variacin del pH se
efecta por adicin de pequeos volmenes de disoluciones diluidas de HCl y
NaOH. La acidulacin y la alcalinizacin de la disolucin se llevan a cabo sobre
alcuotas independientes de la misma, puesto que no se dispone de datos acerca
de la reversibilidad de los equilibrios en que este compuesto participa.
117
MEN
SALIR
Los espectros ms representativos, registrados en todo el rango de pH, as

como la variacin de las seales fotomtricas a distintas longitudes de onda, con el
pH, en los dos medios de trabajo ensayados, se recogen en las Figuras 3 y 4.
Tanto en medio hidroetanlico como acuoso, a medida que disminuye la
acidez se produce un desplazamiento batocrmico del mximo de absorcin desde
306 a 344 nm. Los datos derivados de estas experiencias nos han permitido calcular los valores de pKa en ambos medios y los resultados obtenidos, mediante los
mtodos de Stenstrm y Goldsmith15 y Wilson y Lester16, se resumen en la Tabla 1.
0.2
< 7.0
0.12
0.08
0
320
(nm)
360
400
344 nm
0.08
0.04
280
306 nm
0.12
0.04
240
0.16
10.5
Absorbancia
Absorbancia
0.16
0.2
> 12.0
pH
10
12
14
Figura 3.- Influencia del pH sobre: (A) los espectros de absorcin de disoluciones hidroetanlicas de
trans-piceido y (B) sobre la absorbancia a 306 y 344 nm. [trans-piceido] = 2.28 gmL-1,
etanol:agua, 40:60 v:v
15
16
Stenstrm W., Goldsmith. N., J. Phys. Chem., 1926, 30:1683-1687

Wilson R.F., Lester G.W., Talanta, 1963, 10:319-322
118
SALIR
0.2
A
< 7.0
0.16
> 11.0
9.8
0.12
0.08
0.08
0.04
0
280
320
(nm)
360
306 nm
0.12
0.04
240
0.16
Absorbancia
0.2
Absorbancia
MEN
400
344 nm
pH
10
12
14
Figura 4.- Influencia del pH sobre: (A) los espectros de absorcin de disoluciones acuosas de transpiceido y (B) sobre la absorbancia a 306 y 344 nm. [trans-piceido] = 2.00 gmL-1
El comportamiento cido-base de este analito tambin se ha estudiado

mediante fluorescencia, siguiendo el mismo mtodo operatorio que en absorcin
molecular y trabajando con disoluciones que contienen 0.97 gmL-1 de transpiceido.
En las Figuras 5 y 6 se recogen los espectros de excitacin y emisin del
analito en medio cido y bsico, en cada uno de dos medios de trabajo ensayados,
as como la variacin de la seal de fluorescencia, medida a las longitudes de onda
correspondientes a los mximos de fluorescencia de las formas cida y bsica, con
el pH.
Como se observa en la Figura 5, los espectros de excitacin y emisin
fluorescente de trans-piceido en etanol:agua 40:60, v:v, se desplazan
batocrmicamente de 292 a 344 nm y de 392 a 447 nm, respectivamente, como
consecuencia del aumento del pH.
119
MEN
SALIR
100
100
80
< 7.0
60
> 11.5
40
20
exc/em= 292/392 nm
80
60
40
exc/em= 344/447 nm
20
0
0
200
300
(nm)
400
500
pH
10
12
14
Figura 5.- Influencia del pH sobre: (A) los espectros de excitacin y emisin de disoluciones
hidroetanlicas de trans-piceido y (B) sobre la intensidad de fluorescencia. [trans-piceido] = 0.97
gmL-1, etanol:agua, 40:60 v:v,
600
> 11.0
600
400
> 6.0
200
B
exc/em= 344/457 nm
400
exc/em= 318/405 nm
200
0
200
300
400
(nm)
500
600
pH
10
12
14
Figura 6.- Influencia del pH sobre: (A) los espectros de absorcin de disoluciones acuosas de transpiceido y (B) sobre la intensidad de fluorescencia. [trans-piceido] = 1.14 gmL-1
120
SALIR
En medio acuoso, adems del desplazamiento batocrmico de los

mximos de excitacin y emisin de 318 a 344 nm y de 405 a 457 nm,
respectivamente, se observa un aumento del rendimiento cuntico de fluorescencia
en medio bsico.
En ambos casos se observa un punto isoemisivo, lo que indica la presencia
de dos especies en equilibrio, es decir la existencia de un equilibrio de disociacin
cido-base. Para dichos equilibrios, se han calculado valores de pKa en medio
hidroetanlico, y en medio acuoso. Los resultados obtenidos se presentan en la
Tabla 1.
FOTOMETRA
Tabla 1.- Valores de pKa calculados para el trans-piceido en distintos medios, mediante fotometra y
fluorescencia
FLUORESCENCIA
MEN
Etanol:Agua
40:60, v:v
Agua
Etanol:Agua
40:60, v:v
Agua
Mtodo de Clculo
pKa trans-piceido
10.2 0.1
Wilson y Lester
10.3
9.9 0.9
Wilson y Lester
9.3
10.4 0.1
Wilson y Lester
10.4
8.8 0.3
Wilson y Lester
8.8
* Valor medio Desviacin Estndar
121
MEN
SALIR
Solamente se ha encontrado un artculo17 en el cual se describe el clculo

de la constante de disociacin de primer orden de trans-piceido en medio acuoso,
mediante electroforesis, obtenindose un valor de pKa1 = 9.40, valor bastante en
consonancia con el calculado por nosotros, mediante fotometra en medio acuoso,
empleando el mtodo de Wilson y Lester.
Se procede a estudiar la relacin entre la concentracin de trans-piceido
puesta y la seal fotomtrica o fluorescente medida, y al establecimiento de las
correspondientes rectas de calibrado.
Para obtener las seales fotomtricas se procede aadiendo en la cubeta
de medida 2.00 mL de agua ultrapura y volmenes crecientes, comprendidos entre
0.020 y 0.25 mL, de la disolucin de 57 gmL-1 de trans-piceido en etanol, y
registrando los espectros de absorcin en el rango de longitudes de onda
comprendido entre 240 y 360 nm.
Las medidas de fluorescencia, se realizan aadiendo directamente en la
cubeta de medida 1.80 mL de agua y 1.20 mL de etanol absoluto, con el objetivo de
mantener la composicin ptima del medio de trabajo porque la emisin
fluorescente depende del % de etanol en el medio. Sobre esta mezcla
hidroetanlica, una vez desgasificada por ultrasonidos, se aaden volmenes
sucesivos de una disolucin etanlica de trans-resveratrol conteniendo 19 gmL-1,
en incrementos de 10 L, hasta llegar a 0.10 mL. Tras cada nueva adicin, se
registran los espectros de emisin de fluorescencia en las siguientes condiciones
17 Cao J., Chen G.H., Du Y.S., Hou F.F., Tian Y.L., J. Liquid Chromatogr. & Rel. Technol., 2006,
29:1457-1463
122
MEN
SALIR
instrumentales: 20 C, rendija de excitacin 5 nm, rendija de emisin 5 nm, voltaje

del tubo fotomultiplicador 800 V y exc = 318 nm.
Las ecuaciones de las rectas obtenidas mediante ambas tcnicas, as
como los parmetros analticos de calidad, se encuentran recogidos en la Tabla 2.
Tabla 2.- Parmetros analticos de calidad para la determinacin fotomtrica y fluorimtrica de
trans-piceido
Fotometra
Fluorescencia
A306 nm
I.F.318/390 nm
0.60 6.00
0.060 0.60
-0.0037 0.0010
26.7 4.0
0.0727 0.0003
687 11
0.0033
10.1
0.999
0.997
0.999
0.995
% Linealidad
99.6
98.4
0.0450
0.0147
LOD, Long y Winefordner18 (gmL-1)
0.0433
0.0326
LOD, Clayton19 (==0.05) (gmL-1)
0.101
0.0352
Seal Analtica
Rango Lineal (gmL-1)
18
19
Long G.L., Winefordner J.D., Anal. Chem., 1983, 55:712724

Clayton C.A., Hines J.W., Elkins P.D., Anal. Chem., 1987, 59:25062514
123
MEN
SALIR
Repetitividad de los mtodos

Este estudio se realiza siguiendo los procedimientos que se describen:
Mtodo fotomtrico: En la cubeta de medida, se depositan 2.0 mL de agua
ultrapura y 50 L de disolucin etanlica de trans-piceido, conteniendo 57 gmL-1,
y se mide su absorbancia a 306 nm. El proceso se repite once veces. Se calcula la
media y la desviacin estndar de las mediciones realizadas, as como la
desviacin estndar relativa, como la razn entre ambas.
Mtodo fluorimtrico: En la cubeta de medida de fluorescencia se
depositan 1.20 mL de etanol absoluto y 1.80 mL de agua ultrapura, la mezcla
hidroetanlica se pasa por un bao de ultrasonidos para ser desgasificada, y sobre
ella se aaden 50 L de disolucin etanlica diluida de trans-piceido, conteniendo
19 gmL-1. Se registra su espectro de emisin de fluorescencia, en condiciones
idnticas a las empleadas en el establecimiento de la recta de calibrado. El proceso
se repite once veces. Se calcula la media y la desviacin estndar de las seales
medidas a 385 nm, as como la desviacin estndar relativa del conjunto de
mediciones.
Las desviaciones estndar relativas, calculadas en cada caso sobre las
seales medidas, resultan ser 1.9 % y 5.8 % respectivamente.
Efecto de la irradiacin ultravioleta externa sobre las propiedades
absorbentes y fluorescentes de trans-piceido
Se lleva a cabo un estudio sobre la fotorreaccin que sufre el trans-piceido,
al exponerlo a radiacin UV intensa, mediante fotometra y fluorescencia molecular,
estudindose como influye el disolvente y la acidez del medio.
124
MEN
SALIR
Influencia del disolvente

Se lleva a cabo el estudio de la fotorreaccin que sufre el trans-piceido en
distintos medios de trabajo, mediante fotometra y fluorescencia molecular. Para
ello, se preparan disoluciones del analito, con disolventes orgnicos de diferentes
polaridades, as como en agua y en mezclas hidroetanlicas, y, en cada uno de los
casos, se realiza una influencia del tiempo de irradiacin, bajo una lmpara de
mercurio de alta presin. Cronolgicamente, los ensayos mediante fluorescencia se
realizaron previamente a los de fotometra, de manera que mediante fotometra
slo se estudi la fotorreaccin en medios hidroetanlicos, por los motivos que ms
adelante se exponen.
Absorcin molecular.- Como ya se ha comentado, el espectro de
absorcin de trans-piceido, no se ve afectado por el disolvente, siendo idntico en
etanol, en agua, y en medios hidroetanlicos de diferente composicin. No ocurre
lo mismo con los fotoproductos que se obtienen como consecuencia de la
irradiacin de sus disoluciones bajo una lmpara de mercurio de alta presin. La
cintica de los foto-procesos tambin se ve influenciada por la composicin del
medio de trabajo.
Para estudiar la influencia del disolvente sobre las fotorreacciones que
sufre este analito, se preparan disoluciones, en presencia de porcentajes
crecientes de etanol, conteniendo todas ellas 1.14 gmL-1 de trans-piceido. Cada
una de estas disoluciones se irradia durante intervalos de tiempo acumulativos y se
registran los correspondientes espectros de absorcin entre 240 y 360 nm, Figura
7.
125
MEN
SALIR
Como puede observarse, la irradiacin ultravioleta de las disoluciones

acuosas, etanlicas o hidroetanlicas de trans-piceido, provoca la desaparicin
inmediata de la banda de absorcin centrada a 312 nm, en favor de un nuevo
mximo de absorcin centrado a 290 nm, correspondiente a cis-piceido, segn se
encuentra descrito en la bibliografa13, 14. Para tiempos de irradiacin superiores a
60 segundos, se observa la aparicin de un nuevo mximo centrado a 261 nm, que
alcanza su mxima intensidad para disoluciones conteniendo un 40 % de etanol, e
irradiadas durante 180 segundos, y que es insignificante en disoluciones
puramente etanlicas y muy dbil en disoluciones con porcentajes acuosos
superiores al 60 %. Cuando las disoluciones de trans-piceido son irradiadas
durante un tiempo de 10 minutos tiene lugar la destruccin de este ltimo
fotoproducto.
Para concluir, merece la pena destacar que se ha comprobado, a travs de
los estudios llevados a cabo mediante absorcin molecular que el tiempo de
irradiacin necesario para la obtencin de los fotoproductos es mayor cuanto mayor
es la concentracin de trans-piceido en la disolucin original.
126
SALIR
0.09
0.06
Absorbancia
Absorbancia
0.09
0.03
0.09
0.06
0.03
0
240
280
(nm)
320
360
240
0.09
0.06
Absorbancia
Absorbancia
MEN
0.03
280
(nm)
320
360
320
360
0.06
0.03
240
280
(nm)
320
360
240
280
(nm)
Figura 7.- Influencia del tiempo de irradiacin sobre los espectros de absorcin de disoluciones
conteniendo 1.14 gmL-1 de trans-piceido en etanol absoluto (A) y etanol:agua 60:40, v:v (B),
40:60, v:v (C) y 4:96, v:v (D), sin irradiar () e irradiadas durante 5 segundos (), 30 segundos
(), 60 segundos (), 120 segundos (), 180 segundos () y 600 segundos ()
127
SALIR
Fluorescencia molecular.- Para examinar los efectos de la irradiacin

ultravioleta externa sobre el comportamiento fluorescente de trans-piceido, se
prepara una disolucin, conteniendo 0.30 gmL-1 de analito, en etanol:agua 40:60,
v:v, y se registran los espectros de excitacin y emisin de fluorescencia de dicha
disolucin, recin preparada, y tras ser irradiada durante un tiempo, bajo una
lmpara de mercurio de alta presin.
Se comprueba que la irradiacin ultravioleta externa de disoluciones
hidroetanlicas de trans-piceido, tiene como consecuencia la generacin de
fotoproductos altamente fluorescentes, como puede observarse en la Figura 8.
Los espectros de estos fotoproductos se caracterizan por presentar un
intenso y agudo mximo de excitacin centrado a 261 nm, y dos mximos de
emisin, no menos agudos, a 361 y 379 nm, respectivamente.
1600
MEN
1200
800
400
0
200
300
(nm)
400
500
Figura 8.- Espectros de excitacin y emisin

correspondientes a una disolucin conteniendo 1.20
gmL-1 de trans-piceido, en etanol:agua 40:60, v:v,
aislada de la luz () (exc/em 318/390 nm), e
irradiada durante 180 segundos (), (exc/em
261/361 nm )
128
MEN
SALIR
El estudio de la influencia del tiempo de irradiacin se lleva a cabo en

disolventes orgnicos de distintas polaridades. Se ensayan, concretamente,
metanol, etanol, acetonitrilo, dimetilsulfxido, N,N-dimetilformamida, 1,4-dioxano,
ciclohexano y hexano. Se observa que la naturaleza del fotoproducto es
independiente del disolvente, sin embargo la velocidad de las fotorreacciones s
est influida por el disolvente, siendo mayor en medios puramente orgnicos que
en medios hidroorgnicos. Por otro lado, tambin depende del disolvente el
rendimiento cuntico de fluorescencia de los fotoproductos, que es mximo en
medios hidroetanlicos, con proporciones similares de etanol y agua.
Se selecciona, por tanto, el medio hidroetanlico como ptimo para el
desarrollo de la fotorreaccin, procedindose a continuacin a la optimizacin de
las proporciones relativas de etanol y agua en el medio de trabajo. Para ello se
preparan una serie de disoluciones, en mezclas de etanol y agua, con distintas
proporciones de ambos disolventes, conteniendo todas ellas 0.60 gmL-1 de transpiceido y se irradian durante diferentes tiempos. Las seales obtenidas se
representan en la Figura 9A.
El comportamiento general, en todas las mezclas ensayadas, consiste en
un aumento de la seal de fluorescencia fotoinducida con el tiempo de irradiacin,
hasta alcanzar un mximo, seguido por un decaimiento de la seal, probablemente
debido a la destruccin de los fotoproductos y a la generacin de otros compuestos
no fluorescentes. En disoluciones puramente etanlicas, el tiempo de irradiacin
ptimo est en torno a 50 segundos, pero el rendimiento cuntico de fluorescencia
de los fotoproductos es muy pequeo. A medida que disminuye el porcentaje de
etanol, aumentan tanto el tiempo de irradiacin ptimo como las seales de
fluorescencia fotoinducida. Las mximas seales se obtienen en medios con un
porcentaje de etanol comprendido entre el 30 % y el 50 % con un tiempo de
129
MEN
SALIR
irradiacin de 180 segundos. Por ello para las siguientes experiencias se elige
como medio de trabajo ptimo una mezcla etanol:agua 40:60, v:v.
600
I. F. (361 nm) (exc = 261 nm)
I. F. (361 nm) (exc = 261 nm)
600
400
200
400
200
0
0
100
200
300
20
40
60
% v. Etanol
80
100
Figura 9.- (A) Influencia del tiempo de irradiacin sobre disoluciones de trans-piceido en etanol
absoluto () y etanol:agua 80:20, v:v (), 40:60, v:v () y 10:80, v:v (). (B) Influencia
del porcentaje de etanol sobre la intensidad de fluorescencia irradiando durante 180 segundos.
[trans-piceido] = 0.60 gmL-1, exc = 261 nm, em = 361 nm
Adicionalmente, se estudia por separado cmo afecta la presencia de

etanol a la fotorreaccin y al rendimiento cuntico de fluorescencia de los
fotoproductos, encontrndose que en el caso del piceido, se obtienen mayores
seales irradiando muestras 100 % acuosas y aadiendo etanol hasta completar el
40 % v/v. previamente a la medida de la fluorescencia.
Influencia de la acidez del medio sobre las propiedades absorbentes y
fluorescentes de los fotoproductos de piceido
Para llevar a cabo el estudio de la influencia de la acidez del medio sobre
las propiedades espectroscpicas de los fotoproductos de piceido, se procede
irradiando disoluciones puramente acuosas de trans-piceido, y aadiendo
posteriormente etanol absoluto hasta completar el 40 % v/v. Se preparan de esta
manera dos disoluciones conteniendo 3.7 y 0.57 gmL-1, para ser estudiadas
130
SALIR
mediante fotometra y fluorescencia, respectivamente. Los espectros de absorcin

y los espectros fluorescentes de excitacin y emisin, a distintos valores de pH, se
encuentran recogidos en las Figuras 10 y 11, respectivamente, as como la
variacin de las seales fotomtrica y fluorescente con el pH.
0.3
0.28
8.0
261 nm
> 12
0.24
0.2
11.1
Absorbancia
Absorbancia
MEN
10.8
10.4
0.1
10.0
0.2
0.16
282 nm
0.12
0.08
0
240
260
280
300 320
(nm)
340
360
pH
10
12
14
Figura 10.- Influencia del pH sobre: (A) Espectros de absorcin de los fotoproductos del transpiceido (3.7 gmL-1) en etanol:agua 40:60, v:v y (B) sobre la absorbancia medida a 261 y 282 nm
El espectro de absorcin de disoluciones cidas, neutras y ligeramente

bsicas de los fotoproductos de piceido muestra un slo mximo centrado a 261
nm, como puede observarse en la Figura 10A, cuya posicin e intensidad
permanecen constantes a pH inferiores a 8.0. Para valores superiores de pH se
observa un decaimiento de la seal y la aparicin de un nuevo mximo, centrado a
271 nm, que existe slo en el intervalo de pH 10.5-11.0. En medios ms bsicos se
observa un desplazamiento batocrmico y un efecto hipercrmico, apareciendo un
nuevo mximo centrado a 282 nm, cuya posicin e intensidad se mantiene
prcticamente constante a partir de pH 12.0.
131
MEN
SALIR
600
< 8.0
I. F. (361 nm) (exc= 261 nm)
600
400
9.9
200
> 11.5
400
200
0
200
250
300
350
(nm)
400
450
pH
10
12
14
Figura 11.- Influencia del pH sobre: (A) Los espectros de excitacin y emisin de los fotoproductos
de trans-piceido (0.57 gmL-1) y (B) sobre la intensidad de fluorescencia (exc/em = 261/361 nm)
Los espectros de excitacin y emisin de los fotoproductos de piceido en

medio cido y neutro estn caracterizados por mximos centrados a 261 nm y 361
y 379 nm, respectivamente, Figura 11A. Los fotoproductos son muy poco
fluorescentes a pH superiores a 11.0, no obstante puede observarse un
desplazamiento batocrmico del mximo de emisin hasta 271 nm, as como la
aparicin de un nico mximo de emisin centrado a 420 nm. La variacin de la
seal fluorescente (exc/em = 261/361 nm) con el pH, Figura 11B, muestra un
drstico decaimiento a partir de pH 8.0, obtenindose una seal prcticamente nula
para pH superiores a 11.0.
Finalmente, se ha estudiado fotomtrica y fluorimtricamente la
reversibilidad de los equilibrios cido-base de los fotoproductos de piceido. Para
ello, se alcalinizan las muestras, hasta un pH en torno a 12, y se acidulan a
continuacin, hasta un pH prximo al inicial. Por comparacin de los espectros
correspondientes a las muestras neutras originales, y los registrados tras la
variacin del pH, se deduce que, en el caso de trans-piceido, el proceso cido base
es totalmente reversible, tratndose pues, de un autntico equilibrio cido-base.
132
MEN
SALIR
No obstante, no se ha calculado el valor de la constante de ionizacin

porque cromatogrficamente se ha comprobado la formacin de dos fotoproductos
fluorescentes.
Establecida la influencia de las variables qumicas anteriormente
detalladas, se procede a continuacin a estudiar la relacin entre la concentracin
de piceido puesta y la seal de fluorescencia fotoinducida medida, y al
establecimiento de la correspondiente recta de calibrado.
Para ello, se preparan disoluciones, en el rango de concentraciones entre
6.0 y 30 ngmL-1 de trans-piceido. La irradiacin se lleva a cabo en medio acuoso,
durante 180 segundos, con la posterior adicin de etanol absoluto hasta completar
el 40 % v/v. Se registran los espectros de emisin de fluorescencia de las
disoluciones irradiadas, en las siguientes condiciones experimentales: 20 C,
rendija de excitacin 5 nm, rendija de emisin 5 nm, voltaje del tubo
fotomultiplicador 750 V y exc = 261 nm. Los parmetros analticos se resumen en la
Tabla 3.
133
MEN
SALIR
Tabla 3.- Parmetros analticos para la determinacin, mediante
fluorescencia fotoinducida de trans-piceido
Seal Analtica
I.F. 261/361 nm
6.0 30
18.2 1.9
6.68 0.11
4.55
0.998
0.997
% Linealidad
98.4
0.681
0.850
1.68

Se preparan once disoluciones independientes, conteniendo 14.3 ngmL-1
de trans-piceido, previamente irradiadas en las mismas condiciones que en el la
recta de calibrado, y se registran sus espectros de emisin, manteniendo las
condiciones experimentales empleadas en el establecimiento de la recta de
calibrado. La desviacin estndar relativa resulta ser del 2.3 %.
134
MEN
SALIR
Estudio extracto-espectrofluorimtrico del trans-piceido. Aplicacin al

anlisis de muestras de vino
Los mtodos descritos en la bibliografa para el anlisis de piceido en
diversas muestras complejas siempre hacen uso de tcnicas separativas, bien
cromatogrficas o electroforticas, pero actualmente no existen propuestos
mtodos espectroscpicos de anlisis de este compuesto.
Se pretende desarrollar un nuevo mtodo de anlisis de piceido en vino, en
presencia de su principal interferencia, su aglicona, mediante fluorescencia
fotoinducida.
Como paso previo a la determinacin mediante fluorescencia fotoinducida,
es necesario una etapa de limpieza de la muestra, que se llevar a cabo mediante
una extraccin lquido-lquido de las muestras de vino, para reducir la seal de
fondo de la matriz. Por ello, se lleva a cabo un estudio extractoespectrofluorimtrico del analito, con objeto de optimizar las condiciones para la
extraccin.
Estudios previos
La extraccin de piceido de la matriz acuosa, con disolventes orgnicos, es

ms problemtica que la extraccin de resveratrol. Al emplear ter etlico como
disolvente, prcticamente el 100 % del analito permanece en la fase acuosa,
probablemente debido a la elevada polaridad del residuo de glucosa, presente en la
molcula de piceido. Se ha comprobado que las mejores recuperaciones se
obtienen al extraer con acetato de etilo no el trans-piceido, sino sus fotoproductos.
As, se consiguen los mejores resultados extrayendo disoluciones acuosas de
135
MEN
SALIR
piceido irradiadas durante 180 segundos. El pH de estas disoluciones se fija a 5.0,

tras la irradiacin, por adicin de tampn tartrato monocido de sodio/tartrato
disdico, ya que se comprueba tambin que la presencia de tampn en el proceso
de irradiacin supone una disminucin drstica en la seal de fluorescencia
fotoinducida, debido posiblemente a que el in tartrato impide de alguna manera
que se complete la reaccin fotoqumica.
Dado que la recuperacin no es total y se observa una acusada influencia
de diversas variables sobre la extraccin de los fotoproductos de piceido, se ha
utilizado en este caso el Diseo de Experimentos y la Metodologa de Superficie de
Respuesta para la optimizacin del proceso.
Diseo de experimentos y metodologa de la superficie de respuesta
La metodologa de superficie de respuesta es un conjunto de tcnicas
estadsticas y matemticas para el descubrimiento del mejor valor de una variable
de respuesta (variable de salida) y los valores de los factores (variables de entrada)
que producen dicho valor ptimo.
En este mtodo, el sistema se representa por una ecuacin emprica,

basada en ecuaciones preseleccionadas, usando los datos experimentales
obtenidos del sistema para el ajuste de los correspondientes coeficientes.
Normalmente se usan modelos polinmicos de segundo orden con trminos
cruzados, que permiten describir concavidades o convexidades de la superficie. La
superficie representada por dicho modelo polinmico se denomina Superficie de
Respuesta. As, para el estudio de dos variables, se puede considerar que la
superficie de respuesta se ajusta al modelo:
136
MEN
SALIR
Respuesta = b0 + b1A + b2B + b12AB + b11A2 + b22B2

y, en general,
Respuesta = b0 + biXi + bijXiXj + biiXi2
El ajuste de esta ecuacin implica la realizacin de experiencias a ms de
dos niveles para cada factor, llevndose a cabo la seleccin de las experiencias por
medio del uso de algn Diseo Experimental apropiado.
El fin de un diseo experimental consiste fundamentalmente en obtener la
mxima informacin posible con el menor nmero de experimentos y centrarse
nicamente en la recogida de la informacin estrictamente necesaria. Se disean o
seleccionan un pequeo nmero de experimentos, que se realizan en unas
condiciones controladas. Existen diferentes tipos de diseo, en funcin de las
caractersticas del sistema y el objetivo que se pretende conseguir. En el presente
caso, dado que lo que se persiguen son los valores ptimos de las variables
significativas implicadas en la extraccin, se utiliza un Diseo Central Compuesto.
En este diseo cada factor tiene cinco niveles. En el caso de tres factores, Figura
12, estos sern: estrella bajo, cubo bajo, central, cubo alto y estrella alto. Cubo alto
y bajo son los niveles superior e inferior que se especifican al definir las variables
del diseo. Las muestras estrellas estn localizadas fuera del cubo. Como
consecuencia, todas las muestras, excepto la central, estn localizadas en la
misma esfera, si se dispone de tres factores, o en una hiperesfera, en los dems
casos y, por consiguiente, la informacin que llevan tendr el mismo peso en los
anlisis (rotatividad). La dificultad de ajustar estos niveles es la principal desventaja
de este tipo de diseo que, por otra parte, posee muy buenas propiedades
estadsticas.
137
MEN
SALIR
Una vez realizados los experimentos determinados por el tipo de diseo

elegido, se procede a la determinacin de los coeficientes polinmicos del modelo
experimental. Del estudio del mismo puede deducirse no slo la forma de
dependencia de la respuesta con las variables consideradas, sino tambin las
condiciones ptimas buscadas.
Figura 12.- Diseo Central Compuesto para tres factores
Habitualmente se realiza un Anlisis de la Varianza (ANOVA), con el que

se comprobar la significancia del modelo, la utilidad de las interacciones y los
trminos cuadrados, la calidad del ajuste del modelo y, en ltimo trmino, la
bondad de la superficie de respuesta. Para ello se utiliza el software informtico
THE UNSCRAMBLER20, que permite realizar, entre otros, el ANOVA, estudio de
residuos, anlisis de efectos, representacin grfica de la superficie de respuesta
en el espacio tridimensional, as como mapas de contorno para cada dos variables.
La bondad de la superficie de respuesta la indica el ANOVA a travs de los
parmetros: coeficiente de determinacin (R2), falta de ajuste del modelo
cuadrtico (Lack of Fit) y chequeo del modelo cuadrtico (Model Check
20
Unscrambler v. 6.11, CAMO A/S Olav Tryggvasonsgt, N-7011, Trondheim, Norway
138
MEN
SALIR
Cuadratic). Estos dos ltimos parmetros tienen unos determinados palores p

(nivel de significacin) de tal forma que para un nivel de confianza del 95 %, un
valor de p inferior a 0.05 para Model Check Cuadratic, indica que la parte
cuadrtica del modelo es significativa, es decir, que las interacciones y trminos
cuadrados incluidos en el modelo son tiles; un valor de p superior a 0.05 para
Lack of Fit, indica que la prdida o falta de ajuste del modelo no es significativa. Por
otra parte, R2 interesa que sea prximo a 0.9. El ANOVA que presenta un buen
valor de R2 lleva asociado un buen valor de Model Check Cuadratic y Lack of Fit, y
en definitiva se concluye que la superficie de respuesta es vlida para elegir el
punto ptimo, que generalmente son las condiciones de las variables que
maximizan la respuesta elegida. Dicho punto tambin lo presenta el ANOVA,
aunque se puede deducir analizando la superficie de respuesta en su forma
tridimensional o como mapas de contorno. En el caso del mapa de contorno se
puede deducir una zona alrededor del punto ptimo donde la respuesta no
presenta una diferencia significativa respecto a la respuesta mxima. Dicha zona
ser interesante, puesto que describe unos valores de las variables que pueden ser
considerados tambin como ptimos.
Adems el ANOVA presenta los valores de p para cada uno de los
factores y las interacciones entre ellos, de forma que un valor de p inferior a 0.05
indica que ese factor o interaccin influye de forma significativa con un 95 % de
probabilidad.
El estudio de los residuos permite la deteccin de posibles outliers
(muestras que no se ajustan al modelo) y, por ltimo, la visualizacin de las
superficies o de las grficas de contorno, posibilita una interpretacin final.
139
MEN
SALIR
Planificacin y realizacin de las experiencias

Las variables qumicas implicadas en el proceso de extraccin de los
fotoproductos fluorescentes del trans-piceido con acetato de etilo y los niveles
considerados para cada una de ellas, son las siguientes:
- concentracin de disolucin reguladora tartrico monocido de
sodio/tartrato disdico (NaHTr/Na2Tr) de pH 5.0: 0.026 0.19
M
-
relacin de fases (mL F. Acuosa / mL F. Orgnica): 0.99 3.4
tiempo de agitacin: 12 298 s
Con el diseo central compuesto, se genera un total de 17 experimentos,

Tabla 4.
Las muestras se preparan de manera que el volumen final de la fase
acuosa sea siempre igual a 10.0 mL, conteniendo 0.20 mL de disolucin etanlica
2.86 gmL-1 de trans-piceido y volmenes variables de agua ultrapura y disolucin
reguladora tartrato monocido de sodio/tartrato disdico 0.30 M, de pH 5.0,
irradindolas durante 180 segundos, previamente a la adicin del tampn. La fase
acuosa se extrae con el volumen de acetato de etilo que marque la relacin de
fases, agitando durante el tiempo correspondiente en cada caso. Se registra el
espectro de emisin de fluorescencia de la fase acuosa antes y despus de ser
extrada en las siguientes condiciones instrumentales: 20C, rendija de excitacin 5
nm, rendija de emisin 5 nm, voltaje del tubo fotomultiplicador 800 V y exc = 261
nm.
140
MEN
SALIR
Tabla 4.- Diseo Central Compuesto para tres variables
Posicin en
Experiencia
[NaHTr/Na2Tr] M
Relacin
Tiempo de
el diseo
pH 5.0
de fases
agitacin (s)
* Low A
0.026
2.5
155
* High A
0.19
2.5
155
* Low B
0.11
2.5
12
* High B
0.11
2.5
298
* Low C
0.11
0.99
155
* High C
0.11
4.0
155
Cube 1
0.06
1.6
70
Cube 2
0.16
1.6
70
Cube 3
0.06
1.6
240
Cube 4
10
0.16
1.6
240
Cube 5
11
0.06
3.4
70
Cube 6
12
0.16
3.4
70
Cube 7
13
0.06
3.4
240
Cube 8
14
0.16
3.4
240
Central a
15
0.11
2.5
155
Central b
16
0.11
2.5
155
Central c
17
0,11
2.5
155
141
MEN
SALIR
Anlisis de la superficie de respuesta

La seal empleada para construir la superficie de respuesta es la diferencia
entre las intensidades de fluorescencia, medidas a 361 nm, sobre los espectros de
emisin registrados a la fase acuosa antes y despus de ser extrada. Las
caractersticas de la superficie de respuesta son
-R2 = 0.862
-Multiple Correlation: 0.928
-Model Check Cuadratic (p < 0.05): p = 0.7170
-Lack of Fit (p > 0.05): p = 0.5182
El valor de p para Lack of Fit indica que la prdida de ajuste no es
significativa, adems el valor de R2 indica la bondad del modelo. No obstante, el
valor de p para Model Check Cuadratic es superior a 0.05, lo que indica que la
parte cuadrtica del modelo no es significativa, es decir que las interacciones y
trminos cuadrados incluidos en el modelo no son del todo tiles.
Aplicando el ANOVA al anlisis de los valores p, para la superficie de
respuesta (Tabla 5), se deducen qu variables influyen de forma significativa (p <
0.05). En este caso, dichas variables son la concentracin de tampn y la relacin
de fases, mientras que el tiempo de agitacin, las interacciones entre las variables
y los trminos cuadrticos no son significativas.
En la Figura 13 se recogen las superficies de respuesta para las tres
combinaciones de las tres variables estudiadas. El ptimo estar en la zona de
mxima respuesta, que es la zona de color negro. En esta zona existe un punto
que presenta el valor mximo de respuesta, que ser tomado como ptimo. Este
punto corresponde a los siguientes valores para las variables:
142
MEN
SALIR
-[ NaHTr/Na2Tr] = 0.16 M
-Tiempo de agitacin = 150 s
-Relacin de fases = 0.7
Tabla 5.- Anlisis de los valores p para las variables
estudiadas
Variable
Valor p
A: [Tampn] (M)
0.0422
B: Tiempo de agitacin (s)
0.6673
C: Relacin de fases
0.0020
AB
0.4561
AC
0.9239
BC
0.7689
AA
0.2931
BB
0.1602
CC
0.3235
El valor de relacin de fases predicho como ptimo se encuentra fuera de

los lmites ensayados para esta variable. No obstante, se comprob que el
porcentaje de recuperacin obtenido al emplear como relacin de fases 1 0.7 es
el mismo, fijando por tanto 1 como relacin de fases ptima.
El rendimiento de la extraccin, calculado por comparacin de la pendiente
de la recta de calibrado recogida en la Tabla 6 y una recta (r = 0.995) construida
extrayendo patrones en el mismo rango de concentraciones, y en las condiciones
determinadas como ptimas, resulta ser del 61 %.
143
MEN
SALIR
Figura 13.- Superficies de respuesta para cada par de variables

instrumentales
144
MEN
SALIR
Determinacin de piceido en vino mediante fluorescencia fotoinducida

de segunda derivada
A pesar del paso de extraccin lquido-lquido de las muestras de vino, la
seal fluorescente procedente de la matriz, en las condiciones necesarias para la
obtencin de los espectros de fluorescencia fotoinducida de piceido, no puede ser
despreciada. No obstante, al igual que en caso de resveratrol, dicha seal se
atena en gran medida por obtencin de los espectros segunda derivada. Los
espectros segunda derivada se obtienen en todos los casos mediante el algoritmo
de Savitzsky-Golay21, empleando = 5 nm.
Se comprueba la linealidad entre la amplitud del espectro segunda
derivada entre 353 y 361 nm (2D353-361) y la concentracin de trans-piceido en la
muestra original, como queda reflejado en la Tabla 6, por lo que se propone utilizar
sta como seal analtica para el anlisis de piceido en vino.
El tratamiento al que se someten las muestras de vino objeto del anlisis

es el siguiente: en una celda de cuarzo se aaden 0.10 mL de vino tinto o 0.50 mL
de vino blanco, que se diluyen con agua ultrapura hasta un volumen final de 5.0
mL, en presencia de un 2.0 % v. de etanol. La disolucin resultante se irradia
durante 180 segundos bajo una lmpara de mercurio de alta presin, y a
continuacin se transfiere a un embudo de decantacin. Se fija el pH a 5.0 por
adicin de 5.0 mL de disolucin reguladora tartrato monocido de sodio/tartrato
disdico, 0.30 M, y se extrae con 10.0 mL de acetato de etilo, agitando
vigorosamente durante 150 segundos. Se asla la fase orgnica y se evapora a
sequedad en un rotavapor a temperatura ambiente. El residuo resultante se
21
Savitzky A., Golay M.J.E., Anal. Chem., 1964, 36:16271639
145
MEN
SALIR
redisuelve con 4.0 mL de etanol absoluto y se aade agua ultrapura hasta

completar 10.0 mL.
Tabla 6.- Parmetros analticos de calidad para la determinacin de
piceido mediante fluorescencia fotoinducida segunda derivada
2D
353-361 nm
Seal Analtica
(exc = 261 nm)
6.0 30
-0.165 0.064
0.181 0.004
0.156
0.997
0.995
% Linealidad
98.0
0.862
1.34
2.12
Repetitividad (14.3 ngmL-1)

% R.S.D. (n = 11)
5.9
El mtodo se aplica al anlisis de distintas muestras de vino de la regin.

Las muestras de que se dispone se dividen en tres grandes grupos:
-Vinos blancos
146
MEN
SALIR
Se prepara, dentro de cada grupo, una mezcla conteniendo volmenes

idnticos de todos lo vinos que integran ese grupo, con el objetivo de que estn
representadas las interferencias ms comunes en el anlisis de cualquier muestra
de vino.
Se aplica el mtodo de adicin patrn por triplicado, sobre cada mezcla de
vinos y se construyen las correspondientes curvas 2D353-361 nm vs concentracin de
trans-piceido puesta. Se aplica el test de comparacin de pendientes entre las
rectas obtenidas y una recta de calibrado construida sometiendo a los patrones al
mismo tratamiento que al vino, comprobndose que existen diferencias
significativas entre las pendientes de las tres rectas de adicin patrn y la recta de
calibrado, concluyendo por tanto que existe efecto de matriz. Se elige el mtodo de
la adicin patrn, como mtodo de calibracin para el anlisis de piceido.
Las concentraciones de piceido calculadas en cada mezcla de vinos,
teniendo en cuenta que el rendimiento de la extraccin es 61 %, en comparacin
con las calculadas mediante el mtodo cromatogrfico de validacin22 se
encuentran recogidas en la Tabla 7, observndose que los resultados son muy
aceptables.
22
Galeano Daz T., Durn Mers I., Airado Rodrguez, D., J. Sep. Sci., 2007, 30:3110-3119
147
MEN
SALIR
Tabla 7.- Concentraciones de piceido encontradas en las muestras de vino, calculadas
mediante el mtodo extracto-fluorimtrico de derivadas y mediante HPLC
gmL-1 de piceido
Mtodo
Vinos Tintos
Vinos Tintos de
Jvenes
Crianza
0.75 0.11
0.84 0.14
0.17 0.03
0.72 0.05
0.76 0.08
0.20 0.01
Vinos Blancos
Extractofluorimtrico de
derivadasa
HPLC
a
Adicin Patrn (tres adiciones, por triplicado)
En ltimo lugar, para mejorar el mtodo, en trminos de simplicidad y

rapidez, se examinan los resultados obtenidos llevando a cabo la adicin patrn en
la etapa de medida. As, se comparan los resultados resumidos en la Tabla
anterior, obtenidos dopando muestras de vino diluidas individuales, antes de ser
extradas, con los obtenidos realizando la adicin patrn sobre la disolucin
hidroetanlica resultante de la irradiacin, extraccin, evaporacin y reconstitucin
de la muestra de vino diluida sin dopar, por adicin sucesiva, en la cubeta de
medida de fluorescencia, de pequeos volmenes de disolucin patrn de piceido
irradiada en idnticas condiciones que la muestra de vino diluida. Se comprueba
que los resultados del anlisis no son afectados al llevar a cabo de esta manera la
adicin estndar, lo que supone un recorte sustancial en el tiempo de anlisis, ya
que habr que realizar una sola vez el proceso de extraccin y evaporacin, por
muestra de vino analizada.
148
MEN
SALIR
Interferencias
Los espectros de fluorescencia de los fotoproductos de resveratrol y
piceido son prcticamente iguales, lo que significa que un analito es la principal
interferencia del otro. Con los mtodos propuestos para el anlisis de cada uno de
ellos, se consigue evitar dicha interferencia mediante distintos mecanismos:
- el piceido no se extrae en ter etlico, lo que permite la determinacin de
resveratrol en presencia de su glucsido.
- la irradiacin durante 180 segundos de las muestras, en el proceso de
determinacin de piceido, supone la destruccin y la prdida total de la
fluorescencia del fotoproducto de resveratrol, en los intervalos de concentraciones
normales en los que se trabaja en el anlisis de vino.
Al igual que en el caso de la aglicona, el piceido tambin es retenido en
membranas de nylon, de manera que se est trabajando en el desarrollo de
mtodos de determinacin en soporte slido. Se estudiar tambin la posible
resolucin de la mezcla aglicona-glucsido por aplicacin de quimiometra
(mtodos de calibracin multivariantes) sobre seales de fluorescencia.
149
MEN
SALIR
MEN
SALIR
CAPTULO IV
DETERMINACIN DE RESVERATROL Y
PICEIDO TOTALES EN VINO, SIN
TRATAMIENTO PREVIO, MEDIANTE
DERIVATIZACIN FOTOQUMICA OFF LINEHPLC
MEN
SALIR
CAPTULO IV. Resveratrol y piceido mediante derivatizacin-fotoqumica off line HPLC
152
MEN
SALIR
ANTECEDENTES
Los compuestos fenlicos se encuentran entre los compuestos qumicos no
nutrientes presentes en la dieta y que podran contribuir a los efectos beneficiosos
de la misma. Histricamente, cuando se habla de vino, su compuesto fenlico
prototpico sera el resveratrol. En las uvas y en compuestos derivados, el
resveratrol se encuentra en forma libre o como piceido (resveratrol-3-O-glucsido)
en sus respectivas formas isomricas trans y cis. Los glucurnidos y sulfatos
conjugados del trans y cis-resveratrol se forman en las posiciones 3 y 4. Otros
metabolitos del resveratrol descritos son el producto hidroxilado en posicin 3,
tambin conocido como piceatannol, y el dihidroresveratrol que ha perdido el doble
enlace que conecta ambos anillos bencnicos. No obstante, stos se encuentran
en proporciones inferiores al trans-resveratrol y trans-piceido, que son los que
centran la mayor parte de los estudios.
El piceido, glucsido del resveratrol, recibe tanta atencin como la aglicona
(resveratrol) ya que en derivados de las uvas su concentracin es
significativamente mayor1. La proporcin relativa entre ambas formas depende de
una serie de factores tales como las condiciones de fermentacin2. En un reciente
artculo de revisin3 se comparan los niveles de resveratrol y piceido en vinos tintos
de diferentes regiones y se encuentra que stos pueden llegar a contener hasta
14.3 gmL-1 de trans-resveratrol y 29.2 gmL-1 de trans-piceido, es decir que el
nivel de trans-piceido puede llegar a ser tres veces superior al del trans-resveratrol.
En cuanto a los vinos blancos, el resveratrol, en todas sus formas, se encuentra en
stos en una concentracin bastante inferior a la encontrada en vinos tintos. Los
Lamuela Raventos R. M., Waterhouse A. L., Methods Enzymol., 1999, 299:184-190

Moreno-Labanda J. F., Mallavia R., Prez-Fons L., Lizama V., Saura D., Micol, V., J. Agric. Food
Chem., 2004, 52:5396-5403
3 Stervbo U., Vang O., Bonnesen C., Food Chem., 2007, 101:449-457
1
2
153
MEN
SALIR
niveles ms elevados de trans-resveratrol que aparecen en la bibliografa4 son del

orden de 0.1 gmL-1
Por otro lado, debido a la elevada proporcin entre los ismeros trans y los
cis, se sugiere que estos ltimos pueden aparecer como consecuencia de la
exposicin de los vinos a la luz durante su elaboracin o incluso en el
almacenamiento5.
En cuanto al anlisis de resveratrol y piceido en vino, si bien existen
mtodos de cromatografa de gases, que requieren generalmente un paso de
derivatizacin pre-columna6, 7, o de electroforesis capilar8, 9, fundamentalmente se
efecta por cromatografa de lquidos y, como ya se ha mencionado anteriormente
en esta memoria, la mayora de los mtodos utilizan cromatografa en fase inversa
con fases mviles agua/metanol o agua/acetonitrilo conteniendo cido actico o
cido frmico para fijar la acidez. En casi todos los casos se utiliza una elucin en
gradiente, incluso utilizando dos columnas monolticas en serie10, y los tiempos de
anlisis son elevados. Sin embargo, cuando se utilizan detectores electroqumicos
es ms frecuente el uso de la elucin isocrtica, como en los mtodos
desarrollados por McMurtrey et al11 y por Kolouchova-Hanzlkov et al12. Los
sistemas de deteccin ms utilizados son los detectores UV de serie de diodos en
Siemann E.H., Creasy L.L., Am. J. Enol. Vitic., 1992,43:4952

Lamuela Ravents R. M., Romero Prez A. I., Waterhouse A. L., de la Torre Boronat M. C., J.
Agric. Food Chem., 1995, 43:281283
6 Goldberg D.M., Yan J., Ng E., Diamandis E.P., Karumanchiri A., Soleas G.J., Anal. Chem., 1994,
66:3959-3963.
7 Flamini R., Dalla Vedona A., Rapid Commun.. Mass. Spectrom., 2004, 18:1925-1931
8 Brandolini V., Maietti A., Tedeschi P., Durini E., Vertuani S.,Manfredini S., J. Agric. Food Chem.,
2002, 50:7407-7411
9 Demianov Z., Sirn H., Kuldvee R., Riekkola M.L., Electrophoresis, 2003, 24:42644271
10 Abert Vian M., Tomao V., Gallet S., Coulomb P.O., Lacombe J.M., J. of Chromatogr. A, 2005,
1085:224-229
11 Mc Murtrey K.D., Minn J., Pobanz K., Schultz T.P., J. Agric. Food Chem., 1994, 42:2077-2080
12 Kolouchova-Hanzlkov I., Melzoch K., Filip V., midrkal J., Analytical, Nutritional and Clinical
Methods, 2004, 87:151-158
4
5
154
MEN
SALIR
fila13-17, pero tambin se han usado otros ms sensibles y selectivos como los
fluorescentes18-20, los ya mencionados electroqumicos21, quimiluminiscentes22, 23 o
de espectrometra de masas24, a veces acoplados entre s25, 26.
Los mtodos de HPLC ms sensibles de los encontrados10, 16, 18, 19, 23, 25
presentan lmites de deteccin en el orden de los ngmL-1, y slo en un caso se
reporta un valor de menor orden de magnitud, en concreto 0.2 ngmL-1, obtenido
utilizando deteccin quimiluminiscente22.
El objetivo del trabajo de investigacin descrito en este captulo es el
desarrollo de un mtodo de cromatografa lquida con deteccin fluorescente,
rpido y sencillo, que permita analizar el total (trans + cis) de resveratrol y el total
de piceido con una mayor sensibilidad que los mtodos similares descritos hasta el
momento. Para ello se planea hacer uso de la transformacin que sufren estos
compuestos, al irradiarlos con luz UV intensa, cuyo resultado son compuestos de
eficacia cuntica de fluorescencia muy superior a la de los compuestos de partida.
Rudolf J.L., Resurreccion V.A., Saalia F.K., Phillips R.D., Food Chem., 2005, 89:623-638
Abert Vian M., Tomao V., Gallet S., Coulomb P. O., Lacombe J.M., J. Chromatogr. A, 2005,
1085:224-229
15 Abril M., Negueruela A. I., Prez C., Juan T., Estopan G., Food Chem., 2005, 92:729736
16 Nikfardjam M.S.P., Lszl G., Dietrich H., Food Chem., 2006,96:7479
17 Vitrac X., Bornet A., Vanderline R., Valls J., Richard T., Delaunay J. C., Mrillon J. M., Teissdre
P. L., J. Agric. Food Chem., 2005, 53:56645669.
18 Vitrac X., Monti J.P., Vercauteren J., Deffieux G., Mrillon J.M., Anal. Chim. Acta, 2002, 458:103110
19 Pieiro Z., Palma M., Barroso C.G., J. Chromatogr. A, 2006, 1110:6165
20 Rodriguez-Delgado M.A., Gonzlez G., Prez-Trujillo J.P., Garca-Montelongo F.J., Food Chem.
2002, 76:371-375
21 Bocchi C., Careri M., Groppi F., Mangia A., Manini P., Mori G., J.Chromatogr. A, 1996, 753:157170
22 Zhou J., Cui H., Wan G., Xu H., Pang Y., Duan C., Food Chem., 2004, 88:613620
23 Zhang Q., Cui H., Myint A., Lian M., Liu L., J. Chromatogr. A, 2005, 1095:94101
24 Wang Y., Catana F., Yang Y., Roderick R., Van Breemen R.B., J. Agric. Food Chem., 2002,
50:431-435
25 Loredana La Torre G., Saitta M., Vilasi F., Pellican T., Dugo G., Food Chem., 2006, 94, 640650
26 Bravo M.N., Silva S., Coelho A.V., Vilas Boas L., Bronze M.R., Anal. Chim. Acta, 2006, 563:84-92
13
14
155
MEN
SALIR
Para la optimizacin de las variables cromatogrficas se har uso de

herramientas quimiomtricas, con el objetivo de reducir en lo posible el trabajo
experimental.
Estudios fluorescentes previos
Como se ha descrito en los captulos II y III de esta memoria, transresveratrol y trans-piceido, al igual que sus ismeros cis, presentes los cuatro
analitos en el vino de forma natural, son dbilmente fluorescentes. En resumen, las
disoluciones hidroetanlicas de trans-resveratrol y trans-piceido presentan dbiles
seales de fluorescencia nativa, con mximos de excitacin centrados a 225 y 318
nm, y 230 y 300 nm, respectivamente, y mximos de emisin en torno a 385 y 395
nm, respectivamente. Sin embargo, la irradiacin con luz ultravioleta intensa de sus
disoluciones hidroalcohlicas tiene como consecuencia primeramente el
desplazamiento del equilibrio cistrans, totalmente, hacia las formas cis de ambos
analitos, que rpidamente desaparecen en favor de nuevos fotoproductos
altamente fluorescentes, cuyos espectros de fluorescencia estn caracterizados por
agudos mximos de excitacin a 260 nm, y dos mximos en los espectros de
emisin a 364 y 382 nm en el caso de resveratrol, y 361 y 380 nm en el caso de
piceido. Tambin se ha comprobado que las seales de fluorescencia
proporcionadas por estos fotoproductos, son lineales con la concentracin de
resveratrol en las disoluciones originales, siendo posible por tanto el anlisis de las
cantidades totales (trans- ms cis-ismeros) de resveratrol y piceido en las
muestras originales, a travs de estas seales de fluorescencia fotoinducida.
156
MEN
SALIR
En esta memoria se describen distintas estrategias para explotar este

comportamiento fotoqumico, en favor de la sensibilidad y la selectividad de los
mtodos para el anlisis de resveratrol y piceido en muestras de vino. En este
captulo se persigue el desarrollo de un mtodo de cromatografa de lquidos con
deteccin fluorescente, para el anlisis de las cantidades totales de resveratrol y
piceido en vino, previa irradiacin off-line de las muestras, en una lmpara de
mercurio de alta presin.
En los captulos anteriores de esta memoria tambin se describe el estudio
del efecto de variables tales como la composicin del medio de trabajo en la etapa
de irradiacin y medida de fluorescencia, y el tiempo de irradiacin de las muestras,
deducindose que los valores ptimos de ambos parmetros son distintos para
ambos analitos. Concretamente, se dedujo que el rendimiento de las
fotorreacciones depende en gran medida del porcentaje de etanol en el medio,
siendo la composicin ptima del mismo etanol:agua 40:60, v:v, agua 100 % para
resveratrol y piceido, respectivamente.
Por su parte, el tiempo de irradiacin ptimo, teniendo en cuenta el rango
de concentraciones de trabajo, result ser de 60 y 180 segundos para resveratrol y
piceido, respectivamente. Esto no supone un problema cuando se determinan
individualmente, sino que, en este caso en particular, la utilizacin de un tiempo de
irradiacin ms alto en el caso de piceido supone la eliminacin de la interferencia
de resveratrol en su anlisis, como ya se ha explicado anteriormente, constituyendo
esto una gran ventaja.
Sin embargo para realizar la determinacin cromatogrfica simultnea de
resveratrol y piceido en forma de sus fotoproductos, en una solo inyeccin, es
necesario llegar a alcanzar una situacin de compromiso, en lo que a estas
157
MEN
SALIR
variables se refiere. Teniendo en cuenta, por una parte que los niveles de aglicona
en vino son menores que los de glucsido, y por otra parte la menor polaridad de la
molcula de resveratrol y de su fotoproducto, y por tanto la mayor retencin en la
columna cromatogrfica (C18), lo que provocar que el efecto de la dispersin sea
ms notable en este caso, se seleccionan unos valores de compromiso para el
porcentaje de etanol en el medio de irradiacin y el tiempo de irradiacin ms
favorables para la formacin del fotoproducto del resveratrol que para la del
piceido. Se fija un medio de irradiacin etanol:agua 40:60, v:v, y un tiempo de
irradiacin de 90 segundos para posteriores experimentos. La seleccin de un
tiempo de irradiacin lejos del ptimo para ambos analitos supone prdida de
sensibilidad, tanto si es menor que el ptimo, caso del piceido, ya que el
rendimiento de la fotorreaccin es inferior al 100 %, como si es mayor, caso del
resveratrol, por destruccin del fotoproducto. Sin embargo se hace factible la
determinacin de ambos conjuntamente.
Estudios cromatogrficos previos
Con el objetivo de estudiar los respectivos procesos de transformacin
fotoqumica de resveratrol y piceido, se prepara, en un matraz de 10.0 mL, una
disolucin conteniendo 0.10 mL de sendas disoluciones madre de trans-resveratrol
y trans-piceido de 98 y 114 gmL-1, 3.9 mL de etanol absoluto y agua ultrapura
hasta enrase. Se inyectan en el cromatgrafo dos alcuotas de esta disolucin, una
sin irradiar y una irradiada en la lmpara de mercurio de alta presin durante 90
segundos. Ambas muestras son eludas isocrticamente con una mezcla
acetonitrilo:cido actico (3.2 %), 22:78, v:v, y el eluato se monitoriza
fotomtricamente a 306 nm, y fluorimtricamente a exc/em 260/364 nm, longitudes
de onda correspondientes, respectivamente, a los mximos de absorcin de los
ismeros trans, dbilmente fluorescentes, y a los mximos de los espectros de
158
MEN
SALIR
fluorescencia de sus respectivos fotoproductos, altamente fluorescentes. Los

cromatogramas correspondientes a esta disolucin patrn, antes y despus de ser
irradiada, se recogen en la Figuras 1A y 1B, respectivamente.
En el perfil fotomtrico, obtenido a 306 nm, correspondiente a la muestra
sin irradiar, se observan dos picos cromatogrficos a 2.4 y 6.1 minutos,
correspondientes a trans-piceido y trans-resveratrol, respectivamente. En el perfil
fluorimtrico tambin se observan ambos compuestos, pero en este caso los picos
cromatogrficos son muy pequeos, debido a la dbil fluorescencia nativa de los
analitos. Al irradiar esta disolucin durante 90 segundos en la lmpara de mercurio
de alta presin, se observan cambios en los cromatogramas obtenidos tanto
fotomtrica como fluorimtricamente. En el perfil fotomtrico a 306 nm se produce
un decaimiento importante en los picos cromatogrficos correspondientes a los
ismeros trans, as como la aparicin de nuevos picos, correspondientes a las
formas fluorescentes generadas como consecuencia de la fotorreaccin y a los
restos de cis-ismeros. Existen dos picos que podran atribuirse al cis-piceido y
otros dos para cis-resveratrol, tal y como se indica en la Figura 1A. Se ha
comprobado que, cuando la isomerizacin de trans a cis se lleva a cabo en
condiciones menos energticas que las que proporciona esta lmpara de alta
presin, se genera un nico compuesto cis a partir de cada trans, como se discute
en el siguiente captulo. En este caso, dada la existencia de ms de un pico, cuyo
espectro de absorcin presenta un mximo a 290 nm, tpico de las formas cis,
puede indicar la formacin de fotoproductos secundarios de la reaccin, y que no
son necesariamente los cis-ismeros. Por comparacin con los resultados
obtenidos posteriormente en el captulo V, se postula que trans-piceido y transresveratrol son los picos a 3.9 y 11.3 minutos, respectivamente, correspondiendo
los picos a 2.9 y 10.6 a otros productos de fotodescomposicin de piceido y
resveratrol, respectivamente. Es de destacar que cis-piceido coeluye con FP1. Los
159
MEN
SALIR
resultados ms interesantes producidos como consecuencia de la irradiacin se

observan en el perfil obtenido al monitorizar fluorimtricamente el eluato a exc/em
260/364 nm. En dicho perfil se observan tres nuevos picos cromatogrficos a 3.6,
4.9 y 12.6 minutos.
trans-piceido
trans-resveratrol
A (306 nm)
15
12
9
6
cis-piceido ?
FP2
FR
0
0
F. I. (exc/em 260/364)
cis-resveratrol ?
7
t (min)
10
11
12
13
0
14
40
FP2
30
FR
20
2
A (306 nm)
FP1
10
1
0
F. I. (exc/em 260/364)
18
0
0
7
t (min)
10
11
12
13
14
Figura 1.- Cromatogramas correspondientes a una muestra conteniendo 0.98 y 1.14 gmL-1
de trans-resveratrol y trans-piceido, respectivamente, sin irradiar () e irradiada durante 90
segundos (). Fase mvil acetonitrilo:cido actico (3.2 %), 22:78, v:v, 0.8 mLmin-1; UVD a
306 nm (A), y FLD a exc/em 260/364 nm (B)
Se comprueba la formacin de un nico fotoproducto fluorescente a partir

de resveratrol, en adelante FR, responsable del pico cromatogrfico a 12.6 minutos
de la Figura 1B, lo cual est de acuerdo con los resultados previamente publicados
por Roggero et al27. Por otra parte, los picos cromatogrficos a 3.6 y 4.9 minutos
27
Roggero J.P., Garca-Parrilla C., Sci. Aliments 1995, 15:411-422
160
MEN
SALIR
corresponden a los dos fotoproductos originados a partir de piceido, en adelante

FP1 y FP2, respectivamente. Los espectros de fluorescencia obtenidos en el pice
de ambos picos son idnticos, y en base a los datos encontrados en la literatura28,
que nos permiten asumir que los fotoproductos de la reaccin son derivados del
fenantreno, es totalmente lgica la formacin de dos fotoproductos a partir de
piceido (2,6-dihidroxifenantreno-4--D-glucopiransido y 4,6-dihidroxifenantreno-2-D-glucopiransido) y un nico fotoproducto a partir de resveratrol (2,4,6trihidroxifenantreno), de acuerdo con los esquemas de reaccin representados en
la Figura 2.
En la Figura 1B se observa tambin que el pico cromatogrfico
correspondiente a FP1 es mucho menos intenso que el correspondiente a FP2.
Teniendo en cuenta que los espectros de emisin de fluorescencia en el pice de
ambos picos son idnticos, parece bastante lgica la hiptesis de que ambos
compuestos son ismeros, entre los que la nica diferencia consiste en la
distribucin relativa de los grupos hidroxilo y el residuo de glucosa (Figura 2),
conservando en ambos casos el esqueleto fenantrenoide, responsable mximo del
comportamiento fluorescente. Partiendo de esta base, puede afirmarse que la
diferencia entre la intensidad de ambos picos, se debe nicamente a que uno de
los fotoproductos es ms abundante que el otro, estando ms favorecido, en este
caso concreto, el camino de reaccin que conduce a FP2, que el que desemboca
en FP1.
Con el objetivo de asignar las estructuras correctas a FP1 y FP2, se llevan
a cabo clculos tericos de energa de enlace y momento dipolar, utilizando le
mtodo semiemprico AM1, mediante el paquete de software HyperChem. Los
resultados obtenidos de estos clculos se resumen en la Tabla 1.
28
Chen Y.H., Chen Y.L., Lin C.H., J. Chromatogr. A, 2002, 943:287-294
161
MEN
SALIR
OH
h
OH
HO
HO
OH
OH
OH
HO
OH
OH
OH
Glc
O
OH
h
OH
Glc
OH
OH
Glc
OH
HO
Glc
Figura 2.- Esquemas sugeridos para las fotorreacciones

Tabla 1.- Resultados de los clculos tericos y asignacin de picos
Estructura
OH
Energa de enlace
(Kcalmol-1)
Momento dipolar
(Debye)
Asignacin
-5244.01
1.194
FP2
-5242.98
4.524
FP1
Glc
OH
OH
HO
Glc
Para asignar las estructuras presentadas en la Tabla a los picos

correspondientes se ha tenido en cuenta que se est trabajando en fase inversa, y
por tanto el orden de elucin de los compuestos, en principio, debe ser inverso a su
162
MEN
SALIR
orden de polaridad, es decir, de entre los dos ismeros FP1 y FP2, eluira en primer
lugar el ms polar. As, a la vista de los valores de momento dipolar calculado, se
observa que la estructura de FP1 es la que presenta mayor valor de momento
dipolar, concretamente 4.524 D, siendo la estructura de FP2 la que presenta menor
valor de esta propiedad (1.194 D). Adems, los datos de energa de enlace tambin
estn de acuerdo con esta asignacin de estructuras, ya que la energa de enlace
correspondiente a la estructura ms polar revela que este compuesto es
ligeramente ms inestable que su ismero, lo que concuerda con las abundancias
relativas de ambos compuestos.
Dada la mayor intensidad del pico correspondiente a FP2, ser este
compuesto el que sea utilizado para la cuantificacin de la cantidad total de piceido,
a favor de la sensibilidad del mtodo. En el caso de resveratrol no existen dudas, y
su cuantificacin en la muestra inicial se llevar a cabo a travs de su nico
fotoproducto, FR, una vez comprobada, en ambos casos, la linealidad entre las
seales obtenidas de estos picos y la concentracin de piceido y resveratrol, en la
muestra inicial.
Antes de proceder a la optimizacin de la composicin de la fase mvil
para el anlisis de ambos compuestos en vino, se lleva a cabo el mismo estudio
que se ha descrito hasta ahora, en presencia de vino, con el objetivo de comprobar
la formacin de los mismos fotoproductos en presencia de la matriz. Para ello, se
deposita en un matraz de 10.0 mL, 2.0 mL de vino tinto fortificado con 9.8 y 11.4 g
de trans-resveratrol y trans-piceido, respectivamente, etanol hasta completar el 40
%, y agua ultrapura hasta enrase. Se inyectan en el sistema cromatogrfico,
alcuotas de esta disolucin, antes y despus de ser irradiada durante 90 s en la
lmpara de mercurio de alta presin, y se procede a su elucin y monitorizacin en
idnticas condiciones a las empleadas anteriormente con los patrones. Los
163
MEN
SALIR
cromatogramas registrados en los detectores, fotomtrico y fluorimtrico, en serie,

se recogen en la Figura 3.
100
35
28
21
14
7
0
A (306 nm)
80
60
40
trans-piceido
trans-resveratrol
20
0
0
F. I. (exc/em 260/364)
80
7
t (min)
10
11
12
13
14
7
t (min)
10
11
12
13
14
60
40
20
0
0
Figura 3.- Cromatogramas correspondientes a una muestra conteniendo una

alcuota de 2 mL de un vino tinto comercial fortificado con 9.8 y 11.4 gmL-1 de
trans-resveratrol y trans-piceido, respectivamente en etanol al 40 %, sin irradiar ()
e irradiadas durante 90 segundos (). Fase mvil acetonitrilo:cido actico (3.2 %),
22:78, v:v, 0.8 mLmin-1; UVD a 306 nm, y FLD a exc/em 260/364 nm
En las condiciones en las que la separacin se ha llevado a cabo, slo el

trans-resveratrol es fotomtricamente detectado a 306 nm como un pico totalmente
resuelto, mientras que trans-piceido coeluye con otros componentes del vino
(Figura 3A). Por lo dems, se comprueba como la fotorreaccin se da exactamente
igual en presencia del vino, comprobndose en el perfil de fluorescencia la
formacin de FP1, FP2, y FR.
164
MEN
SALIR
Optimizacin quimiomtrica de la composicin de la fase mvil para el

anlisis de vino
Como se ha descrito en la introduccin de este captulo, en los mtodos de
cromatografa de lquidos previamente propuestos para el anlisis de resveratrol y
piceido, se lleva a cabo la elucin en gradiente. Los disolventes orgnicos ms
comnmente empleados en estas fases mviles son metanol y acetonitrilo, y los
cidos actico y frmico son los ms empleados para fijar la acidez, siendo este
ltimo comn a todos los mtodos en los que la deteccin se lleva a cabo mediante
espectrometra de masas. En nuestro caso concreto se ha seleccionado acetonitrilo
como componente orgnico de la fase mvil, debido principalmente a su menor
viscosidad, menor solubilidad de aire y mayor transparencia en el ultravioleta, y
cido actico para fijar la acidez de la fase mvil.
En estas condiciones se procede a la optimizacin de la composicin de
una fase mvil isocrtica acetonitrilo:cido actico:agua, que proporcione una
adecuada resolucin de FR y FP2 del resto de componentes fluorescentes del vino,
en un tiempo razonable. Tambin se ha contemplado como objetivo que la fase
mvil escogida fuese til para futuros estudios acerca del proceso de
fotodescomposicin en vino, y para el desarrollo de un mtodo en el que la
irradiacin tenga lugar detrs de la separacin, lo que implica tener en cuenta la
resolucin de los picos correspondientes a los ismeros trans del resto de picos
debidos a los restantes componentes del vino en el proceso de optimizacin.
Se utiliza el diseo de experimentos para la optimizacin del porcentaje de
cido actico y disolvente orgnico en la fase mvil isocrtica. Concretamente se
emplea un diseo central compuesto, con el objetivo de calcular simultneamente
el efecto de cada variable, as como sus posibles interacciones, sobre la funcin de
165
MEN
SALIR
respuesta. Este tipo de diseo trabaja con cinco niveles para cada variable.
Tambin incluye tres rplicas de una muestra central, lo que da lugar a un total de
11 experimentos (Figura 4). Dicho diseo es posee rotatividad, lo que implica que
la precisin en el clculo de la respuesta es uniforme en todo el rango ensayado de
cada variable.
% v. cido Actico
16
20
24
28
3.6
3.6
2.4
2.4
1.2
1.2
16
20
24
% v. Acetonitrilo
28
Figura 4.- Diseo central compuesto. Niveles ensayados

para las variables: % v. Acetonitrilo: 14.92, 17, 22, 27,
29.07; % v. cido actico: 0.24, 0.9, 2.5, 4.1, 4.76
Se selecciona la siguiente funcin de respuesta (F.R.):
F .R. =
k ' Rs
t
donde Rs es la suma de los valores de resolucin (Rs) correspondientes a los

picos de FP1 y FP2 (obtenidos en los cromatogramas proporcionados por el
detector de fluorescencia, FLD) y de trans-resveratrol (obtenidos en los
cromatogramas proporcionados por el detector de serie de diodos, UVD), respecto
a los picos correspondientes a sustancias interferentes del vino, k es el factor de
capacidad para trans-piceido (UVD), ya que este compuesto es el menos retenido
en la columna, eluyendo siempre muy cerca del frente y de las interferencias
166
MEN
SALIR
menos retenidas del vino, y t es el tiempo de retencin de ltimo pico, FR, el cual
siempre est resuelto de las interferencias del vino, pero cuyo tiempo de retencin
es demasiado alto con alguna de las fases mviles ensayadas. En el clculo de los
valores de funcin de respuesta en los distintos puntos del diseo, se ha asignado
un valor mximo de 1.5 a Rs, para evitar as que este parmetro tenga demasiado
peso frente al resto de los incluidos en dicha funcin. Es decir, si en uno de los
puntos del diseo, alguno de los picos correspondientes a los compuestos FP1,
FP2 o trans-resveratrol, presentara un valor muy alto de la resolucin, mientras que
los otros no estuvieran resueltos, y se incluyera el valor obtenido para ese pico en
la funcin de respuesta, se obtendra un valor elevado para la funcin en esas
condiciones experimentales, lo que conducira a la eleccin de unas condiciones
ptimas que no suponen una solucin real al problema.
Se prepara en un matraz de 25.0 mL una disolucin conteniendo 5.0 mL de
vino tinto (12 % etanol), volmenes de sendas disoluciones madre, conteniendo 9.8
y 11.4 g de trans-resveratrol y trans-piceido, respectivamente, etanol hasta
completar 10.0 mL y agua ultrapura hasta enrase. En cada una de las condiciones
cromatogrficas marcadas por el diseo, se inyectan en el sistema cromatogrfico
sendas alcuotas de dicha disolucin, una sin irradiar y otra irradiada durante 90
segundos en la lmpara de mercurio de alta presin, y se procede a su elucin. El
flujo se mantiene en todo momento constante a 0.8 mLmin-1, y el eluato se
monitoriza fotomtrica y fluorimtricamente a 306 nm y exc/em 260/364 nm,
respectivamente. Los valores de factor de capacidad del pico de trans-piceido y
resolucin del pico de trans-resveratrol se calculan sobre el cromatograma obtenido
fotomtricamente a 306 nm de la muestra sin irradiar, y los parmetros
correspondientes a las formas fluorescentes, sobre el cromatograma de la muestra
irradiada obtenido mediante deteccin fluorimtrica.
167
MEN
SALIR
Los resultados se interpretan con la Metodologa de la Superficie de

Respuesta y la optimizacin del modelo se lleva a cabo con el paquete de software
THE UNSCRAMBLER (Unscrambler v. 6.11, CAMO A/S Olav Tryggvasonsgt, N7011, Trondheim, Norway). En el correspondiente anlisis de la varianza (ANOVA),
se asume un modelo cuadrtico de segundo grado (Model Check Quadratic, valor p
(95 %) = 0.0004). El valor de p calculado (95 %) para la falta de ajuste (Lack of Fit),
0.0760, indica que sta no es significativa a un nivel de confianza del 95 %, y que,
por tanto, el modelo describe adecuadamente la forma real de la superficie de
respuesta. Por otra parte, aplicando el ANOVA al anlisis de los valores p, para las
variables estudiadas, se deduce que el porcentaje de acetonitrilo (p-value =
0.0002), as como el trmino cuadrtico % ACN - % ACN (p-value = 0.0002) y la
interaccin % ACN - % actico (p-value = 0.0010) contribuyen significativamente al
modelo, para un nivel de confianza del 95 %. Sin embargo, el efecto % actico (pvalue = 0.0639) y el trmino cuadrtico % actico - % actico (p-value = 0.0539), no
son significativas para el modelo, al nivel de confianza considerado.
Figura 5.- Superficie de respuesta estimada para el par de efectos

estudiados
168
SALIR
En la Figura 5 se muestra la superficie de respuesta estimada por el

modelo para el par de variables consideradas. Las variables estudiadas toman en
el mximo de esta superficie valores de: 19 % de acetonitrilo y 3.3 % de cido
actico. Una vez deducida la composicin ptima de la fase mvil, se ensayan
distintos caudales, comprendidos entre 0.6 y 1.2 mLmin-1. Se aprecia que
caudales inferiores a 0.8 mLmin-1 suponen un aumento del tiempo de anlisis sin
que se consiga aumentar la eficacia de la separacin, mientras que caudales por
encima de este valor implican prdida de la eficacia y unas presiones demasiado
elevadas, seleccionndose finalmente un valor de 0.8 mLmin-1 para esta variable.
Por tanto, se fijan las siguientes condiciones para futuras experiencias:
Fase mvil: acetonitrilo:cido actico (4.1 %), 19:81, v:v
Flujo = 0.80 mL/min
Deteccin fluorimtrica: exc/em 260/364 nm
En estas condiciones, como se muestra en la Figura 6, los tres fotoproductos

fluorescentes son eluidos, resueltos a lnea base, en menos de 20 minutos. Siendo
los tiempos de retencin y factores de capacidad para FP1, FP2 y FR, 5.1, 7.3 y
17.9 minutos, y 2.7, 4.4 y 12.2, respectivamente.
16
FP2
F. I. (exc/em 260/364)
MEN
12
FR
8
FP1
4
0
0
10
t (min)
12
14
16
18
20
Figura 6.- Cromatograma (FLD exc/em 260/364 nm) correspondiente a una muestra
patrn conteniendo 290 y 340 ngmL-1 de resveratrol y piceido, respectivamente,
irradiada durante 90 segundos en la lmpara de mercurio de alta presin y eluda
en las condiciones determinadas como ptimas
169
MEN
SALIR
Validacin del mtodo. Parmetros analticos de calidad

Una vez optimizadas las variables implicadas en la separacin
cromatogrfica, se procede a estudiar la linealidad entre las reas de los picos
correspondientes a FP2 y FR, y la concentracin de piceido y resveratrol,
respectivamente, en la muestra original.
Para evaluar la linealidad del mtodo se prepara una serie de disoluciones
estndar conteniendo entre 1.00 y 1000 ngmL-1 de cada analito. Cada una de
estas mezclas patrn, se irradia durante 90 segundos en la lmpara de mercurio de
alta presin, se introduce por triplicado en el sistema cromatogrfico, y se eluye en
las condiciones previamente determinadas como ptimas. La cuantificacin de
resveratrol y piceido totales en las muestras originales, en trminos de transresveratrol y trans-piceido, se lleva a cabo a travs de los picos cromatogrficos
correspondientes a FR y FP2, respectivamente. Los parmetros analticos de
calidad correspondientes a la determinacin cromatogrfica de ambos analitos
utilizando en rea de los picos como seal analtica, se recogen en la Tabla 2.
Los lmites de deteccin (LOD) y cuantificacin (LOQ) se obtienen como 3
y 10 veces, respectivamente, la relacin seal/ruido. Para ello, se mide la amplitud
de la lnea base en los cromatogramas correspondientes a los patrones empleados
en el establecimiento de la recta de calibrado, en varias zonas, en intervalos de
aproximadamente dos minutos. Dicha amplitud se multiplica por 3 o por 10, y se
transforma en unidades de concentracin de trans-resveratrol o trans-piceido, a
travs de rectas de calibrado construidas para cada analito empleando en este
caso como seal analtica la altura de pico.
170
MEN
SALIR
Para evaluar la repetitividad del mtodo se realizan once inyecciones

sucesivas de una disolucin conteniendo 490 y 570 ngmL-1 de trans-resveratrol y
trans-piceido, respectivamente, irradiada durante 90 segundos.
Tabla 2.- Parmetros analticos de calidad para la determinacin cromatogrfica de
resveratrol y piceido
Resveratrol
Piceido
1-1000
1-1000
12.5 2.5
7.36 1.56
Pendiente (b sb) (mLng-1)
1.22 0.01 0.732 0.004
Rango de concentracin examinado(ngmL-1)
0.999
0.999
0.999
0.999
10.09
10.54
LOD (S/N=3) (ngmL-1)
0.29
0.28
LOQ (S/N=10) (ngmL-1)
0.97
0.95
Repetitividad (% RSD)a
9.5
4.6
n=11. 490 y 570 ngmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido, respectivamente.
Determinacin de las cantidades totales de resveratrol y piceido en muestras

de vino
El mtodo previamente optimizado y validado en trminos de linealidad,
lmites de deteccin y repetitividad, se aplica al anlisis de las cantidades totales de
resveratrol y piceido (trans + cis), en muestras de vino.
En primer lugar, se realiza una adicin patrn sobre una muestra de vino
tinto comercial, con el objetivo de determinar si existe o no efecto de matriz y
calcular las recuperaciones de cada analito a los distintos niveles de concentracin.
171
MEN
SALIR
En la Figura 7 se representan las rectas de calibrado y adicin patrn para

resveratrol y piceido (ntese que las concentraciones que figuran en el eje de las
abscisas no son concentraciones en vino, sino en las disoluciones inyectadas en el
cromatgrafo). Como puede apreciarse en dicha Figura, y se ratifica por aplicacin
de los tests estadsticos de comparacin de pendientes, se deduce que las
pendientes de cada par de rectas son indistinguibles a un nivel de confianza del
2500
2500
2000
2000
1500
1500
rea FP2
rea FR
95 %.
1000
1000
500
500
0
0
0.4
0.8
[trans-resveratrol] (gmL -1)
1.2
0.4
0.8
[trans-piceido] (gmL -1)
1.2
Figura 7.- Rectas de patrones externos () y adicin patrn (), para resveratrol
(izquierda) y piceido (derecha)
Las pendientes de las rectas de calibrado y adicin patrn no presentan

diferencias significativas a un nivel de confianza del 95 %, deducindose por tanto
que no existe efecto de matriz y que la determinacin de las cantidades totales de
resveratrol y piceido en muestras de vino puede hacerse mediante calibracin por
patrones externos. Efectivamente, si se calculan los valores de recuperacin para
las muestras fortificadas, usando para ello las rectas de calibrado de patrones
externos (Tabla 3), se obtienen resultados muy satisfactorios, estando en todos los
casos los valores de recuperacin, en torno al 100 %.
172
MEN
SALIR
Tabla 3.- Resultados del procedimiento cromatogrfico para la determinacin de las
cantidades totales de resveratrol y piceido en vino tinto, utilizando la calibracin por
adicin patrn
RESVERATROL
Puesto Encontrado
Recuperacin
en vino
en vino
(%)a
(gmL-1) (gmL-1)a
Puesto
en vino
(gmL-1)
PICEIDO
Encontrado
Recuperacin
en vino
(%)a
(gmL-1)a
0.00
2.120.04
0.00
31.540.39
1.02
3.740.11
1194
1.11
34.980.19
1071
2.55
4.820.31
1037
2.78
33.710.84
982
3.57
6.360.16
1123
3.89
35.560.38
1061
5.10
7.390.68
1029
5.55
37.312.1
1016
amedia
SD (n=2)
Por tanto, el procedimiento cromatogrfico que se propone para determinar

el resveratrol y el piceido totales en vino, a travs de la medida de sus
fotoproductos, es: En un matraz de 10.0 mL se aaden 2.00 mL de vino (12 % v.
etanol), 3.75 mL de etanol absoluto y agua ultrapura hasta enrase. Se transfiere
una alcuota de la disolucin resultante a una cubeta de cuarzo, y se irradia durante
90 s en una lmpara de mercurio de alta presin. Se inyectan 20 L de la
disolucin irradiada en el sistema cromatogrfico, previa filtracin a travs de una
membrana de nylon de 0.22 m, y se procede a su elucin isocrticamente con
acetonitrilo:cido actico (4.1 %), 19:81, v:v, con un flujo de 0.80 mLmin-1. El
eluato se monitoriza fluorimtricamente a exc/em 260 / 364 nm. La cuantificacin de
resveratrol y piceido se hace mediante patrn externo a travs de los picos
cromatogrficos de FR (17.9 minutos) y FP2 (7.3 minutos), respectivamente.
173
MEN
SALIR
El mtodo propuesto se aplica entonces al anlisis de distintas muestras de

vino comerciales. La totalidad de las muestras de las que se dispone se divide en
tres grandes grupos:
-Vinos blancos
y se prepara, dentro de cada grupo, una mezcla, conteniendo volmenes idnticos
de todos lo vinos que integran ese grupo.
Se toman 2.0 mL de cada una de las mezclas, y se llevan a un volumen
final de 10.0 mL con agua ultrapura, y etanol en una proporcin final del 40 %. Se
preparan tres rplicas por pool, que se irradian durante 90 segundos, y se analizan
en las condiciones previamente optimizadas. Los cromatogramas correspondientes
a cada uno de estas mezclas, obtenidos monitorizando fluorimtricamente (exc/em =
260/364 nm) el eluato, se recogen en la Figura 8, en comparacin con el
correspondiente a una disolucin patrn, conteniendo 290 y 340 ngmL-1 de transresveratrol y trans-piceido, respectivamente. Los resultados obtenidos en el anlisis
de cada uno de estas mezclas se resumen en la Tabla 4, en unidades de transresveratrol y trans-piceido.
Tabla 4.- Resultados obtenidos en el anlisis de las cantidades totales de resveratrol y
piceido en distintas muestras de vino, expresados como concentracin de los transismeros
Tinto Joven
Resveratrol Total en vino
0.28 0.01
(ngmL-1 de trans-resveratrol)a
Piceido Total en vino
(ngmL-1 de trans-piceido)a
amedia
174
SD (n=3)
0.72 0.05
Tinto
Crianza
Blanco
0.27 0.02 0.15 0.01
0.76 0.08 0.20 0.01
SALIR
I. F. (exc/em 260/364)
80
60
40
20
FP2
FR
FP1
0
0
I. F. (exc/em 260/364)
80
t (min)
12
16
20
12
16
20
16
20
16
20
60
40
20
0
0
80
t (min)
C
5
I. F. (exc/em 260/364)
MEN
60
40
0
20
10
0
0
t (min)
12
Figura 8.- Cromatogramas (FLD exc/em 260/364 nm) correspondientes a un

patrn conteniendo 290 y 340 ngmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido,
respectivamente (), y a un pool de vino tinto joven (A ), tinto de crianza
(B, ), y blanco (C, ) oportunamente diluidos, irradiados durante 90
segundos y eluidos en las condiciones ptimas
Se observa que, adems de los picos debidos a los compuestos de inters,

aparece un pico de gran magnitud, a un tiempo de retencin cercano a los 8 min.
No hemos encontrado datos bibliogrficos que orienten acerca de la naturaleza del
175
MEN
SALIR
compuesto responsable de este pico, y tampoco corresponde a ninguno de los

compuestos fluorescentes el vino de los que se dispona de patrones.
Por otro lado, en ciertas muestras de vino, se encuentra que aparece otro
pico cromatogrfico muy cercano al pico de FP2, como se aprecia en el ejemplo
mostrado en la Figura 9A.
20
80
16
60
12
I. F.
I. F. (exc/em 260/364)
40
8
20
4
0
0
6.5
t (min)
7.5
280
320
360
(nm)
400
440
Figura 9.- (A) Porcin de los cromatogramas (FLD exc/em 260/364 nm) correspondientes a una
muestra patrn conteniendo 290 y 340 ngmL-1 de resveratrol y piceido, respectivamente (), y de
los obtenidos a em 348 () y 369 nm () (exc 260 nm), para un vino tinto comercial, as como el
cromatograma diferencia entre ellos () (B) Espectros de emisin (exc 260 nm) obtenidos on-line
en los puntos marcados en el cromatograma
Sin embargo, los espectros de emisin de fluorescencia del compuesto

interferente y de FP2, se encuentran ligeramente desplazados entre ellos, como se
muestra en la Figura 9B, lo que hace posible eliminar la contribucin de este
interferente, tomando, como seal analtica, la diferencia entre las reas de los
picos obtenidos empleando como longitudes de onda de emisin 369 y 348 nm
(exc = 260 nm), que se corresponden con puntos isoemisivos en el espectro de
emisin del interferente, pero no en el de FP2. De manera que como se ve en la
Figura 9A, el cromatograma diferencia est totalmente limpio de interferencia.
176
MEN
SALIR
As, para la construccin de la recta de calibrado en estas condiciones, se

ha de hacer uso de la opcin de multiemisin en la configuracin del detector de
fluorescencia, y monitorizar el eluato a una longitud de onda de excitacin
constante de 260 nm, y a longitudes de onda de emisin de 369 y 348 nm. Una vez
obtenido el conjunto de cromatogramas de las disoluciones patrn, se construye la
recta de calibrado, tomando como seal analtica la diferencia de reas del pico
FP2 obtenido en ambos canales de emisin. De esta manera se obtiene una buena
relacin lineal entre seal analtica medida y concentracin de analito en el mismo
rango de concentraciones indicado en la Tabla 2.
Para la identificacin inequvoca de los fotoproductos sera conveniente el
uso de tcnicas acopladas LC-MS, a las que an no tenemos acceso pero con las
que se planea contar en el futuro.
Otro reto es la identificacin del compuesto fluorescente responsable del
pico ms intenso que aparece en los cromatogramas del vino en las condiciones de
excitacin y emisin de los fotoproductos de resveratrol y piceido.
177
MEN
SALIR
MEN
SALIR
CAPTULO V
ANLISIS DE LOS ISMEROS DE
RESVERATROL Y PICEIDO EN VINOS
MEDIANTE HPLC ISOCRTICA, CON
DETECCIN FLUORESCENTE PREVIA
DERIVATIZACIN POST-COLUMNA EN LNEA
MEN
SALIR
CAPTULO V. Ismeros de resveratrol y piceido mediante HPLC y derivatizacin on-line
180
MEN
SALIR
ANTECEDENTES
Las dos metas generales de cualquier tcnica de derivatizacin son:
1.- incrementar la sensibilidad den la deteccin, normalmente introduciendo
los cromforos o fluorforos adecuados, o generando compuestos derivados de los
originales ms fcilmente detectables.
2.- incrementar la selectividad, aplicando una reaccin de derivatizacin
especfica de los compuestos de inters, en la matriz compleja.
En muchos casos las reacciones de derivatizacin llevan consigo la adicin
de reactivos a la disolucin conteniendo el analito, con el objetivo de transformar
ste en una forma ms fcil de detectar. Las reacciones que se llevan a cabo entre
el analito y el agente derivatizante son, normalmente, de esterificacin, acilacin,
silanizacin, dansilacin, etc.
Cuando el reactivo es la luz, el procedimiento se llama derivatizacin
fotoqumica. La luz se considera uno de los agentes derivatizantes ms baratos, y
normalmente las reacciones fotoqumicas son reacciones simples, requiriendo de
instrumentacin muy sencilla, muy limpias y en las que no se da dilucin del
analito, ya que este reactivo derivatizante no implica la adicin de disolventes. Con
respecto al tipo de reacciones, que pueden ser iniciadas por activacin fotoqumica
se pueden citar reacciones de oxidacin, reduccin, fotolisis, fotohidrolisis,
fotoionizacin, reordenamientos moleculares, adicin, eliminacin, isomera,
ciclacin, polimerizacin, etc.
Inicialmente los mtodos basados en reacciones fotoqumicas como
sistemas de derivatizacin, se llevaban a cabo siempre en rgimen estacionario y
los primeros intentos de combinar los procesos fotoqumicos con sistemas
181
MEN
SALIR
dinmicos continuos, como son los mtodos cromatogrficos, fueron realizados en

1976 por Iwaoka y Tannenbaum1. Estos autores realizan un acoplamiento en lnea
de un fotorreactor con un sistema de cromatografa lquida de alta resolucin,
situando el fotorreactor detrs de la columna analtica, y llevan a cabo la
determinacin de derivados N-nitrosos mediante hidrlisis a nitritos por irradiacin
con luz ultravioleta de longitud de onda larga. El tiempo de irradiacin era
excesivamente largo y la sensibilidad no se mejoraba en exceso. Twitchett et al2
obtienen en 1978 resultados ms alentadores, determinando cannabinol en fluidos
corporales sin necesidad de realizar un tratamiento previo de la muestra y con un
lmite de deteccin de aproximadamente 0.5 ng.
A partir de aqu, se han ampliado en gran medida las aplicaciones de este
tipo de sistemas para la mejora de la deteccin. En 1999 Lores et al3 publican un
artculo de revisin donde se recogen varias aplicaciones en anlisis por inyeccin
en flujo (FIA) y HPLC, as como las principales tendencias en instrumentacin y
aspectos tcnicos. Respecto a los compuestos analizados, merece la pena resaltar
diversos
principios
farmacolgicos,
marcadores
biolgicos,
pesticidas,
componentes naturales en alimentos, e incluso trazas de metales, en matrices cada

vez ms complejas.
Como ya se ha descrito en captulos anteriores, los trans-ismeros de
resveratrol y piceido, apenas presentan fluorescencia nativa. Cuando sus
disoluciones son irradiadas con radiacin UV, los trans-ismeros se transforman en
los respectivos ismeros cis, tambin poco fluorescentes, que rpidamente
evolucionan hacia compuestos altamente fluorescentes. En concreto FP1 y FP2
Iwaoka W., Tannenbaum S. R., I.A.R.C. Sci. Publ., 1976, 14:51-56

Twitchett P.J., Williams P.L., Moffat A.C., J. Chromatogr. A, 1978, 149:683-691
3 Lores M., Cabaleiro O., Cela R., Trends in Anal. Chem., 1999, 18:392-400
1
2
182
MEN
SALIR
son generados a partir de piceido, siendo FR el fotoproducto fluorescente de

resveratrol.
Este tipo de fotoreaccin es idnea para ser acoplada en lnea en un
sistema cromatogrfico, y as poder llevar a cabo el anlisis de los ismeros trans y
cis presentes inicialmente en la muestra, de manera sensible, con un mtodo en el
que la manipulacin de la muestra es mnima. As pues, el objetivo de este
captulo, es aprovechar este comportamiento fotoqumico y disear un sistema de
irradiacin post-columna, en lnea, para proponer un mtodo isocrtico sencillo que
permita la determinacin de trans y cis resveratrol y piceido en muestras de vino de
diferente naturaleza.
En el Esquema 1 se muestra la disposicin del sistema cromatogrfico con
el fotorreactor acoplado. Como puede observarse, ste se sita detrs de la
columna, concretamente entre los detectores fotomtrico y fluorimtrico, de manera
que las fotorreacciones tendrn lugar despus de la separacin cromatogrfica. La
principal ventaja de esta disposicin frente al mtodo cromatogrfico descrito en el
captulo anterior es la posibilidad de determinar las concentraciones relativas para
cada par de ismeros, trans y cis, en la muestra original.
Una vez que se ha decidido el esquema de la fotoderivatizacin, el
siguiente paso es la construccin del fotorreactor propiamente dicho.
Comercialmente estn disponibles algunos modelos, pero normalmente se suele
hacer uso de fotorreactores de fabricacin casera. Por otra parte, cuando se disea
algn aparato para acoplarlo a un sistema cromatogrfico, debe prestarse particular
atencin a su posible efecto sobre la integridad de dicho sistema. As, reactores
con un excesivo volumen muerto y caractersticas de flujo muy pobres, pueden
causar prdida en la eficacia de la separacin.
183
MEN
SALIR
En la construccin de un reactor fotoqumico estn implicados dos

componentes fundamentales:
El primero es el reactor, para el cual se han descrito dos diseos

fundamentales: de paso de flujo y envolvente. En el primero el
eluato pasa a travs de una clula de flujo de volumen interno
pequeo, la cual se irradia externamente, mientras que en el
segundo un tubo de tefln se enrolla helicoidalmente sobre la
fuente de irradiacin, de manera que la fotorreaccin se estar
dando mientras que el analito de inters circule por este tubo. La
principal desventaja de los sistemas envolventes es que los
volmenes muertos suelen ser mayores que en los sistemas de
paso de flujo. No obstante, la experiencia demuestra que el
enrollado helicoidal del tubo es la mejor solucin para los efectos
de dispersin y engrosamiento de bandas, de manera que este
sistema es el ms utilizado.
El segundo componente del fotorreactor es la fuente de luz, la cual

est caracterizada por una longitud de onda de radiacin,
intensidad,
tamao
caractersticas
ms
geometra de
importantes
la
lmpara,
tener
en
como
cuenta.
Tradicionalmente se han venido utilizando muchos tipos de

lmparas, como son las lmparas de arco de alta, media y baja
presin, conteniendo normalmente mercurio, xenon, o una mezcla
de ambos, las lmparas de deuterio y de hidrgeno, as como
lmparas fluorescentes, germicidas o incluso lseres.
184
MEN
SALIR
En nuestro caso el fotorreactor se ha construido enrollando helicoidalmente

3 m de tubo de tefln de 0.3 mm de dimetro interno sobre una lmpara de xenon
de 4 W. El conjunto se guarda dentro de una caja metlica, recubierta interiormente
de papel de aluminio como sistema reflectante, para aumentar as la efectividad de
la lmpara (Figura 1).
Esquema 1.- Esquema del instrumento de LC con derivatizacin fotoqumica post-columna.
Figura 1.- Fotorreactor utilizado
185
MEN
SALIR
Estudios Fluorescentes Previos
La gran mayora de los mtodos propuestos para el anlisis de resveratrol
y piceido en vino mediante LC, trabajan en fase inversa y llevan a cabo la elucin
en gradiente, mediante la introduccin progresiva de metanol o acetonitrilo, sobre
disoluciones diluidas de cido actico (o frmico cuando se emplea la
espectrometra de masas como sistema de deteccin).
En nuestro caso, ya que se va a desarrollar una fotorreaccin on-line, es
muy importante la eleccin tanto del cido empleado para fijar el pH de la fase
mvil, como del disolvente orgnico. Se tratar de encontrar unas condiciones que
favorezcan tanto la formacin de los fotoproductos, como el rendimiento cuntico
de fluorescencia de los mismos. Por ello, inicialmente se llevarn a cabo una serie
de estudios previos mediante espectroscopia de fluorescencia.
Con respecto a la acidez del medio, ya se ha puesto de manifiesto en los
captulos anteriores que la fotorreaccin transcurre en medio cido, y adems el
rendimiento cuntico de fluorescencia de los fotoproductos no se ve alterado como
consecuencia de la presencia de una alta concentracin de protones en el medio.
Se ha comprobado que la presencia de los cidos orgnicos tales como actico y
frmico afecta negativamente al proceso, por lo que se elige el H3PO4 como cido
para controlar el pH de la fase mvil.
Con respecto al disolvente orgnico a utilizar para preparar la fase mvil,
teniendo en cuenta los antecedentes bibliogrficos, se plantean dos posibilidades:
metanol o acetonitrilo. Mediante espectroscopa de fluorescencia se comprueba el
186
SALIR
efecto de ambos modificadores sobre la fotorreaccin. Para ello, se prepara una

serie de disoluciones conteniendo 0.34 gmL-1 de trans-resveratrol, en presencia
de distintas proporciones de acetonitrilo o metanol, y se registran sus espectros de
emisin (exc = 260 nm), tras ser irradiadas de manera acumulativa 30, 60 y 90
segundos bajo una lmpara de mercurio de alta presin. Las seales obtenidas se
representan en la Figura 2, observndose que, tanto la velocidad de la
fotorreaccin como la mxima seal de fluorescencia fotoinducida alcanzada, son
ligeramente superiores en presencia de acetonitrilo, por lo que se elige este
disolvente como modificador de la fase mvil.
80
10 % ACN
20 % ACN
40 % ACN
10 % MeOH
20 % MeOH
40 % MeOH
60
I. F. (exc/em 260/364 nm)
MEN
40
20
0
0
20
40
60
80
100
Figura 2.- Influencia del tiempo de irradiacin para disoluciones conteniendo 0.34
gmL-1 de trans-resveratrol en presencia de distintas proporciones de metanol o
acetonitrilo
Estudios Cromatogrficos Previos

Una vez seleccionado el cido para fijar el pH de la fase mvil y el
modificador orgnico, se comienza con los estudios cromatogrficos. Se prepara
una disolucin que, en un volumen final de 25.0 mL, contiene 1.02 y 1.11 gmL-1
187
MEN
SALIR
de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente y agua ultrapura hasta enrase.

Se inyecta en el sistema cromatogrfico una alcuota de esta disolucin y se eluye
isocrticamente, con una mezcla acetonitrilo:agua 19:81, v:v y una velocidad de
flujo de 0.80 mLmin-1. Se realizan dos inyecciones de la misma, una con el
fotorreactor apagado y otra con l encendido, para comprobar la eficacia de la
fotorreaccin. El eluato se monitoriza fotomtricamente a 306 nm y
fluorimtricamente a exc/em = 260/364 nm y los cromatogramas registrados con
ambos detectores se recogen en la Figura 3.
trans-Resveratrol
12
A (306 nm)
trans-Piceido
0
0
8
10
tiempo (min)
12
14
16
18
16
18
(trans-Resveratrol)h
I. F. (exc/em 260/364 nm)
B
6
(trans-Piceido)h
4
2
trans-Resveratrol
trans-Piceido
0
0
8
10
tiempo (min)
12
14
Figura 3.- Cromatogramas correspondientes a una mezcla conteniendo 1.02 y 1.11 gmLde trans-resveratrol y trans-piceido: (A) Perfil DAD a 306 nm y (B) FLD a exc/em 260/364
nm con el fotorreactor encendido () y apagado ()
En ausencia de fotorreaccin, en ambos detectores se observan dos

picos cromatogrficos, correspondientes a trans-piceido y trans-resveratrol,
respectivamente. Los tiempos de retencin son 4.4 y 14.9 minutos en el detector de
188
MEN
SALIR
diodos y aumentan ligeramente en el detector fluorescente, 4.9 y 15.4 min, debido

al fotorreactor que separa ambas clulas de deteccin, cuya longitud es de tres
metros, que produce un retardo de 0.45 minutos entre ambos perfiles. Cuando se
lleva a cabo una segunda inyeccin con el fotorreactor encendido, se produce una
ganancia sustancial en la intensidad de los picos observados fluorimtricamente, lo
que indica que los fotoproductos originados a partir de ambos analitos han sido
satisfactoriamente obtenidos, al menos en cierta extensin.
Para estudiar el efecto de la presencia de H3PO4, tanto en el rendimiento
de la fotorreaccin que ambos compuestos sufren en lnea, como en el rendimiento
cuntico de fluorescencia de los fotoproductos generados, se prepara una
disolucin acuosa conteniendo 1.02 y 1.11 gmL-1 de trans-resveratrol y transpiceido, respectivamente. Esta disolucin se conserva en la oscuridad hasta el
momento de ser inyectada en el cromatgrafo, y se eluye isocrticamente con
distintas fases mviles, conteniendo todas ellas un 19.0% de acetonitrilo y
porcentajes variables de H3PO4 entre 0 y 0.050%, resultando un pH aparente final
para estas fases mviles de 4.42, 2.82, 2.50 y 2.28, respectivamente. El flujo de la
fase mvil se mantiene a 0.80 mLmin-1 y el fotorreactor permanece encendido en
todo momento, de manera que fotomtricamente se observarn los compuestos
trans originales, y fluorimtricamente sus respectivos fotoproductos. Para ello, el
eluato se monitoriza fotomtricamente a 306 nm y fluorimtricamente a exc/em =
260/364 nm. Los cromatogramas obtenidos en el detector fluorescente se
representan en la Figura 4, donde se puede observar que la presencia de H3PO4 en
la fase mvil, origina una ligera disminucin en el rendimiento cuntico de los
fotoproductos. Por otra parte se aprecia que los tiempos de retencin disminuyen, a
medida que aumenta el porcentaje de cido.
189
MEN
SALIR
8
I. F. (exc/em 260/364 nm)
6
4
2
0
4
4.5
5.5
0
0
8
10
tiempo (min)
12
14
16
18
Figura 4.- Influencia del porcentaje de H3PO4: 0% (), 0.010% (), 0.025% () y 0.050%
(). [trans-resveratrol] = 1.02 gmL-1, [trans-piceido] = 1.11 gmL-1, velocidad de flujo = 0.80
mlmin-1
Para finalizar este apartado de estudios previos, es muy importante

remarcar el hecho de que no se pueden utilizar filtros de nylon para filtrar
disoluciones conteniendo resveratrol o piceido como trans- o cis-ismeros,
previamente a su inyeccin en el sistema cromatogrfico, ya que se ha
comprobado que el 100 % de los analitos resulta retenido en dicha membrana. Por
ello, a lo largo de todo este captulo se utilizan filtros de membranas hidrofbicas de
politetrafluoretileno (PTFE) (Millex-FG) para filtrar las muestras.
Optimizacin quimiomtrica de las condiciones cromatogrficas para el
anlisis isocrtico de trans-resveratrol y trans-piceido en muestras de vino
A la hora de optimizar las condiciones cromatogrficas, se han tenido en
cuenta tanto los parmetros relacionados con la separacin cromatogrfica como
los que influyen en la fotorreaccin.
190
MEN
SALIR
As, como variables qumicas, se seleccionan las proporciones relativas de

H3PO4 y de modificador como variables a optimizar.
Por otra parte, la reaccin de derivatizacin que tendr lugar en lnea es
una fotorreaccin, de manera que la luz ultravioleta proporcionada por la lmpara
puede ser considerada como reactivo derivatizante, cuya concentracin podr ser
controlada a travs del tiempo de residencia de los analitos en el fotorreactor, esto
es, a travs de la longitud del fotorreactor, o bien a travs del caudal de la fase
mvil, si se mantiene constante la longitud. Por ello, la sensibilidad del mtodo
estar directamente relacionada con el caudal de fase mvil, siendo sta la tercera
variable a optimizar. Por otra parte, esta variable tambin incidir sobre el resultado
de la separacin cromatogrfica.
Se intenta encontrar una fase mvil que, mediante elucin isocrtica,
permita la determinacin de estos analitos en muestras de vino, y para la
optimizacin de su composicin se har uso de la estadstica multivariante, a travs
del diseo experimental y la metodologa de la superficie de respuesta. Se utiliza
concretamente un diseo central compuesto, con el objetivo de calcular de forma
simultnea el efecto de la variacin de cada una de las variables a optimizar, as
como las posibles interacciones entre ellas. Se ensayan cinco niveles para cada
variable. Existen tambin tres muestras centrales, dando lugar a un total de 17
experiencias. El diseo presenta rotatividad, lo que implica que la precisin en el
clculo de la respuesta es uniforme en todo el rango experimental.
Los rangos considerados para cada una de las tres variables a optimizar
son:
191
MEN
SALIR
% v. acetonitrilo en la fase mvil: 25 15 %
% v. H3PO4 en la fase mvil: 0.01 0.05 %
Flujo: 0.50 1.50 mLmin-1
La eleccin de estos rangos est justificada por diversos motivos: el

porcentaje de acetonitrilo se vara alrededor de un valor central del 20 %, que fue el
valor ptimo deducido en estudios anteriores (Captulo IV). Con respecto al
porcentaje de H3PO4, se elige como valor inferior 0.01 %, ya que por debajo de
ste la capacidad tamponadora de la fase mvil sera mnima, y un valor superior
del 0.05 %, el cual origina una fase mvil ya muy cida cuyo pH se calcula en torno
a 2.3. Respecto a la velocidad de flujo, no se baja de 0.5 mLmin-1, ya que los
tiempos de anlisis seran excesivos.
En la Figura 5 se representa la arquitectura del diseo, as como los
niveles ensayados para cada variable.
Figura 5.- Diseo central compuesto y

niveles ensayados para cada una de las
tres variables en la optimizacin de las
condiciones cromatogrficas:
% acetonitrilo: 25.1, 23.0, 20.0, 17.0, 15.0;
% H3PO4: 0.05, 0.04, 0.03, 0.02, 0.01;
flujo: 1.50, 1.30, 1.00, 0.70, 0.50
mLmin-1
192
MEN
SALIR
Para llevar a cabo las experiencias marcadas por el diseo se preparan

dos disoluciones. Con una disolucin patrn se evala la extensin de la
fotorreaccin a travs de la altura de los picos obtenidos. Por otra parte, para
evaluar la eficacia de la separacin de los analitos de inters, se introduce tambin
en cada punto del diseo una muestra de vino dopada con los analitos. As, en
matraces de 25.0 mL, la disolucin patrn contiene 0.53 gmL-1 de transresveratrol, 0.58 gmL-1 de trans-piceido y agua ultrapura hasta enrase; la
segunda contiene 7.50 mL de un pool de vinos tintos comerciales y las mismas
cantidades de los analitos que en la disolucin patrn. Estas dos disoluciones,
mientras no se utilizan en la ejecucin de los experimentos, se conservan en la
oscuridad a 4 C.
Las experiencias marcadas por el diseo se realizan de manera aleatoria,
analizndose en cada experiencia tanto la disolucin estndar, como la de vino
fortificada. El fotorreactor se mantiene en todo momento encendido, y la
monitorizacin del eluato se lleva a cabo fotomtricamente a 306 nm, y
fluorimtricamente a exc/em 260/364 nm.
Tras cada inyeccin de la muestra de vino, una vez que se ha producido la
elucin de los compuestos de inters, se limpia la columna para expulsar todos los
componentes del vino que puedan originar picos fantasmas en los sucesivos
anlisis. La limpieza de la columna se lleva a cabo en todos los casos por paso
secuencial de: acetonitrilo:agua 25:75, 50:50, 100:0, v:v, a 1.2 mLmin-1, hasta
conseguir presin constante con cada disolucin, manteniendo acetonitrilo puro
hasta obtener una lnea base limpia.
La eleccin de la funcin respuesta es crucial ya que de ella depender
que las condiciones predichas como ptimas sean una solucin real del problema.
193
MEN
SALIR
Se han tenido en cuenta parmetros relacionados con la sensibilidad y la

selectividad. As, la funcin de respuesta (FR) seleccionada fue:
APt R ( h ) + APt P ( h )
(AP = rea de Pico)

F .R. = R * s ( t Pic ) +
2
norm
El primer trmino de la ecuacin representa la eficacia de la separacin

cromatogrfica, mientras que el segundo, est relacionado con la sensibilidad del
mtodo. La resolucin del pico del fotoproducto del trans-piceido, con respecto a
los interferentes del vino, se toma como representativa de la eficacia. En algunas
muestras del diseo este pico aparece resuelto de interferentes pre-eluidos y posteluidos, mientras que en otros puntos, este compuesto coeluye totalmente con los
interferentes del vino. R*s(t-Pic) es el valor de resolucin ms desfavorable (respecto
a los interferentes pre-eluidos o post-eluidos) para el pico correspondiente a transpiceido, multiplicado por dos cuando el otro valor de resolucin sea superior a 1.5,
con el objetivo de dar un mayor peso a la respuesta correspondiente a las
condiciones en que este compuesto est resuelto de todos los interferentes,
aunque slo sea parcialmente. El pico correspondiente a trans-resveratrol aparece
totalmente resuelto en todas las condiciones experimentales ensayadas y, por eso,
los valores de resolucin correspondientes a este pico no han sido incluidos en la
funcin de respuesta.
El segundo trmino evala la sensibilidad a travs de los valores de las
reas de pico de los fotoproductos. stas dependen tanto del rendimiento de la
fotorreaccin, como del rendimiento cuntico de fluorescencia de los fotoproductos
generados. Su valor se calcula como la media normalizada del rea de los picos de
los fotoproductos de trans-resveratrol y trans-piceido. Se utiliza la estrategia de
normalizar el segundo trmino con el objetivo de dar igual importancia a ambos
194
MEN
SALIR
trminos. As, el valor de este trmino normalizado estar siempre en torno a la

unidad, al igual que el trmino de las resoluciones.
Los tiempos de retencin tampoco han sido incluidos en la funcin de
respuesta, ya que en ningn caso fueron superiores a 30 minutos, valor bastante
aceptable, en comparacin con otros mtodos propuestos.
Los resultados se interpretan con la Metodologa de la Superficie de
Respuesta y la optimizacin del modelo se lleva a cabo con el software THE
UNSCRAMBLER (Unscrambler v. 6.11, CAMO A/S Olav Tryggvasonsgt, N-7011,
Trondheim, Norway). En el correspondiente anlisis de la varianza (ANOVA), se
asume un modelo cuadrtico de segundo grado (Model Check Quadratic, valor p
(95 %) = 0.0008). El valor de p calculado (95 %) para la falta de ajuste (Lack of Fit),
0.0583, indica que sta no es significativa a un nivel de confianza del 95 %, y que,
por tanto, el modelo describe adecuadamente la forma real de la superficie de
respuesta. Los resultados del ANOVA revelan tambin un valor para R2 de 0.947.
Por otra parte, aplicando el ANOVA al anlisis de los valores p, para las variables
estudiadas (Tabla 1), se deduce qu variables influyen de forma significativa (p <
0.05) en el modelo.
195
MEN
SALIR
Tabla 1.- Anlisis de los valores p
para las variables estudiadas
Variable
Valor p
% ACN
0.0310
% H3PO4
0.0765
Flujo
0.0067
% ACN - % ACN
0.0019
% H3PO4 - % H3PO4
0.0002
Flujo Flujo
0.0001
% ACN - % H3PO4
0.1348
% ACN Flujo
0.1013
% H3PO4 - Flujo
0.1725
A la vista de los resultados expuestos, se deduce que el % de acetonitrilo y

el flujo, as como los trminos cuadrticos % H3PO4 - % H3PO4, % ACN - % ACN y
flujo-flujo, contribuyen significativamente al modelo, para un nivel de confianza del
95 %. Sin embargo, el efecto % H3PO4 y las interacciones % ACN - % H3PO4 y %
ACN - flujo, no son significativas para el modelo, al nivel de confianza considerado.
En la Figura 6 se muestran las superficies de respuesta estimadas por el
modelo para cada par de variables. En estas superficies, el ptimo, situado en la
zona de mxima respuesta, corresponde a los siguientes valores, para cada una de
las variables estudiadas: 18 % de acetonitrilo y 3.310-2 % de H3PO4 en la fase
mvil y un flujo de 0.9 mLmin-1. Por tanto, la fase mvil seleccionada como ptima
fue acetonitrilo:H3PO4 (0.04 %), 18:82, v:v, y una velocidad de flujo de la fase mvil
de 0.9 mLmin-1.
196
MEN
SALIR
Figura 6.- Superficies de respuesta predichas para

cada par de variables
Con el objetivo de comprobar que las condiciones predichas como ptimas

por el modelo quimiomtrico, corresponden a una solucin real del problema, es
decir, que el anlisis se puede llevar a cabo de manera sensible y libre de
197
MEN
SALIR
interferencias, se registran los cromatogramas correspondientes a una muestra

patrn y una muestra de vino fortificada, en las condiciones determinadas como
ptimas. Los cromatogramas registrados, con el fotorreactor encendido en todo
momento, y monitorizando fluorimtricamente el eluato a exc/em 260/364 nm, se
recogen en la Figura 7.
35
I. F. (exc/em 260/364 nm)
30
25
desconocido
20
15
trans-Piceido
10
trans-Resveratrol
5
0
0
8
tiempo (min)
10
12
14
16
Figura 7.- Cromatogramas correspondientes a una muestra patrn () y a una muestra

de vino tinto fortificada con los analitos (). [trans-resveratrol] = 0.53 gmL-1, [transpiceido] = 0.58 gmL-1, fase mvil: ACN:0.04 % H3PO4, 18:82 v:v, flujo 0.9 mLmin-1
Como se observa, bajo las condiciones seleccionadas como ptimas,

ambos analitos estn resueltos a lnea base, en un tiempo inferior a 15 minutos,
siendo los tiempos de retencin y los factores de capacidad 4.65 y 14.37 minutos, y
2.10
8.58,
respectivamente,
para
trans-piceido
trans-resveratrol,
respectivamente.
Influencia de la Temperatura
Se lleva a cabo el estudio de la precisin inter-da, inyectando en das
sucesivos, y siempre a la misma hora, una disolucin conteniendo 0.50 gmL-1 de
cada analito. Se observa una pobre reproducibilidad en los tiempos de retencin de
ambos compuestos, oscilando stos entre 4.65 y 4.99 minutos para trans-piceido y
198
MEN
SALIR
14.37 y 16.09 para trans-resveratrol. Como es lgico, esta falta de reproducibilidad

en los tiempos de retencin se traduce en una falta de reproducibilidad en la
resolucin de ambos picos con respecto a los interferentes del vino, sobre todo en
el pico de trans-piceido, dada su cercana a una serie de interferencias menos
retenidas que l.
Pensamos que esta irreproducibilidad puede ser debida a fluctuaciones en
la temperatura ambiente. Para comprobar como afecta la temperatura, se llevan a
cabo dos experiencias en condiciones drsticamente diferentes. As, una misma
muestra conteniendo 0.50 gmL-1 de cada analito, se eluye en las condiciones
seleccionadas como ptimas, en primer lugar con los recipientes conteniendo la
fase mvil sumergidos en hielo y, en segundo lugar, con los recipientes sin
sumergir, y con un calefactor de infrarrojos dirigido hacia la columna
cromatogrfica, lo que elevaba en gran medida la temperatura en el ambiente de la
columna. Los tiempos de retencin para el trans-piceido varan entre 4.9 y 5.1
minutos, y para el trans-resveratrol, entre 15.6 y 16.7 minutos, cuando la elucin se
lleva a cabo a alta y baja temperatura, respectivamente. Comprobado el efecto de
la temperatura sobre la retencin de los analitos, se realiza el estudio de la
influencia de la temperatura.
La termostatizacin de la columna se consigue mediante una camisa
consistente en un tubo de silicona, enrollado helicoidalmente sobre la misma, cuyos
extremos estn unidos a la entrada y salida de un bao termosttico, dando lugar a
un circuito cerrado por el que circula agua, cuya temperatura se controla a travs
del bao termosttico.
Se preparan, en sendos matraces de 10.0 mL, dos disoluciones,
conteniendo la primera de ellas 1.02 y 1.11 gmL-1 de trans-resveratrol y trans199
MEN
SALIR
piceido respectivamente, y agua ultrapura hasta enrase, y la segunda, 3.0 mL de

una muestra de vino tinto comercial, diluida con agua ultrapura, hasta enrase.
Ambas disoluciones se inyectan en el sistema cromatogrfico y se eluyen a
diferentes temperaturas comprendidas entre 10 y 30 C, en las condiciones
establecidas anteriormente como ptimas. En la Figura 8 se muestran los
cromatogramas correspondientes a la muestra patrn y de vino, obtenidos a 15 y
30 C.
I. F. (exc/em 260/364 nm)
6
4
2
0
0
10
t (min)
40
15
20
25
25
I. F. (exc/em 260/364 nm)
B
30
20
0
3
t (min)
10
0
0
10
t (min)
15
20
25
Figura 8.- Influencia de la temperatura sobre los tiempos de retencin de: (A)
disolucin patrn conteniendo 1.02 y 1.11 gmL-1 de trans-resveratrol y transpiceido, respectivamente y (B) muestra de vino a 15 C () y 30 C ()
200
MEN
SALIR
Como se observa, el aumento de la temperatura supone una disminucin

de los factores de capacidad de ambos compuestos. Por otra parte, tambin se
observa cmo a 15 C el pico correspondiente a trans-piceido est resuelto a lnea
base, con respecto a las interferencias del vino menos retenidas que l, por lo que
para experiencias futuras, se selecciona 15 C como temperatura de trabajo.
En todas las modalidades de cromatografa lquida, la retencin de los
solutos disminuye con el incremento de la temperatura, y por lo general, se
obtienen relaciones lineales al representar log k frente a 1/T y se acepta como
regla aproximada que un aumento de 30 C en la temperatura, supone una
disminucin de dos veces en el factor de capacidad, k4. Con el objetivo de
comprobar que esta tendencia general se cumple en la separacin cromatogrfica
de estos analitos, se han representado, sobre un eje logartmico, los factores de
capacidad para ambos compuestos, medidos sobre los picos cromatogrficos
detectados mediante fluorescencia, a las distintas temperaturas ensayadas, as
como la presin del sistema, frente a la inversa de la temperatura. Dicha
representacin se encuentra en la Figura 9. Se comprueba que existe una relacin
lineal, al representar sobre un eje logartmico los factores de capacidad de transresveratrol y trans-piceido, frente a la inversa a la temperatura, observndose como
los factores de capacidad disminuyen a media que aumenta la temperatura. Por su
parte, la presin del sistema disminuye al aumentar la temperatura, ya que a mayor
temperatura menor es la viscosidad de la fase mvil.
Introduction to Modern Liquid Chromatography, Second Edition, L.R. Snyder y J.J. Kirkland, John
Wiley & sons, inc
201
MEN
SALIR
1000
80
70
60
50
40
900
800
700
600
500
400
30
300
20
200
109
100
8
7
6
5
4
90
80
70
60
50
40
30
20
P (bar)
k'
10090
10
3.6
3.5
3.4
103/T (K-1)
3.3
3.2
Figura 9.- Efecto de la temperatura (T) sobre los factores de capacidad

(k) de t-resveratrol (R) y t-piceido (P) y sobre la presin del sistema (p)
Rectas de Calibrado y Parmetros Analticos de Calidad

Establecidas las condiciones ptimas para la determinacin cromatogrfica
de trans-resveratrol y trans-piceido en vino, antes de abordar el anlisis de
muestras reales, se procede a estudiar la relacin entre la concentracin de analito
puesta, y la seal analtica medida, y al establecimiento de las rectas de calibrado
para ambos compuestos.
En matraces de 10.0 mL, se preparan, por triplicado, disoluciones
conteniendo entre 0.010 y 0.15 mL de las disoluciones madre etanlicas de 102 y
111 gmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido, respectivamente, y agua ultrapura
hasta enrase. Cada una de estas muestras, recin preparada y aislada de la luz, se
inyecta en el sistema cromatogrfico y se eluye a 0.9 mLmin-1 con una mezcla
acetonitrilo:H3PO4 (0.04 %), 18:82, v:v, manteniendo la temperatura de la columna
202
MEN
SALIR
constante mediante una camisa de agua recirculante a 15 C. El fotorreactor se

mantiene encendido en todo momento, lo que permite el desarrollo de las
fotorreacciones de ambos analitos en lnea, y los correspondientes cromatogramas
se obtienen monitorizando fluorimtricamente el eluato a exc/em 260/364 nm. Los
parmetros analticos de calidad correspondientes a la determinacin
cromatogrfica de ambos analitos se recogen en la Tabla 2.
Tabla 2.- Parmetros analticos de calidad para la determinacin cromatogrfica de trans-resveratrol
y trans-piceido
trans-Resveratrol
trans-Piceido
0.1 1.5
0.1 1.5
Rango de concentracin examinado

(gmL-1)
-6.7x102 3.4x102 -4.3x102 1.2x102
(105.8 3.5)x102 (436.7 1.1)x102
6.6 x102
2.3 x102
0.9944
0.9967
0.9888
0.9934
% Linealidad
96.64
97.42
0.0624
0.0521
LOD (S/N=3) (gmL-1)
0.0012
0.0014
LOQ (S/N=10) (gmL-1)
0.0041
0.0047
Repetitividad inter- e intra-da de los mtodos

Con objeto de comprobar la repetitividad del mtodo propuesto, se
preparan dos series de once disoluciones cada una, en un volumen final de 10.0
mL, la primera de ellas conteniendo 0.204 y 0.222 gmL-1 de trans-resveratrol y
trans-piceido respectivamente y la segunda 1.02 y 1.11 gmL-1 de cada analito.
203
MEN
SALIR
Cada una de estas disoluciones se inyecta en el sistema cromatogrfico y se

obtienen sus respectivos cromatogramas en condiciones idnticas a las empleadas
en el establecimiento de las rectas de calibrado. En la Tabla 3 se resumen las
desviaciones estndar en tiempos de retencin, reas de pico y alturas de pico,
parmetros que permiten evaluar la repetitividad intra-da del mtodo
cromatogrfico.
Por otra parte, para estudiar la repetitividad inter-da, se preparan dos
disoluciones en las mismas condiciones ya indicadas y se inyectan en el
cromatogrfo durante once das consecutivos. Los resultados obtenidos de
encuentran en la Tabla 3. A la vista de los resultados obtenidos, se concluye que la
repetitividad intra- e inter-da del mtodo es aceptable, a los dos niveles de
concentracin estudiados.
Tabla 3.- Repetitividad en la determinacin de trans-resveratrol y trans-piceido
tR (min) SD
I
% R.S.D. (tR)
N
T rea Media SD
R
A % R.S.D. (rea)
- Altura Media SD
D
% R.S.D. (Altura)
tR (min) SD
I
% R.S.D. (tR)
N
T rea Media SD
E
R % R.S.D. (rea)
- Altura Media SD
D
% R.S.D. (Altura)
204
trans-Resveratrol
1.02
0.204
gmL-1
gmL-1
17.990.05 17.880.25
0.25
1.4
(86.77.0)
(12.61.2)x102
x102
9.8
8.1
(19.680.16)
28.82.7
x102
10.0
8.2
17.600.21 17.770.20
1.2
1.1
(89.27.0)
(11.22.0)x102
x102
18.2
7.9
(1.980.13)
22.54.1
x102
18.3
6.9
trans-Piceido
0.222
1.11
gmL-1
gmL-1
5.340.02
5.310.08
0.37
1.4
(4.720.37) (34.61.1)
x102
x102
8.0
3.4
(1.750.20)
21.21.8
x102
8.6
11.9
5.300.02
5.300.05
0.42
0.99
(4.790.86) (34.31.7)
x102
x102
17.9
4.9
(1.930.34)
20.73.7
x102
18.1
17.5
MEN
SALIR
Foto-Isomera cis-trans. Evidencia de la presencia de cis-ismeros de

resveratrol y piceido en vinos
La exposicin a la luz solar, de manera controlada, de disoluciones
conteniendo los trans-ismeros de resveratrol y piceido, tiene como consecuencia
la obtencin de los correspondientes cis-ismeros. Este hecho ha sido
ampliamente discutido en la literatura cientfica, y probado espectroscpicamente
por nosotros, como se ha descrito en los captulos anteriores.
En el captulo IV, correspondiente al anlisis cromatogrfico de resveratrol
y piceido con derivatizacin off-line pre-columna, no es posible diferenciar entre los
picos cromatogrficos correspondientes a los trans- o cis-ismeros de los analitos,
porque la irradiacin en la lmpara de mercurio de alta presin supone la
destruccin total de los mismos, en favor de sus derivados altamente fluorescentes,
de manera que los analitos originales no son eluidos como tal, sino como sus
respectivos fotoproductos. Aunque la principal ventaja del mtodo propuesto en el
captulo anterior es la sensibilidad, ya que el empleo de una lmpara de mercurio
de alta presin supone unos rendimientos muy altos de las fotorreacciones, su
principal limitacin es el hecho de que slo es posible determinar cantidades totales
de resveratrol y piceido presentes en el vino, no pudiendo determinar la distribucin
relativa entre las formas cis- y trans- de cada analito.
En el caso de llevar a cabo las fotorreacciones en lnea post-columna,
primero tiene lugar la separacin cromatogrfica, y a continuacin las respectivas
fotorreacciones sobre porciones discretas del eluato. Es decir, en este caso, dada
la diferente polaridad entre los trans- y cis-ismeros, en primer lugar se produce su
separacin en la columna cromatogrfica, y a continuacin, cada analito,
transportado de manera individual, en un bolo discreto del eluato, sufre la
205
MEN
SALIR
fotorreaccin, que supondr la obtencin en cierta medida de sus fotoproductos

fluorescentes, lo que har posible su deteccin mediante fluorescencia molecular.
De manera que, si bien, al emplear una lmpara ultravioleta en lnea, el rendimiento
de las fotorreacciones es menor, no llegando a completarse en ningn caso, lo que
supondr una disminucin en la sensibilidad con respecto al mtodo de
derivatizacin precolumna, sin embargo tiene la ventaja de que permite la
determinacin de las concentraciones relativas de los trans- y cis-ismeros de cada
analito, y no cantidades totales.
Al no disponer de patrones de los cis-ismeros, stos se obtendrn por
exposicin controlada a la luz solar, de disoluciones de sus respectivos transismeros. Para comprobar las posibilidades de este procedimiento, se realiza la
siguiente experiencia: en un matraz de 10.0 mL se depositan 0.15 mL de sendas
disoluciones madre de trans-piceido y trans-resveratrol, conteniendo 111 y 102
gmL-1, respectivamente, y se completa con agua ultrapura hasta enrase. Cuando
esta disolucin se inyecta en el sistema cromatogrfico, recin preparada y se lleva
a cabo su elucin, en las condiciones previamente determinadas como ptimas, en
el detector fotomtrico se observan nicamente dos picos cromatogrficos, a 4.8 y
16.8
minutos,
correspondientes
trans-piceido
trans-resveratrol,
respectivamente. A continuacin, dicha disolucin, se expone a la luz, evitando la

radiacin solar directa, y se van aislando y guardando en la oscuridad alcuotas de
la misma, a distintos tiempos de exposicin, con el objetivo de seguir el transcurso
de la fotorreaccin de generacin de los cis-ismeros, durante aproximadamente
dos minutos. Dichas alcuotas son inyectadas sucesivamente en el sistema
cromatogrfico. Tres de los cromatogramas tridimensionales registrados en el DAD
se muestran en forma de superficies y mapas de contorno en la Figura 10, y en
ellos puede apreciarse como la exposicin progresiva a la luz genera dos nuevos
206
MEN
SALIR
compuestos correspondientes a los ismeros cis de piceido y resveratrol, a 11.2 y

35.6 minutos, respectivamente.
Figura 10.- Cromatogramas tridimensionales (tiempo longitud de onda - absorbancia) y mapas de

contorno en funcin del tiempo de exposicin a la luz de una disolucin que contiene transresveratrol y trans-piceido. [trans-resveratrol] = 1.53 gmL-1; [trans-piceido] = 1.66 gmL-1
207
MEN
SALIR
Por otra parte, adems de realizar la deteccin fotomtrica con el objetivo

de identificar los cis-ismeros, durante toda la experiencia se mantuvo encendido el
fotorreactor, y se monitoriz el eluato fluorimtricamente (exc/em 260/364 nm).
Como se representa en la Figura 11, se comprueba que las fotorreacciones
tambin tienen lugar con xito a partir de los cis-ismeros.
*FLD1
*FLD1
*FLD1
*FLD1
A,
A,
A,
A,
Ex=260,
Ex=260,
Ex=260,
Ex=260,
Em=364
Em=364
Em=364
Em=364
(E:\DIEGO\PST19A22.D)
LU
300
250
200
150
100
50
0
0
10
15
20
25
30
35
40
min
Figura 11.- Perfiles de fluorescencia correspondientes a la muestra de trans-resveratrol

y trans-piceido (azul) y a las distintas alcuotas expuestas a la luz durante tiempos
sucesivos (rojo, verde y rosa)
Se comprueba que los picos cromatogrficos correspondientes a los cisismeros estn totalmente resueltos de los correspondientes a los trans-. Adems,
los cis-ismeros, son menos polares que los correspondientes trans-, como revela
su mayor afinidad por la fase estacionaria, debido probablemente a interacciones
intra-moleculares, tipo puente de hidrgeno entre grupos hidroxilo, en las molculas
cis.
Con el objetivo de comprobar la presencia de los cuatro ismeros en el
vino, se comparan los cromatogramas correspondientes a una muestra patrn,
conteniendo 1.43 y 1.55 gmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido,
respectivamente y expuesta durante 30 s a la sombra, en el exterior del laboratorio,
208
SALIR
lo que dar lugar a la generacin de ciertas cantidades de los cis-ismeros de

resveratrol y piceido y una muestra de vino diluida con agua ultrapura (0.50 mL de
un vino tinto comercial se llevan hasta un volumen final de 10.0 mL). Ambas
disoluciones son inyectadas en el sistema cromatogrfico y eludas en las
condiciones previamente determinadas como ptimas, y los cromatogramas
obtenidos se recogen en la Figura 12 donde se aprecia la presencia de los cuatro
ismeros en la muestra de vino. La resolucin de los cuatro compuestos de inters
con respecto a las interferencias del vino es en todos los casos superior a 1.5,
excepto en el caso del pico correspondiente a cis-piceido que solapa ligeramente
con una interferencia previa. No obstante, la resolucin en este caso es aceptable,
de manera que no se contempla la posibilidad de cambiar las condiciones
cromatogrficas.
200
I. F. (exc/em 260/364 nm)
MEN
160
trans-resveratrol
trans-piceido
120
Desconocido
80
cis-piceido
cis-resveratrol
40
0
0
10
20
t (min)
30
40
Figura 12.- Perfiles-FLDexc/em 260/364 nm correspondientes a una muestra conteniendo 1.43 y

1.55 gmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido, respectivamente, expuesta durante 30
segundos a la luz solar (), y a un vino comercial diluido 20 veces con agua ()
Para poder realizar la cuantificacin en vinos es necesario realizar

previamente un calibrado a partir de disoluciones patrn, algo realmente complejo,
porque como ya se ha indicado, no se comercializan patrones de los cis-ismeros.
209
MEN
SALIR
En nuestro caso, para cuantificar los cis-ismeros se van a emplear

disoluciones patrn de dichos compuestos, obtenidas por exposicin a la luz solar
de sus respectivos trans-ismeros, en concentraciones conocidas. Para llevar a
cabo el calibrado, es necesario relacionar la seal analtica, en este caso, rea de
los picos correspondientes a cis-resveratrol y cis-piceido, con sus respectivas
concentraciones, calculadas por diferencia entre las reas de los picos de los transismeros, antes y despus de la exposicin a la luz solar. De manera que se
prepararn mezclas de trans-resveratrol y trans-piceido, se inyectarn rpidamente
en el sistema cromatogrfico y a continuacin dichas disoluciones se expondrn a
la luz solar y se volvern a inyectar en el sistema, relacionando el rea de los dos
nuevos picos, correspondientes a los cis-ismeros, con la cada de concentracin
de trans-resveratrol y trans-piceido.
No obstante, antes de proceder al establecimiento de rectas de calibrado, y
con el objetivo de no cometer errores en la cuantificacin de los ismeros cis, es
necesario asegurar las condiciones de exposicin, en las cuales slo se obtenga el
cis-ismero de cada analito, y no sus respectivas formas fluorescentes.
Se ha comprobado la existencia de ambos pares de ismeros, en ausencia
total de sus formas fluorescentes, cuando disoluciones conteniendo entre 0.20 y
1.50 gmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido son expuestas a la sombra, en el
exterior del laboratorio, durante un periodo de 30 segundos. La forma ms directa
de realizar esta comprobacin, es comparando alguno de los cromatogramas
obtenidos en estas condiciones, con el cromatograma correspondiente a una
disolucin irradiada en la lmpara de mercurio de alta presin, durante un tiempo
tal que se haya dado en cierta extensin, la formacin de los fotoproductos
fluorescentes. Para ello, en un matraz de 10.0 mL se depositan 0.10 mL de las
disoluciones madre de trans-resveratrol y trans-piceido de 102 y 111 gmL-1
210
MEN
SALIR
respectivamente, 3.8 mL de etanol absoluto y agua ultrapura hasta enrase. Una

alcuota de esta disolucin se deposita en una cubeta de cuarzo, de un centmetro
de paso de luz, y se expone a la luz de una lmpara de mercurio de alta presin,
durante 90 segundos bajo agitacin magntica. Por otra parte, el matraz
conteniendo el resto de la disolucin, se expone a la luz del da, a la sombra en el
exterior del laboratorio, durante 30 segundos. Ambas disoluciones se inyectan en el
sistema cromatogrfico y se eluyen en las condiciones ya optimizadas. Los
cromatogramas registrados monitorizando fotomtricamente el eluato a 260 nm, se
encuentran en la Figura 13.
Figura 13.- Cromatogramas (260 nm) correspondientes a las muestras expuestas a la

luz del da (superior) y a la luz ultravioleta de la lmpara de mercurio de alta presin
(inferior)
A la vista de la Figura 13 se comprueba la no existencia de FP1 ni FR en

las condiciones de obtencin de los cis-ismeros, ya que no se observan los picos
correspondientes. Con respecto a FP2, que coeluye con trans-resveratrol, tambin
se comprueba que no se genera nada, al ser puro el pico de trans-resveratrol en el
cromatograma de la muestra expuesta a la luz solar.
211
MEN
SALIR
Este hecho tambin ha sido corroborado monitorizando la fotorreaccin a

275 nm, longitud de onda correspondiente al punto isobstico de los espectros de
absorcin obtenidos en los picos correspondientes de cada par cis-trans, Figura 14.
Dado que para un par cualquiera, en el punto isobstico las absortividades molares
de ambos ismeros es la misma, la razn rea de pico vs concentracin es tambin
la misma. Por lo tanto, el rea total debe mantenerse constante, si la concentracin
de cada par cis-trans hace lo mismo.
7
21
6
5
A (mAu)
A (mAu)
14
4
3
2
1
0
240
280
(nm)
320
360
240
280
(nm)
320
360
Figura 14.- Espectros en el pico obtenidos en lnea correspondientes a una

disolucin de trans-piceido antes de la exposicin a la luz del da (- - -), y tras un
tiempo de exposicin de 30 s (----) y 60 s (). Punto isobstico a 275 nm,
redondeado en la figura de la derecha
La comprobacin matemtica de este hecho, basada en la ley de LambertBeer, es la siguiente:

Supongamos la siguiente fotorreaccin:
h<
trans
cis
Podemos establecer un balance de materia, considerando que antes del

proceso de irradiacin slo existen los ismeros trans y que una vez que las
212
MEN
SALIR
muestras comienzan a exponerse a la luz, coexisten ambos ismeros por lo que las
concentraciones antes y despus de la irradiacin seran:
Inicialmente
Despus de la irradiacin
trans
cis
c0t rans
c0trans - ccis
ccis
Teniendo en cuenta que el rea de los picos viene dada por:
Area =
A dt =
trans
b c dt
Puesto que el caudal de la fase mvil es constante dt ser sinnimo de

dvol y tendremos, para cada una de las especies, las siguientes relaciones entre
rea de pico y concentracin, y entre rea de pico y masa inyectada
Area trans =
trans
b ctrans dt = trans
b ctrans dvol = trans
b mtrans
Area cis =
cis
b ccis dt = cis
b ccis dvol = cis
b mcis
Inicialmente, la cantidad del ismero trans es perfectamente conocida y

esto nos permite poder relacionarla con el rea de pico. Cuando, a travs de la
irradiacin, comienza a formarse el ismero cis, el rea de pico del trans disminuye
pero, asumiendo que a lo largo de todo el proceso la masa total se conserva,
tambin lo har la suma de las reas de ambos picos. Si definimos un parmetro,
y, como
213
MEN
SALIR
y=
Area trans + Area cis

x100
0
Area trans
0
donde Area trans
es el rea inicial del pico del trans, sustituyendo en esta ecuacin
las relaciones previamente establecidas entre rea y masa, tendremos:
trans
b mtrans + cis
b mcis
y=
x 100
0
trans b mtrans
i
i
= cis
, entonces:
y como en el punto isobstico, i, se cumple que trans
y=
mtrans + mcis
x 100
0
mtrans
Por tanto, si el parmetro y, obtenido a partir de las reas medidas para los
picos antes y despus de irradiar, es constante e igual a 100, significar que la
suma de las cantidades de cis y trans obtenidas al irradiar es igual a la cantidad
inicial de trans, y ello permitir calcular la concentracin de cis.
Se ha comprobado que, efectivamente, para los picos obtenidos
detectando a la del punto isobstico, a la cual se cumple que las absortividades
son iguales, el rea total es igual a la suma de las reas de cada pico, por lo que se
comprueba que se conserva la masa y se confirma la existencia nicamente de cisy trans-resveratrol, y cis- y trans-piceido.
Comprobado este hecho, es correcto proceder al calibrado de los
compuestos cis relacionando el rea de sus correspondientes picos con la
concentracin deducida a partir de la disminucin de concentracin de sus
respectivos ismeros trans.
214
MEN
SALIR
Rectas de calibrado y parmetros analticos de calidad para la cuantificacin

de los ismeros cis
Con el objetivo de comprobar la linealidad del mtodo, se prepara en un
matraz de 10.0 mL y en ausencia de luz, una disolucin conteniendo 1.53 y 1.66
gmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido, respectivamente. Esta disolucin,
recin preparada, se inyecta en el cromatgrafo y se eluye en las condiciones
previamente fijadas, con el objetivo de relacionar el rea de cada pico con las
concentraciones de trans-resveratrol y trans-piceido. A continuacin, la disolucin
se expone a la luz del da en el exterior del laboratorio, mantenindola a la sombra.
Se van aislando de la luz, alcuotas de la misma, durante un periodo de un minuto,
y se van guardando en la oscuridad, lo que supone la paralizacin de la
fotorreaccin, en distintos momentos de su desarrollo. Las alcuotas obtenidas, se
conservan en ausencia total de luz, y se van inyectando sucesivamente en el
sistema cromatogrfico.
Excepto en la primera disolucin, totalmente aislada de la luz, donde slo
existirn trans-ismeros, en todas las dems se observan los 4 ismeros y la
relacin entre seal (rea de pico) y la concentracin de cada uno de los ismeros
se establece de la siguiente manera:
1.- Se van inyectando las alcuotas expuestas a la luz, medimos el
rea de los picos correspondientes a los compuestos trans y, a travs de sus
correspondientes rectas de calibrado (Tabla 2), se calcula la concentracin
que va quedando de cada ismero trans en cada momento.
215
MEN
SALIR
2.- Por diferencia entre la concentracin inicial de cada trans-ismero

y la concentracin de esta misma especie calculada en las diferentes
alcuotas expuestas a la luz, se calcula la concentracin del cis-ismero
correspondiente. Se representan los valores de rea de pico, para los
ismeros cis, frente a los valores de concentracin as deducidos.
Los resultados obtenidos, se presentan en la Figura 15, observndose que
no son excesivamente buenos, porque, sobre todo en el caso del cis-resveratrol, no
se ajustan a una lnea recta.
6000
rea de Pico
5000
4000
3000
2000
1000
0
0
0.4
0.8
1.2
[cis-ismero] (gmL-1)
1.6
Figura 15.- rea de pico vs concentracin de

cada cis-ismeros, para muestras obtenidas
por exposicin continuada a la luz de una
misma muestra y extraccin sucesiva de
alcuotas
Con objeto de mejorar la linealidad, se realizan diversas experiencias

ensayndose diferentes metodologas y finalmente proponemos el siguiente
mtodo operatorio:
En matraces de 10.0 mL, se preparan disoluciones conteniendo entre 0.20
y 1.70 gmL-1 de ambos analitos, etanol absoluto hasta completar el 1.5 % y agua
216
SALIR
ultrapura hasta enrase. Cada uno de estos patrones, se inyecta dos veces en el
sistema cromatogrfico, la primera vez, recin preparado y aislado de la luz, y la
segunda vez tras haber sido expuesto durante 30 segundos a la luz del da, a la
sombra en el exterior del laboratorio. En todos los casos, se inyectan las muestras
en el sistema cromatogrfico, se eluyen a 0.9 mLmin-1 con una mezcla
acetonitrilo:H3PO4 (0.04 %), 18:82, v:v, manteniendo la temperatura de la columna
constante a 15 C. El fotorreactor se mantiene encendido en todo momento, lo que
permite el desarrollo de las fotorreacciones de los analitos en lnea, y los
correspondientes cromatogramas se obtienen monitorizando fluorimtricamente el
eluato a exc/em 260/364 nm. Las concentraciones de cada uno de los ismeros en
las muestras que han estado expuestas a la luz se calculan como se ha explicado
anteriormente.
En la Figura 16 se representan las rectas de calibrado obtenidas para los
cuatro ismeros, y en la Tabla 4 se recogen los parmetros analticos de calidad
correspondientes a la determinacin cromatogrfica de los dos cis-ismeros. Los
valores de los coeficientes de correlacin son bastante aceptables en ambos
casos.
3000
2000
2500
1600
rea de Pico (FLD)
rea de Pico (FLD)
MEN
2000
1500
1000
1200
800
400
500
0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
[cis-Resveratrol] (gmL -1)
0.2
0.4
0.6
[cis-Piceido] (gmL -1 )
0.8
Figura 16.- rea de pico frente a la concentracin de analito cis
217
MEN
SALIR
Tabla 4.- Parmetros analticos de calidad para la determinacin cromatogrfica de

cis-resveratrol y cis-piceido
Rango de concentracin
examinado (gmL-1)
Ordenada en el Origen
(a sa)
Pendiente (b sb)
(mLg-1)
Desviacin Estndar de la
Regresin (sy/x)
% Linealidad
(-1)
Resolucin Analtica
(gmL-1)
LOD (S/N=3) (gmL-1)
LOQ (S/N=10) (gmL-1)
cis-Resveratrol
cis-Piceido
0.10 1.00
0.10 1.00
(3.21.0)x102
(1.71.1)x102
(28.21.9)x102 (19.0 2.4)x102

103.7
125.8
0.9957
0.9843
0.9914
0.9688
93.44
87.31
0.0368
0.0661
0.014
0.0071
0.046
0.023
Se comprueba que las disoluciones de cis-resveratrol y cis-piceido, en el

rango de concentraciones detallado en la Tabla 2, y obtenidas por exposicin de
disoluciones de sus trans-ismeros durante 30 segundos a la luz del da, son
estables al menos durante 24 horas.
Repetitividad del mtodo cromatogrfico para la determinacin de cisresveratrol y cis-piceido
Para estudiar la repetitividad del mtodo se prepara una disolucin
conteniendo 0.10 mL de cada una de las disoluciones madre etanlicas de transresveratrol y trans-piceido, de 102 y 111 gmL-1, respectivamente, 0.05 mL de
etanol absoluto y agua ultrapura hasta completar 10.0 mL. Esta disolucin se
218
MEN
SALIR
expone durante 30 segundos a la luz en el exterior del laboratorio, y transcurrido

ese tiempo se asla totalmente de la luz. Se realizan once inyecciones de la misma,
para estudiar as la repetitividad relativa al sistema.
Tabla 5.- Repetitividad relativa al sistema en la determinacin cromatogrfica de los cuatro analitos
trans-resveratrol cis-resveratrol
trans-piceido
cis-piceido
tR (min) SD
17.9 0.2
37.3 0.3
5.30 0.04
18.0 0.2
% R.S.D.
1.4
0.82
0.81
1.6
rea Media SD (38.21.8)x102 (28.21.2)x102 (10.750.27)x102 (12.460.39)x102
% R.S.D. (rea)
4.6
4.1
2.5
3.2
Altura Media SD
74.0 1.5
27.5 0.8
43.8 1.1
25.6 0.6
% R.S.D. (Altura)
2.1
3.0
2.6
2.4
Aplicacin: Anlisis de los ismeros de resveratrol y piceido en vino

En primer lugar y para comprobar si existe o no efecto de matriz, se va a
llevar a cabo una adicin patrn sobre un pool de vinos tintos comerciales.
Para poder realizar esta experiencia es necesario disponer de una muestra
que contenga los cuatro analitos en concentracin conocida. Esta disolucin se
prepara en un matraz que, en un volumen final de 50.0 mL, contiene 1.47 y 1.60
gmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente, 0.06 mL de etanol
absoluto, y agua ultrapura hasta enrase. Esta disolucin se expone a la luz,
evitando la radiacin solar directa, durante 30 segundos, lo que da lugar a la
transformacin parcial de los trans-ismeros en cis-ismeros. La concentracin de
cada ismero se determina registrando el cromatograma de una alcuota de esta
disolucin y una vez medidas las reas, sustituyendo estas en las ecuaciones de
calibrado previamente establecidas. Esta disolucin se conserva en la oscuridad,
219
MEN
SALIR
condiciones en las que previamente se determin que los cuatro analitos son
estables al menos durante 24 horas.
Para llevar a cabo la adicin patrn, se dispone un conjunto de cuatro
matraces de 10.0 mL y se deposita en todos ellos 0.50 mL del pool de vinos tintos,
volmenes crecientes de la disolucin que contiene los cuatro analitos de inters
(0.00, 3.00, 6.00 y 9.00 mL) y agua ultrapura hasta enrase. Paralelamente, en otra
serie de tres matraces de 10.0 mL, se preparan patrones por dilucin de 3.00, 6.00
y 9.00 mL de la disolucin que contiene los cuatro analitos de inters. Se registran
los cromatogramas y se representan las reas de pico frente a la concentracin de
analito, Figura 17.
Como se aprecia, en todos los casos, excepto en el del trans-resveratrol,
existe un marcado efecto de matriz, hecho que se ha comprobado por aplicacin de
los correspondientes tests estadsticos de Fischer y de la t-student.
220
SALIR
3000
trans-Piceido
3000
rea de Pico (FLD)
rea de Pico (FLD)
4000
2000
1000
0
cis-Piceido
2000
1000
0
0
6000
0.1
0.2
0.3
0.4
[trans-Piceido] (gmL-1)
0.5
5000
trans-Resveratrol
0.2
0.4
0.6
0.8
cis-Resveratrol
rea de Pico (FLD)
4000
rea de Pico (FLD)
MEN
4000
2000
3000
2000
1000
0
0
0.1
0.2
0.3
0.4
[trans-Resveratrol] (gmL-1)
0.5
0.2
0.4
[cis-Resveratrol] (gmL -1 )
0.6
Figura 17.- Rectas de calibrado correspondientes a los patrones (------) y a la adicin

patrn sobre una muestra de vino tinto (-------)
Se sospecha que el origen de este efecto matriz est en la fotorreaccin

que tiene lugar en lnea. Para comprobarlo, se miden las seales correspondientes
a los analitos de inters sobre los cromatogramas registrados fotomtricamente, ya
que el fotorreactor est situado tras el detector fotomtrico, y en el caso de que la
raz del efecto matriz fuese la fotorreaccin, ste efecto no se apreciara sobre las
seales fotomtricas. En la Figura 18 se muestran los cromatogramas obtenidos a
306 y 290 nm de una muestra de vino contaminada con 3.0 mL de la disolucin
conteniendo los cuatro analitos. Al emplear este tipo de deteccin, no se consigue
una resolucin total de los picos correspondientes a los ismeros del piceido con
221
MEN
SALIR
respecto a los interferentes del vino, de manera que se medirn alturas, en vez de
reas de pico, sobre los cromatogramas obtenidos midiendo absorbancia a 306 nm
para los trans-ismeros y a 290 nm para los cis-ismeros.
mAU
trans-Piceido
306 nm
trans-Resveratrol
3
2
1
0
0
10
15
20
25
30
35
min
mAU
290 nm
5
4
3
2
cis-Piceido
cis-Resveratrol
1
0
0
10
15
20
25
30
35
min
Figura 18.- Cromatogramas obtenidos fotomtricamente a 306 y 290 nm, correspondientes a

una muestra de vino tinto fortificada con los cuatro analitos de inters
En estas condiciones, se construyen los correspondientes grficos de

calibracin y adicin patrn, representando las alturas de pico frente a la
concentracin de analito puesta o aadida, respectivamente, Figura 19.
222
SALIR
1.2
trans-Piceido
Altura de Pico (DAD290nm)
8
6
4
2
0
cis-Piceido
0.8
0.4
0
0
0.1
0.2
0.3
0.4
[trans-Piceido] (gmL -1 )
0.5
1.2
trans-Resveratrol
MEN
0.2
0.4
0.6
0.8
cis-Resveratrol
0.8
0.4
0
0
0.2
0.4
0.6
0.2
0.4
0.6
Figura 19.- Alturas de pico frente a la concentracin de analito aadida sobre la

muestra de vino (-------) y frente a la concentracin de analito en el patrn (-------)
Como se observa, y posteriormente se comprueba por aplicacin de los

correspondientes tests estadsticos de Fischer y de la t-student, en este caso, no
existen diferencias significativas, para un nivel de confianza del 95 %, entre las
pendientes de las rectas de patrones externos y de adicin patrn obtenidas para
cada compuesto, lo que confirma el hecho de que el efecto matriz se produce en la
fotorreaccin.
Dicho efecto matriz podra deberse a algn tipo de catlisis de la
fotorreaccin en presencia de vino. Para comprobarlo, se lleva a cabo el estudio de
la influencia del tiempo de irradiacin en lnea, para trans-piceido, ya que es el
223
MEN
SALIR
primer compuesto en eluir. El tiempo de exposicin del analito a la luz ultravioleta

se controla a travs del caudal de fase mvil. Se prepara una disolucin
conteniendo 0.55 gmL-1 de trans-piceido, y otra conteniendo 0.50 mL de vino tinto
y la misma cantidad de analito, completando en ambos casos con agua ultrapura
hasta 10.0 mL. Ambas disoluciones se eluyen con velocidades de flujo
comprendidas entre 0.2 y 1.8 mLmin-1, manteniendo en todo caso el fotorreactor
encendido, y monitorizando fluorimtricamente el eluato. La representacin del
rea de pico de cis-piceido correspondientes a la muestra patrn y a la muestra de
vino fortificada frente a la velocidad de flujo (Figura 20), pone de manifiesto la
aceleracin del proceso fotoqumico en presencia de vino, como puede observarse
en el primer tramo de crecida de las curvas. Por otra parte, los valores de rea de
pico que se alcanzan en presencia de vino son mucho mayores que el rea
correspondiente, segn la recta de patrones externos, a la suma de trans-piceido
aadido y lo que el vino contiene.
rea de Pico (FLD)
8000
6000
4000
2000
0
0
0.4
0.8
1.2
1.6
Flujo (mLmin -1)
Figura 20.- Influencia del tiempo de

irradiacin en lnea sobre trans-piceido, en
presencia (-----) y en ausencia de vino (----)
Una vez comprobado que en vinos tintos existe efecto de matriz, y que por
tanto el anlisis de los cuatro analitos tiene que llevarse a cabo mediante adicin
patrn, se comienza el estudio de los vinos blancos.
224
SALIR
En este caso, se lleva a cabo una adicin patrn operando exactamente

igual que en caso anterior con la excepcin de que el volumen de vino blanco es en
este caso de 5.0 mL. Las correspondientes rectas de calibrado tanto de patrones
externos como de la adicin patrn al vino blanco se representan en la Figura 21.
Por aplicacin de los test estadsticos de Fischer y de la t-student, se
deduce que en el caso de los vinos blancos no existe efecto de matriz para ninguno
de los cuatro analitos, pudindose por tanto llevar a cabo el anlisis mediante
1000
2500
800
2000
rea de Pico (FLD)
rea de Pico (FLD)
calibracin externa.
600
400
1500
1000
200
500
0
0
0.1
0.2
0.3
[trans-Piceido] (gmL-1)
0.4
2000
2000
1600
1600
rea de Pico (FLD)
rea de Pico (FLD)
MEN
1200
800
400
0.1
0.2
0.3
0.4
0.1
0.2
0.3
0.4
1200
800
400
0
0
0.1
0.2
0.3
0.4
Figura 21.- rea de pico frente a la concentracin de analito aadida sobre la muestra
de vino blanco (-------) y frente a la concentracin de analito en el patrn (-------)
225
MEN
SALIR
En ltimo lugar nos planteamos tambin el anlisis de un vino blanco de

podredumbre noble, en concreto el vino hngaro Tokaji. Los vinos de podredumbre
noble se elaboran a partir de uvas afectadas por Botrytis, de manera que estos
vinos, an siendo vinos blancos, deben tener concentraciones de resveratrol, en
todas sus formas, superiores a las encontradas en vinos blancos normales. El
anlisis de este vino se realiza tambin mediante adicin patrn, encontrndose
que en este caso tampoco hay efecto de matriz para ninguno de los cuatro analitos
de inters.
En la Tabla 6, se resumen los resultados del anlisis para todos los vinos
analizados. Todos ellos fueron analizados mediante adicin patrn por triplicado.
Tabla 6.- Concentraciones encontradas de los ismeros de resveratrol y piceido en diferentes
vinos. Mtodo de adicin patrn (por triplicado)
[t-Piceido]
(gmL-1)
[c-Piceido]
(gmL-1)
[t-Resveratrol]
(gmL-1)
[c-Resveratrol]
(gmL-1)
Vinos Tintos:
Pool 1
6.5 0.5
2.9 0.3
1.4 0.1
0.21 0.12
Vinos Tintos:
Pool 2
1.2 0.1
1.5 0.1
0.070 0.050
0.060 0.020
Pool de
Vinos Blancos
0.099 0.013
0.42 0.02
0.054 0.009
0.068 0.010
Vino Blanco de
Podredumbre
Noble (Tokaji)
0.29 0.05
0.70 0.02
0.070 0.010
0.064 0.050
226
MEN
SALIR
CAPTULO VI
UTILIZACIN DE SEALES FLUORESCENTES
DE TRES VAS (MATRICES DE EXCITACINEMISIN) PARA CARACTERIZACIN DE
VINOS
MEN
SALIR
CAPTULO VI. EEMs para caracterizacin de vinos
228
MEN
SALIR
ANTECEDENTES
Fluorescencia front-face
La espectroscopia de fluorescencia molecular es una tcnica de anlisis
qumico que cada vez est adquiriendo mayor importancia como tcnica analtica
cuantitativa, principalmente debido a su gran sensibilidad, facilidad de utilizacin,
versatilidad instrumental (se pueden ajustar muchos parmetros instrumentales),
rapidez del anlisis, pequeas cantidades de muestra y por ser, adems, una
tcnica no invasiva ni destructiva. Sin embargo, aunque esta tcnica presenta un
gran potencial, hasta ahora ha sido poco utilizada para la caracterizacin de
alimentos a pesar de que muchos presentan fluorescencia nativa. Esto ha sido
debido a que la fluorescencia clsica no puede aplicarse a muestras turbias,
opacas o disoluciones muy concentradas. Cuando la muestra en estudio presenta
elevada absorcin, la intensidad de la radiacin emitida no es proporcional a la
concentracin de los fluorforos presentes, debido principalmente al efecto de filtro
interno. Los espectros de excitacin y emisin disminuyen y adems los espectros
de excitacin estn distorsionados. Para evitar este problema, lo ms usual es diluir
la muestra de tal forma que la absorbancia sea inferior a 0.1. Sin embargo, los
resultados obtenidos para estas disoluciones diluidas no tienen por que ser
extrapolables a la matriz original de la muestra, ya que con la dilucin se pierde la
organizacin de la matriz original. Este problema puede ser evitado utilizando la
tcnica de front-face, desarrollada por C.A. Parker en 19681, cuya principal
diferencia con respecto a la modalidad tradicional es la modificacin del ngulo de
incidencia de la radiacin sobre la muestra, pasando de un ngulo de 90 en la
tcnica tradicional a un ngulo prximo a 30 en la tcnica de front-face,
Parker C.A., Apparatus and experimental methods in Photoluminescence of solutions with
applications to photochemistry and analytical chemistry. C. A. Parker, ed. Elsevier, Amsterdam, The
Netherlands 1968, Pginas 128302
229
MEN
SALIR
midindose la radiacin emitida en la misma cara que la radiacin incidente y sin

que las radiaciones incidente y emitida atraviesen la disolucin en medida
apreciable. Esta modalidad reduce los efectos de dispersin debidos a la elevada
concentracin de las muestras no diluidas o a la presencia de turbidez. En un
principio, su aplicacin ms relevante fueron los estudios de fluorescencia en
matrices slidas pero en las dos ltimas dcadas su aplicacin en el anlisis y
caracterizacin de alimentos se ha incrementado considerablemente.
Si adems, las seales fluorescentes obtenidas en modo front-face, se
combinan con tcnicas de anlisis multivariante, se consigue potenciar su uso
como herramienta para la caracterizacin de alimentos. Los mtodos de anlisis
multivariante ms utilizados son PCA (Anlisis de Componentes Principales) y PLS
(Mnimos Cuadrados Parciales), para tratar datos de primer orden, y en caso de
datos de rdenes superiores el ms utilizado es PARAFAC (PARAllel FACtor
analysis).
Todava son relativamente escasas las publicaciones que hacen uso de
esta combinacin de front-face con seales multivariantes para la caracterizacin y
clasificacin de alimentos. En 2006, Christensen et al2 publican un artculo de
revisin acerca de las posibilidades que ofrece la autofluorescencia de diversos
alimentos, en combinacin con mtodos de anlisis multivariante, como
herramienta, tanto para el anlisis, como para la clasificacin de los mismos. Casi
todos los procedimientos hacen uso de datos de primer orden, espectros de
fluorescencia de excitacin, emisin o en algunos casos espectros sincrnicos, en
combinacin casi siempre con PCA. As, dichos procedimientos se aplican al
estudio de protenas en harinas con gluten3 o bien para seguir la evolucin de la
2
3
Christensen J., Nrgaard L., Bro R., Engelsen S.B., Chem. Reviews, 2006, 106:1980-1994
Genot C., Tonetti F., Montenay-Garestier T., Drapron R., Sci. Aliments, 1992,12:687704
230
MEN
SALIR
reaccin de Maillard en alimentos infantiles, realizando medidas de fluorescencia,

que permiten tomar la huella digital en base a los cambios que se producen durante
la manufacturacin y analizando estos datos mediante mtodos quimiomtricos4.
Los productos lcteos son matrices en que la fluorescencia front-face se usa
ampliamente para la caracterizacin y clasificacin. As, permite el seguimiento del
cambio estructural que se produce en las protenas de la leche durante el proceso
de calentamiento5, o bien la cuantificacin simultnea de furosina y lactosa en
leche, lo que proporciona un mtodo para evaluar la calidad de la leche6. En
combinacin con PCA, permite la discriminacin entre diferentes tipos de leche
segn la temperatura y el tiempo utilizado en el tratamiento trmico7. La
determinacin de riboflavina en yogures se usa para evaluar la conservacin de los
mismos y la aplicacin de PCA a los espectros de emisin revela cambios en la
seal de fluorescencia con el tiempo de conservacin8. Wold et al8 proponen el uso
de fluorescencia front-face y PCA como herramienta para seguir la foto-oxidacin
de productos lcteos frescos. Tambin se propone la caracterizacin de helados
basada en la relacin existente entre grasas, protenas y emulsionantes9.
La clasificacin de cervezas procedentes de diferentes pases, se lleva a
cabo registrando los espectros de emisin y sincrnicos de muestras de cervezas
sin diluir y utilizando PLS para realizar el tratamiento quimiomtrico de los datos10
Birlouez-Aragon I., Locquet N., de St Louvent E., Jouan-Rimbaud Bouveresse D., Stahl P., Annals
of the New York Academy of Sciences, 2005, 1043:308318
5 Dufour E., Riaublanc A., Lait, 1997, 77:657-670
6 Kulmyrzaev, A.A., Dufour E., Lait, 2002, 82:725-735
7 Kulmyrzaev A.A., Levieux D., Dufour E., J. Agric. Food Chem., 2005, 53:502-507
8 Miquel Becker E., Christensen J., Frederiksen C.S., Haugaard V.K., J. Dairy Sci., 2003, 86:25082515
8 Wold J.P., Jrgensen K., Lundby F., J. Dairy Sci., 2002 85:1693-704
9 Granger C, Da Costa JP, Toutain J, Barey P, y Cansell M, Int. Dairy J., 2006, 16:489-496
10 Sikorska E., Grecki T., Khmelinskii I.V., Sikorski M.Y., Keukeleire D., J. Institute of Brewing,
2004, 110:267-275
4
231
MEN
SALIR
y, en esta misma matriz, la aplicacin de PLS a los espectros sincrnicos permite

determinar el contenido en vitamina B211.
Karoui et al han publicado varios trabajos en los que informan del uso de la
fluorescencia front-face para diferenciar entre productos de cereales diferentes12 o
entre filetes de pescado fresco y congelado13, asegurar la frescura de huevos
almacenados14, seguir el proceso de oxidacin en quesos semicurados15 y
clasificar mieles de diferente origen botnico16.
La cantidad de informacin que puede obtenerse es an mayor si las
seales fluorescentes no se limitan a los espectros de excitacin, emisin o
sincrnicos, sino que se manejan las seales fluorescentes totales, es decir las
matrices de excitacin-emisin (EEMs) o espectros tridimensionales que, si se
combinan con tcnicas quimiomtricas, adems de permitir aumentar la
selectividad, posibilitan que se pueda obtener informacin extra sobre parmetros
que, de forma genrica, nos permiten agrupar y discriminar objetos, descritos
mediante un vector de atributos, ya sea construyendo las clases o asignando los
objetos a clases previamente definidas. Esta combinacin permite obtener, en
tiempos de anlisis muy pequeos, informacin que puede ser usada como huella
digital de diversos alimentos.
Por tanto, aplicando la tcnica de front-face se pueden obtener datos de
segundo orden que se pueden tratar con herramientas quimiomtricas con fines
clasificatorios, de tipificacin, seguimiento de procesos, etc. En su aplicacin al
Sikorska E., Eur. Food Res. Technol., 2007, 225:43-48
Karoui R., Cartaud G., Dufour E., J. Agric. Food Chem., 2006, 54:2027-2034
13 Karoui R., Thomas E., Dufour E., Food Res. Int., 2006, 39:349-355
14 Karoui R., Schoonheydt E., Decuypere B., Nicolau J., De Baerdemaeker, J., Anal. Chim. Acta,
2007, 582: 83-91
15 Karoui R., Dufour E., De Baerdemaeker J., Food Chem., 2007, 101:1305-1314
16 Karoui R., Dufour E., Bosset J.O., De Baerdemaeker, J., Food Chem., 2007, 101:314-323
11
12
232
MEN
SALIR
anlisis de alimentos son muy pocos los procedimientos desarrollados. Bro et al, a
travs de las EEMs y PARAFAC, evalan los fluorforos responsables de la
autofluorescencia de diversas muestras de azcar17. El anlisis mediante
PARAFAC, de las matrices de excitacin-emisin de diferentes yogures, obtenidas
mediante front-face, pone de manifiesto la presencia de tres fluorforos, riboflavina,
triptfano y lumicromo cuya cantidad est relacionada con las condiciones de
almacenamiento18. Guimet et al aplican PARAFAC a las EEMs para evaluar los
principales fluorforos y realizar una clasificacin de diferentes tipos de aceites de
oliva19. Tambin se ha sugerido su aplicacin como un mtodo potencial para
comprobar la contaminacin por dioxina en aceite de pescado, basado en una
correlacin indirecta20.
Caso concreto del vino
El inters por el estudio acerca de la composicin qumica del vino se debe
a su importancia en la evaluacin de la calidad de este producto. En los ltimos
aos los productores han mejorado la calidad de los vinos, y por otra parte, los
consumidores son cada vez ms exigentes. Por ello, es importante desarrollar
mtodos de anlisis rpidos, sin tratamiento previo de las muestras. Las
herramientas para manejar y abordar el anlisis qumico del vino se estn
convirtiendo en una necesidad en la industria del vino, con el fin de automatizar la
produccin y estabilizar la calidad por lo que todas aquellos procedimientos que
permitan la clasificacin de los vinos en funcin de la regin de origen, del tipo de
uva utilizada en la elaboracin o del proceso de elaboracin de los vinos, pueden
ser tiles para esta industria.
Bro R., Chemom. and Intell. Lab. Syst., 1999, 46:133-147

Christensen J., Miquel Becker E., Frederiksen C.S., Chemom. Intell. Lab. Syst., 2005, 75:210-208
19 Guimet F., Ferre J., Boque R., Rius F.X., Anal. Chim. Acta, 2004, 515:75-85
20 Pedersen D.K., Munck L., Engelsen S.B., J. Chemom., 2002, 16: 451-460
17
18
233
MEN
SALIR
Los nicos antecedentes sobre la utilizacin de seales fluorescentes para

clasificar vinos segn la variedad y cosecha, son los descritos por Dufour et al21,
que estudian el potencial de las seales de primer orden obtenidas mediante
fluorescencia front-face, combinadas con mtodos quimiomtricos e investigan un
total de 120 vinos producidos en Francia y Alemania. Registran los espectros de
emisin (275450 nm) y excitacin (250350 nm) de cada muestra y los relacionan
con el contenido en compuestos fenlicos. Los espectros de emisin se
caracterizan por presentar un mximo a 376 nm y un hombro a 315 nm y los de
excitacin muestran dos picos localizados en torno a 260 y 320 nm y su fisonoma
vara para las diferentes muestras de vino, principalmente en cuanto a la relacin
de intensidades de mximo/hombro. Las muestras se evalan usando anlisis de
componentes principales (PCA) y se clasifican mediante anlisis factorial
discriminatorio (FDA). En este primer estudio se muestran las posibilidades de la
fluorescencia front-face, en combinacin con herramientas quimiomtricas, para
asegurar la trazabilidad de vinos.
Sobre la utilizacin de datos de segundo orden con fines clasificatorios en
muestras de vino, no se han encontrado antecedentes en la bibliografa consultada.
No obstante, el potencial de la tcnica debe aumentar con la dimensionalidad de
los datos, de manera que los datos tridimensionales seran una herramienta ms
poderosa que los bidimensionales, especialmente desde el punto de vista de la
clasificacin de muestras. Ello nos ha llevado a explorar las posibilidades de las
matrices de excitacin-emisin obtenidas mediante la tcnica de front-face para la
clasificacin de muestras de vino y constituir una posible huella digital. As, en este
captulo se aborda, por primera vez, el estudio de la matriz de excitacin-emisin
del vino.
21
Dufour E., Letort A., Laguet A., Lebecque A., Serra J.N., Anal. Chim. Acta, 2006, 563:292-299
234
MEN
SALIR
El objetivo principal de este captulo es detectar los principales compuestos

fluorescentes presentes en el vino, con el objetivo de mejorar en la interpretacin
de los espectros de fluorescencia de una matriz tan compleja. Para ello, se aplica
PARAFAC sobre un cubo de datos construido a partir de las matrices de excitacinemisin de fluorescencia del conjunto de muestras consideradas en este estudio.
La estrategia de muestreo que se sigue consiste en incluir en el modelo muestras
de diferentes orgenes, lo suficientemente diferentes entre ellas, con el objetivo de
representar un abanico real de compuestos fluorescentes que pueden estar
presentes en cualquier muestra. Para la identificacin de los principales fluorforos
en el vino, se buscarn las correlaciones existentes entre los scores de cada
muestra en cada uno de los componentes obtenidos en la descomposicin
mediante PARAFAC y las alturas de los picos correspondientes a componentes
individuales separados en la columna cromatogrfica, establecindose as las
bases para el desarrollo de futuros mtodos rpidos para la determinacin
cuantitativa de tales fluorforos.
Por otra parte, teniendo en cuenta que en el modelo se incluyen vinos de
distinta procedencia, se estudiar la capacidad de las seales de autofluorescencia
con fines clasificatorios segn dicha procedencia. Esta propuesta es muy
importante en pases importadores de vino.
Muestras de vino incluidas en el modelo
Para la construccin del modelo se parti de un conjunto de 57 muestras
de vino, de diferentes orgenes y elaborados con distintos tipos de uva, con el
objetivo de que en el modelo estn representados toda la variedad de compuestos
235
MEN
SALIR
fluorescentes que pueden estar en una muestra real, y en niveles tambin lo ms

cercanos posible a la realidad. Concretamente, la procedencia de las muestras es:
dos de Francia, 16 de Chile, 3 de Sudfrica, 6 de Australia (2 de ellas de
Occidente), 3 de Espaa, 6 de Argentina, 3 de U.S.A., 15 de Italia, 1 de Tnez y 2
de Portugal. En la Tabla 1 se detalla el origen de cada muestra, as como el tipo de
uva del que se obtienen, cuando este dato est disponible. Las muestras se
mantienen a una temperatura aproximada de 4 C, y la matriz de fluorescencia de
cada muestra se registra inmediatamente despus de abrir cada botella.
Tabla 1.- Origen y tipo de uva de las muestras consideradas en el estudio
Muestra N
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
236
Origen
Francia
Francia
Chile
Chile
Chile
Chile
Chile
Chile
Chile
Chile
Chile
Chile
Chile
Chile
Sudfrica
Sudfrica
Sudfrica
Australia Occidental
Australia Occidental
Australia
Australia
Australia
Australia
Espaa
Espaa
Espaa
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Tipo de Uva
Cabernet Sauvignon
Cabernet Sauvignon
Cabernet Sauvignon
Cabernet Sauvignon
Cabernet Sauvignon
Cabernet Sauvignon
Cabernet Sauvignon
Merlot
Cabernet Sauvignon
Cabernet Sauvignon
Cabernet Sauvignon
Cabernet Sauvignon
Cabernet Sauvignon
Cabernet Sauvignon
Syrah
Syrah
Syrah - Cabernet
Syrah - Cabernet
Malbec Syrah
Malbec Syrah
Malbec Syrah
Syrah
MEN
SALIR
Tabla 1.- Origen y tipo de uva de las muestras consideradas en el estudio (continuacin)
Muestra N
31
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
Origen
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
U.S.A.
U.S.A.
U.S.A.
Italia
Italia
Italia (Sicilia)
Italia
Italia
Italia
Italia
Italia
Tnez
Italia
Italia
Italia
Italia
Italia
Italia
Chile
Chile
Chile
Chile
Portugal
Portugal
Italia
Tipo de Uva
Syrah
Syrah
Syrah
Syrah
Syrah
Ruby Cabernet
Ruby Cabernet
Sangiovese
Sangiovese
Merlot
Merlot
Sangiovese
Matrices de excitacin-emisin de fluorescencia

Las
matrices
de
excitacin-emisin
de
fluorescencia
(EEMs)
correspondientes a las 57 muestras se registran en modo front-face, con el objetivo

de minimizar los efectos de filtro interno, reflexin, dispersin y despolarizacin de
la luz. El ngulo de incidencia, definido como el formado entre el haz de excitacin
y la perpendicular a la superficie de la celda, se mantiene en 30 y el de
observacin en 60 (Figura 1). Una alcuota de cada muestra de vino se transfiere
directamente de la botella a una celda de cuarzo de 3 mL y 1 cm de paso de luz. La
237
MEN
SALIR
temperatura del laboratorio se mantiene en torno a 15 C. Las rendijas de

excitacin y emisin de los monocromadores se fijan en 15 y 5 nm,
respectivamente. La velocidad de adquisicin se fija en 500 nm/min, como solucin
de compromiso para disminuir el ruido en los espectros registrados y el tiempo de
adquisicin de la matriz. Los rangos de longitudes de onda de excitacin y emisin
son 245-340 nm y 300-500 nm, con incrementos de 5 y 0.5 nm, respectivamente.
Cada EEM se registra como mltiples espectros de emisin, a distintas longitudes
de onda de excitacin, de manera decreciente, es decir de la radiacin excitante
menos energtica a la ms energtica, con el objetivo de evitar en lo posible la
alteracin de la muestra por el haz UV de excitacin. El tiempo empleado en el
registro de cada EEM es aproximadamente 10 minutos. Todas las matrices se
registran en el periodo de tiempo lo ms corto posible, en concreto se emplearon 6
das, con el objetivo de minimizar las variaciones instrumentales, tales como las
fluctuaciones en la intensidad de la lmpara.
Figura 1.- Accesorio para realizar medidas de fluorescencia front-face
238
MEN
SALIR
En la Figura 2 se recogen las EEMs de cuatro de los vinos analizados, en

forma de mapas de contorno, as como los espectros de excitacin y emisin
extrados de las mismas, como cortes horizontales y verticales, respectivamente, a
las longitudes de onda de emisin y excitacin, indicadas en el pie de dicha Figura.
Como puede observarse en los mapas de contorno de la Figura 2, todas
las muestras emiten radiacin fluorescente de longitudes de onda comprendidas
entre 300 y 400 nm, cuando son excitadas a longitudes de onda por debajo de 290
nm. Los espectros de excitacin y emisin previamente publicados por Dufour et
al21., empleados para discriminar entre vinos franceses y alemanes, caen dentro de
esta zona de fluorescencia comn a todas las muestras. No obstante, como puede
verse en la Figura 2, esta regin es demasiados compleja, como para obtener una
visin general de la misma utilizando un nico par de espectros de excitacin y
emisin. Por otra parte, cuando la radiacin excitante es menos energtica,
concretamente cuando es de longitudes de onda superiores a 290 nm, se observa
una nueva zona de emisin de fluorescencia entre 350 y 450 nm.
239
MEN
SALIR
Muestra nmero 1: Vino francs
Muestra nmero 7: Vino Chileno
Muestra nmero 17: Vino sudafricano
Muestra nmero 19: Vino australiano
Figura 2.- IZQUIERDA: EEMs correspondientes a las muestras nmero 1 (Vino Francs), 7 (Vino
Chileno), 17 (Vino Sudafricano) y 19 (Vino Australiano). CENTRO: Espectros de excitacin extrados
de la EEM a em= 325 (negro), 363 (azul), y 388 nm (rojo). DERECHA: Espectros de emisin
extrados de la EEM a exc= 260 (azul), 280 (negro), y 320 nm (rojo)
240
MEN
SALIR
Realizando un anlisis ms profundo de las EEMs, se describen a

continuacin las caractersticas ms relevantes de los espectros obtenidos
realizando una serie de cortes horizontales y verticales, en las zonas de mxima
fluorescencia de las mismas:
Los espectros de emisin (lnea azul), excitando a 260 nm, presentan una
banda relativamente ancha, centrada a 372 nm, en la cual pueden distinguirse dos
mximos a 363 y 380 nm. La razn de intensidades de emisin de fluorescencia en
ambos mximos vara segn la muestra, como ya describieron previamente Dufour
et al21. As por ejemplo, en la muestra 19, la intensidad a 380 nm es mayor que a
363 nm, al contrario que para las muestras 7 y 17, o en la muestra 1, en cuyo caso
la razn de intensidades a ambas longitudes de onda est prxima a 1. En los
espectros de excitacin (lnea azul), obtenidos a 363 nm, se observan dos mximos
centrados a 260 y 280 nm. Al igual que ocurre con los espectros de emisin
previamente descritos, las intensidades relativas en ambos mximos de excitacin
varan con la muestra, pudiendo ser la razn I.F.(260) /I.F.(280) mayor o menor que
uno, como ocurre en las muestras 19 y 1, respectivamente. En otros casos, como
en las muestras 7 y 17, la mxima intensidad de excitacin est localizada en torno
a 280 nm, observndose adems un simple hombro a 260 nm.
La mxima intensidad de emisin de fluorescencia, excitando a 280 nm,
(lnea negra) se centra a 363 nm, apareciendo en algunos casos, como por ejemplo
en las muestras 1 y 17, un segundo mximo de emisin en torno a 325 nm, tan
importante como el primero. En los espectros de excitacin, a 325 nm, se observa
para todas las muestras un nico mximo centrado a 275 nm.
Por ltimo, en la zona de longitudes de onda de excitacin ms desplazada
hacia el rojo, concretamente a 320 nm, se obtiene el tercer espectro de emisin
241
MEN
SALIR
tpico del vino (lnea roja). En este caso se observa una banda de emisin centrada
a 388 nm. En los espectros de excitacin obtenidos a 388 nm, se observa un
mximo a 325 nm, siendo la forma de dichos espectros, por debajo de 300 nm,
similar a la de los previamente descritos a em= 363 nm.
Construccin del modelo PARAFAC
Fundamentos del anlisis factorial paralelo (PARAFAC)
Cuando una muestra produce una matriz de datos de dimensiones J x K
(tensor de segundo orden), tal como una EEM, siendo J el nmero de longitudes de
onda de emisin y K el nmero de longitudes de onda de excitacin, el
correspondiente
conjunto
de
datos
obtenidos
apilando
las
matrices
correspondientes a las I muestras incluidas en el modelo es un cubo de datos

(matriz 3D), de dimensiones I x J x K (Figura 3).
Figura 3.- Estructura del cubo de

datos
Dado que las EEMs siguen un modelo bilineal, dicho cubo puede
expresarse como un sumatorio de tensores producto de tres vectores, extendido al
nmero de componentes que contribuye a la EEM. Sean los vectores An, Bn y Cn la
contribucin (I x 1), el perfil de emisin (J x 1) y el perfil de excitacin (K x 1) para el
242
MEN
SALIR
componente n, respectivamente, entonces el cubo de datos F, puede escribirse

como22,23.
N
F=
An Bn Cn + E
n =1
donde representa un producto de tensores, N es el nmero total de

componentes, y E es el trmino de error residual, cuyas dimensiones son las
mismas que las de F. Los vectores columna an, bn y cn se recogen en la matriz de
los scores A, conteniendo las contribuciones relativas de los diferentes
componentes, y en las matrices de los loadings B y C.
En la Figura 4 se representa esquemticamente la descomposicin
mediante PARAFAC de un conjunto de EEMs.
Figura 4.- Descomposicin mediante PARAFAC de una serie de EEMs en tres factores
Una ventaja importante del modelo PARAFAC viene dada por el hecho de
que las soluciones que propone son nicas (unicidad). La descomposicin de F
suministra los loadings y los scores de los componentes individuales en todas las
muestras, sean qumicamente conocidos o no. Esto es especialmente til en el
anlisis de matrices de alimentos, donde no se disponen de patrones de los
componentes puros.
22
23
Ewing G.W., Instrumental methods of chemical analysis; Mc. Graw-Hill; New York, 1985
Leurgans S., Ross R.T., Stat. Sci., 1992, 7: 289-319
243
MEN
SALIR
Bro24 denomina a esta tcnica como cromatografa matemtica, debido al

hecho de que la separacin (cromatografa) de las seales de los constituyentes se
lleva a cabo matemticamente (computacionalmente).
Modelo PARAFAC
El anlisis por PARAFAC se lleva a cabo en Matlab 7.1.0 (The Mathworks
Inc., MA, USA), utilizando las rutinas contenidas en PLS_Toolbox (Eigenvector
Research Inc., WA, USA).
Las dimensiones del cubo de datos obtenido agrupando las EEMs
correspondientes a las 57 muestras, es 57 x 398 x 20 (muestras x excitacin x
emisin). Una vez construido este cubo, los datos han de ser pretratados antes de
proceder a su anlisis mediante PARAFAC. Se procede en primer lugar a la
eliminacin de las seales de dispersin Rayleigh. Para ello, se inserta el trmino
NaN (not a number) en las lneas exc = em y 2exc= em, con una amplitud
determinada. Por otra parte, en la zona triangular de la matriz donde exc > em se
insertan ceros, ya que no es lgico que exista emisin a longitudes de onda
menores que la de excitacin, ya que esta situacin se correspondera con una
emisin ms energtica que la radiacin causante de la excitacin. Se ha
comprobado que los ceros en esta zona aceleran los clculos, pero no deben estar
demasiado cerca de la zona exc = em ya que si as fuera se introduciran
deformaciones (artefacts) en las matrices.
El cubo de datos ya pretratado se descompone mediante PARAFAC,
utilizando diferente nmero de factores y aplicando en todos los casos la restriccin
24 Bro R., Multi-way Analysis in the Food Industry. Theory, Algorithms and Applications. Doctoral
Dissertation, University of Amsterdam, 1998
244
MEN
SALIR
de no negatividad en los tres modos. Estas restricciones se aplican para obtener

una solucin realista, ya que tanto las concentraciones como las seales de
fluorescencia tienen que ser positivas.
Por aplicacin de PARAFAC sobre el cubo de datos se obtienen los perfiles
espectrales de componentes fluorescentes puros o, como sera ms correcto decir
al trabajar directamente sobre una muestra tan compleja como el vino, se
obtendran los perfiles correspondientes a conglomerados de fluorforos de
comportamiento similar.
La eleccin del nmero ptimo de factores es el primer paso en la
construccin del modelo. Para tomar esta decisin pueden adoptarse diferentes
criterios25, entre ellos el llamado diagnstico de la consistencia del modelo (core
consistency diagnostic), CORCONDIA26, segn el cual, cuando se incrementa de
forma progresiva el nmero de componentes y se representa el valor del core en
funcin del nmero de factores, se obtiene un salto brusco una vez alcanzado el
nmero de componentes ideal. En nuestro caso, los porcentajes de core calculados
para modelos con uno y dos factores son 100 y 99.2 %, respectivamente. Para tres,
cuatro y cinco factores se obtienen porcentajes de core de 50.9, 40.4 y -3.3 %,
respectivamente. A la vista de estos resultados se rechazan los modelos con uno y
dos factores, as como el modelo con cinco factores, en cuyo caso se
desembocara en una situacin de sobreajuste. En este caso, la apariencia de los
perfiles fluorescentes nos ha sido especialmente til para decidir que el nmero
ptimo de factores es cuatro, ya que los perfiles fluorescentes del quinto
componente tienen la apariencia de ser una combinacin de los del primero y el
25
26
Andersen C.M., Bro R., J. Chemom., 2003, 17:200-215

Bro R., Kiers H.A.L., J. Chemom., 2003, 17:274-286
245
MEN
SALIR
cuarto, mientras que los perfiles obtenidos en el modelo con cuatro factores
parecen independientes entre ellos.
Por otra parte, observando los valores de score se deduce que no existen
muestras discrepantes al no encontrar valores extremos.
En la Figura 5 se muestran los perfiles espectrales de excitacin y emisin
obtenidos. En base a estos perfiles, y asumiendo la bilinearidad en las EEMs, se
obtiene la estructura tridimiensional para cada factor, obtenida por multiplicacin de
I. F. Relativa
I. F. Relativa
los vectores columna perfil de excitacin perfil de emisin (Figura 6).
240
260
280
300
exc (nm)
320
340
300
350
400
em (nm)
450
500
Figura 5.- Perfiles fluorescentes de excitacin (izquierda) y emisin (derecha) para los cuatro
factores (primero (), segundo (), tercero () y cuarto () del modelo de PARAFAC
construido en base a las EEMs de las 57 muestras de vino
246
MEN
SALIR
Figura 6.- Estructura tridimensional de los factores primero (azul), segundo (rosa), tercero
(naranja) y cuarto (verde), obtenidos por multiplicacin de los correspondientes vectores
loading
El perfil de excitacin del primer componente presenta un nico mximo en la

zona ms desplazada hacia el ultravioleta, concretamente, a 255 nm y el perfil de
emisin consiste en un mximo agudo a 380 nm, con un hombro a 365 nm. Los
mximos de excitacin y emisin para el segundo factor estn situados a 275 y 323
nm, respectivamente. En los mximos de excitacin y emisin del tercer
componente se observa un importante desplazamiento batocrmico, estando
centrados a 330 y 410 nm, respectivamente, as como un ensanchamiento de los
mismos con respecto a los componentes previamente descritos. Por ltimo, el
cuarto componente se sita cercano al primero y segundo, estando relacionado por
tanto con la zona ms desplazada al azul en las EEMs, y presenta un mximo de
excitacin a 280 nm, con un hombro a 260 nm, y un mximo de emisin a 364 nm.
247
MEN
SALIR
Por otra parte, la matriz de scores, que mide la contribucin o participacin

de cada uno de los cuatro componentes en cada EEM, se analiza mediante anlisis
de componentes principales (PCA), con el objetivo de extraer el mximo de
informacin.
Antes de pasar a comentar los resultados de este PCA, se procede a
comprobar la estabilidad del modelo construido mediante split-half analysis27. Este
consiste en dividir el cubo inicial de datos en distintos subconjuntos y aplicar
PARAFAC a cada uno de ellos independientemente. Se ensayan distintos criterios
de divisin, como muestras pares muestras impares, italianas no italianas,
chilenas no chilenas, etc., obtenindose en todos los casos perfiles de excitacin
y emisin similares a los obtenidos al analizar el cubo de datos completo. Queda
as demostrada la estabilidad del modelo construido.
Otra manera de comprobar la estabilidad del modelo, basada en la misma
idea de aplicar PARAFAC por subzonas, es dividir, no por muestras, sino por
subrangos, dentro de los ejes de excitacin y emisin. As, se definen nuevos
subconjuntos de datos, teniendo en cuenta la zona en la que se sitan los mximos
de excitacin y emisin de cada componente. Por ejemplo, segn el componente
uno, la subzona comprendera los rangos de excitacin y emisin de 245 a 270 nm,
y de 360 a 420 nm, respectivamente. De esta manera se extraen cuatro nuevos
subcubos de datos sobre los que se aplica PARAFAC, obtenindose en todos los
casos idnticos perfiles, y quedando por tanto ratificada la estabilidad del modelo.
Harshman R.A., de Sarbo W.S. An application of PARAFAC to a small sample problem,

demonstrating preprocessing, orthogonality constraints, and split-half diagnostic techniques. In
Research Methods for Multimode Data Analysis, Law HG, Snyder CW, Hattie JA, McDonald RP
(eds). Praeger:New York, 1984; 602-642
27
248
MEN
SALIR
Anlisis de componentes principales de los valores de PARAFAC-score

El anlisis de componentes principales (PCA) es una poderosa herramienta
de visualizacin para la evaluacin de datos, que proporciona un modo de reducir
la dimensionalidad del conjunto inicial de datos y representa grficamente las
posibles relaciones inter-variable e inter-muestra. El PCA es un mtodo de anlisis
no supervisado, en tanto en cuanto no se conoce, o se ignora deliberadamente, la
existencia de categoras en el conjunto inicial de datos.
La proyeccin sobre el plano de una nube de puntos multidimensionales
puede ofrecer visiones muy ilustrativas de las estructuras que contiene. Para ello,
es necesario seleccionar cuidadosamente, mediante la aplicacin de criterios
racionales, el plano de observacin. Se trata de construir modelos de la nube de
puntos, buscando secuencialmente las direcciones del espacio (nuevo ejes de
coordenadas) que ofrecen la mejor visin posible de la misma. Estos nuevos ejes
de coordenadas, vectores propios (eigenvectors), autovectores o componentes
principales - PC, se construyen como combinaciones lineales de las variables
manifiestas (ejes de coordenadas iniciales). Estos componentes principales son,
por tanto variables latentes que se utilizan para descubrir las direcciones del
espacio correlacionadas con causas objetivas de varianza que son las variables
fundamentales o factores subyacentes, en nuestro caso pas de origen y variedad
de uva. Se trata, por tanto, de encontrar las combinaciones lineales de variables
manifiestas que contribuyen en mayor medida a hacer diferentes unas muestras de
otras. Cuando se construye un vector que modula una nube de puntos, la varianza
total de los datos queda dividida en varianza explicada por el vector y varianza
residual. Se denomina autovalor del componente principal a la varianza explicada
por ste. Los componentes principales se hallan siguiendo el criterio de hacer
mxima la varianza explicada, o lo que es igual, hacer mnima la varianza residual.
249
MEN
SALIR
El primer PC, es el que contiene la mayora de la informacin o, en trminos

estadsticos, el que tiene el mayor valor de varianza explicada, el segundo PC
llevar la mayor parte de la informacin residual, y as sucesivamente.
Si se proyectan las muestras sobre el plano de los dos primeros
componentes, o de cualquiera otros dos, obtenemos una representacin de una
parte de la informacin aportada por el conjunto de las variables manifiestas que
ser igual al porcentaje de la varianza total explicada por dichos PCs. Las
coordenadas de cada muestra sobre cada uno de estos ejes transformados se
denominan scores, o, en espaol, puntuaciones o contribuciones. Las muestras
que tienen valores de score muy cercanos a lo largo del mismo PC son similares,
en cuanto a los valores para las correspondientes variables manifiestas recogidas
en dicho PC. Contrariamente, muestras cuyos scores difieren mucho son tambin
bastante diferentes en cuanto a los valores de dichas variables. La representacin
ms til en cuanto a su interpretacin es la del primer componente respecto al
segundo, ya que stos contienen la mayor parte de la informacin.
Por otro lado, resulta igualmente interesante describir la estructura de los
datos en trminos de correlacin entre variables. Cada variable manifiesta tiene
una contribucin carga o loading en cada PC. Este valor refleja en qu medida
dicha variable manifiesta contribuye a dicho PC, as como el grado en que dicho
PC toma en cuenta la variacin de dicha variable en el conjunto de los datos.
Cunto mayor el enlace entre la variable y el PC, mayor el loading. Si dos variables
tienen loadings altos respecto al mismo PC dichas variables estarn altamente
correlacionadas, positivamente si los loadings tienen el mismo signo, o
negativamente si tienen signos contrarios. Si consideramos cada PC por separado,
podemos decir que las variables con valores de loading pequeos no deben
considerarse en su interpretacin. En cuanto a las muestras, podemos decir que si
250
MEN
SALIR
el score de una muestra y el loading de una variable en un particular componente

principal tienen el mismo signo entonces la muestra tiene un valor superior a la
media de dicha variable.
Los valores de los loadings se representan igualmente en grficos
bidimensionales en los que se recogen los valores respecto a dos componentes
principales, usualmente los dos primeros. Para interpretarlos hay que considerar
que si el punto se halla a gran distancia del centroide del grfico, es decir si los
loadings sobre ambos componentes son altos, la variable cede casi toda su
varianza al plano de ambos componentes y no le queda varianza relevante que
ceder a otros componentes. Los ngulos que forma el vector que une el origen de
coordenadas con el punto y con los ejes de coordenadas indican a cul de los PC
cede preferentemente su varianza, esto es, con cul de los dos est ms
fuertemente correlacionada. Si el punto se encuentra cerca del centroide, no cede
varianza al plano de ambos componentes. Si existen dos o ms variables
manifiestas con distancias grandes respecto al origen, todas ellas ceden gran parte
de su varianza a dicho plano, es decir son casi coplanares con los dos PC
considerados. Un ngulo pequeo o prximo a 180 indica fuerte correlacin
positiva o negativa entre las variables, y probablemente los vectores
correspondientes sealan la direccin de una variable fundamental. En cambio un
ngulo prximo a 90 indica ortogonalidad o independencia entre esas variables
manifiestas.
El PCA sobre el conjunto de scores de PARAFAC se lleva a cabo mediante
el paquete de software The Unscrambler28.
28
Unscrambler v. 6.11b, CAMO A/S Olav Tryggvasonsgt, N-7011, Trondheim, Norway
251
MEN
SALIR
El conjunto de valores de score es una matriz de dimensiones 57 x 4, es

decir, nmero de muestras x nmero de factores. Cada fila de la misma, compuesta
de cuatro valores, representa la participacin de cada uno de los cuatro factores en
la EEM de la muestra en cuestin y se denominan en adelante f1 a f4. En dicho
conjunto de datos se incluyen dos variables de categora: el origen de las muestras
y el tipo de uva, cuando dicho dato sea conocido (Tabla 1).
En la Figura 7 se muestra el conjunto de las 57 muestras proyectadas
sobre el plano definido por los componentes principales 1 (PC1) y 2 (PC2),
agrupadas segn el origen. El porcentaje de varianza explicada segn este modelo
y con estos dos componentes principales es del 75 %.
252
MEN
SALIR
Figura 7.- Scores (superior) y loadings (inferior) del PCA sobre las 57 muestras.
Muestras agrupadas en el mapa de scores en funcin del origen.
Se observa cierta discriminacin entre muestras de diferentes pases.

Respecto a PC1, las muestras chilenas son las que presentan valores de score
ms negativos sobre este eje, estando dichas muestras agrupadas en la parte
izquierda del mapa de scores. Las muestras espaolas y las procedentes de
Australia occidental presentan los valores de score ms altos en dicho
componente, estando ambos conjuntos diferenciados entre si por los valores de
score en PC2, presentando las muestras 18 y 19 los valores de score ms altos en
253
MEN
SALIR
dicho componente. Por ltimo, merece la pena resaltar los bajos valores de score
en ambos PCs de las muestras italianas, francesas, sudafricanas y americanas,
estando claramente diferenciadas de los dos clster previamente descritos.
Como es natural, no todas las muestras estn incluidas en un clster, ya
que hay otros muchos factores, aparte del origen que influyen sobre la poblacin
de compuestos fluorescentes en el vino. Los compuestos fluorescentes presentes
en el vino son mayoritariamente generados en la pulpa, semillas y pieles de la uva,
y son parcialmente extrados en el proceso de elaboracin del vino. Por lo tanto,
parece lgico pensar que la variedad de uva ser un factor muy influyente en los
fluorforos presentes en el vino, as como sus concentraciones relativas. Otros
factores que afectan a la poblacin de fluorforos en el vino son, por ejemplo, el
clima, las condiciones ambientales y del terreno en el que crecen las uvas, el
tratamiento de los viedos (riego, poda, etc.), la madurez del fruto en el momento
de la cosecha, el tipo de fermentacin empleada en el proceso de elaboracin, la
maceracin, el envejecimiento en barrica, entre otros. Tal y como se muestra en la
Tabla 1, en algunos casos se conoce el tipo de uva empleado en la elaboracin de
alguna de las muestras, siendo algunas de ellas monovarietales y otras
multivarietales. Se realiza entonces un PCA sobre el conjunto de muestras de las
que se dispone de este dato. Los resultados de este anlisis se recogen en la
Figura 8 en la que se representa los scores y loadings sobre el plano definido por
los componentes principales 1 (PC1) y 2 (PC2) (90 % de la varianza explicada).
254
MEN
SALIR
Figura 8.- Scores (superior) y loadings (inferior) del PCA sobre el conjunto de
muestras de las que se conoce el tipo de uva. Muestras agrupadas en el mapa de
scores en funcin del tipo de uva
Se observa que las muestras chilenas son un claro ejemplo de la influencia

de esta variable. As, las muestras 9, 53 y 54 elaboradas a partir de uvas Merlot
estn separadas del resto de muestras chilenas en el mapa de los scores definido
por PC1 y PC2. La influencia del origen sobre muestras elaboradas con el mismo
tipo de uva tambin es una evidencia. Se observa que las muestras nmero 18 y
255
MEN
SALIR
19 procedentes de Australia Occidental estn situadas en el mapa de los scores

muy lejos de las muestras 30, 31 y 32, procedentes de Argentina, y de la muestra
33, procedente de USA, estando todos estos vinos elaborados con uva de tipo
Sirah.
Como se observa en las Figuras 7 y 8, las variables f1 y f4 ceden casi toda
su varianza al plano definido por PC1 y PC2, estando dichas variables
negativamente correlacionadas.
La poblacin de muestras procedentes de Chile, son un caso bastante
particular, como se comenta a continuacin. Los resultados del PCA sobre este
conjunto de muestras, incluyendo como variable de categora el tipo de uva, se
representan en la Figura 9. De nuevo se pone de manifiesto la discriminacin entre
los vinos elaborados con uva de tipo Merlot (muestras nmero 9, 53, 54) del resto
de muestras, a pesar de ser todas del mismo pas. Como se observa en la Figura 7
estas tres ltimas muestras no estn dentro del clster de muestras chilenas,
posiblemente debido al tipo de uva. Adems, como se observa en el mapa de los
loadings el tercer componente de PARAFAC contribuye en mayor medida a PC2
que en los modelos representados en las Figuras 7 y 8. Tambin se observa una
inversin en las posiciones relativas de f1 y f4 en esta grfica de loadings y por ello
las muestras 9, 53 y 54 estn situadas en la parte izquierda en las grficas de los
score al contrario de lo que ocurre en las grficas de las Figuras 7 y 8.
256
MEN
SALIR
Figura 9.- Scores (superior) y loadings (inferior) del PCA sobre el conjunto de
muestras chilenas. Muestras agrupadas en el mapa de scores en funcin del tipo de
uva
257
MEN
SALIR
Identificacin de los fluorforos presentes en vino

Caracterizacin fluorescente de fluorforos presentes en vino
Se registran los espectros de excitacin y emisin de fluorescencia de una
serie de compuestos presentes en el vino que poseen propiedades fluorescentes.
Concretamente se ensayan los cidos glico, p-cumrico, elgico, ferrlico,
gentsico, vanllico, cafico, y sinpico, trans-resveratrol, trans-piceido, quercetina,
rutina, catequina y epicatequina, y los antocianos malvidina-3-O--glucopiransido,
petunidina-3-O--glucopiransido
delfinidina-3-O--glucopiransido.
El
comportamiento fluorescente de estos compuestos es altamente dependiente del

entorno qumico en el que se encuentran, estando muy influenciado por variables
tales como la acidez y la composicin del medio. Por lo tanto, se ha buscado un
entorno qumico lo ms similar posible a la matriz del vino, de modo que todas las
medidas de estos patrones se llevan a cabo en una matriz de vino sinttica,
compuesta por tampn tartrato de pH 3.7 en una concentracin de 3 g/L y etanol al
13 % v. Las condiciones instrumentales empleadas son similares a las utilizadas en
el registro de las muestras de vino, pero usando la geometra tradicional de medida
(90 ), al no tratarse de muestras concentradas.
En la Tabla 2 se resumen las longitudes de onda de mxima
excitacin y emisin de cada uno de estos compuestos as como las de los cuatro
factores obtenidos mediante PARAFAC.
258
MEN
SALIR
Tabla 2.- Propiedades fluorescentes de los compuestos ensayados, en medio tartrico de pH

3.7 3 g/L y etanol al 13 % v., y de los cuatro componentes obtenidos en la descomposicin
mediante PARAFAC de la EEM total del vino.
Compuesto
exc (nm)
em (nm)
cido glico
241
350
cido p-cumrico
348
410
cido vanllico
241, 282, 305
354
cido cafeico
262
433
cido elgico
333
422
cido sinpico
297, 335
446
cido ferrlico
cido gentsico
320
446
trans-resveratrol
318
390
trans-piceido
318
390
quercetina
427
480
rutina
catequina
279
317
epicatequina
280
316
280
355
280
355
280
355
Componente 1
260
380
Componente 2
275
323
Componente 3
330
410
Componente 4
260, 280
364
cidos fenlicos
No-Flavonoides
Estilbenos
Flavonoles
Flavanoles
Flavonoides
Antocianos
malvidina-3-O-glucopiransido
delfinidina-3-O-glucopiransido
petunidina-3-O-glucopiransido
259
MEN
SALIR
Las longitudes de onda de mxima excitacin y emisin del par de

ismeros catequina y epicatequina, son prximas a las del componente 2. Por otra
parte, los mximos de excitacin y emisin de los cidos p-cumrico y gentsico,
trans-resveratrol y trans-piceido, son cercanos a los del componente 3. Por ltimo,
se deduce que el cido vanllico podra estar relacionado con el componente 4,
dada la proximidad entre sus mximos de emisin, y entre los diferentes mximos
que aparecen en el espectro de excitacin. Con respecto al componente 1, no se
encuentra ninguna similitud entre las longitudes de onda correspondientes a los
perfiles de este factor y los estndares medidos.
Los espectros de excitacin y emisin correspondientes a los estndares
de los posibles candidatos, se muestran en la Figura 10. Es importante resaltar que
excepto en el caso del par de ismeros catequina y epicatequina, que encajan
perfectamente con los perfiles del componente 2, para el resto de los compuestos
ensayados no se da una similitud tan elevada entre los patrones y los perfiles de
PARAFAC, lo que apoya la idea de que cada componente de PARAFAC no
representa un nico fluorforo, sino un conglomerado de fluorforos o familia de
compuestos de comportamiento fluorescente similar.
260
SALIR
800
500
Catechin
Epicatechin
400
600
F. I.
F. I.
300
400
200
200
100
0
0
200
300
300
(nm)
400
200
500
1000
p-Coumaric Acid
300
(nm)
400
500
400
500
t-Resveratrol / t-Piceid
800
200
F. I.
F. I.
600
400
100
200
0
0
200
1000
300
(nm)
400
500
200
300
Gentisic Acid
300
(nm)
Vanillic Acid
800
200
600
F. I.
F. I.
MEN
400
100
200
0
0
200
300
(nm)
400
500
200
300
(nm)
400
500
Figura 10.- Espectros de excitacin y emisin de algunos de los compuestos ensayados
261
MEN
SALIR
Anlisis cromatogrfico de las muestras de vino

Con el objetivo de alcanzar un mayor conocimiento acerca de la poblacin
de molculas fluorescente en el vino se procede a cromatografiar las 57 muestras
incluidas en este estudio, monitorizando fluorimtricamente el eluato a los pares de
longitudes de onda de excitacin y emisin correspondientes a los componentes
obtenidos en la descomposicin de las EEMs mediante PARAFAC. Para llevar a
cabo la elucin de las muestras, se selecciona un programa de gradiente
apropiado, con el objetivo de obtener una buena separacin. Como fase mvil se
emplea una mezcla metanol-cido frmico-agua (10:2:88, v:v:v) como disolvente A
y metanol-cido frmico-agua (90:2:8, v:v:v) como disolvente B, con el siguiente
gradiente: 0 minutos, 100% A; 15 minutos, 85 % A:15 % B; 25 minutos, 50 % A:50
% B; 34 minutos 30 % A:70 % B. El flujo se mantiene a 0.25 mLmin-1. El eluato se
monitoriza fotomtricamente a 255, 260, 275, 280 y 330 nm, y fluorimtricamente a
exc/em 260 / 360 nm (longitudes de onda de compromiso para los componentes 1 y
4), 275 / 320 nm (componente 2) y 330 / 410 nm (componente 3), respectivamente.
En la Figura 11 se recogen los tres cromatogramas registrados para una de
las muestras a los tres pares de longitudes de onda de excitacin/emisin. Se
observa que la fluorescencia global de la muestra al excitar a 330 nm, es mucho
menor que la obtenida excitando a 260 275 nm. Se obtiene una buena
separacin entre los componentes fluorescentes a cada par de longitudes de onda,
lo que permite obtener una estimacin de su concentracin real en la muestra a
travs de la altura de sus picos cromatrogrficos.
262
MEN
SALIR
Figura 11.- Perfiles de fluorescencia a los tres pares de longitudes de onda, correspondientes a una
misma muestra
Una vez que se registran los cromatogramas correspondientes a las 57

muestras, se empiezan a buscar posibles correlaciones entre los valores de score
obtenidos en la descomposicin por PARAFAC y las alturas de los picos
correspondientes a componentes individuales, en los respectivos cromatogramas.
Con respecto al primer componente, se encuentran buenas correlaciones
entre los valores de score para este componente y las alturas de los picos a 30.0 y
34.5 minutos en los perfiles obtenidos a exc/em 260 / 360 nm. No obstante, la mejor
correlacin se encuentra con la altura del pico que aparece a 34.5 minutos. En la
Figura 12 se representa la altura de este pico para las 57 muestras frente a los
scores en el componente uno.
Con el fin de completar la caracterizacin de los componentes
fluorescentes en el vino se han registrado los espectros de emisin, excitando a
263
MEN
SALIR
260 nm, y se encuentra que el espectro de emisin correspondiente al pico que

aparece a 34.5 minutos es prcticamente similar al perfil de emisin del
componente uno (Figura 13). Con respecto al espectro en el pico a 30.0 minutos,
se encuentra que est localizado en la misma regin en longitudes de onda que el
componente uno, pero que su fisonoma no se corresponde con la de este
componente (Figura 13). Por dopaje de las muestras con los patrones de los que
se dispone, se corrobora que este pico no se corresponde con ninguno de ellos,
como era de esperar ya que al caracterizar estos patrones fluorimtricamente no se
encontr que ninguno de ellos presentara espectros de excitacin y emisin
coincidentes con los perfiles del componente uno. Mediante LC-MS se deduce que
la masa molecular de este compuesto es de 534, un valor relativamente elevado, lo
que nos lleva a pensar que pudiera tratarse de un compuesto de condensacin.
I. F. Relativa
Figura 12.- Correlacin entre los valores de score del componente 1 de cada muestra y la altura
del pico a 34.5 minutos
300
350
400
em (nm)
450
500
Figure 13.- Espectros de emisin a exc= 260 nm obtenidos en los pices de los picos a 30
(izquierda) y 34.5 minutos (centro). (derecha) perfil de emisin del componente uno.
264
MEN
SALIR
Como ya se coment anteriormente, al describir la caracterizacin de

fluorforos tpicos presentes en el vino, se piensa que el componente cuatro puede
estar relacionado con el cido vanllico. En la Figura 14 se representa la altura del
pico correspondiente a este polifenol, en los 57 cromatogramas obtenidos a exc/em
260/360 nm, frente a los valores de score para dicho componente, encontrando
cierta correlacin, si bien no muy elevada.
Figura 14.- Altura del pico correspondiente al cido vanllico (25 minutos) vs valores de score
en el componente 4, para las 57 muestras.
Con respecto a los cromatogramas obtenidos a exc/em 275/ 320 nm (en

este caso no se inyectan todas las muestras, sino las ms representativas de la
variacin de este factor, es decir muestras con alto, medio y bajo contenido en este
factor), se encuentran elevadas correlaciones entre los valores de score
correspondientes al segundo componente de PARAFAC y las alturas de los picos a
22.2 y 27.7 minutos, correspondientes al par de ismeros catequina y epicatequina,
respectivamente (Figura 15). Este hecho est de acuerdo con la similitud ya
comentada, entre los espectros de excitacin y emisin de ambos compuestos con
los perfiles correspondientes al componente 2, confirmndose por tanto, la
asignacin de dicho componente a ambos ismeros.
265
MEN
SALIR
Figura 15.- Altura de los picos correspondientes a catequina (superior) y epicatequina (inferior)
frente a los valores de score del componente 2 para las muestras ensayadas
En ltimo lugar, con respecto al tercer componente, se encuentran buenas

correlaciones entre los valores de score para el mismo y los picos a 28.7, 30.2
(cido p-cumrico), 33.0 y 36.3 minutos en los cromatogramas obtenidos a exc/em
330/410 nm, para las muestras ms representativas de la envergadura de este
factor. Esto nos indica que efectivamente este factor est asociado a un conjunto
de fluorforos y con los datos disponibles, no podemos concluir el peso de cada
uno de ellos.
266
MEN
SALIR
Utilizacin de las seales de autofluorescencia total del vino en combinacin

con herramientas quimiomtricas para asegurar la pertenencia del vino a una
DO
El vino es un producto que muy comnmente est sometido a
denominaciones de origen, lo que implica la necesidad de disponer de
herramientas analticas potentes que permitan llevar a cabo un control de las
diferentes partidas. Las seales totales de autofluorescencia de este producto se
perfilan como candidatas idneas para futuros mtodos de control analtico. El
objetivo de este apartado es el estudio de las posibilidades de las EEMs para
discriminar entre muestras de vino pertenecientes a la DO Rioja y las no
pertenecientes, as como la posible diferenciacin entre muestras de vino joven,
crianza y reserva, y las capacidades para predecir el contenido total de polifenoles.
En este caso se construye un modelo en el que se incluyen 59 muestras de
vino, 48 de las cuales pertenecen a la DO, y 11 son no pertenecientes. Dentro de
los vinos de la DO, hay muestras de vinos joven, de crianza y reserva. Las
muestras se mantienen a una temperatura aproximada de 4 C, y la matriz de
fluorescencia de registra inmediatamente despus de abrir cada botella.
Las EEMs correspondientes a las 59 muestras se registran en modo frontface. En este caso, el ngulo de incidencia, definido como el formado entre el haz
de excitacin y la perpendicular a la superficie de la celda, se mantiene en 34.
Para el registro de la EEM, una alcuota de cada muestra de vino se transfiere
directamente de la botella a una celda de cuarzo de 3 mL y 1 cm de paso de luz. La
temperatura del laboratorio se mantiene en torno a 15 C. Las rendijas de
excitacin y emisin de los monocromadores se fijan en 5 nm, respectivamente. La
velocidad de adquisicin se fija en 1200 nm/min, como solucin de compromiso
267
MEN
SALIR
entre ruido en los espectros registrados y tiempo de adquisicin de la matriz. Los

rangos de longitudes de onda de excitacin y emisin son 245-345 nm y 300-500
nm, respectivamente, con incrementos de 2 nm, en ambos casos, lo que implica 51
valores de longitudes de onda de excitacin y 101 de emisin. Cada EEM se
registra como mltiples espectros de emisin, a distintas longitudes de onda de
excitacin.
Cuando se agrupan las EEMs correspondientes a las 59 muestras, se
obtiene un cubo de datos de dimensiones 59 x 101 x 51. Este cubo de datos es
pretratado, para eliminar del mismo las seales de dispersin y anular la zona de
las matrices en las que exc>em, como se ha explicado anteriormente.
Se procede entonces a la descomposicin de este cubo de datos mediante
PARAFAC. En primer lugar se procede a deducir el nmero ptimo de factores.
Para ello se realizan los clculos empleando un nmero de factores comprendido
entre uno y cuatro, aplicando en todos los casos la restriccin de no negatividad en
los tres modos. Los valores de % core obtenidos para uno, dos y tres factores son
de 100, 99.9 y 80.2 %, mientras que para el modelo construido con cuatro factores
se obtiene un valor del 34.3 %. A travs de esta cada en el valor del core y al
observar la estructura de los perfiles obtenidos, se deduce finalmente que el
nmero ptimo de factores en este caso es de tres, ya que los perfiles de
fluorescencia del cuarto parecen nicamente ruido sin una forma definida. Los
perfiles de excitacin y emisin de los tres componentes se representan en la
Figura 16.
268
SALIR
I. F. Relativa
I. F. Relativa
MEN
240
260
280
300 320
(nm)
340
360
300
350
400
(nm)
450
500
Figura 16.- Perfiles normalizados de excitacin (izquierda) y emisin (derecha),

correspondientes a los factores 1 (), 2 () y 3 (), obtenidos mediante PARAFAC
El perfil de excitacin del primer componente se caracteriza por un mximo

centrado a 260 nm, y un hombro a 295 nm; su perfil de emisin consta de un
mximo principal centrado a 363 nm, y cuatro pequeos picos a 420, 470, 485 y
495 nm. El segundo componente est caracterizado por bandas relativamente
anchas de excitacin y de emisin, centradas a 330 y 425 nm, respectivamente. El
perfil de excitacin del tercer componente presenta dos mximos, el ms intenso
de ellos, centrado a 285 nm, y uno de menor intensidad a 335 nm; en el perfil de
emisin de este componente se observa un mximo principal centrado a 325 nm.
Como se hizo con el modelo anteriormente discutido, en este caso tambin
se comprueba la estabilidad mediante split half analysis, y analizando las matrices
por zonas de excitacin y emisin.
La matriz de scores obtenida en este caso mediante PARAFAC tiene
dimensiones 59 x 3. Dicho set de datos se analiza por PCA. Los resultados de
dicho anlisis se recogen en la Figura 17 en forma de grficos de scores y
loadings.
269
MEN
SALIR
Figura 17.- Grficos de loadings (superior) y scores (inferior) en el plano PC1-PC2.

En la grfica de los scores, se muestran en azul las muestras de las DO y en rojo
las que no pertenecientes
Del grfico de los loadings, se deduce que las variables 1 y 3 estn

inversamente correlacionadas, y ambas variables ceden su varianza a PC1 y PC2.
Por su
parte, en el grfico de los scores, las muestras se han agrupado
dependiendo de su pertenencia o no a la DO, as las muestras azules son vinos de

Rioja y las rojas son vinos de DO distintas. Se observa cierto grado de
discriminacin. Las muestras 49 (vino casero) y 53 (Ribera del Duero) presentan
270
MEN
SALIR
valores negativos en el primer componente, y por tanto un valor superior a la media

de aquellas variables cuyos loadings respecto a este PC sean altos y negativos, es
decir, los scores en el componente uno obtenido mediante PARAFAC. El resto de
muestras no pertenecientes a la DO presentan valores negativos en PC2,
presentando valores inferiores a la media para las tres variables. Se deduce que
ambos PCs estn relacionados con la variable fundamental pertenencia a la DO.
Por otra parte, se ha realizado un nuevo anlisis de componentes
principales sobre el conjunto de muestras de la DO de las cuales se conoca su
carcter de vino joven, crianza o reserva. Los resultados de este PCA se muestran
en la Figura 18. En este caso, las muestras se han agrupado en el mapa de los
scores atendiendo a su carcter de jvenes, crianza o reserva. En este caso no se
observa una clara existencia de clsteres, y este hecho es bastante natural, porque
como se coment anteriormente, son muchos los factores que influyen sobre la
poblacin de compuestos fluorescentes en el vino. No obstante, parece que el PC2
s distingue entre muestras jvenes, que presentan los mayores valores de score
en este componente, y muestras de crianza o reserva. En el grfico de los loadings
en este nuevo modelo se observa que la variable 1 cede casi toda su varianza a
PC2, y la variable 3 a PC1. De modo que las muestras de vino jvenes tienen
valores superiores a la media en la variable 1.
271
MEN
SALIR
Figura 18.- Grficos de loadings (superior) y scores (inferior) en el plano PC1-PC2.

En la grfica de los scores, se muestran en azul las muestras de vino jvenes, en
rojo las crianza y en verde las reserva
272
MEN
SALIR
En este caso, adems, se mide el ndice total de polifenoles en las 59

muestras de vino, mediante el mtodo de Folin-Ciocalteau. El modo de operar
experimentalmente fue el siguiente: Se deposita 1.00 mL de vino en un matraz de
10.0 mL y se aade agua ultrapura hasta enrase. Se toman 0.25 mL de vino diluido
y se llevan a un matraz de 25.0 mL, en el cual se aaden 15.0 mL de agua, 1.25
mL de reactivo de Folin-Ciocalteu, 3.75 mL de disolucin de carbonato sdico y
agua ultrapura hasta enrase. La disolucin resultante se deja reposar 2 horas y al
cabo de este tiempo, se mide la absorbancia a 755 nm. El contenido total de
polifenoles se mide en unidades de cido glico, sobre una recta de calibrado
previamente construida con disoluciones patrn de dicho compuesto, en el rango
de concentraciones de 0.50 a 5.0 gmL-1.
Actualmente se estn estudiando las posibilidades de distintos espectros
de excitacin y emisin extrados de las EEMs, as como de diversas zonas de las
mismas, para predecir el ndice de polifenoles totales del vino. La proposicin de un
mtodo rpido de medida de este parmetro ser un gran reto, ya que evitar llevar
a cabo el lento proceso de Folin-Ciocalteu.
273
MEN
SALIR
MEN
SALIR
CAPTULO VII
ANLISIS DE RESVERATROL EN VINOS
TINTOS MEDIANTE VOLTAMPEROMETRA DE
REDISOLUCIN ADSORTIVA DE ONDA
CUADRADA
MEN
SALIR
CAPTULO VII. Resveratrol en vino tinto mediante Ad-SSWV
276
MEN
SALIR
ANTECEDENTES
Las tcnicas voltamperomtricas en general, y en particular las tcnicas de
redisolucin, se han utilizado ampliamente para el anlisis de alimentos. En la
mayora de los casos se trata de mtodos para anlisis de metales, y entre los
alimentos en que se han utilizado estas tcnicas se encuentra tambin el vino1, 2.
Sin embargo son ms escasos los antecedentes encontrados acerca de mtodos
electroanalticos para la determinacin de otros componentes del vino, si bien la
mayora de ellos se refieren al anlisis de antioxidantes. As, Kilmartin et al3
realizan un estudio mediante voltamperometra cclica y describen el
comportamiento de los orto-difenoles presentes en el vino, que disueltos en un vino
sinttico, originan, en el electrodo de carbn vitrificado, un pico andico a
potenciales prximos a 400 mV, debido a la prdida de dos electrones para dar
orto-quinonas, y atribuyen las seales que aparecen a potenciales superiores, a
otras clases de compuestos fenlicos. Entre otros, incluyen al trans-resveratrol
entre los compuestos responsables del pico cercano a 650 mV, puesto que, segn
sus resultados, tiene un potencial de pico de 667 mV.
Posteriormente, el mismo grupo de investigacin informa de una seal de
oxidacin a 300 mV que atribuyen a miricetinas y de un hombro a 470 mV adscrito
a la oxidacin de glucsidos de quercetina4. La integral de las curvas I-E hasta 500
mV se usa como una medida de los compuestos fenlicos de menores potenciales
de oxidacin (llamados equivalentes de cido glico). El pico a 640 mV que
proporcionan los vinos tintos se asocia a antocianos derivados de la malvidina y
Daniele S., Baldo M.A., Ugo P., Mazzocchin A., Anal. Chim. Acta, 1989, 219:9-18
Brainina Kh.Z., Stozhko N.YU., Belyshva G.M., Inzhevatova O.V., Kolyadina L.I., Cremisini C.,
Galleti M., Anal. Chim. Acta, 2004, 514:227-234
3 Kilmartin P.A., Zou H., Waterhouse A.L., J. Agric. Food Chem., 2001, 49:1957-1965
4 Kilmartin P.A., Zou H., Waterhouse A.L., Am. J. Enol. Vitic., 2002, 53:294-302
1
2
277
MEN
SALIR
oxidaciones posteriores a potenciales mayores de 700 mV a meta-difenoles o a

grupos fenlicos aislados.
En otro artculo, recogen los resultados obtenidos al examinar la
fermentacin de mostos de Pinot Noir utilizando la voltamperometra cclica para
realizar el seguimiento de los compuestos fenlicos5.
Piljac et al6 comprueban que la voltamperometra cclica proporciona una
estimacin fiable del contenido de compuestos fenlicos en vino y que es til para
la identificacin de clases especficas de polifenoles, segn sus potenciales de
oxidacin. Los flavonoles totales, expresados como equivalentes de quercetina,
son determinados en vino y otras bebidas mediante un mtodo de inyeccin en
flujo/voltamperometra de redisolucin adsortiva7, que incluye un cambio de medio
entre la preconcentracin y la obtencin de las seales electroqumicas, utilizando
un electrodo de pasta de carbono.
Sin embargo, en ninguno de los artculos citados se hace referencia a la
determinacin individual de trans-resveratrol en vinos. S se encuentran en la
bibliografa diferentes artculos en que se describe el comportamiento
electroqumico de resveratrol.
As, Corduneanu et al8 evalan la actividad antioxidante de los ismeros
trans y cis, mediante voltamperometra cclica, diferencial de pulso y de onda
cuadrada, en amplio rango de pH, usando un electrodo de carbn vitrificado. Segn
sus resultados, el resveratrol presenta dos picos de oxidacin, el primero de ellos
Zou H., Kilmartin P.A., Inglis M., Frost A., Australian J. of Grape and Wine Research, 2002, 8:1-12
Piljac J., Martnez S., Stipevi T., Petrovi , Metiko-Hukovi M., Am. J. Enol. Vitic., 2004,
55:417-422
7 Volikakis G.J., Efstathiou, C.E., Anal. Chim. Acta, 2005, 551:124-131
8 Corduneanu O., Janeiro P., Brett A. M. O., Electroanalysis, 2006, 18: 757-762
5
6
278
MEN
SALIR
correspondiente a la oxidacin irreversibe del grupo fenlico y el segundo a la

oxidacin de los grupos hidroxilo del anillo de resorcinol, tambin de forma
irreversible.
Zhang et al9 estudian el comportamiento de trans-resveratrol en el
electrodo de pasta de carbono, mediante las tcnicas voltamperometra cclica y de
onda cuadrada. Deducen de su estudio que la molcula de trans-resveratrol sufre
una oxidacin irreversible en dicho electrodo, siendo el proceso controlado por
adsorcin y dependiente del pH.
Ensayan distintos medios de trabajo tales como disoluciones acuosas 0.1
M de HCl, HNO3, H2SO4, H3PO4, KNO3, KCl, KI, KBr, NaCl, NH4Cl, Na2CO3, tartrato
sdico, Na2B4O7, y NaOH, tampn Britton-Robinson de pH 4.7 o tampn
actico/acetato, y observan un nico pico andico del analito en medio fuertemente
cido. Obtienen mejores resultados en presencia de cido ntrico o cido clorhdrico
que en medio cido sulfrico. Adems, encuentran que la adicin de cloruros al
medio de trabajo incrementa la intensidad del pico andico obtenido,
probablemente debido a que la adsorcin de este in en la superficie del electrodo
de pasta de carbono mejora las propiedades de esta superficie y facilita la
velocidad de transferencia de electrones10. Finalmente, el medio de trabajo que
emplean est compuesto por 10-3 M de KCl + 0.1 M HNO3, siendo 1.0 el pH del
mismo. Adems, realizan un estudio mediante voltamperometra cclica del cual se
deduce el carcter totalmente irreversible de la reaccin electrdica de transresveratrol, al no observarse pico alguno en el barrido inverso.
Zhang H., Xu L., Zheng J., Talanta, 2007, 71:19-24

Dong S.Y., Zheng J.B., Gao H., Chem. J. Chin. Universities, 2003, 24:428
10
279
MEN
SALIR
A travs de la variacin del potencial de pico con la velocidad de registro,

deducen que el nmero de electrones que participan en la reaccin es 1,
asumiendo = 0.5. Se encuentra tambin que los potenciales de pico se
desplazan hacia valores menos negativos segn se aumenta el pH, deducindose
a travs de la ecuacin de Nernst que el nmero de protones involucrados en la
reaccin es 1.
Dada la similitud entre la estructura qumica de resveratrol y la de los
flavonoides, postulan que el pico observado para este compuesto debe
corresponder a la oxidacin del grupo hidroxilo del anillo fenlico de resveratrol, y,
deducen la existencia de adsorcin del analito sobre la superficie del electrodo, al
observar el efecto atenuador de la adicin de pequeas cantidades de surfactante
sobre el pico andico. Por ltimo, ponen a punto un mtodo de anlisis, llevando a
cabo los registros mediante voltamperometra de onda cuadrada. Encuentran una
buena relacin lineal entre concentracin de resveratrol puesta y la seal medida
(intensidad de pico), y aplican el mtodo a la determinacin de este compuesto en
frmacos y orina.
Por ltimo, en un artculo muy reciente11 se propone un mtodo de
redisolucin adsortiva de diferencial de pulso, en electrodo de grafito, para
determinar resveratrol en tabletas. Los estudios realizados apoyan, nuevamente, la
oxidacin del grupo hidroxilo en el anillo fenlico como responsable del pico que
aparece a potenciales prximos a 0,5 V, a pH 6.0.
Basndonos en los resultados anteriormente descritos, asumimos como
principal reto llegar a proponer un mtodo para la determinacin de transresveratrol en vino, que nos parece interesante dada la rapidez y sensibilidad de
11
Liu X.J., Wu Y.J., Wang F., Gao L., Ye B.X., J. of the Chinese Chem. Soc., 2008, 55:264-27
280
MEN
SALIR
las tcnicas electroanalticas. Buscamos diferentes estrategias, como es el cambio

de medio, y un tratamiento de muestra adecuado, al enfrentarnos a una muestra
tremendamente compleja.
Nuestro electrodo de trabajo es un electrodo de carbono vitrificado, y el
cido que utilizamos para fijar la acidez del medio de trabajo es HClO4.
El objetivo de este captulo es ms el desarrollo de un mtodo para la
determinacin de trans-resveratrol en muestras de vino, que el estudio de los
procesos electroqumicos en que se basa. Por ello, la mayor parte de las
experiencias que aqu se describen se llevan a cabo en presencia de la matriz del
vino, y partiendo de los antecedentes ya descritos por Zhang et al9, para la
oxidacin del trans-resveratrol en medio cido.
Eleccin del sistema de limpieza del electrodo de carbn vitrificado
Uno de los inconvenientes que tiene la utilizacin de electrodos slidos, y
en concreto la utilizacin del electrodo de carbn vitrificado, es el frecuente
deterioro de su superficie como consecuencia de la adsorcin de los compuestos
en estudio o de los productos resultantes de su oxidacin, o bien de la modificacin
qumica de la misma. Esto produce la obtencin de resultados no reproducibles en
barridos sucesivos y hace necesaria la utilizacin de algn procedimiento de
limpieza de los mismos. Para seleccionar el ms apropiado en nuestro caso, se
han examinado varios de entre los ms frecuentes, atendiendo a la reproducibilidad
que proporcionan en registros sucesivos de voltamperogramas del compuesto en
estudio. En concreto, los mtodos de limpieza examinados han sido el pulido con
281
MEN
SALIR
almina y el frotamiento con un disco de algodn empapado en un disolvente

orgnico como etanol, acetonitrilo o dimetilformamida, as como en hidrxido sdico
2 M, seguido en todos los casos de frotamiento sobre un disco de algodn
empapado en agua. En todos los casos se ensaya, asimismo, el resultado de
efectuar una limpieza electroqumica, posterior a la mecnica, mediante la
realizacin de un barrido de potencial en sentido inverso al que pretendemos
efectuar. Conforme a los resultados obtenidos se ha decidido efectuar la limpieza
del electrodo mediante frotamiento con un algodn empapado en dimetilformamida
(DMF) durante 1 minuto, seguido de limpieza con algodn empapado en agua
durante otro minuto. Antes de la obtencin de los voltamperogramas se efecta,
adems, un barrido mediante voltamperometra de onda cuadrada desde + 1.2 a
0.0 V, sobre un blanco. Este registro, adems de contribuir a la limpieza del
electrodo, permite comprobar la efectividad del procedimiento de limpieza
completo, tomando como referencia la reproducibilidad del perfil I-E obtenido en el
mismo.
Influencia de la concentracin de cido
Puesto que como ya se ha dicho el trans-resvetratrol origina ondas de
adsorcin en medio cido, en primer lugar estudiamos la influencia de la
concentracin de cido perclrico en el medio de trabajo. Para ello, se preparan 4
disoluciones conteniendo todas ellas, en un volumen final de 25.0 mL, 73 ngmL-1
de trans-resveratrol, volmenes diferentes de HClO4 1.0 M y NaClO4 1.0 M, tales
que la suma de ambos se mantenga constante en 5.0 mL, para as mantener la
fuerza inica del medio, y agua ultrapura hasta enrase. Se procede a registrar los
voltamperogramas de redisolucin adsortiva de onda cuadrada (Ad-SSWV) de
todas ellas, en las siguientes condiciones instrumentales: Eac = +0.50 V, tac = 60 s,
teq = 10 s, frecuencia = 25 Hz, paso de potencial = 10 mV, amplitud = 50 mV.
282
SALIR
La lnea base de los voltamperogramas obtenidos (Figura 1 izquierda) se

corrige mediante el mtodo de la media mvil (moving average), obtenindose los
voltamperogramas de la Figura 1-derecha. Se trata de un mtodo automtico de
correccin a lnea base, el cual es bastante efectivo cuando los picos aparecen
como hombros sobre perfiles escarpados. De manera que, los picos reales se
observarn como tales, una vez hecha la correccin. El nmero de puntos
integrantes del voltamperograma resulta reducido una vez realizada la correccin,
ya que se van obteniendo valores medios dentro de una ventana, cuyo tamao es
un parmetro a especificar para llevar a cabo la correccin. La lnea base se
calcula posteriormente, por comparacin de cada punto con el valor medio de sus
dos vecinos. Si el valor absoluto medio es menor, ste sustituye al valor real. La
operacin se repite una y otra vez, hasta que ya no sea necesario reemplazar
ningn valor. Cuando el nmero de iteraciones necesarias sea superior a 1000, el
proceso se para.
8E-007
5.5E-006
5E-006
6E-007
I (A)
4.5E-006
I (A)
MEN
4E-007
4E-006
2E-007
3.5E-006
3E-006
0
0.5
0.6
0.7
E (V)
0.8
0.9
0.5
0.6
0.7
E (V)
0.8
0.9
Figura 1.- Influencia de la concentracin de cido perclrico en el medio de trabajo. Izquierda:

voltamperogramas originales; derecha: voltamperogramas corregidos. Concentraciones
ensayadas: 0.1 M HClO4 (); 0.08 M HClO4 - 0.02 M NaClO4 (); 0.04 M HClO4 - 0.06 M
NaClO4 (); 0.02 M HClO4 - 0.08 M NaClO4 ()
Se comprueba que, en el intervalo examinado, la concentracin de HClO4

no influye sobre la intensidad de pico del trans-resveratrol y que el potencial de pico
tampoco sufre un cambio apreciable. En lo sucesivo se utiliza HClO4 0.1 M para
283
MEN
SALIR
fijar la acidez. Se comprueba, adems, que la seal no vara al eliminar el NaClO4

del medio, por lo que en adelante solamente se aadir HClO4 como electrolito
soporte.
Limpieza del vino
Se ha comprobado que el vino ha de ser sometido a una serie de etapas
previas de limpieza, dado que en presencia de la matriz completa del vino no se
observa seal alguna debida al proceso adsortivo-oxidativo del trans-resveratrol.
Primeramente se procede al registro de un voltamperograma Ad-SSWV sobre una
muestra de vino sin tratar, simplemente filtrado y diluido, en presencia de una
concentracin de HClO4 0.10 M, producindose una contaminacin severa de la
superficie del electrodo que obliga a la regeneracin total de la misma mediante
frotamiento con almina. Con el fin de obtener una disolucin de trans-resveratrol
en una matriz ms simple, el primer tratamiento al que se someti la muestra fue a
una extraccin lquido-lquido con ter etlico, segn el procedimiento previamente
descrito en el Captulo II de esta memoria12, y que proporciona una recuperacin
del 100 % para el analito de inters. Se oper sobre una alcuota de 0.25 mL de
vino, fortificado con 2.0 gmL-1 de trans-resveratrol, en un volumen de 10.0 mL.
Cuando se procede al registro de los voltamperogramas de estos extractos,
encontramos que, si bien la seal de fondo se reduce apreciablemente, cuando el
extracto se fortifica en la celda con mayores concentraciones de trans-resveratrol
las seales Ad-SSWV medidas, no responden a dicho aumento de concentracin,
probablemente debido a la adsorcin competitiva de otros compuestos del vino en
la superficie del electrodo. Entonces se decide someter a este extracto a un
procedimiento de limpieza adicional, concretamente se procede a la limpieza del
Galeano-Daz T., Durn-Mers I., Airado-Rodrguez D., Anal. Bioanal. Chem., 2007, 387:1999
2007
12
284
MEN
SALIR
mismo, mediante extraccin en una fase slida de octadecilo (C18). El

procedimiento de extraccin en fase slida que se selecciona inicialmente consiste
en hacer pasar la muestra por el cartucho previamente acondicionado por paso de
5.0 mL de metanol y 20.0 mL de agua ultrapura. Una vez cargada la muestra en el
cartucho, se procede al lavado del mismo por paso de 30 mL de etanol al 10 % en
agua y posterior elucin por paso de 3.0 mL de etanol al 50 % en agua. Los 3.0 mL
de eluato se transfieren a un matraz de 10.0 mL, y sobre ellos se aade 1.0 mL de
etanol (% final de etanol = 25 %), 1.0 mL de HClO4 1M, y agua ultrapura hasta
enrase. Sobre esta disolucin es sobre la que se lleva a cabo el conjunto de
experiencias que se describen a continuacin, con el objetivo de tener siempre al
analito en presencia de la matriz, ya que, al tratarse de un mtodo de adsorcin, es
importante que el analito de inters est siempre en presencia de posibles
competidores por unirse a la superficie del electrodo. En la Figura 2 se recogen los
voltamperogramas correspondientes al extracto resultante de la primera extraccin
lquido-lquido, y al extracto limpio mediante extraccin en fase slida. Para realizar
las medidas, en primer lugar se lleva a cabo la acumulacin sobre el electrodo a
+ 0.60 V durante un minuto, y a continuacin se procede al registro de los
voltamperogramas, en las siguientes condiciones instrumentales: frecuencia = 25
Hz, paso de potencial = 10 mV, amplitud de onda cuadrada = 50 mV.
Cabe resaltar, no slo la importante reduccin de la seal de fondo que se
observa en los voltamperogramas, sino tambin el hecho de que cuando se aade
trans-resveratrol al extracto doblemente limpio, se obtiene el esperable aumento de
seal, a diferencia de lo que ocurre al fortificar la disolucin obtenida directamente
tras el primer procedimiento de limpieza mediante extraccin lquido-lquido.
285
MEN
SALIR
7E-006
4.4E-006
6E-006
I (A)
I (A)
4.2E-006
5E-006
4E-006
4E-006
3E-006
3.8E-006
0.6
0.7
E (V)
0.8
0.9
Figura 2.- Voltamperogramas correspondientes a las

muestras resultantes de la primera extraccin lquidolquido con ter etlico () y de la extraccin
adicional en fase slida del extracto sobre C18
()
No obstante, hay que sealar que estos voltamperogramas se han

obtenido llevando a cabo, despus de la etapa de equilibrado (10 s) del electrodo
en el medio de deposicin, un cambio de dicho electrodo a un medio conteniendo
HClO4 0.10 M y etanol al 10 %. En dicho medio se efecta el registro, en las
condiciones instrumentales detalladas anteriormente. Este requisito es necesario
puesto que, de otro modo, no se observa seal alguna distinguible de la elevada
seal de fondo.
Seleccin del porcentaje de etanol en cada medio
Una vez demostrada la conveniencia del cambio de medio y elegido
inicialmente un procedimiento de limpieza de la muestra, se procede a la
optimizacin del porcentaje de etanol en los medios de acumulacin y de registro.
Para optimizar el porcentaje de etanol en el medio de acumulacin, se
prepara una muestra de la siguiente manera: 0.50 mL de vino fortificado con 2.0
gmL-1 de trans-resveratrol y 5.0 mL de tampn tartrico 0.26 M de pH 5.0, se
286
MEN
SALIR
llevan a un volumen de 10.0 mL, y se extraen con 5.0 mL de ter etlico por
agitacin durante un minuto. Se recoge la fase orgnica a travs de papel de filtro,
y se evapora el ter etlico hasta sequedad. El residuo se reconstituye con 0.20 mL
de etanol y agua ultrapura hasta un volumen final de 10.0 mL. Esta disolucin se
hace pasar a travs de un cartucho C18, previamente acondicionado por paso de
5.0 mL de metanol y 20.0 mL de agua. Una vez cargada la disolucin en el
cartucho, se lava ste con 10.0 mL de etanol al 10 %, y se procede a la elucin del
trans-resveratrol con 1.0 mL de etanol al 50 %. El eluato se transfiere a un matraz
de 10.0 mL, y se aade 1.0 mL de HClO4 1.0 M y agua ultrapura hasta enrase. Al
proceder de esta manera, la disolucin final contiene un 5 % de etanol. Se lleva a
cabo la acumulacin del trans-resveratrol de esta muestra sobre el electrodo de
carbn vitrificado, aplicando a ste un potencial de + 0.60 V durante 1 minuto y
dejando transcurrir posteriormente un tiempo de equilibrado de 10 s.
Posteriormente se sumerge el electrodo en otra disolucin conteniendo HClO4 0.10
M y 25 % de etanol, en la cual, se registra el voltamperograma de onda cuadrada
en las siguientes condiciones instrumentales: frecuencia = 25 Hz, paso de potencial
= 10 mV y amplitud = 50 mV. A continuacin se repiten las etapas de acumulacin
y obtencin de los voltamperogramas, aadiendo de manera sucesiva volmenes
de etanol absoluto de 0.5, 1.5, 1.0 y 2.0 mL, en la celda que contiene la disolucin
de trans-resveratrol, lo que implica porcentajes de etanol de 9.5, 20.8, 26.9 y 36.7
% en el medio de acumulacin, manteniendo constante la composicin del medio
en que se registran los voltamperogramas.
En la Figura 3 se representa la variacin de la altura de pico, corregida
segn el factor de dilucin en cada caso, con el porcentaje de etanol en el medio
de acumulacin. Como se observa en la misma, la altura de pico aumenta
ligeramente con el porcentaje de etanol cuando este est por debajo del 10 %,
287
MEN
SALIR
cayendo drsticamente para valores mayores. Se fija un porcentaje de etanol del

10 % en el medio de acumulacin para posteriores experiencias.
700
I (nA)
600
500
400
300
0
10
20
% v. Etanol
30
40
Figura 3.- Variacin de la altura de pico

con el porcentaje de etanol en el medio
de acumulacin
Una vez fijado el porcentaje de etanol en el medio de acumulacin, se

procede a la optimizacin de dicha variable en el medio utilizado para el registro de
los voltamperogramas. La experiencia se realiza utilizando una muestra de vino
fortificada igualmente con 2.0 gmL-1 de trans-resveratrol y sometida al tratamiento
de limpieza anteriormente detallado, fijando un porcentaje final de etanol en la
disolucin del 10 %. Se lleva a cabo la etapa de acumulacin en todos los casos
durante 60 segundos a + 0.60 V, seguida de 10 s de equilibrado. A continuacin se
procede al registro de los correspondientes voltamperogramas en presencia de
HClO4 0.10 M y de distintos porcentajes de etanol, y en las siguientes condiciones
instrumentales: frecuencia = 25 Hz, paso de potencial = 10 mV y amplitud = 50 mV.
En la Figura 4 se representa la variacin de la altura de pico con el
porcentaje de etanol en el medio de medida. Como se observa en la misma, la
intensidad de pico se mantiene constante entre el 0 y 10 % de etanol, aumentando
ligeramente entre porcentajes de etanol comprendidos entre el 10 y el 25 %,
mantenindose para porcentajes de etanol mayores, de manera que se fija un
288
SALIR
porcentaje de etanol del 30 % en el medio de registro, para posteriores

experiencias.
500
400
I (nA)
MEN
300
200
100
0
0
10
20
30
% v. Etanol
40
50
Figura 4.- Influencia del porcentaje de

etanol en el medio de medida
Eleccin de la tcnica de barrido

Aunque en las experiencias anteriormente descritas se utiliz
voltamperometra de onda cuadrada para efectuar el registro, con el fin de
comprobar si efectivamente es la tcnica ms apropiada, se comparan (Figura 5)
los voltamperogramas registrados para una misma muestra, previa acumulacin a
+ 0.60 V durante 60 segundos y cambio de medio, en onda cuadrada (izquierda) y
diferencial de pulsos (derecha), as como los correspondientes voltamperogramas
corregidos a lnea base, establecida este por el mtodo de la media mvil.
289
MEN
SALIR
1.04E-005
3.65E-007
1E-005
3.6E-007
2.5E-007
2E-007
I (A)
1.5E-007
1E-007
9.6E-006
3.55E-007
9.2E-006
3.5E-007
5E-008
0
3.45E-007
8.8E-006
0.6
0.7
E (V)
0.8
0.9
Icorregido (A)
3.7E-007
I (A)
1.08E-005
-5E-008
0.6
0.7
E (V)
0.8
0.9
Figura 5.- Voltamperogramas en onda cuadrada () y diferencial de pulsos (), y los

correspondientes corregidos a lnea base (), de una misma muestra de vino sometida al
tratamiento especificado y fortificada con 24.6 ngmL-1 de trans-resveratrol en la celda
Se observa cmo al trabajar en la tcnica diferencial de pulsos, en el

voltamperograma inicial el pico est algo mejor definido que en onda cuadrada, no
obstante la sensibilidad se reduce varias veces al trabajar en diferencial de pulsos,
como se aprecia fcilmente en los voltamperogramas corregidos a lnea base. Por
lo tanto, se elige onda cuadrada para posteriores experimentos. Adems, son
varias las ventajas de la voltamperometra de onda cuadrada sobre otras tcnicas
electroanalticas, entre las que cabe citar la mayor velocidad de anlisis y la
existencia de menos problemas de bloqueo de la superficie del electrodo.
Adsorcin sobre el electrodo
Se comprueba que la adsorcin del trans-resveratrol sobre el electrodo de
carbono vitrificado se dan, en presencia de la matriz del vino, tras los
procedimientos de limpieza establecidos, en un rango de potenciales entre -0.60 y
+0.60 V, pasando por 0 V, pero que no se produce a circuito abierto, es decir con el
potenciostato apagado.
Por tanto se procede a estudiar cmo influye el potencial de deposicin,
sobre la acumulacin del analito en presencia de la matriz del vino. Sobre el fondo
290
SALIR
de vino preparado como anteriormente se indic, se ensayan diferentes potenciales

de acumulacin, manteniendo en todos los casos un tiempo de acumulacin de 60
segundos y un periodo de equilibrado de 10 s, y realizando el registro en HClO4
0.10 M, en las siguientes condiciones instrumentales: frecuencia = 25 Hz, paso de
potencial = 10 mV y amplitud = 50 mV. Los voltamperogramas registrados en estas
condiciones se recogen en la Figura 6.
4.6E-006
8E-008
4.4E-006
6E-008
4.2E-006
4E-008
4E-006
2E-008
I (A)
I (A)
MEN
3.8E-006
3.6E-006
-2E-008
0.6
0.7
E (V)
0.8
Circuito Abierto
0V
+ 0.20 V
+ 0.40 V
+ 0.60 V
0.9
Figura 6.- Influencia del potencial de acumulacin sobre la adsorcin de trans-resveratrol

en presencia de la matriz de vino. Voltamperogramas sin corregir (lnea continua) y
corregidos a lnea base, establecida sta con el mtodo de la media mvil (lnea
discontinua)
Se selecciona para posteriores experiencias un potencial de acumulacin

de + 0.60 V, dado que, como se observa en la Figura 6, es el valor que proporciona
mayores intensidades de pico, medidas sobre el voltamperograma corregido a lnea
base, la cual se establece segn el mtodo de la media mvil.
En ltimo lugar, se comprueba con un patrn conteniendo 90 ngmL-1 de
trans-resveratrol en HClO4 0.10 M, cmo la adsorcin del analito al electrodo
aumenta segn lo hace el tiempo de acumulacin, cuando este se vara entre 10 y
120 segundos (Figura 7). No obstante, este parmetro se optimizar
posteriormente para el rango de concentraciones en que se establece la recta de
calibrado y en presencia de la matriz del vino, ya que los compuestos presentes en
291
MEN
SALIR
dicha matriz pueden interferir en la adsorcin del analito de inters sobre la

superficie del electrodo, siendo necesarios tiempos mayores o menores, en
presencia de la matriz.
1.6E-007
1.1E-005
1.2E-007
I (A)
1E-005
8E-008
9E-006
4E-008
8E-006
7E-006
6E-006
-4E-008
0.5
0.6
0.7
E (V)
0.8
Icorregido (A)
1.2E-005
0s
10 s
60 s
120 s
0.9
Figura 7.- Influencia del tiempo de acumulacin sobre 90 ngmL-1 de transresveratrol
Optimizacin de las variables instrumentales

Se ha decidido llevar a cabo la optimizacin de las variables instrumentales
que influyen sobre los voltamperogramas de onda cuadrada, utilizando para ello
una muestra conteniendo trans-resveratrol en presencia de la matriz del vino,
sometida al tratamiento descrito en apartados anteriores y que consiste en la
extraccin con ter etlico de una fase acuosa conteniendo 2.5 % de vino
(fortificado con 2.0 gmL-1 de trans-resveratrol), aislamiento de la fase orgnica y
evaporacin a sequedad del disolvente, reconstitucin del residuo y posterior
limpieza de este extracto mediante extraccin en fase slida de octadecilo,
disponiendo el eluato en un volumen final de 10.0 mL, en presencia de HClO4 0.10
M y 10 % de etanol.
Se procede a analizar la muestra final mediante voltamperometra de
redisolucin adsortiva de onda cuadrada (Ad-SSWV). La etapa de acumulacin se
292
SALIR
lleva a cabo en todos los casos durante un periodo de tiempo de 60 segundos,

durante los cuales se est aplicando un potencial de + 0.60 V. Transcurrido este
tiempo, y el periodo de equilibrado de 10 s, se procede a cambiar la celda en la
cual se encuentra la disolucin inicial por otra celda que contiene el medio de
medida, cuya composicin es etanol al 30 % en agua, en presencia de una
concentracin de 0.1 M de HClO4, y se efecta el registro mediante
voltamperometra de onda cuadrada.
La influencia de la frecuencia se ha estudiado variando la misma entre 25
y 150 Hz, manteniendo constantes el resto de variables instrumentales, en los
siguientes valores: Eac = + 0.6 V, tac = 60 s, teq = 10 s, paso de potencial = 10 mV,
amplitud = 50 mV.
La variacin de la intensidad de pico con la frecuencia se recoge en la
Figura 8. Como puede observarse en la misma, los valores de intensidad de pico
obtenidos aumentan linealmente a medida que lo hace la frecuencia. De entre los
valores de frecuencia que mayor Ip proporcionan, se ha elegido 65 Hz como el ms
apropiado, ya que se obtienen picos con una mejor fisonoma.
300
200
Ip (nA)
MEN
100
0
0
40
80
120
Frecuencia (Hz)
160
Figura 8.- Variacin de la intensidad de

pico con la frecuencia
293
MEN
SALIR
Otro parmetro que se ha optimizado para la determinacin de transresveratrol mediante Ad-SSWV, ha sido el paso de potencial. Para ello se han
registrado los voltamperogramas de la muestra con diferentes valores de paso de
potencial, comprendidos entre 4 y 20 mV, manteniendo constantes el resto de
condiciones instrumentales: Eac = + 0.6 V, tac = 60 s, teq= 10 s, frecuencia = 65 Hz,
amplitud = 50 mV.
6E-007
I (A)
4E-007
2E-007
0
-2E-007
0.6
0.7
E (V)
0.8
0.9
Figura 9.- Voltamperogramas registrados a

valores de paso de potencial de 2 mV (
), 6 mV (), 10 mV () y 14 mV
()
Como resultado de esta experiencia se observa que Ip aumenta

proporcionalmente con el paso de potencial, alcanzndose los valores mximos de
Ip para los mximos de esta variable. Sin embargo, se ha considerado como valor
de paso de potencial ptimo para los estudios siguientes 10 mV, ya que nos
permite conseguir una sensibilidad suficientemente elevada con una buena
definicin del pico.
Por ltimo, para llevar a cabo el estudio de la influencia de la amplitud de
onda cuadrada, se han registrado los voltamperogramas de la muestra variando
los valores de amplitud entre 20 y 100 mV y manteniendo constante el resto de
294
MEN
SALIR
condiciones instrumentales: Eac = +0.6 V, tac = 60 s, teq = 10 s, frecuencia = 65 Hz,

paso de potencial = 10 mV.
Se mide en los voltamperogramas corregidos a lnea base los valores de Ip
y se obtiene un aumento progresivo a medida que aumenta la amplitud, hasta
alcanzar un mximo en 60 mV, a partir del cual se produce una disminucin de Ip
(Tabla 1). Se ha seleccionado 60 mV como valor de amplitud ms apropiado para
estudios posteriores.
Tabla 1.- Variacin de la intensidad de pico con la
amplitud de onda cuadrada
Amplitud (mV) Intensidad de pico (nA)

20
135
40
175
60
221
80
160
Optimizacin del tratamiento de muestra

Como ya se ha explicado, para llevar a cabo el anlisis de trans-resveratrol
en muestras de vino, es necesario someter a las mismas a un proceso de limpieza
bastante exhaustivo. En el Captulo 1 se describe el proceso de extraccin lquidolquido optimizado para la separacin del trans-resveratrol en muestras de vino, el
cual proporciona recuperaciones del 100% de dicho compuesto. Este tratamiento
consiste esencialmente en extraer durante 1 minuto muestras diluidas de vino con
ter etlico, utilizando una relacin de fases 2:1, fase acuosa:fase orgnica, y
ajustando el pH de la fase acuosa a 5.0 con un tampn tartrato monocido de
sodio/tartrato disdico. Se asla la fase etrea, se evapora a sequedad y el residuo
295
MEN
SALIR
se redisuelve con 4.0 mL de etanol absoluto y se aade agua ultrapura hasta

completar 10.0 mL. No obstante, para la aplicacin de tcnicas electroqumicas se
ha comprobado que este tratamiento no es suficiente, ya que an persisten en la
muestras especies que interfieren en la determinacin de resveratrol,
probablemente porque afectan al proceso de adsorcin en el electrodo o porque
contribuyen a una importante seal de la matriz. Por ello, tras la extraccin lquidolquido con la posterior evaporacin de ter y reconstitucin del residuo, se incluye
una etapa de extraccin en fase slida utilizando cartuchos C18, con el fin de
eliminar la mayor cantidad de interferentes de dicho residuo sin sufrir la prdida de
trans-resveratrol, antes de llevar a cabo la medida electroqumica. En esta ltima
etapa, una vez depositada la muestra en el cartucho, se procede a la limpieza y
posterior elucin del analito por paso de disoluciones acuosas de etanol de
diferente concentracin. El lavado del cartucho tiene como finalidad eluir el mayor
nmero de interferencias posible sin dispersar el bolo del analito y, por supuesto,
sin eluir parte del mismo. Por otra parte, la elucin del analito debe hacerse de
manera completa y de forma que venga acompaado del menor nmero de
interferencias posible, esto es, eluir exactamente la banda conteniendo el analito.
En nuestro caso, la eleccin de la composicin de las mezclas etanol-agua
utilizadas en las etapas de lavado y de elucin est basada en una serie de
estudios previos llevados a cabo mediante espectrofotometra de fluorescencia y se
fija en 10 % y 50% de etanol, respectivamente. La eleccin de los volmenes de
lavado y elucin es una etapa crtica, de la cual depender el grado de limpieza del
extracto obtenido, as como la recuperacin del analito, as, un volumen de elucin
superior al ptimo, generara eluatos no lo suficientemente limpios, y un volumen
inferior al ptimo, implicara recuperaciones inferiores al 100 %.
296
MEN
SALIR
A la vista del proceso de limpieza que hay que llevar a cabo, se deduce
que las variables a optimizar son las siguientes: porcentaje de vino en la fase
acuosa a extraer con ter y relacin de fases, en la extraccin lquido-lquido, as
como el volumen de lavado y volumen de elucin en la etapa de extraccin en fase
slida.
Se procede entonces a la optimizacin de estas variables, con ayuda del
diseo experimental y la metodologa de la superficie de respuesta.
Concretamente, se elije un diseo de experimentos de Box-Behnken, generndose
la secuencia de experimentos que se resume en la Tabla 2. Para llevar a cabo este
conjunto de experiencias, se parte de una muestra de vino fortificada con transresveratrol, en una concentracin aadida de 2.0 gmL-1.
297
MEN
SALIR
Tabla 2.- Experimentos realizados para la optimizacin del procedimiento de
tratamiento de muestra (diseo Box-Behnken)
Relacin de
Fases (A/O)
Cube001a
Cube002a
Cube003a
Cube004a
Cube005a
Cube006a
Cube007a
Cube008a
Cube009a
Cube010a
Cube011a
Cube012a
Cube013a
Cube014a
Cube015a
Cube016a
Cube017a
Cube018a
Cube019a
Cube020a
Cube021a
Cube022a
Cube023a
Cube024a
Cent-a
Cent-b
Cent-c
1
3
1
3
1
3
1
3
1
3
1
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
% Vino
5
5
40
40
22,5
22,5
22,5
22,5
22,5
22,5
22,5
22,5
5
40
5
40
5
40
5
40
22,5
22,5
22,5
22,5
22,5
22,5
22,5
Volumen de
Lavado (mL)
27,5
27,5
27,5
27,5
5
5
50
50
27,5
27,5
27,5
27,5
5
5
50
50
27,5
27,5
27,5
27,5
5
50
5
50
27,5
27,5
27,5
Volumen de
Elucin (mL)
3
3
3
3
3
3
3
3
1
1
5
5
3
3
3
3
1
1
5
5
1
1
5
5
3
3
3
En todas las experiencias, el volumen de ter etlico se mantiene fijo en 5.0

mL, de manera que los volmenes de fase acuosa y de vino contenido en la misma
vendrn dados por el valor de la relacin de fases y de porcentaje de vino,
respectivamente, en cada punto del diseo. En todos los casos, una vez realizada
la extraccin, se espera hasta separacin total de ambas fases, recogindose a
travs de papel de filtro la fase orgnica completamente seca. Esta fase orgnica
se evapora a sequedad en un rotavapor a temperatura ambiente, y el residuo se
298
MEN
SALIR
redisuelve con 0.20 mL de etanol absoluto, se completa con agua hasta un

volumen final de 10.0 mL, y la disolucin resultante se hace pasar a travs de un
cartucho de extraccin en fase slida C18, previamente acondicionado por paso de
5.0 mL de metanol y 20 mL de agua ultrapura. Una vez cargada la muestra en el
cartucho, se procede a su lavado y elucin, por paso sucesivo de los volmenes de
sendas disoluciones acuosas de etanol al 10 y 50 %, respectivamente, que marque
el diseo. Se emplea como funcin de respuesta la intensidad del pico obtenido en
cada caso.
La optimizacin del modelo se llev a cabo con el paquete de software The
Unscrambler13, y los resultados fueron interpretados mediante la Metodologa de la
Superficie de Respuesta (RSM).
En el correspondiente anlisis de la varianza (ANOVA), se asume un
modelo cuadrtico de segundo grado (model check quadratic, p-value (95 %) =
0.3576). Se comprueba que el nico efecto que contribuye significativamente al
modelo, asumiendo un nivel de confianza del 95 %, es el porcentaje de vino en la
fase acuosa (p-value (95 %) = 0.0005), resultando no significativas el resto de las
variables estudiadas, as como todas las posibles interacciones entre ellas.
Las superficies de respuesta correspondientes a algunas parejas de las
variables estudiadas se representan en la Figura 10.
13
Unscrambler v.6.11, CAMO A/S Olav Tryggvasonsgt, N-7011, Trondheim,Norway
299
MEN
SALIR
Figura 10.- Superficies de respuesta para algunas parejas de las variables estudiadas
300
MEN
SALIR
Sin embargo, en el diseo realizado, se ve que la influencia del porcentaje

de vino es tan grande, que pensamos que esta variable puede desvirtuar los
resultados relativos a la influencia de las restantes. Adems, en la tabla de
experimentos, puede verse que slo hay 6 puntos del diseo con un valor de 5 %
para el porcentaje de vino, pasando al siguiente nivel que es del 22.5 %, un valor
muy elevado, que dificulta la medida de los voltamperogramas resultantes. Por ello
se procede a comprobar dichos resultados, mediante una serie de experiencias
adicionales, de optimizacin secuencial de variables.
Para llevar a cabo las siguientes experiencias, se parte del mismo vino
inicial fortificado con 2.0 gmL-1 de trans-resveratrol, y el tratamiento general de la
muestra es el anteriormente descrito, variando cada una de las variables a
optimizar en tanto se mantienen los valores del resto de variables, como se indica
en cada caso.
En primer lugar, se vara el porcentaje de vino en la fase acuosa entre 5 y
20 %, manteniendo una relacin de fases acuosa/orgnica 2:1 y los volmenes de
lavado y elucin en 10.0 y 3.0 mL, respectivamente. A la vista de los
voltamperogramas obtenidos para cada uno de los valores de porcentaje de vino
ensayados (Figura 11), se observa que la sensibilidad, en trminos relativos a la
concentracin en la muestra inicial, es aproximadamente la misma al 5 y al 10 %,
ya que cuando se aumenta al doble el porcentaje de vino, se obtiene prcticamente
la mitad de la seal. No obstante se fija un 5 % de vino para posteriores
experiencias, ya que la seal se encuentra mejor definida.
301
MEN
SALIR
1.36E-005
1.7E-005
1.6E-005
1.34E-005
I (A)
I (A)
1.5E-005
1.32E-005
1.4E-005
1.3E-005
1.3E-005
1.28E-005
1.2E-005
0.5
0.6
0.7
E (V)
0.8
0.9
0.65
0.7
0.75
E (V)
0.8
0.85
Figura 11.- Influencia del porcentaje de vino en la muestra inicial. A la derecha se muestra
una ampliacin de la zona sealada. Valores de porcentaje de vino ensayados: 5 % (),
10 % () y 20 % ()
Fijado el 5 % de vino en la fase acuosa, se procede a examinar de nuevo la

influencia del volumen de disolucin utilizado en el lavado. Para ello, se
preparan muestras conteniendo 0.5 mL de vino, 5 mL de tampn tartrato
monocido de sodio/tartrato disdico 0.26 M, de pH 5.0 y agua hasta 10 mL. Se
extraen con 5 mL de ter etlico, se separa el extracto orgnico y se evapora a
sequedad en un rotavapor a temperatura ambiente. El residuo resultante se
reconstituye con 0.2 mL de etanol y agua hasta completar 10.0 mL y se pasa a
travs de un cartucho C18, lavndose con volmenes de 5.0, 10.0 y 20.0 mL de
disolucin acuosa de etanol al 10 %, y a continuacin se procede a la elucin del
analito contenido en los cartuchos, por paso de 3.0 mL de disolucin acuosa de
etanol al 50 %. Los voltamperogramas registrados se recogen en la Figura 12. Se
aprecia que, efectivamente, la influencia de esta variable no es muy importante,
fijndose para posteriores experiencias un lavado con 10 mL de disolucin de
etanol al 10 %.
302
SALIR
1.45E-005
1.4E-005
1.35E-005
I (A)
MEN
1.3E-005
1.25E-005
1.2E-005
0.6
0.7
E (V)
0.8
0.9
Figura 12.- Influencia del volumen de lavado.

Valores ensayados: 5 mL (), 10 mL
() y 20 mL ()
Una vez seleccionado el volumen de lavado del cartucho, se procede a

revisar la influencia del volumen de disolucin acuosa de etanol al 50 %, utilizado
para llevar a cabo la elucin del analito. La elucin del analito del cartucho se debe
realizar con el menor volumen posible de eluyente, o lo que es lo mismo, con el
volumen de eluyente necesario para eluir justamente la banda conteniendo la
totalidad del analito, pero no ms de dicha banda, ya que se corre el riesgo de
arrastrar interferencias indeseables. Al ensayar eluyentes con diferentes
porcentajes de etanol, los mejores resultados se obtienen con el 50 % de etanol y
se ensayan volmenes de 1.0, 3.0 y 5.0 mL de esta disolucin para efectuar la
elucin.
303
MEN
SALIR
1.45E-005
1.4E-005
I (A)
1.35E-005
1.3E-005
1.25E-005
1.2E-005
1.15E-005
0.6
0.7
E (V)
0.8
0.9
Figura 13.- Influencia del volumen de

elucin. Valores ensayados: 1 mL (), 3
mL () y 5 mL ()
A la vista de los voltamperogramas recogidos en la Figura 13, se aprecia

que no mejora significativamente la seal al utilizar mayores volmenes de
disolucin en esta etapa y, por tanto, se decide utilizar 1 mL de etanol al 50 % para
eluir el trans-resveratrol de los cartuchos C18.
Parmetros analticos de calidad
Una vez optimizadas las variables qumicas e instrumentales implicadas en
el presente mtodo analtico, se procede a estudiar la linealidad entre seal
analtica medida (intensidad de pico) y concentracin de trans-resveratrol puesta.
No obstante, al tratarse de un mtodo de redisolucin queda un ltimo
parmetro a optimizar antes del establecimiento de los parmetros analticos de
calidad, que es el tiempo de acumulacin adecuado para alcanzar mxima
sensibilidad, sin que se produzca la saturacin de la superficie del electrodo, y por
tanto la prdida de linealidad. Por tanto, se lleva a cabo el estudio de la influencia
de esta variable a distintos niveles de concentracin de trans-resveratrol, en
304
SALIR
presencia siempre de la matriz del vino, sometida al tratamiento anteriormente

optimizado. Esta matriz de vino se dispone en las condiciones de medida, y sobre
ella se van haciendo adiciones sucesivas de pequeos volmenes de una
disolucin de trans-resveratrol, registrando los voltamperogramas correspondientes
a los tiempos de acumulacin ensayados en cada caso. En la Figura 14 se
representa la variacin de la intensidad de pico con el tiempo de acumulacin, a los
distintos niveles de concentracin estudiados. Como se observa, la intensidad del
pico crece en todos los casos con el tiempo de acumulacin, hasta cierto valor, a
partir del cual se mantiene o incluso empieza a caer ligeramente. Se selecciona un
tiempo de acumulacin de 30 segundos para posteriores experiencias, ya que
como se ve en la Figura 14, para dicho tiempo de acumulacin la intensidad an
sigue creciendo al aumentar tac, es decir el electrodo no llega a saturarse en el
rango de concentracin examinado.
500
400
I (nA)
MEN
12.3 ppb
24.6 ppb
36.9 ppb
49.2 ppb
61.5 ppb
300
200
100
0
0
20
40
60
80
Tiempo de acumulacin (s)
100
Figura 14.- Influencia del tiempo de acumulacin, en

presencia de la matriz de vino
En estas condiciones, se preparan patrones de trans-resveratrol en medio

HClO4 0.10 M y 10 % de etanol, y se encuentra una relacin lineal entre
concentracin de trans-resveratrol puesta y intensidad del pico medida, en un
rango de concentraciones de 5.0 a 35.0 ngmL-1 de trans-resveratrol. Los
305
MEN
SALIR
parmetros analticos de calidad correspondientes al calibrado se reflejan en la

Tabla 3.
Tabla 3.- Parmetros analticos de calidad en la determinacin mediante
Ad-SSWV de trans-resveratrol
5.0 35.0
-7.67 0.93
Pendiente (b sb) (mLng -1)
10.76 0.42
14.35
0.994
0.988
% Linealidad
96.08
Resolucin analtica (-1) (ngmL-1)
1.33
LDD, Long y Winefordner14 (ngmL-1)
2.58
LDD, Clayton15 (==0.05) (ngmL-1)
4.18
Es de resaltar los bajos lmites de deteccin, en el orden de las partes por

billn, alcanzados, que permitiran detectar concentraciones en el vino del orden de
algunas decenas de ngmL-1, de acuerdo al procedimiento propuesto.
Anlisis de trans-resveratrol en muestras de vino
A la hora de aplicar el mtodo al anlisis de muestras reales, es importante
deducir si existe o no efecto de matriz, y en caso positivo, determinar en qu
momento se da este efecto, si en la etapa de preparacin de la muestra, en cuyo
caso es necesario determinar el porcentaje de recuperacin a distintos niveles de
concentracin, o bien en la de medida electroqumica.
14
15
Long G.L., Winefordner J.D., Anal. Chem., 1983, 55:712-724

Clayton C.A., Hines J.W., Elkins P.D., Anal. Chem., 1987, 59:2506-2514
306
SALIR
En primer lugar, para ver si existe efecto matriz en la etapa de

determinacin, se prepara una mezcla representativa de vinos, con una serie de
muestras comerciales, y sobre una alcuota de dicha mezcla se lleva a cabo todo el
procedimiento de tratamiento de la muestra anteriormente optimizado. El extracto
final se lleva a un matraz de 10.0 mL, se fija un porcentaje de etanol del 10 % y una
concentracin de HClO4 de 0.1 M, y se aade agua ultrapura hasta enrase. Esta
disolucin se dispone en la celda electroqumica y se lleva a cabo una adicin
patrn de trans-resveratrol, por adicin sucesiva de pequeos volmenes de una
disolucin concentrada en la misma celda. En la Figura 15, se representan algunos
de los voltamperogramas registrados, una vez corregidos a lnea base, para las
adiciones realizadas.
2E-007
1.5E-007
1E-007
I (A)
MEN
5E-008
0
-5E-008
0.65
0.7
0.75
0.8
E (V)
0.85
0.9
Figura 15.- Adicin Patrn en la celda

electroqumica a una mezcla de vinos tintos
comerciales. Concentraciones aadidas en
la celda: 0.0, 5.04, 10.1 y 20.1 ngmL-1
Se construye la correspondiente recta de adicin patrn, representando las

intensidades de pico medidas frente a la concentracin de analito aadida. En la
Figura 16 se encuentran representada dicha recta de adicin patrn, junto con la
recta de calibrado de patrones externos anteriormente establecida, deducindose a
la vista de las mismas, que existe un importante efecto de matriz, y que por tanto
ser necesario llevar a cabo el anlisis mediante adicin patrn. Se observa que el
307
MEN
SALIR
efecto de matriz es negativo, debido probablemente a la adsorcin de manera

competitiva de otros componentes del vino en la superficie del electrodo.
400
Ip (nA)
300
200
100
0
0
10
20
30
[trans-resveratrol] (ngmL-1)
40
Figura 16.- Recta de calibrado de

patrones externos (negra) y de adicin
patrn en la celda (azul) de transresveratrol
Por otro lado, con el objetivo de calcular el porcentaje de recuperacin se

lleva a cabo una adicin patrn sobre muestras independientes, antes de
someterlas al proceso de limpieza. La experiencia se lleva a cabo sobre dos
muestras distintas, una mezcla de vinos de la D.O. Rioja y un vino tinto de mesa.
En cada caso se calcula el porcentaje de recuperacin como el cociente entre las
pendientes de las rectas obtenidas al practicar la adicin patrn en la celda (6.78) y
las obtenidas en cada caso al realizar la adicin patrn antes de tratar las muestras
(6.67 y 6.88 para los vinos de Rioja y el tinto de mesa, respectivamente),
resultando ser 101.6 y 98.5 %, para los vinos de Rioja y el tinto de mesa,
respectivamente. En ambos casos, el porcentaje de recuperacin es muy cercano
al 100 %.
Este hecho supone una importante ganancia en sencillez y rapidez para el
mtodo analtico, ya que, si bien el anlisis tiene que ser llevado a cabo mediante
el mtodo de adicin patrn, dichas adiciones pueden ser hechas en la celda de
308
MEN
SALIR
medida sobre muestras preparadas para cada vino, evitando as tener que realizar
el tratamiento de la muestra tantas veces como adiciones se practiquen.
Resumiendo, a partir de los resultados anteriormente descritos se propone
el siguiente procedimiento para el anlisis de trans-resveratrol en vino tinto,
mediante Ad-SSWV: Se toman 0.50 mL de vino, sobre los que se adicionan 5.0 mL
de tampn tartrico 0.26 M de pH 5.0 y agua ultrapura hasta completar
aproximadamente 10 mL. Esta disolucin acuosa se extrae con ter etlico por
agitacin durante 60 segundos. Ambas fases se dejan en contacto hasta su
completa separacin. La fase inferior, acuosa, se desecha, y la fase orgnica se
recoge en un matraz de bola sobre papel de filtro. Esta fase etrea se evapora a
sequedad en un rotavapor a temperatura ambiente. El residuo se redisuelve con
0.20 mL de etanol absoluto, y agua hasta aproximadamente 10 mL. Esta disolucin
se hace pasar a travs de un cartucho C18, previamente acondicionado por paso
de 5.0 mL de metanol y 20.0 mL de agua. Una vez cargada la muestra en el
cartucho, se procede al lavado de ste con 10.0 mL de etanol al 10 %. Finalmente
se eluye el trans-resveratrol por paso de 1.0 mL de etanol al 50 %. Sobre el eluato
se aade 1.0 mL de HClO4 1.0 M, 0.50 mL de etanol absoluto (para fijar el 10 % de
etanol en el medio final) y agua ultrapura hasta completar 10.0 mL. Esta disolucin
se transfiere a la celda electroqumica, y se procede a la acumulacin del analito
sobre el electrodo, previamente limpiado por frotamiento durante un minuto en
dimetilformamida y otro minuto en agua, durante 60 segundos a + 0.60 V. Una vez
finalizada la etapa de acumulacin se deja transcurrir un tiempo de equilibrado de
10 s y se cambia la celda conteniendo la muestra por otra celda conteniendo el
medio de registro, compuesto por HClO4 0.1 M y etanol al 30 %. Se sumergen los
electrodos en el medio de registro y se obtiene el voltamperograma de onda
cuadrada entre +0.60 y +0.90 V, en las siguientes condiciones instrumentales:
frecuencia = 65 Hz, paso de potencial = 10 mV y amplitud 60 mV. Posteriormente,
309
MEN
SALIR
se realizan adiciones sucesivas de analito sobre la celda, obtenindose los

voltamperogramas que nos permiten realizar el calibrado por el mtodo de adicin
patrn.
En estas condiciones, se procede llevar a cabo el anlisis de transresveratrol en una serie de muestras. Concretamente se analizan tres mezclas
diferentes de vinos de la D.O. Rioja, en los cuales se han agrupado un total de 21
muestras en vinos agrupados segn sean jvenes, de crianza o de reserva.
Adems se analiza otra mezcla de vinos de la misma D.O., que agrupa a vinos de
distintas edades, y por ltimo un vino tinto de mesa de menor calidad. Estos
anlisis han sido validados por HPLC, segn el mtodo descrito en el captulo V de
esta memoria16. Segn este mtodo la elucin de las muestras se lleva a cabo a
0.9 mLmin-1 con una mezcla acetonitrilo:H3PO4 (0.04 %), 18:82, v:v. No se ha
incorporado el fotorreactor al sistema cromatogrfico, ya que seleccionando una
de 306 nm en el detector fotomtrico se observa un pico totalmente resuelto para
trans-resveratrol. La calibracin se ha llevado a cabo por adicin patrn, inyectando
una muestra de cada vino diluida 2.5 veces con agua ultrapura, sobre la que se
realizan adiciones de 50, 100 y 200 ngmL-1, lo que equivale a 125, 250 y 500
ngmL-1 en vino. En la Tabla 4 se recogen los resultados encontrados con el
mtodo voltamperomtrico y los encontrados en la etapa de validacin.
16
Durn-Mers I., Galeano-Daz T., Airado-Rodrguez A., Food Chem., 2008, 109:825-833
310
MEN
SALIR
Tabla 4.- Concentraciones de trans-resveratrol encontradas en vinos mediante Ad-SSWV
VOLTAMPEROMETRA
HPLC
Mezcla rioja jvenes
0.20 0.07
0.19 0.06
Mezcla rioja crianza
0.19 0.05
0.20 0.05
Mezcla rioja reserva
0.16 0.03
0.17 0.06
Mezcla rioja
0.24 0.01
0.23 0.04
tinto de mesa
0.13 0.05
0.16 0.05
Seguimiento cromatogrfico de las etapas de Limpieza

Con el objetivo de comprobar la efectividad de los procesos de limpieza de
la muestra, se inyectan en el sistema cromatogrfico alcuotas de la misma, en
distintos momentos de dicho proceso. Las condiciones en las que se eluyen estas
muestras son las similares a las empleadas en la validacin del mtodo. El eluato
se monitoriza en todo momento fotomtricamente a 306 nm, as como
fluorimtricamente a exc/em 260/361 nm. En ambos detectores se observan
resultados similares y en la Figura 17 se muestran los cromatogramas obtenidos en
el detector fluorimtrico. Como puede apreciarse en el cromatograma de la muestra
inicial se observa una interferencia importante co-eluyendo con el resveratrol. Esta
interferencia, junto con otros compuestos se elimina totalmente en la etapa de
extraccin lquido-lquido, mientras que la extraccin slido-lquido posterior hace
desaparecer los picos ms cercanos al frente del disolvente. La recuperacin final
del trans-resveratrol, segn esta experiencia es en torno al 85 % de trans-
311
MEN
SALIR
resveratrol, si bien no se han efectuado rplicas para obtener un valor medio ms

fiable.
I. F. (exc/em 260/364 nm)
80
60
40
20
0
t (minutos)
12
16
20
Figura 17.- Perfiles fluorescentes a exc/em 260 / 364 nm, correspondientes a la disolucin original
de 0.50 mL de vino en 10.0 mL (); la fase acuosa una vez extrada con ter etlico (); el
residuo seco de la fase etrea reconstituido (); las aguas madre resultado de pasar el extracto
reconstituido por el cartucho C18 (); las aguas de lavado del cartucho (); y el eluato ()
Perspectivas de futuro.
Se ha comprobado que tanto trans-resveratrol como su glucsido transpiceido no son electroactivos en reducciones sobre el electrodo de gotas de
mercurio (MDE), no obstante, la irradiacin de sus disoluciones con luz ultravioleta
proveniente de una lmpara de mercurio de alta presin, induce la generacin de
grupos electrforos, haciendo que los fotoproductos de ambos analitos presenten
importantes ondas de reduccin.
Se estudia la influencia del tiempo de irradiacin tanto en el caso de transresveratrol, como en el caso de trans-piceido, y se observa una evolucin de los
polarogramas con el tiempo de irradiacin que se muestra en la Figura 18.
312
SALIR
Resveratol
-2E-008
-3E-008
Piceido
Fondo
0s
90 s
150 s
300 s
600 s
-4E-009
I (A)
Fondo
0s
60 s
120 s
150 s
180 s
-1E-008
I (A)
MEN
-8E-009
-1.2E-008
-0.9
-0.8
E (V)
-0.7
-0.6
-0.9
-0.8
E (V)
-0.7
-0.6
Figura 18.- Evolucin de los polarogramas de resveratrol y piceido (9 gmL-1) con el tiempo de
irradiacin
Nos parece interesante continuar con estos estudios, con el objetivo de

llegar a proponer un mtodo de anlisis de resveratrol en vino ms selectivo, que
evite la necesidad de realizar un tratamiento previo de la muestra tan complejo.
313
MEN
SALIR
MEN
SALIR
CONCLUSIONES
MEN
SALIR
MEN
SALIR
1.- Se han estudiado las propiedades espectroscpicas de inters analtico de

resveratrol y su 3--glucsido, piceido, los cuales se presentan en dos formas
ismeras cis y trans. Estos derivados se han caracterizado fotomtrica y
fluorimtricamente en distintos medios de trabajo, concluyndose que las mejores
seales se obtienen en medios hidroalcohlicos. Se han aportado valores de pKa
de 8.2 y 9.7 para trans-resveratrol, y un valor de pKa de 9.6 para trans-piceido, en
medio acuoso, calculados mediante fotometra.
2.- La irradiacin UV de resveratrol y piceido origina fotorreacciones, en las que los
fotoproductos generados son ms fluorescentes que los analitos de partida. En
base
estas
fotorreacciones
se
han
propuesto
sendos
mtodos
espectrofluorimtricos de segunda derivada, para la determinacin de dichos

analitos en muestras de vino, previa extraccin lquido-lquido de las mismas.
3.- Se ha desarrollado un mtodo mediante cromatografa de lquidos para la
determinacin de las cantidades totales (trans + cis) de resveratrol y piceido a
travs de sus fotoproductos, en muestras de vino, previa irradiacin de las mismas.
En dicho mtodo se utiliza elucin isocrtica y deteccin fluorescente. Se obtiene
una buena resolucin para los picos de inters, y la principal ventaja de dicho
mtodo es su elevada sensibilidad.
4.- La fotorreaccin que sufren estos compuestos, se ha acoplado con la
cromatografa de lquidos, diseando un sistema de LC con fotoderivatizacin postcolumna en lnea. La incorporacin de un fotorreactor antes de la entrada al
detector de fluorescencia, permite llevar a cabo de manera muy sensible el anlisis
de los dos ismeros de resveratrol y piceido en el vino. Se obtiene una buena
resolucin para los cuatro analitos en modo isocrtico.
MEN
SALIR
5.- Se han estudiado las seales de fluorescencia total, obtenidas en modo frontface, proporcionadas por muestras de vino, sin tratamiento previo de las mismas.
La descomposicin de las matrices de excitacin emisin de fluorescencia se ha
efectuado mediante PARAFAC. Por combinacin de los resultados obtenidos
mediante fluorescencia con las medidas realizadas sobre patrones y ensayos de
cromatografa lquida, se ha alcanzado un mejor conocimiento de la poblacin de
compuestos fluorescentes presentes en el vino. Se demuestra tambin la potencia
de dichas seales, en combinacin con mtodos quimiomtricos de anlisis
multivariante, en concreto Anlisis por Componentes Principales (PCA), con fines
clasificatorios, atendiendo a variables tales como el origen de la muestra, el tipo de
uva o la pertenencia a una denominacin de origen.
6.- El estudio del comportamiento voltamperomtrico de trans-resveratrol en el
electrodo de carbn vitrificado, pone de manifiesto su oxidacin, as como su
adsorcin a la superficie del electrodo. Se ha propuesto un mtodo de redisolucin
adsortiva en onda cuadrada para la determinacin de trans-resveratrol en vino,
previa extraccin lquido-lquido de las muestras y limpieza de los extractos
mediante extraccin en fase slida sobre con cartuchos C18.
MEN
SALIR
ANEXO
ARTCULOS RESULTANTES DE ESTE
TRABAJO DE INVESTIGACIN
MEN
SALIR
MEN
SALIR
Anal Bioanal Chem (2007) 387:19992007

DOI 10.1007/s00216-006-1007-z
ORIGINAL PAPER
Determination of resveratrol in wine by photochemically

induced second-derivative fluorescence coupled
with liquidliquid extraction
T. Galeano Daz & I. Durn Mers & D. Airado Rodrguez
Received: 29 September 2006 / Accepted: 8 November 2006 / Published online: 20 December 2006
# Springer-Verlag 2006
Abstract Basic studies on the photochemical behaviour of

trans-resveratrol and its photoproduct are reported. Photometrically and fluorimetrically calculated acidity constants
of the former were determined. The usefulness of the
determination of resveratrol by photochemically induced
fluorescence and second-derivative photochemically induced fluorescence was also examined. The very weakly
fluorescent trans-resveratrol is converted into a highly
fluorescent photoproduct by irradiating hydroethanolic
solutions of trans-resveratrol containing 40% v/v of ethanol
for 60 s with intense UV radiation. The photoproduct
presents excitation and emission maxima centred at
260 nm, and 364 and 382 nm, respectively. Under these
conditions, a linear relationship between fluorescence
intensity and trans-resveratrol concentration was found
between 6.6 and 66 ng mL1. Optimum conditions for the
extraction of trans-resveratrol from an aqueous phase at pH
5.0 with diethylether were a phase ratio (aqueous/organic)
of 2, a shaking time of 60 s and a buffer concentration of
0.15 mol L1. An extraction recovery of 100% was reached
under these conditions. The optimized extraction procedure
was applied to the analysis of resveratrol in wine samples,
employing the amplitude between 356 and 364 nm of the
second-derivative photoinduced emission spectrum as
analytical signal. It was found that there is not matrix
effect and recoveries around 100% were obtained at
different fortification levels.
Keywords Photochemically induced fluorescence .
Second-derivative . Liquidliquid extraction .
Resveratrol . Wine
T. Galeano Daz : I. Durn Mers (*) : D. Airado Rodrguez
Department of Analytical Chemistry, University of Extremadura,
06071 Badajoz, Spain
e-mail: iduran@unex.es
Introduction
Resveratrol (3,4,5-trihydroxystilbene, Scheme 1) is a
stilbene produced by plants in response to fungal infection
or abiotic stresses, e.g. produced by heavy metal ions.
Resveratrol occurs in mulberries, peanuts and grapes.
Grapes contain a large amount of different phenolic
compounds in skins, pulp and seeds, that are partially
extracted during winemaking [1]. The determination of
phenolic compounds in wine is very important since this
group of substances are responsible for several sensorial
characteristics such as colour, flavour, astringency and
hardness of wine. There is a broad range in the concentration of resveratrol in different wines. Intervals from 660 to
less than 0.68 g mL1, and from 100 to less than
0.23 g mL1, within red and white wines, respectively,
have been reported [2]; the higher concentrations in red
wines are partially due to the winemaking process but also
they depend on the grape variety, environmental factors in
the vineyard and wine processing techniques [3].
trans-Resveratrol has been suggested as a cause for
reduced mortality from coronary heart disease in wine
drinkers. Numerous studies describe potential mechanisms
by which trans-resveratrol could reduce heart disease,
inhibiting platelet aggregation [47] and low density
lipoprotein oxidation [8] and protecting the liver from lipid
peroxidation [9]. trans-Resveratrol has received attention in
recent years owing to its capacity to protect against global
cerebral ischemic injury and to ameliorate oxidative
damage; it can also inhibit cellular events associated with
tumour initiation, promotion and progression [10].
Intense UV irradiation of alcoholic solutions of transresveratrol first induces isomerization into cis-resveratrol
and then leads to the formation of an unidentified, highly
fluorescent compound [11].
MEN
SALIR
2000
Scheme 1 Chemical structures

of trans-resveratrol (a)
and cis-resveratrol (b)
OH
HO
OH
OH
HO
OH
a
Separation techniques such as liquid chromatography
(LC) or capillary electrophoresis (CE) have been widely
exploited for the analysis of trans-resveratrol [12, 13] in a
variety of food samples, but no spectroscopic methods have
been published so far. In recent years, reversed-phase highperformance liquid chromatography (RP-HPLC) by acidic
solvent gradient elution, has been the most commonly used
procedure for the determination of trans-resveratrol in
wine, either with diode array detection (DAD) [1418],
fluorimetric detection [19, 20], DAD-fluorimetric detection
[21, 22], chemiluminiscent detection [23, 24], electrochemical detection [25] or with mass spectrometry (MS) [2628]
and DAD-MS [29, 30]. The detections based on electrochemistry, luminiscence and MS offer higher sensitivity
than DAD. Gas chromatography tandem MS, with previous
derivatization, normally with bis-[trimethylsilyl]-trifluoroacetamide (BSTFA), before column application [31], and
micellar electrokinetic chromatography (MEKC) with UV
detection [32], capillary zone electrophoresis (CZE), with
DAD [33, 34] or electrochemical detection [35, 36], or nonaqueous CZE with DAD [37] have also been employed for
the analysis of this compound.
Lowest reported limits of detection (S/N=3) are in the order
of ppb [16, 1922, 24, 25, 30] and the best one, 0.166 g/L,
was reached by using chemiluminiscent detection [23].
The present paper reports basic spectral studies on
resveratrol. Moreover, the photochemical behaviour of
resveratrol has been exploited for an analytical goal for
the first time, and a new, fast, simple and sensitive method
for its determination in wine samples by second-derivative
emission spectra of the photochemically produced fluorescent product (2D-RTPF), coupled with liquidliquid extraction, has been developed.
Experimental
Reagents
For all experiments, analytical reagent grade chemicals and
solvents were used. Ultrapure water was obtained from a
Millipore Milli-Q System.
b
trans-Resveratrol was obtained from Sigma and used as
received. A 50.0 g mL1 stock solution was prepared in a
50.0-mL, coloured volumetric flask by dissolving the
suitable amount of the commercial product and diluting to
the mark with absolute ethanol. This solution was stored at
4 C, avoiding exposure to direct light. Fresh solutions of
lower concentrations were prepared by appropriate dilution
of the stock solution with absolute ethanol and water.
Buffer solution of sodium hydrogen tartrate/disodium
tartrate (total concentration 0.26 mol L1) was prepared by
dissolving the suitable amount of disodium tartrate dihydrate in water and adjusting the pH of the resulting solution
to 5.0 with small volumes (in the order of microlitres) of
diluted hydrochloric acid.
Wine samples
Several samples of young red wines, barrel-aged red wines
and white wines were provided by Viaoliva, Cooperative
Society (Almendralejo, Badajoz, Extremadura, Spain) and
three different pools were made with the whole samples.
All the samples were previously filtered through a 0.45-m
cellulose acetate filter. Samples were kept at 4 C, avoiding
exposure to direct light.
Apparatus
Fluorescence spectral measurements were performed using a
Varian Cary Elipse fluorescence spectrophotometer,
equipped with two Czerny-Turner monochromators and a
xenon flash lamp, and connected to a PC microcomputer via
an IEEE 488 (GPIB) serial interface. The Cary Elipse
software was used for data acquisition. Fluorescence
measurements were recorded in a 10-mm quartz cell at 20
0.1 C, by use of a thermostatically controlled cell holder and
a Selecta Model 382 thermostatically controlled water bath.
An Osram 200-W mercury lamp with an Oriel model
8500 power supply was used for the UV irradiation of
resveratrol solutions.
A Milton Roy Spectronic 3000 diode-array spectrophotometer, provided with the Milton Roy Rapid Scan software
package V2.2, was used for acquisition and treatment of
MEN
SALIR
spectrophotometric data. Photometric measurements were

recorded in a 10-mm quartz cell at 20 C, by use of a
thermostatic cell holder and a Selecta thermostatic bath.
Procedures for the study and determination of resveratrol
Photometric studies of trans-resveratrol
Suitable aliquots of the 50 g mL1trans-resveratrol ethanolic
stock solution, containing different amounts of the analyte
between 1.5 and 18.4 g, are transferred to the cell,
containing 3.0 mL of ultrapure water. The absorption
spectrum of each solution is recorded in the range from
200 to 500 nm and the absorbance at 306 nm is employed as
analytical signal.
Fluorimetric studies of trans-resveratrol
A 1.8-mL aliquot of ultrapure water and 1.2 mL of absolute
ethanol are transferred to the cell in order to keep the
optimum composition of the solvent media (40% v/v
ethanol). The resulting mixture must be shaken and
degassed by ultrasonication, and suitable aliquots of the
50 g mL1 trans-resveratrol ethanolic stock solution are
added, maintaining the final concentration between 0.080
and 0.80 g mL1. The fluorescence intensity is measured
at 385 nm (exc =318 nm).
Photochemically induced fluorimetric determination
of resveratrol
A 3.0-mL sample of degassed hydroethanolic mixture
containing 40% v/v of ethanol and different volumes of
ethanolic diluted trans-resveratrol stock solution containing
between 20.0 and 200 ng of analyte are transferred to the
cell. The resulting solutions are irradiated for 60 s under a
high pressure mercury lamp and their emission spectra
(exc =260 nm) are registered. The fluorescence intensity at
364 nm is employed as analytical signal.
Recommended procedure for determining resveratrol
in wine
In a separatory funnel, 0.10 mL of red wine or 0.50 mL of
white wine at pH 5.0, fixed by the addition of 6.0 mL of
sodium hydrogen tartrate/disodium tartrate buffer solution
(0.26 mol L1), are diluted with ultrapure water up to
10.0 mL, and extracted with 5.0 mL of diethylether by
shaking for 60 s. The upper organic phase is separated and
evaporated to dryness by a stream of nitrogen at room
temperature. The residue is re-dissolved with 4.0 mL of
absolute ethanol and water is added up to 10.0 mL. This
solution is irradiated under a high pressure mercury lamp
2001
for 60 s and its emission spectrum is registered (exc =

260 nm). The emission spectrum is smoothed by the
moving average method with a segment of seven data
points, its second derivative is obtained by Savitzky-Golay
algorithm and it is smoothed again using the same
conditions. The amplitude of the derivative between 356
and 364 nm is taken as analytical signal.
Results and discussion

Basic photometric and fluorimetric studies
of trans-resveratrol
Absorption and fluorescence spectra of different hydroethanolic solutions of trans-resveratrol were recorded. A single
absorption band was observed around 310 nm with a
bandwidth of 20 nm and two little maxima centred at 306
and 319 nm, in water (Fig. 1a), ethanol and hydroethanolic
media, at acid and neutral pH, and it was proven that the
ethanol percentage has no influence on the absorption signal.
trans-Resveratrol itself is weakly fluorescent, showing two
excitation maxima centred at 225 and 318 nm, and a single
emission maximum centred at 385 nm, in a hydroethanolic
medium containing 40% of absolute ethanol, at acid and
neutral pH (Fig. 1b). The influence of the acidity on the
spectral properties of trans-resveratrol has been studied
photometrically and fluorimetrically. The pH was varied by
the addition of small volumes (in the order of microlitres) of
aqueous hydrochloric acid or sodium hydroxide solutions in
the 0.011.0 mol L1 concentration range, in the presence of
potassium chloride 0.10 mol L1 in order to maintain the
ionic strength. The photometric study (Fig. 1a) was carried
out in aqueous medium and no spectral changes for the
absorption band centred at 310 nm were observed for pH
values less than 6.5; however, a bathochromic shift was
observed in basic medium, with a new maximum appearing
centred at 343 nm for pH values higher than 10.0. In contrast,
the fluorimetric study was carried out in aqueous and
hydroethanolic media (40% v/v ethanol). A bathochromic
shift and a decay of the signal was observed in the excitation
and emission fluorescence maxima, in both media, centred at
352 and 459 nm, respectively, for pH values higher than 10.0,
as shown in Fig. 1b. A constant fluorescent signal (exc/em =
318/385 nm) was observed in the pH range from 2.0 to 6.0
followed by a drastic decay up to pH 11, remaining constant
and negligible for higher pH values. The reversibility of the
acidbase processes was photometrically and fluorimetrically proven. Ionization constants have been calculated based
on the variation of the photometric and the fluorescent
signals with the pH. The variation of the photometric signal
at 306 and 343 nm is shown in Fig. 2a and the pKa values
corresponding to the two ionizations photometrically ob-
MEN
SALIR
2002
0.3
600
a
Fluorescence Intensity
12.2
2.0-6.5
0.2
9.2
0.1
400
200
10.9
0
250
300
350
(nm)
served are too close to allow application of classic methods,

e.g. the Wilson and Lester method [41], to calculate them.
Therefore they were calculated by means of absorbance
diagrams (A-diagrams) [38]. An A-diagram is a plot of the
absorbance at one wavelength against the absorbance (A) at
another wavelength (Fig. 2b). Consequently, an A-diagram
shows the relative absorbance changes at two wavelengths as
a function of the pH of the solutions. For a one-step system,
the absorbance at any wavelength must be proportional to
the absorbance at any other wavelength, so an A-diagram for
such a system will be linear. However, if the system is
governed by two or more equilibria, the A-diagrams will
change direction every time a new equilibrium becomes
dominant in the system [38]. These diagrams are particularly
useful for systems where the spectra alone do not clearly
reveal the number of equilibria involved. In this case A
(306 nm) is plotted against A (343 nm), as shown in Fig. 2b,
and the plot clearly consists of two linear segments,
suggesting the existence of two successive equilibria in the
pH 7.211.4 interval. The first ionization predominates in
the pH 7.28.9 range (first lineal segment) and the second
one in the pH 10.011.4 range (second lineal segment).
400
450
200
300
400
(nm)
500
600
Thus, we calculated pKa1 =8.2 and pKa2 =9.7, in comparison

with the reported values of pKa1 =8.1, pKa2 =9.9 and pKa3 =
10.5, photometrically calculated in aqueous medium by
extrapolation of experimental values in different hydromethanolic media [39], or pKa1 =9.49, electrophoretically
calculated [40]. These ionizations correspond to the deprotonation of the hydroxyl groups present in the molecule. A
single ionization was fluorimetrically observed in aqueous
and hydroethanolic (40% v/v ethanol) media, and pKa values
of 8.3 and 9.2, respectively, were calculated by the Wilson
and Lester method [41]. It was found that the pKa value of
this polyphenol is highly influenced by the alcoholic
percentage in the working medium.
Photometric and fluorimetric determination
of trans-resveratrol: analytical parameters
The photometric or fluorescent determination of transresveratrol involves the construction of the corresponding
calibration curves. The analytical figures of merit for the
photometric and fluorimetric determination in aqueous and
hydroethanolic (40% v/v ethanol) media, respectively, are
0.24
0.24
a
0.2
Absorbance (306 nm)
0.2
Absorbance
Fig. 2 a Absorbance values at

306 nm () and 343 nm ()
as a function of the pH in
aqueous media. b Absorbance
diagram of trans-resveratrol. pH
range 7.211.4
3.6
Absorbance
Fig. 1 a Absorption spectra

corresponding to an aqueous
solution of 1.52 g mL1transresveratrol, at different pH values in the presence of potassium
chloride (0.10 mol L1). b Excitation (dashed line) and emission (solid line) fluorescence
spectra corresponding to an
hydroethanolic (40% v/v ethanol) solution of
0.98 g mL1trans-resveratrol,
in acidic (exc/em =318/385 nm)
and basic (exc/em =342/459 nm)
media in the presence of
0.10 mol L1 potassium chloride
0.16
0.12
0.16
0.12
0.08
0.08
0.04
0.04
2
8
pH
10
12
14
0.04
0.08
0.12
0.16
0.2
Absorbance (343 nm)
0.24
MEN
SALIR
2003
summarized in Table 1. As can be observed, there is a linear

relationship between analytical signal and trans-resveratrol
concentration in the range 0.55.0 and 0.080.8 g mL1
for molecular absorption and fluorescence, respectively. On
the other hand, better limits of detection are obtained
fluorimetrically.
The repeatability of the methods was analysed by
measuring eleven identical solutions under similar conditions
as employed in the construction of the calibration curves.
Photometric and fluorimetric studies of trans-resveratrol
photoreaction and photoproducts
It is known that intense irradiation of trans-resveratrol
solutions induces the formation of a new compound
fluorescing in the ultraviolet range [11]. The photochemical
process was monitored photometrically and fluorimetrically
in different hydroethanolic media.
Photometric study
It was proven that the ethanol percentage has no influence
in the shape or intensity of the absorption spectra of transresveratrol, exhibiting a single maximum centred to 310 nm
with a bandwidth of 20 nm, as previously stated. On the
other hand, the absorption spectra corresponding to the
photoproduct obtained by irradiation of trans-resveratrol
solutions under a high pressure mercury lamp, in different
media, are highly influenced by the ethanol percentage
(Fig. 3a). Thus, when trans-resveratrol solutions are UV
irradiated, a new absorption maximum centred at 290 nm
appears immediately, corresponding to cis-resveratrol [11].
When the ethanol percentage is between 40 and 60% and
the solutions are irradiated for at least 60 s, another, equally

important maximum centred at 260 nm can be observed,
which is negligible in purely ethanolic medium, and very
weak in hydroethanolic media containing more than 60% of
water. The maximum centred at 260 nm could be associated
with the highly fluorescent photoproduct discussed below.
The study of the influence of the acidity on the absorption
properties of the fluorescent resveratrol photoproduct was
carried out with a hydroethanolic (40% v/v ethanol) solution
of 1.2 g mL1trans-resveratrol, irradiated for 60 s under a
high pressure mercury lamp (irradiation time, for this
concentration level, and medium composition were determined as optimum conditions for obtaining the fluorescent
photoproduct, as discussed below). The pH of this solution
was varied by the addition of small volumes (in the order of
microlitres) of aqueous hydrochloric acid and sodium
hydroxide in the 0.011.0 mol L1 concentration range, in
the presence of potassium chloride in order to maintain the
ionic strength. Some absorption spectra at different pH
values are collected in Fig. 3b. Two maxima are observed in
acidic and neutral media, the main one, centred at 261 nm,
and a smaller one centred at 287 nm, and their position and
intensity are practically constant in acid and neutral media. A
bathochromic shift and a decay are observed in basic media
with regard to the 261 nm maximum, a new maximum
appearing perfectly centred at 303 nm for pH values higher
than 10.5. The reversibility of the acidbase process was
studied, by acidifying the solution from highly basic to
acidic pH values, but the original spectrum corresponding to
the acid form was not recovered. The variation of the
absorbance at 261 nm with the pH shows a drastic decay,
whereas the signal measured at 303 nm increases, for pH
values higher than 7.5. The inflection point of both curves
Table 1 Analytical figures of merit

Method
Photometric determination of transresveratrol (=306 nm)

Fluorescent determination of transresveratrol (exc/em =318/385 nm)
Photoinduced fluorescent
determination of resveratrol
(exc/em =260/365 nm)
Second-derivative photoinduced
fluorescent determination of
resveratrol 2D356364 (exc =260 nm)
a
Intercept (a)
Linear
concentration Sa
range
(ng mL1)
Determination LODa
LODb
% RSDc
coefficient
(ng mL1) (ng mL1) (concentration
(r2)
level, ng mL1)
0.1270.001*
0.9989
0.058*
0.14*
4.4 (1.4*)
80800
3.7103
2.5103
12.85.5
0.9390.013
0.9972
17.9
34.5
4.7 (324.5)
6.666
21.13.5
7.770.12
0.9964
1.6
3.1
3.6 (19.2)
6.666
9.0102
13.1102
0.1820.004
0.9907
2.2
5.0
4.8 (19.2)
0.55*
Long and Winefordner method (k=3) [43]

Clayton et al. method (==0.05) [44]
c
Relative standard deviation (n=11)
*Units are g mL1
b
Slope (b)Sb
(mL ng1)
MEN
SALIR
2004
0.3
0.15
(5)
0.1
(4)
(1)
Absorbance
(2)
Absorbance
0.2
a
2.0-7.0
0.1
9.8
11.6
0.05
(3)
0
250
300
350
(nm)
400
450
Fig. 3 a Absorption spectra corresponding to 2.04 g mL1 of transresveratrol in absolute ethanol irradiated for 120 s (1), in hydroethanolic medium containing 60% v/v of ethanol, irradiated for 120 s
(2), in aqueous medium irradiated for 120 s (3), in hydroethanolic
medium containing 40% v/v of ethanol irradiated for 5 s (4), and in
was calculated around a pH value of 9.6, but this value does

really not correspond to a pKa value because the alkaline
transformation is not fully reversible, probably due to a
partial hydrolysis.
Fluorescence study
It has been proven that intense UV irradiation of transresveratrol solutions, under a high pressure mercury lamp,
transforms trans-resveratrol into a highly fluorescent
compound [11] with a sharp excitation maximum (em =
364 or 382 nm) at 260 nm and two emission maxima (exc =
260 nm) centred at 364 and 382 nm, respectively, as
shown in Fig. 4a. The intensity of the photoinduced signal
and the optimum irradiation time are highly influenced by
the solvent, but not the identity of the photoproduct because
no changes were observed in the shape of spectra recorded
in different media. Water, organic solvents of different
polarities like methanol, ethanol, acetonitrile, dimethylsulfoxide, N,N-dimethylformamide, 1,4-dioxane, cyclohexane
and hexane, and some hydro-organic mixtures were
assayed. The photoreaction rate is higher in any purely
organic media than in hydro-organic ones, but the fluorescence quantum yield of the photoproduct is higher in
hydroethanolic media. Finally, different hydroethanolic
media were assayed in order to obtain the greatest photoinduced signal in a reasonable irradiation time. The influence
of the irradiation time on the photoinduced signal in different
225
250
275
300
(nm)
325
350
any hydroethanolic medium without being irradiated (5). b Absorption

spectra corresponding to a hydroethanolic (40% v/v ethanol) solution
of 1.2 g mL1trans-resveratrol, irradiated for 60 s, in the presence of
potassium chloride (0.10 mol L1) at different pH values
hydroethanolic mixtures was studied, and the results are

shown in Fig. 4b. In all cases, the fluorescence intensity
increases when increasing irradiation time. No changes in
the optimum wavelengths were observed when changing
the proportion of ethanol and water, but different optimum
irradiation times and different photoinduced intensities
were obtained in different hydroethanolic media. The
maximum photoinduced signal in purely ethanolic solutions
is reached in just 25 s, but this signal increases with
increasing the water percentage and is at a maximum for
ethanol percentages between 30 and 50%. Therefore,
hydroethanolic medium containing 40% v/v of ethanol
was selected as optimum for subsequent experiments,
obtaining the maximum photoinduced signal with an
irradiation time of 120 s for the assayed concentration
(2.3 g mL1). Nevertheless, it was proven that the
optimum irradiation time is directly related, to a certain
extent, to the concentration of trans-resveratrol in the
original solution and this parameter has to be optimized
depending on the concentration range.
The influence of the acidity on the spectrofluorimetric
behaviour of the photoproduct obtained under optimum
conditions was studied. A hydroethanolic (40% v/v
ethanol) solution containing 0.098 g mL1trans-resveratrol, in the presence of potassium chloride 0.10 mol L1,
was prepared and irradiated for 60 s (previously determined
as the optimum irradiation time at this concentration level).
This solution was divided into two portions and their pH
MEN
SALIR

300
500
30-50 %
F. I. ( exc/em = 260/364 nm)
(2)
Fig. 4 a Excitation (dashed

line) and emission (solid line)
spectra corresponding to
57.0 ng mL1 of trans-resveratrol in hydroethanolic medium
containing 40% v/v of ethanol,
isolated from light (1, exc/em
318/385 nm) and irradiated for
60 s under a high pressure
mercury lamp (2, exc/em 260/
364 nm). b Photoreaction profiles corresponding to
2.3 g mL1 of trans-resveratrol
in hydroethanolic media containing different percentages of
ethanol
2005
200
100
400
3%
300
200
100
100 %
(1)
0
200
250
300
350 400
(nm)
values were varied by the addition of small volumes (in the

order of microlitres) of aqueous hydrochloric acid or
sodium hydroxide in the 0.011.0 mol L1 concentration
range. The emission fluorescence spectra were recorded at
different pH values and it was found that the fluorescent
signal (exc/em =260/364 nm) was maximum and constant
in acid and neutral media, but a drastic decay occurs at pH
values higher than 7.0, and a negligible signal is obtained
from pH 11 and above. In addition, the reversibility of the
acidbase process was studied by acidifying the solution
from highly basic pH values, through neutral pH to acidic
values; however, the original signal was reduced by half.
The inflection point of the curve of fluorescence intensity
versus pH value was calculated at a pH value of 9.8, but
this value cannot be assigned to a pKa, because a hydrolysis
probably occurs in parallel with the alkaline transformation.
Photoinduced fluorimetric determination of resveratrol:
analytical parameters
A linear relationship between the photoinduced signal
(exc/em =260/364 nm) and the original concentration of
trans-resveratrol was found between 6.6 and 66 ng mL1,
selecting an irradiation time of 60 s and a hydroethanolic
medium containing 40% v/v ethanol. The analytical figures
of merit are shown in Table 1, and a great enhancement of
the sensitivity with regard to the photometric or fluorescent
determination of trans-resveratrol can be observed.
The repeatability of the method was analysed by measuring
eleven identical solutions under similar conditions, as
employed in the construction of the calibration curve.
450
500
50
100
150 200
Irradiation Time (s)
250
300
analyte, with regard to the extraction in different organic

solvents (e.g. ethers, esters or chlorinated hydrocarbons),
was studied by molecular absorption, obtaining satisfactory
recoveries with diethylether or ethyl acetate. However, the
photoinduced fluorescent signal obtained in these media is
weaker than that obtained in the optimum hydroethanolic
medium and it is advisable to evaporate the organic extracts
to dryness and re-dissolve the residue with the optimum
hydroethanolic mixture. Diethylether was finally chosen as
extractant for two reasons: it afforded extraction recoveries
around 100% and its higher volatility substantially reduced
the analysis time in the evaporation stage.
The neutral polyphenol species is the predominant
species present in acid and neutral media, and the pH of
the aqueous phase was fixed at 5.0, by the addition of
6.0 mL of 0.26 mol L1 hydrogen sodium tartrate/disodium
tartrate buffer solution in a final volume of aqueous phase
of 10.0 mL (final concentration of buffer 0.16 mol L1).
The shaking time and phase ratio were also optimized and a
shaking time of 60 s and a phase ratio aqueous/organic of
2.0 were selected as optimum values. After the extraction
stage, the developed procedure was used to obtain the
photoproduct (i.e. hydroethanolic medium containing 40%
v/v of ethanol and irradiation time of 60 s for transresveratrol concentrations lower than 0.1 g mL1). The
extraction recovery reached under optimum conditions was
100%. The evaporated and reconstituted ethereal extract
was stable at least up to 12 h after its preparation when
stored at 4 C in the dark.
Determination of resveratrol in wines by means
of 2D-RTPF: analytical parameters
Extraction of resveratrol
A liquidliquid extraction of resveratrol from the aqueous
phase with organic solvents is necessary prior to its analysis
in wine samples by photoinduced fluorescence in order to
reduce the matrix signal. Firstly, the behaviour of the
In previous assays carried out with wine samples it was

evident that the matrix made an important contribution to
the emission fluorescence spectrum under the conditions
necessary to obtain the photoproduct, despite extracting
wine samples. Nevertheless, this contribution was reduced
MEN
SALIR
2006

1
800
20
600
10
1.5
1
0.5
0
400
-0.5
-10
200
-1
0
320
360
400
440 320
360
400
440 320
360
400
440
em (nm) ( exc = 260 nm)
em (nm) ( exc = 260 nm)
em (nm) ( exc= 260 nm)
Fig. 5 Emission spectra and their first and second derivatives, corresponding to barrel-aged red wines pool non-spiked (dashed line) and spiked
(solid line) with 1.57 g mL1 of trans-resveratrol, extracted under optimal conditions, and subjected to a final 100-fold dilution
to a great extent by obtaining derivative signals, particularly

the second-derivative emission spectra, as shown in Fig. 5,
where the emission spectra corresponding to a wine sample
non-spiked and spiked with trans-resveratrol and their first
and second derivatives are represented. This also proved the
linearity between different signals measured on the secondderivative emission spectra and the original trans-resveratrol concentration (Table 1): the best linear relationship was
obtained by employing the amplitude of the secondderivative emission spectra between 356 and 364 nm as
analytical signal (2D356364).
The optimized derivative photoinduced fluorescence
extractive method was applied to the analysis of resveratrol
in wine samples. Young and barrel-aged red wine and white
wine pools were analysed in order to represent the
commonest interferences in any future wine analysis. A
standard addition was applied in triplicate and the
corresponding curves of analytical signal versus added
concentration of trans-resveratrol were constructed. The
slopes comparison test was applied between these plots and
the calibration curves, and it was found that there was not
matrix effect. RP-HPLC-FLD method with isocratic elution
(C18 column; mobile phase acetonitrile/acetic acid (10% v/
v)/water, 19:33:48, v:v:v) and photochemical pre-column
derivatization developed by the authors [42] was used to
prove that the concentration of resveratrol in the analysed
pools was under the limit of detection of the method.
Calculated average recoveries at different fortification
levels are shown in Table 2. A commercial red wine
containing a higher concentration of resveratrol was
analysed and the result (1.12 g mL1; 8% RSD) was
satisfactorily ratified by the chromatographic method
developed by the authors [42].
Conclusions
A very weakly fluorescent analyte (trans-resveratrol) has
been photochemically converted into a highly fluorescent
product. Acidbase ionization constants have been photometrically and fluorimetrically calculated for trans-resveratrol, but not for the photoproduct, because it has been
proven that its alkaline transformation is not fully reversible. A new, simple and fast method has been developed for
the determination of total resveratrol (trans- and cisisomers) in wine by second-derivative photochemically
induced fluorescence coupled with liquidliquid extraction.
Table 2 Averages recoveries (n=3) and RSD (n=3) obtained in the
analysis of different wine pools fortified with trans-resveratrol
Wine pool
Added
(g mL1)
Young red or barrel-aged red 0.63

0.94
1.6
3.1
4.7
White
a
b
Young red
Barrel-aged red
0.13
0.19
0.31
0.63
0.94
Recovery (% RSD)
107 (5)a
109 (4)b
110 (4)a
108 (8)b
104 (2)a
111 (3)b
98 (4)a
105 (3)b
104 (3)a
101 (3)b
100 (8)
94 (7)
102 (4)
96 (5)
102 (3)
MEN
SALIR
It has been demonstrated that there is not matrix effect from

the wine. Satisfactory recoveries are obtained at different
fortification levels.
Acknowledgements The authors acknowledge to Consejera de
Educacin y Ciencia de la Junta de Extremadura (Exp: 2PR03A073)
for financial support. Diego Airado Rodrguez is grateful to the
Consejera de Infraestructura y Desarrollo Tecnolgico de la Junta de
Extremadura for a fellowship (DOE 22/06/04). Lda. Dolores Lpez
Soto (Viaoliva S.C.) is also thanked for providing wine samples.
References
1. Jackson RS (1994) Wine science. Academic Press, New York
2. Siemann EH, Creasy LL (1992) Am J Enol Vitic 43:4952
3. Kallithraka S, Arvanitoyannis I, El-Zajouli A, Kefalas P (2001)
Food Chem 75:355363
4. Chung MI, Teng CM, Cheng KL, Ko FN, Lin CN (1992) Planta
Med 58:274276
5. Kimura Y, Okuda H, Arichi S (1985) Biochim Biohys 834:275
278
6. Pace-Asciak CR, Hahn SE, Diamandis EP, Soleas G, Goldberg
DM (1995) Clin Chim Acta 235:207219
7. Bertelli AA, Giovannini L, Giannessi D, Migliori M, Bernini W,
Fregoni M, Bertelli A (1995) Int J Tissue React 17:13
8. Frankel EN, Waterhouse AL, Kinsella JE (1993) Lancet
341:11031104
9. Kimura Y, Ohminami H, Okuda H, Baba K, Kozawa K, Arichi S
(1983) Planta Med 49:5154
10. Jang M, Cai L, Udeani GO, Slowing K, Thomas CF, Beecher
CWW, Fong HSS, Farnsworth NR, Kinghorn AD, Mehta RG,
Moon RC, Pezzuto JM (1997) Science 275:218220
11. Roggero JP, Garcia-Parrilla C (1995) Sci Aliments 15:411422
12. Orea JM, Montero C, Jimnez JB, Gonzlez Urea A (2001) Anal
Chem 73:59215929
13. Gu X, Chu Q, ODwyer M, Zeece M (2000) J Chromatogr A
881:471481
14. Castellari M, Sartini E, Fabiani A, Arfelli G, Amati A (2002) J
Chromatogr A 973:221227
15. Kerem Z, Bravdo B, Shoseyov O, Tugendhaft Y (2004) J
Chromatogr A 1052:211215
16. Abert Vian M, Tomao V, Gallet S, Coulomb PO, Lacombe JM
(2005) J Chromatogr A 1085:224229
17. Abril M, Negueruela AI, Prez C, Juan T, Estopan G (2005)
Food Chem 92:729736
2007
18. Pour Nikfardjam MS, Lszl G, Dietrich H (2006) Food Chem
96:7479
19. Vitrac X, Monti JP, Vercauteren J, Deffieux G, Mrillon JM
(2002) Anal Chim Acta 458:103110
20. Pieiro Z, Palma M, Barroso CG (2006) J Chromatogr A
1110:6165
21. Rodrguez Delgado MA, Malovan S, Prez JP, Borges T, Garca
Montelongo FJ (2001) J Chromatogr A 912:249257
22. Rodrguez Delgado MA, Gonzlez G, Prez Trujillo JP, Garca
Montelongo FJ (2002) Food Chem 76:371375
23. Zhou J, Cui H, Wan G, Xu H, Pang Y, Duan C (2004) Food Chem
88:613620
24. Zhang Q, Cui H, Myint A, Lian M, Liu L (2005) J Chromatogr A
1095:94101
25. Kolouchov Hanzlkov I, Melzoch K, Filip V, Smidrkal J (2004)
Food Chem 87:151158
26. Stecher G, Huck CW, Popp M, Bonn GK (2001) Fresenius J Anal
Chem 371:7380
27. Wang Y, Catana F, Yang Y, Roderick R, van Breemen RB (2002)
J Agric Food Chem 50:431435
28. Bravo MN, Silva S, Coelho AV, Vilas Boas L, Bronze MR (2006)
Anal Chim Acta 563:8492
29. Domnguez C, Guilln DA, Barroso CG (2001) J Chromatogr A
918:303310
30. Loredana La Torre G, Saitta M, Vilasi F, Pellican T, Dugo G
(2006) Food Chem 94:640650
31. Flamini R, Dalla Vedona A (2004) Rapid Commun Mass
Spectrom 18:19251931
32. Fan E, Zhang K, Yao C, Yan C, Bai Y, Jiang S (2005)
Chromatographia 62:289294
33. Dobisov Z, Pazourek J, Havel J (2002) Electrophoresis 23:263267
34. Spanil M, Pazourek J, Farkov M, Havel J (2005) J Chromatogr
A 1084:180185
35. Gao L, Chu Q, Ye J (2002) Food Chem 78:255260
36. Peng YY, Chu QC, Lin FH, Ye JN (2004) J Agric Food Chem
52:153156
37. Demianov Z, Sirn H, Kuldvee R, Riekkola ML (2003)
Electrophoresis 24:42644271
38. Polster J, Lachmann H (1989) Spectrometric titration, analysis of
chemical equilibria. VCH, Weinheim
39. Takagai Y, Kubota T, Kobayashi H, Tashiro T, Takahashi A,
Igarashi S (2005) Anal Sci 21:183186
40. Cao J, Chen GH, Du YS, Hou FF, Tian YL (2006) J Liq
Chromatogr Rel Technol 29:14571463
41. Wilson RF, Lester GW (1963) Talanta 10:319322
42. Galeano T, Duran-Meras I, Airado D (in preparation)
43. Long GL, Winefordner JD (1983) Anal Chem 55:712724
44. Clayton CA, Hines JW, Elkins PD (1987) Anal Chem 59:25062514
MEN
SALIR
Available online at www.sciencedirect.com
Talanta 74 (2008) 675682
Determination of piceid by photochemically induced

uorescence and second-derivative
Response surface methodology for the optimization
of a liquidliquid extraction procedure for
its analysis in wine samples
Isabel Duran Meras , Teresa Galeano Daz, Diego Airado Rodrguez
Department of Analytical Chemistry, University of Extremadura, 06071 Badajoz, Spain
Received 21 February 2007; received in revised form 25 June 2007; accepted 25 June 2007
Available online 25 July 2007
Abstract
trans-Piceid itself is weakly uorescent, but the uorescence signal (exc/em = 260/361 nm) is greatly enhanced by UV-irradiation of its
hydroethanolic solutions. Employing the photoinduced emission signal at 361 nm or the amplitude of the second-derivative-photoinduced emission
spectrum, between 353 and 361 nm, a linear relation is found in the assayed range 5.731.4 ng mL1 of trans-piceid and limits of detection of 1.7
and 2.1 ng mL1 , respectively, are obtained. A previous liquidliquid extraction is necessary for the determination of piceid in wine. Experimental
design (Central Composite Design) together with the Response Surface Methodology have been used to nd optimum conditions for the extraction
procedure. For this purpose, the difference between the photoinduced-uorescence signal (exc/em = 260/361 nm) of the aqueous phase, before and
after being extracted, has been considered as Response Function. A tartrate buffer (pH 5.0) concentration of 0.15 mol L1 and a phase ratio of 1 are
determined as optimum conditions. The amplitude of the second-derivative-emission spectrum, corresponding to the evaporated and re-dissolved
organic phase, between 353 and 361 nm has been employed as analytical signal. Standard addition method has been applied to the analysis of
piceid in different wine samples under optimum conditions. Results of wine analysis have been satisfactorily validated by HPLC.
2007 Elsevier B.V. All rights reserved.
Keywords: Piceid; Wine; Photochemically-induced uorescence; Second-derivative; Response surface methodology; Liquidliquid extraction
1. Introduction
Piceid (3,4 ,5-trihydroxystilbene-3--mono-d-glucoside) is
a glucoside of the stilbene-like resveratrol. These are phenolic
compounds present in many families of plants, but grapes and
related products, e.g. wine, are considered the most important
dietary sources of these substances [1].
The determination of phenolic compounds in wine is very
important because most of them play an important role in several sensorial characteristics such as colour, avour, astringency
and hardness of wine [2,3]. Some others, like piceid, have been
Corresponding author. Tel.: +34 924289375; fax: +34 924289375.

E-mail address: iduran@unex.es (I.D. Meras).
0039-9140/$ see front matter 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.
doi:10.1016/j.talanta.2007.06.049
intensively studied in the past decade due to their biological or

pharmaceutical importance, as discussed below.
Resveratrol and piceid occur as trans- and cis-isomers. The
chemical structure of trans-piceid is shown in Fig. 1. Due to the
generally high ratio of trans- to cis-isomers found in wines, it
has been suggested that the cis-isomers could arise from light
exposure of must or wine during the wine-making process or
possibly from light exposure of wine bottles during storage
[4].
Piceid has received such attention as resveratrol because, in
grape products, the concentration of the glucoside is usually
signicantly higher than the aglycone [4]. The relative distribution between the glycosylated and aglycone forms in wines
is dependent on a number of factors such as fermentation and
ecological conditions [5]. On the other hand, resveratrol in all
MEN
676
SALIR
I.D. Meras et al. / Talanta 74 (2008) 675682
Fig. 1. Chemical structure of trans-piceid.
its forms is found in much higher concentration in red grape

varieties compared with white grape varieties.
Piceid is the major polyphenol found in the root of Polygonum
cuspidatum. The powder of this root is used in China and Japan as
a treatment for atherosclerosis and for other therapeutic purposes
[6,7]. The evidence for piceid in red wines was established by
the use of a piceid standard extracted from P. cuspidatum [4].
Piceid isomers have properties similar to those of resveratrol in
inhibiting platelet aggregation [810] and inhibiting oxidation of
human low-density-lipoproteins [11]. On the other hand, in a less
active manner than trans-resveratrol, trans-piceid reduces the
elevations of lipid levels [12] and inhibits eicosanoid synthesis
[7].
However, the human digestive tract is known to have glycosidase activity [13], so it is possible that the glucoside of
resveratrol could release the aglycone on ingestion.
Liquid chromatography (LC) has been widely exploited for
the analysis of piceid in several food samples, but no spectroscopic methods have been published so far. Thus, in the
last years, reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) by acidic solvent gradient elution, has been
the most commonly used procedure for the determination of
piceid in wine, either with diode array detection (DAD) [1417],
uorimetric detection [18], DADuorimetric detection [19],
DADuorimetricelectrochemical detection [20] or with mass
spectrometry (MS) [20] and DAD-MS [21,22]. The detection
based on electrochemistry, luminiscence and MS offer higher
sensitivity than DAD. Capillary zone electrophoresis (CZE),
with DAD [23] has been also employed for the analysis of this
compound.
Regarding to the sample preparation, extraction with organic
solvent, commonly ethyl acetate, followed by solvent evaporation and re-dissolution of the residue is widely employed [20,22],
although an additional stage of cation-exchange chromatography has been also employed [14] previously to the injection
in the chromatographic system. Solid phase extraction is other
common treatment previous to the chromatographic [21] or
electrophoretic [23] analysis. Nevertheless some methods are

reported, in which wine samples are ltered through cellulose
lters and directly injected into the chromatographic system
[15,17,18].
Piceid itself is weakly uorescent but it has been demonstrated that intense UV irradiation of piceid contained in the
grape skins gives rise to the formation of the cis-isomer, which
very quickly disappears in favour of a compound highly uorescent in the ultraviolet range [24]. For the rst time we
have exploited the photochemical behaviour of piceid with an
analytical purpose. The photoinduced-spectrouorimetric study
of piceid has been carried out and a sensitive, new, simple
and inexpensive extractive-uorimetric method, employing the
amplitude of the second-derivative-emission spectra as analytical signal has been proposed for the analysis of piceid in wine
samples previous liquidliquid extraction.
In the development of the extractive procedure, experimental
design (Central Composite Design) and the Response Surface
Methodology (RSM) have been used to elucidate the manner in
which the assayed variables affect the response function (RF)
[25,26]. The use of these tools has the advantage of reaching
the optimum values of the variables with the smallest number of
experiments and in the shortest time possible.
2. Experimental
2.1. Chemicals
For all experiments, analytical reagent grade chemicals and
solvents were used. Ultrapure water was obtained from a Millipore Milli-Q System.
trans-Piceid was purchased from Aldrich Chem. Co. and
used as received. Standard ethanolic stock solutions containing 50.0 g mL1 were prepared in colored volumetric asks
by weighting and suitable dilution of the commercial product.
This solution was stored at 4 C avoiding the exposure to direct
light. Fresh solutions of lower concentrations were prepared by
appropriate dilution of the stock solution with absolute ethanol
and water.
Buffer solution sodium hydrogen tartrate/disodium tartrate
0.26 mol L1 was prepared by dissolving the suitable amount of
disodium tartrate dihydrate with water and adjusting the pH of
the resulting solution to 5.0 with hydrochloric acid.
2.2. Wine samples
Several samples of young red wines, barrel-aged red wines
and white wines were provided by Vinaoliva, Cooperative Society (Almendralejo, Badajoz, Extremadura, Spain) and three
different pools were made with the whole samples. All of them
were previously ltered through a 0.45 m cellulose acetate
lter. Samples were kept at 4 C avoiding exposure to direct
light.
2.3. Instrumentation and software
Fluorescence spectral measurements were performed using a
Varian Cary Elipse uorescence spectrophotometer, equipped
MEN
SALIR
with two Czerny-Turner monochromators and a xenon ash

lamp, and connected to a PC microcomputer via an IEEE 488
(GPIB) serial interface. The Cary Elipse software was used for
data acquisition. Fluorescence measurements were recorded in
a 10-mm quartz cell at 20 0.1 C, by use of a thermostatically
controlled cell holder and a Selecta Model 382 thermostatically
controlled water-bath.
An Osram 200-W mercury lamp with an Oriel model 8500
power supply was used for the UV-irradiation of resveratrol
solutions.
A Milton Roy Spectronic 3000 diode-array spectrophotometer, provided with the Milton Roy Rapid Scan software package
V2.2, was used for acquisition and treatment of spectrophotometric data. Photometric measurements were recorded in a
10-mm quartz cell at 20 C, by use of a thermostatic cell holder
and a Selecta thermostatic bath.
The software package THE UNSCRAMBLER 6.11b
CAMO ASA [27], running under Windows XP, was used for
the application of chemometrics.
2.4. Procedures for the photochemically induced
uorimetric determination of total piceid
2.4.1. Calibration graph of total piceid
In a quartz cell, 5.0 mL of ultrapure water, different volumes
of an ethanolic diluted stock trans-piceid solution containing
between 57 and 320 ng of analyte, and ethanol up to 2% were
added. The resulting solution was irradiated for 180 s, under a
high pressure mercury lamp. Ethanol and water were added to
the irradiated solution up to 10 mL (40%, v/v ethanol). The corresponding emission spectra (exc = 260 nm) were registered and
the uorescence intensity at 361 nm was employed as analytical
signal.
2.4.2. Recommended procedure for determining total
piceid in wine
Aliquots of 0.10 mL of red wine or 0.50 mL of white wine,
were diluted to 5.0 mL with ultrapure water and absolute ethanol,
in a nal percentage 2/98 ethanol/water (v/v). The resulting solutions were irradiated for 180 s under a high pressure mercury
677
lamp, in a quartz cell with magnetic stirring. The irradiated

solutions were transferred to a separatory funnel, and 5.0 mL
of buffer solution (sodium hydrogen tartrate/disodium tartrate
0.26 mol L1 , pH 5.0), were added. These aqueous phases were
extracted with 10.0 mL of ethyl acetate by shaking for 150 s.
The organic phases were evaporated to dryness at room temperature in a rota-evaporator. The residues were re-dissolved in
4.0 mL of absolute ethanol and ultrapure water was added up
to 10.0 mL. Aliquots of 3.0 mL of the resulting solutions were
transferred to the measure cell and a standard addition was carried out by adding successively small volumes of trans-piceid
standard solution irradiated for 180 s in the same conditions as
the diluted wine sample. The corresponding emission spectra
(exc = 260 nm) were registered. These spectra were smoothed
by the moving average method with a segment of seven data
points. Their second derivatives were calculated by SavitzkyGolay algorithm ( = 5 nm) and they were smoothed again in
the same conditions as the spectra. The amplitude between 353
and 361 nm was employed as analytical signal. The analysis of
every wine sample was carried out by triplicate.
3. Results and discussion
3.1. Determination of piceid by means of photochemically
induced uorescence
The ultraviolet absorption spectra of trans-piceid in aqueous,
ethanolic or any hydroethanolic media are characterized by a
single wide band around 312 nm with a band width of 15 nm,
and two little maxima centered to 306 and 318 nm, respectively
(Fig. 2A).
In order to establish the basic chemico-physical characteristics of trans-piceid, the inuence of acidity on the absorbent
properties of trans-piceid in aqueous medium was studied. The
pH of the solution was varied by the addition of small volumes,
in order of microlitres, of diluted solutions of hydrochloric acid
or sodium hydroxide, in presence of 0.10 mol L1 of potassium
chloride to keep the ionic strength. A bathochromic shift to
343 nm and a narrowing of the absorption band was observed
in basic medium. The absorbance at 343 nm keeps minimum
Fig. 2. (A) Absorption spectra corresponding to 1.14 g mL1 of trans-piceid in hydroethanolic medium containing 40% (v/v) of ethanol, irradiated for different
times and without being irradiated. (B) Excitation (left) and emission (right) uorescence spectra corresponding to a 1.2 g mL1 hydroethanolic (40%, v/v ethanol)
solution of trans-piceid, non-irradiated (- - -) (exc/em = 318/380 nm) and irradiated for 180 s under a high pressure mercury lamp () (exc/em = 260/380 nm).
MEN
SALIR
678
Fig. 3. Inuence of irradiation time on the uorescence intensity

(exc/em = 260/380 nm) of 0.60 g mL1 trans-piceid in ethanol:water
40:60 (v/v) medium in presence of sodium chloride 0.1 mol L1 in neutral, acid
and basic media.
to pH 7.5 and increases in the 7.511.0 pH interval, remaining

constant and independent of the acidity for higher pH values.
Based on this experience, pKa = 9.3 was calculated by Wilson
and Lester method [28] for trans-piceid, in accordance with the
reported value of 9.4 [29].
When trans-piceid aqueous, ethanolic or hydroethanolic
solutions are UV-irradiated, the band corresponding to transpiceid, disappears, and a new maximum centered to 290 nm,
corresponding to cis-piceid [24,30], appears immediately, as
shown in Fig. 2A. For irradiation times higher than 60 s another
maximum centered to 260 nm (Fig. 2A) can be observed in
solutions containing between 40% and 60% (v/v) of ethanol,
corresponding to the highly uorescent photoproducts discussed
below, while the absorptivity at 290 is kept. This new maximum is negligible in purely ethanolic solutions and very weak in
hydroethanolic media containing more than 60% (v/v) ethanol.
The highest intensity of this maximum is reached for irradiation times around 180 s but decreases for higher irradiation
times and turns negligible for irradiation times higher than 600 s,
probably due to the UV-destruction of the highly uorescent

photoproducts.
A similar photochemical study was carried out by uorescence. Hydroethanolic solutions of trans-piceid are slightly
uorescent and present excitation and emission maxima centered to 230 and 300, and 395 nm, respectively (Fig. 2B).
Intense UV-irradiation of trans-piceid solutions, transforms
trans-piceid into a highly uorescent compounds, with a sharp
excitation maximum (em = 361 or 380 nm) at 260 nm and two
emission maxima (exc = 260 nm) centered to 361 and 380 nm,
respectively (Fig. 2B). It was found that the intensity of the photoinduced signal and the optimum irradiation time are highly
inuenced by the solvent, but not the identity of the photoproducts because no changes were observed in the shape
of spectra recorded in different media. Water, organic
solvents of different polarities like methanol, ethanol, acetonitrile, dimethylsulfoxide, N,N-dimethylformamide, 1,4-dioxane,
cyclohexane and hexane and some hydro-organic mixtures were
assayed. The photoreaction rate is higher in any purely organic
media than in hydro-organic ones, but the uorescence quantum
yield of the photoproducts is higher in hydroethanolic media.
Absorption and uorescence spectra have been on-line
obtained, after chromatographic separation for trans-piceid and
its photoproducts [32], and the shape of these spectra are completely in agreement with the reported data [24,30].
Finally, the photoreaction was studied in different
hydroethanolic media, and it was found that the ethanol percentage inuenced in different ways to the kinetic of the
photochemical process and to the quantum yield uorescence
of the generated photoproducts. The ethanol percentage in the
medium for the photochemical reaction and for the uorescence
measure was varied between 0 and 100%. The best results were
obtained by irradiating for 180 s hydroethanolic solutions of
trans-piceid containing 2% (v/v) ethanol followed by a subsequent addition of ethanol up to 40% (v/v) before the uorescence
measurement.
With regard to the inuence of the acidity, several solutions containing 0.60 g mL1 of trans-piceid in ethanol:water
40:60 (v/v), were prepared in presence of sodium chloride
0.10 mol L1 at different pH values, xed by the addition of
aqueous hydrochloric acid or sodium hydroxide. The inuence
Table 1
Analytical and statistical parameters for the determination of total piceid
Assayed concentration range (ng mL1 )

Intercept (a) sa
Slope (b) sb (mL ng1 )
Determination coefcient (r2 )
Analytical sensitivity ( 1 ) (ng mL1 )
LODa (ng mL1 )
LODb (ng mL1 )
% RSDc (14.3 ng mL1 )
a
b
c
Long and Winefordner method (k = 3) [33].

Clayton et al. method ( = = 0.05) [34].
Relative standard deviation (n = 11).
Photoinduced-uorescent
method (exc/em = 260/361 nm)
Second-derivative-photoinduced-uorescent
method 2 D353361 (exc = 260 nm)
5.731
18 2
6.7 0.1
0.9967
0.68
0.85
1.7
2.3
5.731
0.17 0.06
0.18 0.01
0.9947
0.86
1.3
2.1
5.9
MEN
SALIR
679
Table 2
Optimization of the extractive procedure (experiments resulting of a central composite design)
Experiment
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
a
Design position
Aa
Low
High Aa
Low Ba
High Ba
Low Ca
High Ca
Cube 1
Cube 2
Cube 3
Cube 4
Cube 5
Cube 6
Cube 7
Cube 8
Central a
Central b
Central c
[Buffer] (mol L1 )
Shaking time (s)
Phase ratio
0.026
0.19
0.11
0.11
0.11
0.11
0.06
0.16
0.06
0.16
0.06
0.16
0.06
0.16
0.11
0.11
0.11
155
155
12
298
155
155
70
70
240
240
70
70
240
240
155
155
155
2.5
2.5
2.5
2.5
0.99
4.0
1.6
1.6
1.6
1.6
3.4
3.4
3.4
3.4
2.5
2.5
2.5
Experiments in a star point in the model.
of the irradiation time was carried out in all of them, and it was
found (Fig. 3) that the greatest enhancement of the uorescent
signal is obtained in acid and neutral media.
The use of an irradiation time of 180 s makes the photochemically induced-uorescent determination of trans-piceid in
presence of its aglycone possible, because the uorescence of
the aglycone photoproducts becomes negligible for irradiation
times longer than 60 s, probably because they are destroyed [31].
Finally the inuence of the irradiation time was also carried
out in presence of other typical polyphenols found in wines, concretely 4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid, quercetin, caffeic
acid, gallic acid, ()-epicatechin and (+)-catechin and substantial changes in the photochemical process were not observed.
Under optimum conditions, satisfactory linear relation
between uorescence intensity and trans-piceid concentration
was found in the assayed concentration range 5.731 ng mL1 .
Analytical gures of merit for the determination of trans-piceid
are summarized in Table 1.
3.2. Application: analysis of piceid in wine samples

A previous liquidliquid extraction of diluted wine samples
is necessary to analyse piceid by means of photoinduceduorescence, in order to reduce the background signal. Firstly,
the behaviour of the analyte with regard to the extraction in
different organic solvents, was studied by molecular absorption, and it was found that the better extraction recoveries were
obtained by extracting not the trans-piceid but its photoproducts,
with ethyl acetate. However the quantum uorescence yield of
the photoproducts in ethyl acetate is minor than the obtained in
the optimum hydroethanolic medium (40%, v/v ethanol) and it
would be necessary to evaporate the organic extracts to dryness
and re-dissolve the residue with the optimum hydroethanolic
mixture.
It was proven that the dihydroxy-stilbene-glucoside neutral
species is the predominant in acid and neutral media. Thus, the
pH of the aqueous phase was xed at 5.0 by the addition of

hydrogen sodium tartrate/disodium tartrate buffer.
Anyway the extraction recovery was much lower than
100% and the implied physicalchemical variables, such as
shaking time, phase ratio and buffer concentration in aqueous phase were optimized chemometrically by means of the
Response Surface Methodology (RSM) to get the better recovery
value.
3.3. Optimization of the extraction procedure by the RSM
For the optimization of buffer concentration, shaking time
and phase ratio (aqueous/organic) an experimental design,
central composite design, was used with the aim of calculating simultaneously the effect of the change in each one of
these variables and also their possible interactions. Five levels were xed for each variable. Three central samples were
also included, giving rise to a total of 17 experiments (Table 2).
This design is rotatable and therefore the precision in the calculation of the response is uniform over the whole experimental
eld.
The aqueous samples were constituted by standard solutions containing 57 ng mL1 of trans-piceid in a nal volume of
10.0 mL (2% ethanol), in presence of different amounts of buffer,
irradiated for 180 s previously to the addition of the buffer solution, because a decrease in the photoinduced signal was observed
when irradiating in presence of buffer.
The uorescence emission spectra (exc = 260 nm) of the
aqueous phases were recorded before and after extracting them
as marked by the design, and the difference between the uorescence intensity of aqueous phase at 361 nm before and after
the extraction was employed as RF.
RF = F.I.(exc/em 260/361)before extracting F.I.
(exc/em 260/361)after extracting
MEN
SALIR
680
The optimization of the model was made with THE

UNSCRAMBLER software package [27], and the results were
interpreted with the RSM. In the corresponding analysis of variance (ANOVA) a second-grade quadratic model is assumed.
From this ANOVA, the results of which are summarized in
Table 3, it was deduced which of the considered effects contribute signicantly to the model for a 95% condence level. In
this case, buffer concentration and phase ratio were signicant
variables but not the shaking time or the interactions between
them. Fig. 4 shows the response surfaces estimated by the model,
for each pair of variables. In these diagrams, it can be noticed that
appreciable variations in the response function occurs when the
two specied factors, buffer concentration or phase ratio are varied. In these surfaces, the maximum value of RF is located at the
following values of the variables: 0.16 mol L1 of buffer, phase
ratio of 0.7, considered optimum conditions. The predicted value
of phase ratio was out of the assayed points in the experimental
design, nevertheless it was proven that the extraction percentage
obtained with a phase ratio of 1 is similar to the obtained with a
phase ratio of 0.7. Because of this, an optimum phase ratio of 1
was nally selected. The shaking time was xed at an arbitrary
value of 150 s.
The extraction recovery under these conditions was calculated as the ratio between the slopes of the calibration curve
and a calibration curve constructed extracting standards, and it
resulted to be 61%.
3.4. Determination of piceid in wine samples
Despite extracting wine samples, an important background
signal from the matrix was observed in the optimum conditions to obtain the uorescent spectra of the photoproducts.
Nevertheless this contribution was reduced to a great extent
by obtaining derivative signals, fundamentally the secondderivative-emission spectra. It was also examined the linearity
between different signals measured on the second-derivativeemission spectra and the original trans-piceid concentration, and
it was found a linear relationship employing the amplitude of the
second-derivative-emission spectra between 353 and 361 nm as
analytical signal. The analytical and statistical parameters for
Fig. 4. Estimated response surfaces for each pair of variables.
Table 3
Optimization of the extractive procedure (results from the ANOVA of effects contributing to the model (by RSM))
Effect
Sum of squares
d.f.a
Mean square
F-ratio
p-valueb
A ([Buffer])
B (Shaking time)
C (Phase ratio)
AB
AC
BC
AA
BB
CC
Total error
Total (corrected)
11750
362.705
47950
1128
17.645
167.952
2359
4562
2055
10660
77260
1
1
1
1
1
1
1
1
1
6
15
11750
362.705
47950
1128
17.645
167.952
2359
4562
2055
1777
5150
6.614
0.204
26.981
0.635
0.009929
0.09451
1.327
2.567
1.156
0.0422
0.6673
0.0020
0.4561
0.9239
0.7689
0.2931
0.1602
0.3235
a
b
Degrees of freedom.
Effect is declared signicant if p-value <0.05.
MEN
SALIR

Table 4
Piceid concentration found by the extractive-derivative-photoinduceduorescence method and by HPLC [32] in the validation stage
Method
Extractive-derivativephotoinduceduorescencea
HPLCb
a
b
[Piceid] (g mL1 )
Young red wine
Barrel-aged red wine
White wine
0.75 0.11
0.84 0.14
0.17 0.03
0.72 0.05
0.76 0.08
0.20 0.01
Standard addition (three additions by triplicate).

Average standard deviation (n = 3).
the determination of trans-piceid in these conditions are summarized in Table 1.

The
optimized
extractive-photoinduced-uorescencederivative method was applied to the analysis of total piceid in
wine samples. Young and barrel-aged red wine and white wine
pools were analyzed in order to representing the commonest
interferences in any future wine analysis. The standard addition
method was applied in any case on the diluted wine samples
by adding them increasing volumes of a trans-piceid ethanolic
stock solution before irradiating, and the correspondent plots
analytical signal vs added concentration of trans-piceid,
were constructed. The slopes comparison test was applied
between these plots and the constructed by extracting irradiated
standards of trans-piceid without wine, and it was found that
there was matrix effect, and the standard addition method is
necessary in order to eliminate it.
Lastly, in order to improve the simplicity and speed of the
method it was proven that the standard addition can be carried
out on the nal hydroethanolic reconstituted solution, by adding
successively small volumes of a trans-piceid standard solution
irradiated in the same conditions as the diluted wine samples,
instead of on separated diluted wine solutions before extracting. We have found that these two calibration plots, taking into
account the recovery percentage in the extraction, have similar
slopes, which involves that the matrix effect does not occur in
the extraction nor in the photoreaction stage, but in the uorescence measure. This means that a single extraction is necessary
per wine sample, and the results are not altered.
The concentrations of piceid in wines, calculated taking into
account the 61% extraction recovery, are summarized in Table 4
in comparison with those calculated by a HPLC method with
isocratic elution (C18 column; mobile phase: acetonitrile/acetic
acid (10%, v/v)/water, 19/33/48, v/v/v, 0.8 mL min1 ) and
photochemical pre-column derivatization and uorescence
detection (exc/em 260/364 nm), developed by the authors [32],
in the validation stage.
4. Conclusions
It has been demonstrated that a very weakly uorescent
analyte has been photochemically converted into highly uorescent products. Based on literature data [35], it is possible
that phenanthrene derivatives to be originated as a result of the
UV-irradiation of piceid solutions. The complete structural elu-
681
cidation for these photoproducts is a new challenge for the future

research work of this group. It has been proposed a new, simple, fast and inexpensive method for the determination of piceid
in wine by second-derivative-photochemically induced uorescence coupled with liquidliquid extraction. The optimization
of the variables involved in the extraction procedure by using
chemometric tools (Central Composite Design and Response
Surface Methodology) gives good results. The accuracy of the
proposed method has been validated by comparison with a chromatographic method developed by the authors and it has been
applied successfully to different wine samples. Limits of detection (according to Clayton criteria [34]) ve times lower than the
better reported [18] (S/N = 3) have been achieved. Better precision (% RSD) values than ours have been previously reported
[14] when precision is evaluated at higher concentration levels
(g mL1 ). Although a previous clean-up stage is needed, the
solvent used is rapidly eliminated, which implies a fast analysis, so the spent time in the whole procedure, is comparable to
the expended time in the fastest reported HPLC methods, when
sample preparation is not necessary [15,17,19].
Acknowledgements
The authors acknowledge to Ministerio de Educacion y Ciencia (Project: CTQ2005-02389) for nancial support. Diego
Airado Rodrguez is grateful to the Consejera de Infraestructura y Desarrollo Tecnologico de la Junta de Extremadura for a
fellowship (DOE 22/06/04). Dra. Dolores Lopez Soto (Vinaoliva
S.C.) is also acknowledged for providing wine samples.
References
[1] R.M. Lamuela Raventos, A.L. Waterhouse, Methods Enzimol. 299 (1999)
184.
[2] J.L. Robichaud, A.C. Noble, J. Sci. Food Agric. 53 (1990) 343.
[3] G. Mazza, Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 35 (1995) 341.
[4] R.M. Lamuela Raventos, A.I. Romero Perez, A.L. Waterhouse, M.C. de la
Torre Boronat, J. Agric. Food Chem. 43 (1995) 281.
[5] J.F. Moreno-Labanda, R. Mallavia, L. Perez-Fons, V. Lizama, D. Saura, V.
Micol, J. Agric. Food Chem. 52 (2004) 5396.
[6] Y. Kimura, H. Ohminami, H. Okuda, K. Baba, M. Kozawa, S. Arichi, Planta
Med. 49 (1983) 51.
[7] Y. Kimura, H. Okuda, S. Arichi, Biochim. Biophys. Acta 834 (1985) 275.
[8] M.I. Chung, C.M. Teng, K.L. Cheng, F.N. Ko, C.N. Lin, Planta Med. 58
(1992) 274.
[9] F. Orsini, F. Pelizzoni, L. Verotta, T. Aburjai, C.B. Rogers, J. Nat. Prod. 60
(1997) 1082.
[10] C. Shan, S. Yang, H. He, S. Shao, P. Zhang, Acta Pharmacol. Sin. 11 (1990)
527.
[11] J.M. Merillon, B. Fauconneau, P. Waffo, L. Barrier, A. Decendit, F. Huguet,
Proceedings of the 18th International Conference on Polyphenols; Polyphenols Communications 96, Bordeaux (France), 1996.
[12] H. Arichi, Y. Kimura, H. Okuda, K. Baba, M. Kozawa, S. Arichi, Chem.
Pharm. Bull. 30 (1982) 1766.
[13] A.M. Hackett, The metabolism of avonoid compounds in mammals, in: V.
Cody, E. Middleton Jr., J.B. Harborne (Eds.), Plant Flavonoids in Biology
and Medicine, Liss, New York, 1986, pp. 177194.
[14] M.T. Ribeiro de Lima, P. Waffo-Teguo, P.L. Teissedre, A. Pujolas, J. Vercauteren, J.C. Cabanis, J.M. Merillon, J. Agric. Food Chem. 47 (1999)
2666.
[15] J. Burns, T. Yokota, H. Ashihara, M.E.J. Jean, A. Crozier, J. Agric. Food
Chem. 50 (2002) 3337.
MEN
682
SALIR
[16] X. Vitrac, A. Bornet, R. Vanderline, J. Valls, T. Richard, J.C. Delaunay,

J.M. Merillon, P.L. Teissedre, J. Agric. Food Chem. 53 (2005) 5664.
[17] M. Abert Vian, V. Tomao, S. Gallet, P.O. Coulomb, J.M. Lacombe, J.
Chromatogr. A 1085 (2005) 224.
[18] X. Vitrac, J.P. Monti, J. Vercauteren, G. Defeux, J.M. Merillon, Anal.
Chim. Acta 458 (2002) 103.
[19] P. Jeandet, A.C. Breuil, M. Adrian, L.A. Weston, S. Debord, P. Meunier,
G. Maume, R. Bessis, Anal. Chem. 69 (1997) 5172.
[20] M.N. Bravo, S. Silva, A.V. Coelho, L. Vilas Boas, M.R. Bronze, Anal.
Chim. Acta 563 (2006) 84.
[21] C. Domnguez, D.A. Guillen, C.G. Barroso, J. Chromatorgr. A 918 (2001)
303.
[22] M.A. Pozo-Bayon, M.T. Hernandez, P.J. Martn-Alvarez,

M.C. Polo, J.
Agric. Food Chem. 51 (2003) 2089.
[23] V. Brandolini, A. Maietti, P. Tedeschi, E. Durini, S. Vertuani, S. Manfredini,
J. Agric. Food Chem. 50 (2002) 7407.
[24] J.P. Roggero, J. Food Comp. Anal. 13 (2000) 93.

[25] G.E.P. Box, K.B. Wilson, J. R. Stat. Soc. B 13 (1951) 1.
[26] D.C. Montgomery, Design and Analysis of Experiments, second ed., Wiley,
New York, 1984.
[27] Unscrambler v. 6.11b, CAMO A/S Olav Tryggvasonsgt, N-7011, Trondheim, Norway.
[28] R.F. Wilson, G.W. Lester, Talanta 10 (1963) 319.
[29] J. Cao, G.H. Chen, Y.S. Du, F.F. Hou, Y.L. Tian, J. Liquid Chromatogr.
Rel. Technol. 29 (2006) 1457.
[30] J.P. Roggero, C. Garca-Parrilla, Sci. Aliments 15 (1995) 411.
[31] T. Galeano Daz, I. Duran Meras, D. Airado Rodrguez, Anal. Bioanal.
Chem. 387 (2007) 1999.
[32] T. Galeano, I. Duran-Meras, D. Airado, J. Sep. Sci., in press.
[33] G.L. Long, J.D. Winefordner, Anal. Chem. 55 (1983) 712.
[34] C.A. Clayton, J.W. Hines, P.D. Elkins, Anal. Chem. 59 (1987) 2506.
[35] Y.-H. Chen, Y.-L. Cheng, C.-H. Lin, J. Chromatogr. A 943 (2002) 287.
MEN
SALIR
T. Galeano-Daz et al.
3110
Teresa Galeano-Daz
Isabel Durn-Mers
Diego Airado-Rodrguez
Departamento de Qumica
Analtica, Facultad de Ciencias,
Universidad de Extremadura,
Badajoz, Spain
J. Sep. Sci. 2007, 30, 3110 3119
Original Paper
Isocratic chromatography of resveratrol and piceid
after previous generation of fluorescent
photoproducts: Wine analysis without sample
preparation
Resveratrol and its 3-glucoside (piceid), are stilbene-like molecules produced by
plants. Both of them are weakly fluorescent, but highly fluorescent compounds are
obtained when their hydroethanolic solutions are UV-irradiated, which implies a
substantial improvement in the sensitivity of analytical methods. Experimental
design (central composite design) together with the response surface methodology
have been used to find optimum conditions for the fast, sensitive, and precise chromatographic analysis (with isocratic elution) of resveratrol and piceid in wine samples. These compounds have been UV-transformed into their respective photoproducts, which have been separated in a C18 column (Novapack C18 15063.9 mm,
4 lm) by isocratic elution, using a mobile phase made up of acetonitrile and
4.1 vol% aqueous acetic acid, 19:81 v/v, at a flow rate of 0.8 mL/min, and fluorimetrically detected at 364 nm (kexc = 260 nm). Detection limits (S/N = 3) are 0.29 and
0.28 lg/L for resveratrol and piceid, respectively. The method has been applied to
the analysis of these compounds in wine samples without a clean-up step. The analysis is completed in only 20 min. The standard addition method has been applied to
the analysis of a commercial red wine and average recoveries near 100% were
obtained for resveratrol and piceid. Three wine pools were satisfactorily analysed by
external calibration.
Keywords: Isocratic HPLC / Photochemical-derivatization / Piceid / Response surface methodology / Resveratrol / Wine /
Received: June 28, 2007; revised: August 6, 2007; accepted: August 6, 2007
DOI 10.1002/jssc.200700285
1 Introduction
Resveratrol (3,49,5-trihydroxystilbene) is a stilbene phytoalexin, and it has been identified as a constituent of
various plant species. Its production increases in
response to stress of the plant or fungal infection [1],
among other causes. It appears in grapes as well as in
wine [1 3]. In wine, resveratrol occurs free, and as glucoside (piceid), in their respective isomeric forms (Fig. 1).
Piceid is the major polyphenol found in the root of the
medicinal plant Polygonum cuspidatum. The powder of this
Correspondence: Professor Teresa Galeano-Daz, Departamento
de Qumica Analtica, Facultad de Ciencias, Universidad de Extremadura, Avda. de Elvas s/n, C.P. 06071 Badajoz, Spain
E-mail: tgaleano@unex.es
Fax: +34 924289375
Abbreviations: BSTFA, bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide;
CLD, chemiluminiscent detection; DAD, diode array detection;
ECD, electrochemical detection; FLD, fluorimetric detection;
RSM, response surface methodology
2007 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
root is used in China and Japan for treatment of some

cardiac ailments, including atherosclerosis and inflammation [4]. The evidence for piceid in red wines was established by the use of a piceid standard extracted from P.
cuspidatum [5].
Resveratrol can inhibit cellular events associated with
tumour initiation, promotion, and progression [6],
reduce cell death from oxidative stress [7], inhibit the oxidation of human low-density lipoprotein (LDL) [8] and
inhibit platelet aggregation and eicosanoid synthesis [9],
and it is an agonist for the estrogen receptor. Piceid isomers have properties similar to those of resveratrol in
inhibiting platelet aggregation [10] and inhibiting oxidation of human low-density lipoproteins. On the other
hand, in a less active manner than trans-resveratrol, transpiceid reduces the elevations of lipid levels and inhibits
eicosanoid synthesis [11].
However, the human digestive tract is known to have
glycosidase activity, so it is possible that the glucoside of
resveratrol could release the aglycone on ingestion.
www.jss-journal.com
MEN
SALIR
J. Sep. Sci. 2007, 30, 3110 3119
Liquid Chromatography
3111
Figure 1. Chemical structures of resveratrol and piceid isomers, and suggested structures for their respective photoproducts.
In a recently published review, the levels of resveratrol

and piceid in red wines from different regions are compared [12]. Based on this paper, red wine contains as
much as 14.3 mg/L, and 29.2 mg/L of trans-resveratrol and
trans-piceid, respectively. On the other hand, levels of
resveratrol and piceid in red and white wines are quite
different, thus 100 lg/L has been reported as the maximum level of resveratrol in white wines [2]; the higher
concentrations in red wines are partially due to the winemaking process, but they also depend on the grape variety, environmental factors in the vineyard, and wine
processing techniques [13]. Piceid has received similar
attention to resveratrol because, in grape products, the
concentration of the glucoside is usually significantly
higher than the aglycone [14]. The relative distribution
between the glucosylated and aglycone forms in wine is
dependent on a number of factors such as fermentation
and ecological conditions [15]. Resveratrol in all its forms
is found in much higher concentration in red grape varieties than in white grapes.
On the other hand, due to the generally high ratio of
trans- to cis-isomers found in wines, it has been suggested
that the cis-isomers could arise from light exposure of
must or wine during the wine-making process, or possibly from light exposure of wine bottles during storage
[5].
In recent years, reverse phase high performance liquid

chromatography with acidic solvent gradient elution
has been the most commonly used procedure for the
determination of resveratrol and/or piceid in wine, with
either diode array detection (DAD) [16 19], fluorimetric
detection (FLD) [20, 21], DAD FLD [22, 23], chemiluminescent detection (CLD) [24, 25], electrochemical detection (ECD) [23], or mass spectrometry (MS) [23] and DAD
MS [26]. Detection based on electrochemistry, luminescence, and MS offers higher sensitivity than DAD. Gas
chromatography tandem MS, previous derivatization,
normally with bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide
(BSTFA), before column application [27], and micellar
electrokinetic chromatography (MEKC) with UV-detection [28], capillary zone electrophoresis (CZE), with DAD
[29] or ECD [30], or non-aqueous CZE with DAD [31] have
been also employed for the analysis of resveratrol. Piceid
has been also analyzed by CZE, with DAD [32]. In liquid
chromatographic methods, acetonitrile or methanol and
acetic or formic acids are the most widely employed
organic solvent and acid, respectively, in mobile phases
to carry out the elution (always in gradient programs).
trans-Piceid and trans-resveratrol themselves are weakly
fluorescent, but intense UV-irradiation of their alcoholic
solutions first induces their isomerization into cis-isomers, also weakly fluorescent, which very quickly disapwww.jss-journal.com
MEN
SALIR
3112
pear in favour of highly fluorescent compounds [33, 34],

by means of which total (trans-isomer plus cis-isomer)
resveratrol and piceid present in a sample can be analyzed. We have exploited, for the first time, this photochemical behaviour to develop a sensitive chromatographic method for the analysis of these compounds by
previous UV-irradiation of the samples before injecting
them into the chromatographic system.
As with other analytical techniques, optimization of
the variables in HPLC can be carried out by using chemometric techniques, such as experimental design and
response surface methodology (RSM). The use of these
tools has the advantage of attaining the optimal values
of the variables, with the smallest number of experiments and in the shortest time.
Thus the goal of the present study is the development
of a sensitive and fast method, for the simultaneous chromatographic determination of total (trans-isomer plus cisisomer) resveratrol and piceid in wine samples, quantifying them through the peaks of their fluorescent photoproducts.
Finally, the method was validated in terms of linearity,
limits of detection, and repeatability, and it was applied
to the analysis of wine samples. Detection limits have
been calculated, and were found to be significantly lower
than the expected levels of these compounds in wines.
Thus the method allows easy determination without
prior stages of sample cleaning or concentration.
2 Experimental
2.1 Chemicals and solutions
All solvents were of gradient grade for liquid chromatography (Merck, Spain). All other chemicals were of analytical reagent grade and used without further purification.
Ultrapure water, obtained from a Millipore Milli-Q System, was used throughout.
trans-Resveratrol and trans-piceid were obtained from
Sigma and Aldrich Chem. Co., respectively, and used as
received. 50.0 lg/mL ethanolic stock solutions were prepared and stored at 48C in darkness. Fresh working
standard solutions were prepared by appropriate dilution of stock solutions in absolute ethanol and water
40:60, v/v.
2.2 Wine samples

Several samples of young red wines, barrel-aged red
wines, and white wines were provided by Viaoliva,
Sociedad Cooperativa (Almendralejo, Badajoz, Extremadura, Spain) and three different pools were made with
the whole samples. Samples were kept at 48C avoiding
exposure to direct light.
J. Sep. Sci. 2007, 30, 3110 3119
2.3 Instrumentation and software

The chromatographic studies were performed on a Hewlett-Packard Mod. 1100 LC instrument, equipped with
degasser, quaternary pump, manual six-way injection
valve with a 20-lL loop, UV-visible diode-array detector,
rapid scan fluorescence spectrophotometer detector,
and the Chemstation software package to control the
instrument, data acquisition, and data analysis. The analytical column used was a Nova-Pak C18, 15063.9 mm id,
4 lm particle size, and 60 pore size (Waters Millipore).
The mobile phase consisted of a mixture acetonitrile
acetic acid (4.1%), 19:81, v/v. Mobile phase components
were filtered through a 0.22-lm membrane nylon filter
and degassed by ultrasonication before use. The flow-rate
was 0.8 mL/min. UV detection was performed at 306 nm,
and fluorescence detection was performed at 364 nm
(kexc = 260 nm). Samples were filtered through 0.22-lm
membrane nylon filters before injection.
An Osram 200-W mercury lamp with an Oriel model
8500 power supply was used for the UV-irradiation of solutions.
The software package The Unscrambler 6.11b CAMO
ASA [35], running under Windows XP, was used for chemometrics work.
2.4 General procedure: Calibration curves

Aliquots of trans-resveratrol and trans-piceid ethanolic
solutions containing between 0.1 and 100 lg of each
compound were placed in 10.0 mL volumetric flasks,
ethanol was added up to 4.0 mL (final medium composition ethanol water 40:60, v/v.), and ultrapure water was
added to the mark. The resulting solutions were irradiated for 90 s under a high pressure mercury lamp, and a
20-lL volume of each irradiated solution was injected
into the chromatographic system after previous filtration through a 0.22 lm membrane nylon filter. The eluate was fluorimetrically monitored at 364 nm (kexc =
260 nm).
2.5 Procedure for the analysis of total resveratrol

and piceid in wine samples
Aliquots of 2.0 mL of wine (12% ethanol) were placed in
10.0 mL volumetric flasks, and 3.75 mL of ethanol and
water to the mark were added (final medium composition ethanol water 40:60, v/v). The resulting solutions
were irradiated for 90 s under a high pressure mercury
lamp, and a 20-lL volume of each one of the irradiated
solutions was injected into the chromatographic system,
after previous filtration through a 0.22 lm membrane
nylon filter. The eluate was fluorimetrically monitored
at 364 nm (kexc = 260 nm).
www.jss-journal.com
MEN
SALIR
J. Sep. Sci. 2007, 30, 3110 3119
3 Results and discussion

The photoinduced spectrofluorimetric behaviour of
resveratrol and piceid has been previously studied by us,
and the results reported in recent papers [36, 37]. In
short, hydroethanolic solutions of trans-resveratrol and
trans-piceid are weakly fluorescent, showing excitation
maxima centred at 225 and 318 nm, and 230 and
300 nm, respectively, and emission maxima centred at
385 and 395 nm, respectively. It has been proven that
intense UV-irradiation of those solutions under a high
pressure mercury lamp totally transforms resveratrol
and piceid into highly fluorescent compounds, with a
single and sharp excitation maximum at 260 nm, and
two emission maxima at 364 and 382 nm, and 361 and
380 nm, respectively.
The optimum values of irradiation time and ethanol
percentage in the reaction medium are different for the
two photoreactions. Thus it was previously determined
by this research group [36, 37] that 60 and 180 s were the
optimum irradiation times for resveratrol and piceid,
respectively, and in both cases longer irradiation times
led to the photo-destruction of the fluorescent photoproducts. On the other hand, the ethanol percentage in
the photoreaction medium has a pronounced influence
on the yield of these reactions, and for this reason ethanol water 40:60, v/v, and purely aqueous media were
selected as optimum solvents for resveratrol and piceid
photoreactions, respectively. Thus it was necessary to
choose compromise values for these variables to perform
simultaneous chromatographic determination of resveratrol and piceid in a single run. Taking into account,
first, that resveratrol concentrations in wine are lower
than piceid concentrations, and, secondly, that the elution time for resveratrol is higher than for piceid, which
implies that dispersion has a greater effect on the resveratrol peak, the compromise irradiation time and ethanol
proportion were selected to be more favourable for
resveratrol determination, and further experiments on
irradiated samples were carried out by irradiating solutions in a 40:60, v/v ethanol water medium for 90 s.
3.1 Previous chromatographic studies

In order to study the respective photodecomposition
processes by chromatography, aliquots of non-irradiated
and irradiated standard solutions of resveratrol and
piceid were injected into the chromatographic system.
These samples were initially eluted in isocratic mode
with a mixture of acetonitrile acetic acid (3.2%), 22:78,
v/v. Chromatograms corresponding to a mixture of transresveratrol and trans-piceid and their corresponding photoreaction products are depicted in Fig. 2-top. As shown
in Fig. 2A, trans-resveratrol and trans-piceid were UVdetected at 306 nm in non-irradiated samples at 6.1 and
3113
2.4 min, respectively, but these compounds were not fluorescently detected (Fig. 2B), as they themselves are
weakly fluorescent. When these solutions were UV-irradiated for 90 s, the peaks corresponding to trans-isomers,
previously observed by UV-detection, became negligible
and three new peaks were fluorimetrically observed.
The products of the photoreactions were fluorimetrically monitored at 364 nm (kexc = 260 nm), and it was proven that a single photoproduct originated from resveratrol, designated FR, in accordance with previous results
reported by Roggero et al. [33]. On the other hand, two fluorescent photoproducts, designated FP1 and FP2, were
obtained from piceid. The fluorescence spectra corresponding to FP1 and FP2 are identical and, assuming
that the photoproducts are phenanthrene derivatives,
the formation of two isomers, namely 2,6-dihydroxyphenanthrene-4-b-D-glucopyranoside and 4,6-dihydroxyphenanthrene-2-b-D-glucopyranoside, from piceid and a single compound, 2,4,6-trihydroxyphenanthrene, from
resveratrol, appears logical on the basis of literature data
[38]. As shown in Fig. 2B, FP2 is much more abundant
than FP1, and because of this FP2 will be used for the
quantification of piceid, in the interests of method sensitivity.
Before optimizing the mobile phase composition for
the analysis of resveratrol and piceid in wine, the photodecomposition process was studied in wine samples in
order to determine whether the wine matrix interferes
with generation of the photoproducts. An aliquot of
2.0 mL of a commercial red wine was fortified with 9.8
and 11.4 lg of trans-resveratrol and trans-piceid, respectively, and diluted to a final volume of 10.0 mL with ethanol and water (final percentage of ethanol 40 vol.%). This
sample was injected into the chromatographic system
before and after being irradiated for 90 s, and was eluted
under the same conditions as the standard mixture. The
recorded chromatograms are depicted in Fig.2-bottom.
With this mobile phase, only trans-resveratrol is photometrically detected at 306 nm as a separated peak, and
trans-piceid co-elutes with other compounds of the wine,
Fig. 2C. By carrying out the photoreaction on a wine sample, it was proven that the photoreaction proceeds in the
same way in the wine matrix, and the corresponding
photoproducts were observed.
3.2 Optimization of the mobile phase for wine

analysis by the RSM
Previously proposed methods for the analysis of resveratrol and piceid used a gradient solvent program for elution [16 26]. Methanol and acetonitrile are the most
widely employed organic solvents, and formic and acetic
acids are most widely employed to fix the pH of the aqueous phase. We chose acetic acid to fix the pH of the
mobile phase and acetonitrile as organic solvent. Thus,
www.jss-journal.com
MEN
SALIR
3114
J. Sep. Sci. 2007, 30, 3110 3119
Figure 2. Chromatograms corresponding to a sample containing 0.98 and 1.14 mg/L of trans-resveratrol and trans-piceid,
respectively, (A and B), and to an aliquot of 2 mL of a commercial red wine fortified with 9.8 and 11.4 lg of trans-resveratrol and
trans-piceid, respectively and diluted to a final volume of 10.0 mL (C and D), non-irradiated ( N N N .) and irradiated for 90 s ().
Mobile phase acetonitrile acetic acid (3.2%), 22:78, v/v, 0.8 mL/min; UV-detection at 306 nm, and FLD at kexc/em 260/364 nm.
we have selected an isocratic mobile phase acetonitrile

water acetic acid in order to simplify the analysis,
obtaining an adequate resolution of the peaks of interest
with respect to other fluorescent compounds typically
present in wine. Also, we have taken into account that
the selected mobile phase could be used in the future to
study the photodecomposition process in wine and to
develop an on-line post-column photoderivatization
methodology, which requires consideration of the resolution of the peaks corresponding to the trans-isomers,
with respect to the peaks corresponding to other interferents of wine, in the optimization procedure.
For optimization of the percentage of acetic acid and
organic solvent in the isocratic mobile phase, an experimental design, central composite design (Fig. 3A), was
used with the aim of calculating simultaneously the
effect of the change in each one of these variables, and
also its possible interaction. Five levels were fixed for
each variable. There are also three central samples, giving rise to a total of 11 experiments (Fig. 3A). This design
is rotatable, and therefore the precision in the calculation of the response is uniform over the whole experimental field.
The selected response function (RF) was RF = (k9 N RRs)/t,
where RRs is the sum of the resolution (Rs) corresponding
to peaks FP1 (FLD), FP2 (FLD), and trans-resveratrol (UVD),
with respect to the main interfering peaks corresponding to wine components, k9 is the capacity factor for transpiceid (UVD), which is the first-eluted peak, near to nonretained compounds in some points of the design, and t
is the time corresponding to the elution of the last peak
(FR), which is always resolved, but at very high retention
times with some of the assayed mobile phases. Rs has
been maintained at 1.5 for the resolution values greater
than this. With this RF the best separation of the analytes
of interest from the interfering compounds in the wine
would be achieved in the shortest time.
RF = (k N RRs)/t
Each experiment was carried out on two independent
samples, corresponding to wine samples non-irradiated
and UV-irradiated for 90 s. A sample containing 2.0 mL of
a pool of commercial red wines (12% ethanol), volumes
of trans-resveratrol and trans-piceid stock solutions containing 9.8 and 11.4 lg, respectively, ethanol up to
3.4 mL, and water to a final volume of 10.0 mL, was
injected into the chromatographic system, without
being irradiated, and irradiated for 90 s under a high
pressure lamp, after previous conditioning of the system
with each one of the assayed mobile phases, marked by
the model. Elution was carried out at a flow rate 0.8 mL/
www.jss-journal.com
MEN
SALIR
J. Sep. Sci. 2007, 30, 3110 3119
3115
Figure 3. (A) Central composite design and variable levels used for the optimization of the mobile phase. Vol.% Acetonitrile:
14.92, 17, 22, 27, 29.07. Acetic acid: 0.24, 0.9, 2.5, 4.1, 4.76. (B) Estimated response surface for the pair of effects% ACN, and
% acetic acid.
Figure 4. Chromatogram (FLD

kexc/em 260/364 nm) corresponding
to a standard sample containing
290 and 340 lg/L of resveratrol
and piceid, respectively, irradiated
for 90 s, and eluted under optimum
conditions.
min, and the eluate was photometrically and fluorimetrically monitored at 306 nm and kexc/em 260/364 nm,
respectively.
Optimization of the model was performed with The
Unscrambler software package [35], and the results were
interpreted with RSM. In the corresponding analysis of
variance (ANOVA) a second-grade quadratic model is
assumed (Model Check Quadratic, p-value (95%) =
0.0004). It was proven that the effect of % ACN (p-value =
0.0002) and the interactions % ACN % ACN (p-value =
0.0002) and % ACN % acetic acid (p-value = 0.0010) contribute significantly to the model for a 95% confidence
level. Nevertheless, the effect of % acetic acid (pvalue = 0.0639) and the interaction % acetic acid % acetic acid (p-value = 0.0539) are not significant in the model
for the considered confidence level. On the other hand,
the p-value (95%) calculated for lack of fit was 0.0760,
which means that the model describes the true shape of
the response surface. Fig. 3B shows the response surface
estimated by the model for the studied pair of variables.

The maximum point of this surface corresponds to the
values of the variables 19% ACN and 3.3% acetic acid.
Thus, the mobile phase selected as optimum for the
determination of resveratrol and piceid in wines was acetonitrile acetic acid (4.1%), 19:81, v/v. Under these conditions, the three fluorescent photoproducts are baseline
resolved in less than 20 min, as shown in Fig. 4, and the
retention times and capacity factors are 5.1, 7.3, and
17.9, and 2.7, 4.4, and 12.2, respectively, for FP1, FP2, and
FR, respectively.
3.3 Method validation. Analytical parameters

The linearity of the method was assessed by preparing
calibration standards with concentrations ranging from
1.0 to 1000 lg/L of each analyte. Each standard was introduced into the chromatographic system in triplicate
with the mobile phase determined as optimum and
www.jss-journal.com
MEN
SALIR
3116
J. Sep. Sci. 2007, 30, 3110 3119
Table 1. Analytical and statistical parameters for the chromatographic determination of total resveratrol and piceid.
Linearity range (lg/L)

Calibration curve (Peak area vs. lg/L)
r2
LODa) (lg/L)
LOQb) (lg/L)
Repeatability % RSDc)
a)
b)
c)
Resveratrol
Piceid
1 1000
y = (1.22 l 0.01) x (12.5 l 2.5)
0.999
0.29
0.97
9.5
1 1000
y = (0.732 l 0.004) x (7.36 l 1.56)
0.999
0.28
0.95
4.6
S/N = 3.
S/N = 10.
n = 11.490 and 570 lg/L of trans-resveratrol (FR) and trans-piceid (FP2), respectively.
Table 2. A) Results of the chromatographic procedure for the determination of resveratrol and piceid in a commercial red wine,
using the standard addition method.
Resveratrol
Added (mg/L)
Found (mg/L)a)
0.00
2.12 l 0.04
1.02
3.74 l 0.11
2.55
4.82 l 0.31
3.57
6.36 l 0.16
5.10
7.39 l 0.68
Slope calibrationb)
In absence of wine: 1154
In presence of wine: 1180
a)
b)
Piceid
Recovery (%)a)
Added (mg/L)
119 l 4
103 l 7
112 l 3
102 l 9
0.00
31.54 l 0.39
1.11
34.98 l 0.19
2.78
33.71 l 0.84
3.89
35.56 l 0.38
5.55
37.31 l 2.1
Slope calibrationb)
In absence of wine: 281.8
In presence of wine: 274.9
Recovery (%)a)
107 l 1
98 l 2
106 l 1
101 l 6
Average l standard deviation (n = 2).

Peak area vs. mg/L.
Table 2. B) Results obtained in the analysis (mg/L) of total

resveratrol and piceid in wine pools by external calibration
Resveratrol
Piceid
Young red
wine
Barrel-aged
red wine
White wine
Repeatability was evaluated by performing 11 successive injections of analytes at the concentration levels
490 lg/L for resveratrol and 570 lg/L for piceid.
0.28 l 0.01
0.72 l 0.05
0.27 l 0.02
0.76 l 0.08
0.15 l 0.01
0.20 l 0.01
3.4 Determination of total resveratrol and piceid in

wine samples
eluted at a flow rate of 0.8 mL/min, after previous irradiation of samples for 90 s under a high pressure mercury
lamp. Resveratrol and piceid were quantified through FR
and FP2, respectively. Calibration curves were built by
plotting the mean of the obtained area as a function of
the standard concentration. The results obtained are
summarized in Table 1.
The limits of detection and quantification were
obtained as 3 and 10 times, respectively, the signal-tonoise ratio. Thus the average amplitude of the baseline of
standard chromatograms, measured in different zones,
for time intervals of around two minutes, was multiplied
by 3 or 10, and the concentrations of resveratrol or piceid
corresponding to these signals were calculated with the
respective calibration curves constructed employing the
peak height as analytical signal.
Found (mg/L)a)
The optimized method was applied to the analysis of

wine samples.
First, a standard addition was carried out on a commercial red wine in order to examine the possible matrix
effect, and to calculate the recoveries at different concentration levels. It was proven that there is no matrix effect
by comparing the slope of the calibration graph obtained
by external calibration with that of the standard addition plot, and then recoveries at four different concentration levels were calculated for resveratrol and piceid. As
shown in Table 2, the recoveries are highly satisfactory at
around 100% in all cases.
Secondly, the method was applied to the analysis of a
large number of samples by external calibration. All the
wine samples were divided into three groups: young and
barrel-aged red wine and white wine, in order to represent the commonest interferences in any future wine
analysis. Samples of each pool were prepared in triplicate
www.jss-journal.com
MEN
SALIR
J. Sep. Sci. 2007, 30, 3110 3119
3117
Figure 5. Chromatograms (FLD

kexc/em 260/364 nm) corresponding
to a standard sample containing
290 and 340 lg/L of resveratrol
and piceid, respectively ( N N N ),
and young red (A, ), barrelaged red (B, ), and white (C,
) wine pools irradiated for
90 s, and eluted under optimal
conditions.
according to the sample preparation protocol previously

detailed. A 20 lL volume of each one of the resulting samples was injected into the chromatographic system, and
the eluate was fluorimetrically monitored at 364 nm
(kexc = 260 nm).
Chromatograms corresponding to the three pools are
represented in Fig. 5, in comparison with a standard solution containing 290 and 340 lg/L of resveratrol and
piceid, respectively.
The results obtained on analysis of the three pools are
also summarized in Table 2.
To sum up, the concentration of these two stilbenes
are correctly determined at low concentration levels in a
simple and fast manner.
The content of resveratrol and piceid in these wine

pools was also determined spectrofluorimetrically by
methods previously proposed by us [36, 37], and the
results obtained agree with those presented here.
Finally, in the chromatograms obtained under optimized conditions for some of the analysed red wines, a
peak very close to that of FP2 is observed (Fig. 6A). However, the emission spectrum of the interferent compound
and that corresponding to FP2 are slightly different (Fig.
6B), which led us to eliminate the contribution of the
interferent by selecting as analytical signal the difference
between the peak areas obtained on detection at 369 and
348 nm (kexc = 260 nm), isoemissive points in the emission
spectrum of the interferent, but not in that of FP2.
www.jss-journal.com
MEN
SALIR
3118
J. Sep. Sci. 2007, 30, 3110 3119
Figure 6. (A) Chromatogram (FLD exc/em 260/364 nm) corresponding to a standard sample containing 290 and 340 lg/L of resveratrol and piceid, respectively ( N N N ), and chromatograms obtained at kem 348 ( ) and 369 nm ( ) (kexc 260 nm), and the
chromatogram difference between them () for a commercial red wine. (B) Emission spectra (kexc 260 nm) at the marked points
of the chromatogram.
4 Concluding remarks
5 References
Very weakly fluorescent analytes (trans-resveratrol and

trans-piceid) have been photochemically converted into
highly fluorescent products, and on that basis a new,
fast, and sensitive isocratic chromatographic method
with fluorescence detection has been proposed for the
analysis of resveratrol and piceid in wine samples. Satisfactory results have been obtained in the analysis of
different wine pools.
It is very important to highlight that the photochemical behaviour of the two compounds has been exploited
here for the first time with the aim of improving their
chromatographic analysis in wines, and the results open
the way for other interesting alternatives.
Lowest LOD (S/N = 3) in reported HPLC methods with
DAD, FLD, or MS detection are in the order of ppb [16, 18,
20, 21, 25, 26]. The LOD for the method reported in this
paper is 10 or even 100 times lower than these. There is
only one reported HPLC method with chemiluminiscent
detection in which a LOD of 0.2 lg/L has been reached
[24].
Nowadays, our main challenges in this field are on the
one hand the study of the photodecomposition process
and the identification of the photoproducts (elucidation
of their structures), and on the other hand the design of
a system for the post-column derivatization on-line.
[1] Lamuela-Ravents, R. M., Waterhouse, A. L., J. Agric. Food Chem.

1993, 41, 521 523.
[2] Siemann, E. H., Creasy, L. L., Am. J. Enol. Vitic. 1992, 43, 49 52.
[3] Goldberg, D. M., Yan, J., Ng, E., Diamandis, E. P., Karumanchiri,
A., Soleas, G., Waterhouse, A. L., J. Agric. Food Chem. 1995, 43,
1245 1250.
[4] Kimura, Y., Ohminami, H., Okuda, H., Baba, K., Kozawa, M., Arichi, S., Planta Med. 1983, 49, 51 54.
[5] Lamuela Ravents, R. M., Romero Prez, A. I., Waterhouse, A. L.,
de la Torre Boronat, M. C., J. Agric. Food Chem. 1995, 43, 281 283.
[6] Jang, M., Cai, L., Udeani, G. O., Slowing, K., Thomas, C. F.,
Beecher, C. W. W., Fong, H. S. S., Farnsworth, N. R., Kinghorn, A.
D., Mehta, R. G., Moon, R. C., Pezzuto, J. M., Science 1997, 275,
218 220.
[7] Chanvitayapongs, S., Draczynska-Lusiak, B., Sun, A. Y., Neuroreport 1997, 8, 1499 1502.
[8] Frankel, E. N., Waterhouse, A. L., Kinsella, J. E., Lancet 1993, 341,
1103 1104.
[9] Pace-Asciak, C. R., Hahn, S., Diamandis, E. P., Soleas, G., Goldberg, D. M., Clin. Chim. Acta 1995, 235, 207 219.
[10] Orsini, F., Pelizzoni, F., Verotta, L., Aburjai, T., Rogers, C. B., J.
Nat. Prod. 1997, 60, 1082 1087.
[11] Arichi, H., Kimura, Y., Okuda, H., Baba, K., Kozawa, M., Arichi, S.,
Chem. Pharm. Bull. 1982, 30, 1766 1770.
[12] Stervbo, U., Vang, O., Bonnesen, C., Food Chem. 2007, 101, 449
457.
[13] Kallithraka, S., Arvanitoyannis, I., El-Zajouli, A., Kefalas, P., Food
Chem. 2001, 75, 355 363.
[14] Lamuela Raventos, R. M., Waterhouse, A. L., Methods Enzymol.
1999, 299, 184 190.
[15] Moreno-Labanda, J. F., Mallavia, R., Prez-Fons, L., Lizama, V.,
Saura, D., Micol, V., J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 5396 5403.
[16] Abert Vian, M., Tomao, V., Gallet, S., Coulomb, P. O., Lacombe, J.
M., J. Chromatogr. A 2005, 1085, 224 229.
[17] Abril, M., Negueruela, A. I., Prez, C., Juan, T., Estopan, G.,
Food Chem. 2005, 92, 729 736.
[18] Pour Nikfardjam, M. S., Lszl, G., Dietrich, H., Food Chem. 2006,
96, 74 79.
The authors acknowledge the Ministerio de Educacin y Ciencia

(Project: CTQ2005-02389) for financial support. Diego Airado
Rodrguez is grateful to Consejera de Infraestructura y Desarrollo Tecnolgico de la Junta de Extremadura for a fellowship
(DOE 22/06/04). Dra. Dolores Lpez Soto (Viaoliva S.C.) is also
acknowledged for providing wine samples.
www.jss-journal.com
MEN
SALIR
J. Sep. Sci. 2007, 30, 3110 3119
[19] Vitrac, X., Bornet, A., Vanderline, R., Valls, J., Richard, T., Delaunay, J. C., Mrillon, J. M., Teissdre, P. L., J. Agric. Food Chem. 2005,
53, 5664 5669.
[20] Vitrac, X., Monti, J. P., Vercauteren, J., Deffieux, G., Mrillon, J.
M., Anal. Chim. Acta 2002, 458, 103 110.
[21] Pieiro, Z., Palma, M., Barroso, C. G., J. Chromatogr. A 2006, 1110,
61 65.
[22] Rodrguez Delgado, M. A., Gonzlez, G., Prez Trujillo, J. P., Garca Montelongo, F. J., Food Chem. 2002, 76, 371 375.
[23] Bravo, M. N., Silva, S., Coelho, A. V., Vilas Boas, L., Bronze, M. R.,
Anal. Chim. Acta. 2006, 563, 84 92.
[24] Zhou, J., Cui, H., Wan, G., Xu, H., Pang, Y., Duan, C., Food Chem.
2004, 88, 613 620.
[25] Zhang, Q., Cui, H., Myint, A., Lian, M., Liu, L., J. Chromatogr. A
2005, 1095, 94 101.
[26] Loredana La Torre, G., Saitta, M., Vilasi, F., Pellican, T., Dugo,
G., Food Chem. 2006, 94, 640 650.
[27] Flamini, R., Dalla Vedona, A., Rapid Commun. Mass. Spectrom.
2004, 18, 1925 1931.
[28] Fan, E., Zhang, K., Yao, C., Yan, C., Bai, Y., Jiang, S., Chromatographia 2005, 62, 289 294.
3119
[29] Spanil, M., Pazourek, J., Farkov, M., Havel, J., J. Chromatogr. A
2005, 1084, 180 185.
[30] Peng, Y. Y., Chu, Q. C., Lin, F. H., Ye, J. N., J. Agric. Food Chem. 2004,
52, 153 156.
[31] Demianov, Z., Sirn, H., Kuldvee, R., Riekkola, M. L., Electrophoresis 2003, 24, 4264 4271.
[32] Brandolini, V., Maietti, A., Tedeschi, P., Durini, E., Vertuani, S.,
Manfredini, S., J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 7407 7411.
[33] Roggero, J. P., Garcia-Parrilla, C., Sci. Aliments 1995, 15, 411 422.
[34] Roggero, J. P., J. Food Comp. Anal. 2000, 13, 93 97.
[35] Unscrambler v. 6.11, CAMO A/S Olav Tryggvasonsgt, N-7011,
Trondheim, Norway.
[36] Galeano Daz, T., Durn Mers, I., Airado Rodrguez, D., Anal.
Bioanal. Chem. 2007, 387, 1999 2007.
[37] Galeano Daz, T., Durn Mers, I., Airado Rodrguez, D., Talanta
2007, available on line: http://dx.doi.org/10.1016/j.talanta.2007.
06.049.
[38] Chen, Y. H., Cheng, Y. L., Lin, C. H., J. Chromatogr. A 2002, 943,
287 294.
www.jss-journal.com
MEN
SALIR
This article appeared in a journal published by Elsevier. The attached

copy is furnished to the author for internal non-commercial research
and education use, including for instruction at the authors institution
and sharing with colleagues.
Other uses, including reproduction and distribution, or selling or
licensing copies, or posting to personal, institutional or third party
websites are prohibited.
In most cases authors are permitted to post their version of the
article (e.g. in Word or Tex form) to their personal website or
institutional repository. Authors requiring further information
regarding Elseviers archiving and manuscript policies are
encouraged to visit:
http://www.elsevier.com/copyright
MEN
SALIR
Author's personal copy
Available online at www.sciencedirect.com
Food Chemistry 109 (2008) 825833

www.elsevier.com/locate/foodchem
Analytical Methods
Post-column on-line photochemical derivatization

for the direct isocratic-LC-FLD analysis of resveratrol
and piceid isomers in wine
Isabel Duran-Meras *, Teresa Galeano-Daz, Diego Airado-Rodrguez
Departamento de Qumica Analtica, Facultad de Ciencias, Universidad de Extremadura, Avda. de Elvas s/n, C.P. 06071 Badajoz, Spain
Received 24 July 2007; received in revised form 28 December 2007; accepted 31 December 2007
Abstract
Resveratrol is a stilbene produced by plants, e.g. grapes, in response to stress. Resveratrol is extracted during winemaking, being present in wine as 3-O-b-D-gluocoside (piceid) and as aglycone. Both, resveratrol and piceid exist in two isomeric forms, trans and cis. Resveratrol and piceid are weakly uorescent in both of their isomeric forms, but highly uorescent compounds are obtained when the
original molecules are UV-irradiated. A chromatographic method with post-column on-line photoderivatization, has been developed
for the analysis of resveratrol and piceid isomers. The four analytes are rstly separated in a C18 column (150 mm 3.9 mm i.d.,
4 lm) by isocratic elution, at 15 C, with a mobile phase consisting of a mixture acetonitrile:o-phosphoric acid (0.04%), 18:82, v:v, at
0.9 mL min1, and secondly they are on-line phototransformed into their uorescent photoproducts in a 3 m PTFE tube coiled around
a 4 W xenon lamp. The elution conditions have been chemometrically optimized by means of the experimental design and the response
surface methodology. Linearity ranges from 0.10 to 1.50 and from 0.10 to 1.00 lg mL1 and LOD around 0.001 and 0.01 lg mL1 have
been calculated for trans- and cis-isomers, respectively. The method has been satisfactorily applied to red and white wine samples by
standard addition and external calibration, respectively.
2008 Elsevier Ltd. All rights reserved.
Keywords: Resveratrol; Piceid; Post-column photochemical derivatization; LC; Response surface methodology; Wine
1. Introduction
Resveratrol (3,40 ,5-trihydroxystilbene), is a stilbene produced by plants in response to fungal infection or abiotic
stresses such, e.g. produced by heavy metal ions. It occurs
in mulberries, peanuts and grapes. Grapes contain a large
amount of dierent phenolic compounds in skins, pulp
and seeds, that are partially extracted during winemaking
(Jackson, 1994).
It is believed that the high level of this compound in red
wine (0.115 mg/L, of total trans-resveratrol, i.e. aglycone
and glucoside forms) (Fremont, 2000) is linked to the low
incidence of heart diseases in some regions of France, the
Corresponding author. Tel./fax: +34 924289375.

E-mail address: iduran@unex.es (I. Duran-Meras).
0308-8146/$ - see front matter 2008 Elsevier Ltd. All rights reserved.
doi:10.1016/j.foodchem.2007.12.080
so-called French paradox, i.e. despite high fat intake,

mortality from coronary heart disease is lower due to the
regular drinking of wine (Corder et al., 2001; Soleas,
Diamandis, & Goldberg, 1997).
This compound has attracted considerable attention due
to its various biological and pharmacological activities,
including antioxidative and anticancer activities, being
implied in the inhibition of cellular events associated with
tumour initiation, promotion and progression (Savouret
& Quesne, 2002).
Resveratrol-3-O-b-D-glucoside (piceid) is the main component of the Polygonum cuspidatum root, used in Japanese
and Chinese folk medicine for the treatment of some cardiac ailments, including atherosclerosis and inammation.
trans-Resveratrol, trans-piceid, and their cis-isomers
have been found in wines (Lamuela-Raventos, RomeroPerez, Waterhouse, & de la Torre-Bororat, 1995).
MEN
826
SALIR
I. Duran-Meras et al. / Food Chemistry 109 (2008) 825833
c-Resveratrol, t-piceid, and c-piceid are physiologically

as important as t-resveratrol. It seems that t-piceid can be
more eectively absorbed than the aglycone; according to
Hollman (1997), the absorption of some phenols from the
diet is enhanced by conjugation with glucose.
Piceid has received such attention as resveratrol because,
in grape products, the concentration of the glucoside is,
usually, signicantly higher than the aglycone (Lamuela
Raventos & Waterhouse, 1999). The relative distribution
between the glucosilated and aglycone forms in wines, is
dependent on a number of factors such as fermentation
and ecological conditions (Moreno-Labanda et al., 2004).
It is a fact that resveratrol in all its forms is found in much
higher concentration in red grape varieties compared with
white grape ones.
On the other hand, due to the generally high ratio of tto c-isomers found in wines, it has been suggested that the
c-isomers could arise from light exposure of must or wine
during the winemaking process or possibly from light exposure of wine bottles during storage (Lamuela-Raventos
et al., 1995).
Numerous methods have been described to determine
the concentration of the four resveratrol derivatives in
wine, most of them, HPLC methods by acidic solvent
gradient elution. Currently, HPLC detection procedures
are based upon UV absorption (Abril, Negueruela, Perez,
Juan, & Estopanan, 2005; Castellari, Sartini, Fabiani,
Arfelli, & Amati, 2002; Vitrac et al., 2005), uorimetry
(Bravo, Silva, Coelho, Vilas Boas, & Bronze, 2006; Pineiro,
Palma, & Barroso, 2006; Vitrac, Monti, Vercauteren, Defeux, & Merillon, 2002), electrochemistry (Bravo et al.,
2006; Kolouchova Hanzlkova, Melzoch, Filip, & Smidrkal, 2004), and mass spectrometry (Bravo et al., 2006;
Loredana La Torre, Saitta, Vilasi, Pellicano, & Dugo,
lvarez, & Polo,
2006; Pozo-Bayon, Hernandez, Martn-A
2003).
t-Piceid and t-resveratrol themselves are weakly uorescent, but intense UV-irradiation of their alcoholic solutions, rst induces the isomerization into c-isomers, also
weakly uorescent, which very quickly disappear in favour
of highly uorescent compounds (Roggero & GarcaParrilla, 1995; Roggero, 2000). With the objective of
exploiting this photochemical behaviour, in favour of the
method sensitivity, a chromatographic method for the
analysis of total (t- plus c-) resveratrol and piceid in wine,
previous o-line irradiation of samples, has been proposed
(Galeano-Daz, Duran-Meras, & Airado-Rodrguez,
2007b). The aim of the present work was to design a system
in which the photochemical process occurs on-line after the
separation of isomers in the chromatographic column, i.e.
an on-line post-column LC method.
An isocratic mobile phase has been optimized for wine
analysis, by using the experimental design and the response
surface methodology (RSM). The method has been validated in terms of linearity and limits of detection, and
has been successfully applied to the analysis of wine
samples.
2. Experimental
2.1. Chemicals and solutions
All solvents were gradient grade for liquid chromatography (Merck, VWR International Eurolab, SL; Carretera
no. 152, km10; 08100 Mollet del Valles, Barcelona, Spain).
All other chemicals were of analytical reagent grade and
used without further purication. Ultrapure water,
obtained from a Millipore Milli-Q System, was used
throughout.
t-Resveratrol and t-piceid were obtained from Sigma
and Aldrich Chem. Co. (Sigma Aldrich Qumica, SA;
Avda. Valdelaparra, 53; 28100 Alcobendas, Madrid,
Spain) respectively, and used as received. Ethanolic stock
solutions (100 lg mL1) of each compound were prepared
and stored at 4 C in darkness. Fresh working standard
solutions were prepared by appropriate dilution of stock
solutions in ultrapure water.
c-Resveratrol and c-piceid were in situ obtained by exposure of solutions of their t-isomers containing 1.5 lg mL1
to the sunlight for a period of thirty seconds. The concentration of the obtained c-isomers was calculated through
the decrease of the chromatographic peaks of their respective t-isomers.
2.2. Wine samples
Several samples of red and white wine, were obtained in
the market. Samples were kept at 4 C avoiding exposure
to direct light.
2.3. Instrumentation and software
The chromatographic studies were performed on a HewlettPackard Mod. 1100 LC instrument, equipped with
degasser, quaternary pump, manual six-way injection valve
containing a 20 lL loop, UVvisible diode-array detector,
rapid scan uorescence spectrophotometer detector and
the CHEMSTATION software package to control the
instrument, data acquisition and data analysis. The analytical column used was a Nova-Pak C18, 150 mm 3.9 mm
pore size (Waters Millii.d., 4 lm particle size, and 60 A
pore). The column temperature was controlled by a coil
with re-circulating water, which temperature was selected
through a thermostatic bath. A post-column photoreactor
(Softron, Gynkotek HPLC, Germany), consisting of a
PTFE tube (3 m 0.3 mm I.D. 1.6 mm E.D.) coiled
around a 4 W xenon lamp, was placed between the UVvisible diode-array detector and the uorescence detector. The
mobile phase consisted of a mixture acetonitrile:o-phosphoric acid (0.04%), 18:82, v:v. Mobile phase components
were ltered through a 0.22 lm membrane nylon lter
and degassed by ultrasonication before use. The ow rate
was 0.9 mL min1. Fluorescence detection was performed
at 364 nm (kexc = 260 nm). A scan range from 200 to
500 nm was performed in DAD. Samples were ltered
MEN
SALIR
through 0.20 lm membrane PTFE lters (Millex-FG)

before injection.
The software package THE UNSCRAMBLER 6.11b
CAMO ASA (Unscrambler v. 6.11, CAMO A/S Olav Tryggvasonsgt, N-7011, Trondheim, Norway), running under
Windows XP, was used for the application of
chemometrics.
2.4. General procedure: calibration curves
Aliquots of t-resveratrol and t-piceid ethanolic solutions, containing between 1.0 and 10 lg of each one of
them, were placed in 10.0 mL volumetric asks, and ultrapure water was added up to the mark. Aliquots (20 lL) of
each solution were injected into the chromatographic system, previous ltration through 0.20 lm membrane PTFE
lters. The eluate was uorimetrically monitored at 364 nm
(kexc = 260 nm).
To obtain the calibration curves for the c-isomers, the
procedure was: solutions containing 1.5 lg mL1 of t-resveratrol and t-piceid were exposed to the sunlight for
thirty seconds. The resulting solutions were injected into
the chromatographic system and the concentration of
c-resveratrol and c-piceid in this solution was calculated
through the decrease observed in the chromatographic
peaks corresponding to their t-isomers, quantiable
through their respective calibration curves, previously
established. It was proven that the solutions containing
c-isomers, kept in the dark, were stable at least for 24 h.
Calibration curves for c-isomers were established from
c-resveratrol and c-piceid samples, prepared by successive
dilution of the sun-irradiated solutions, in the concentration range from 0.10 to 1.0 lg mL1. Aliquots (20 lL) of
each standard solution were injected into the chromatographic system, and eluted and monitored as previously
specied.
2.5. Procedure for the analysis of resveratrol and piceid
isomers in wine samples
2.5.1. Red wines
The analysis of the four compounds in red wine was carried out by the standard addition method. Identical aliquots of wine were added into a set of asks, and
increasing volumes of a standard mixture of the four isomers, previously quantied, and ultrapure water were
added to the mark. Aliquots (20 lL) of each one of these
solutions were injected into the chromatographic system.
2.5.2. White wines
In this case, the analysis was carried out by external
standard calibration. Aliquots of 5.0 mL of wines and
ultrapure water up to the mark were added in a 10-mL volumetric ask. 20 lL of the resulting solutions were directly
injected into the chromatographic system. The concentration of the four analytes in white wine was calculated from
their respective calibration graphs.
827
3. Results and discussion

The study about the photoinduced spectrouorimetric
behaviour of resveratrol and piceid has been recently published (Duran Meras, Galeano Daz, & Airado Rodrguez,
2008; Galeano Daz, Duran Meras, & Airado Rodrguez,
2007a). In short, hydroethanolic solutions of t-resveratrol
and t-piceid are weakly uorescent, showing two excitation
maxima centered to 225 and 318 nm & 230 and 300 nm,
respectively, and a single emission maxima centered to
385 and 395 nm, respectively. It has been proven that
intense UV-irradiation of those solutions, under a high
pressure mercury lamp, totally transforms resveratrol and
piceid into highly uorescent compounds with a sharp excitation maxima at 260 nm, and two emission maxima at 364
and 382 nm & 361 and 380 nm, respectively.
On the other hand, this photochemical behaviour, has
been also exploited for the chromatographic analysis resveratrol and piceid in wine, previous photochemical derivatization, (Galeano-Daz et al., 2007b). However, the main
drawback of that method is the fact that total amounts
(t- plus c-isomer) of each one of the analytes are determined,
and it is not possible to determine the relative isomeric distribution of each one of them, because no the original analytes
present in the sample, but their photoproducts, are injected
and separated into the chromatographic system. In the
method reported in this paper, t- and c-isomers of resveratrol
and piceid are eluted in their original state, and once eluted
and photometrically detected, they are phototransformed
into their respective uorescent photoproducts, in order to
increase the sensibility and selectivity in the detection.
Most of the previously proposed chromatographic methods for the analysis of these analytes in wine, are reverse
phase methods, and carry the elution out by a gradient,
being the mobile phases mixtures of diluted acid solutions
and organic solvents. Acetic and formic acids, and methanol and acetonitrile, are the most common acidic and
organic components of mobile phases, respectively. In the
development of a chromatographic method in which a
post-column derivatization reaction goes on-line, it is highly
important the composition of the mobile phase not only for
the separation, but for the detection. Thus, some previous
assays were carried out by uorescence spectroscopy. It
was proven that the post-column photoreaction goes
equally in neutral and acidic media when the pH was xed
by the addition of diluted hydrochloric acid. It was also proven the minor photoinduced uorescent signals obtained in
presence of any other acid, specially the organic ones, and
nally o-phosphoric acid was chosen as a compromising
solution. Regarding to the organic component of the mobile
phase, it was proven that the rate of the photoreactions and
the maximum photoinduced signal were similar in presence
of dierent percentages of methanol or acetonitrile. Finally
acetonitrile was chosen, mainly because of its lower viscosity, higher elution strength, and lower UV absorptivity.
A study was rst done to evaluate the eect of the
photoreactor on the uorimetric detection of a mixture of
MEN
SALIR
828
for the best environment for the reaction course, namely

acetonitrile as organic modier and o-phosphoric acid to
x the pH, were nally selected, as said above. On the other
hand, in the present case, a photochemical reaction is going
to take place, which implies that ultraviolet light could be
considered as one of the reactants, and its concentration
will be controlled through the residence time of the analytes in the photoreactor, that is, the mobile phase ow.
Because of this, the sensitivity of the method will be mainly
controlled through the mobile phase ow.
An isocratic mobile phase has been looked for, and for
the optimization of its composition, i.e. the percentage of
acetonitrile and o-phosphoric acid, and its ow rate, the
experimental design, namely a central composite design,
has been used with the aim of calculating simultaneously
the eect of the change in each one of the variables, and
also their possible interactions. Five levels were xed for
each variable. There are also three central samples, giving
rise to a total of 17 experiments. The assayed levels for each
one of the variables were: % vol. acetonitrile: 25.1, 23.0,
20.0, 17.0, 15.0; % vol. H3PO4: 0.05, 0.04, 0.03, 0.02,
0.01; ow: 1.50, 1.30, 1.00, 0.70, 0.50. This design is rotatable, and therefore the precision in the calculation of the
response is uniform over the whole experimental eld.
A standard solution containing 0.50 lg mL1 of t-resveratrol and t-piceid, respectively, and a sample containing
7.50 mL of a pool of commercial red wines, fortied with
13 lg of t-resveratrol and t-piceid, respectively, in a nal
volume of 25.0 mL, were eluted under the conditions indi-
t-resveratrol and t-piceid. For this purpose, a mixture of

both t-isomers was injected and eluted with a mobile phase
consisting in acetonitrile:water 19:81, v:v, with the photoreactor turned OFF. Two chromatographic peaks were
observed at 4.87 and 15.35 min, corresponding to t-piceid
and t-resveratrol, respectively. A second injection under
the same conditions, but with the photoreactor turned
ON, showed that both compounds were greatly modied
by photoreaction, and their uorescent photoproducts, discussed above, had been obtained in a certain extension.
Fig. 1A shows a comparison of the obtained FLD-proles
with and without post-column photoderivatization.
Besides, it was chromatographically proven that increasing the content of o-phosphoric acid in the mobile phase,
implies a slight reduction in the retention times and a loss
of sensitivity in t-resveratrol and t-piceid chromatographic
peaks.
Lastly it is too important to highlight that nylon lters
cannot be used to lter solutions containing resveratrol
or piceid because it was proven that 100% of the analyte
was retained in the membrane. Hydrophobic uoropore
(PTFE) lters are used throughout this work.
3.1. Optimization of the chromatographic conditions, by the
RSM, for the sensitive analysis of wine samples
Separation and photoreaction results have to be taken
into account to select the best mobile phase. Thus the nature of the mobile phase components was chosen looking
A
F. I. (exc/em 260/364 nm)
10
8
t-Resveratrol
t-Piceid
6
4
2
0
0
10
12
14
16
18
t (min)
35
F. I. (exc/em 260/364 nm)
30
25
unknown
20
15
t-Piceid
10
t-Resveratrol
5
0
0
10
12
14
16
18
t (min)
Fig. 1. (A) Chromatograms corresponding to a mixture containing 1.00 lg mL1 of t-resveratrol and t-piceid, obtained with the photoreactor turned
OFF () and ON ( ). Mobile phase acetonitrile:water 19:81, v:v, 0.9 mL min1; FLD at kexc/em 260/364 nm. (B) FLD-proles (FLD kexc/em 260/
364 nm) corresponding to a standard sample containing 0.50 lg mL1 of trans-resveratrol and trans-piceid, respectively (), and a sample containing
7.50 mL of a pool of commercial red wines, fortied with 13.0 lg of trans-resveratrol and trans-piceid, respectively, in a nal volume of 25.0 mL ( ),
eluted under conditions predicted as optimum and submitted to post-column photoderivatization.
MEN
SALIR
829
cated by the design. The photoreactor was turned ON during all the experiments, and the eluate was photometrically
and uorimetrically monitored at 306 nm, and kexc/em 260/
364 nm, respectively.
In the selection of the response function (RF), sensitivity
and sensibility parameters have been taken into account.
The selected response function was

PAt-Rht PAt-Pht
RF Rst-Pic
PA Peak Area
2
norm
The rst term represents the performance of the chromatographic separation, and the second one, the method
sensitivity. The resolution of the t-piceid peak with respect
to the wine interferences is taken as representative of the
performance. In some samples of the design, this peak
appears resolved from the pre-eluted or the post-eluted
interferences, and in some other points it is completely
co-eluted with wine interferences. So, Rst-Pic is the less
favourable resolution value for the peak corresponding to
t-piceid, multiplied by two when the other resolution value
for this peak is higher than 1.5. The peak corresponding to
t-resveratrol was fully resolved in all of the assayed conditions, and because of this, the resolution of this peak was
not included in the response function. The second term,
evaluates the sensitivity through peak areas values. These
depend on the photoreaction yield and uorescence quantum yield of the on-line generated photoproducts. This
term has been obtained by normalizing the mean value of
the peak areas of phototransformed t-resveratrol and
t-piceid, measured in the standard mixture chromatograms.
The strategy of normalizing the second term has been carried out to give a similar importance to both terms. The
retention times were not considered, as in any case they
were not longer than 30 min, an acceptable analysis time
for an isocratic method.
The optimization of the model was made with THE
UNSCRAMBLER software package (Unscrambler v.
6.11, CAMO A/S Olav Tryggvasonsgt, N-7011, Trondheim, Norway), and the results were interpreted with the
Response Surface Methodology. In the corresponding
analysis of variance (ANOVA) a second-grade quadratic
model is assumed (model check quadratic, p-value
(95%) = 0.0008). It was proven that the eects % ACN
(p-value = 0.0310) and ow (p-value = 0.0067) and the
interactions % ACN% ACN (p-value = 0.0019), %
H3PO4% H3PO4 (p-value = 0.0002), and owow
(p-value = 0.0001) contribute signicantly to the model
for a 95% condence level. Nevertheless, the eect %
H3PO4 (p-value = 0.0765), and the interactions % ACN
% H3PO4 (p-value = 0.1348), % ACNow (p-value =
0.1013), and % H3PO4ow (p-value = 0.1725) are not signicant to the model for the considered condence level.
On the other hand, the p-value (95%) calculated for lack
of t was 0.0583, which means that the model describes
the true shape of the response surface. Fig. 2 shows the
response surfaces estimated by the model, for each pair
Fig. 2. Estimated response surfaces for each pair of variables.
of variables. In these surfaces, the maximum value of RF

corresponds to the values of variables: 18% ACN,
3.3 102 % H3PO4, and ow 0.9 mL min1. Thus, the
mobile phase selected as optimum was acetonitrile:o-phosphoric acid (0.04%), 18:82, v:v, at a ow rate of
0.9 mL min1. Under these conditions, both analytes are
MEN
SALIR
830
3.3. cistrans Isomery
resolved to the baseline in less than 15 min, as shown in

Fig. 1B, and the retention times and capacity factors are
4.65 and 14.37 min, and 2.1 and 8.58, respectively, for
t-piceid and t-resveratrol, respectively.
It has been described in the literature (Roggero, 2000;

Roggero & Garca-Parrilla, 1995), and spectrophotometrically proven (Duran Meras et al., 2008; Galeano Daz
et al., 2007a), the cistrans photoisomery of resveratrol
and piceid.
c-Resveratrol and c-piceid are originated by exposing
the corresponding t-isomers to sunlight, as shown in
Fig. 3A. When the sunlight-exposed sample is eluted under
conditions previously deducted as optimum, two new peaks
are observed at 11.30 and 35.04 min, corresponding to
c-piceid and c-resveratrol, respectively, apart from peaks
corresponding to t-resveratrol and t-piceid. The establishment of the nature of those peaks has been carried out
by obtaining the spectra in the peak with the diode-array
detector. The peaks corresponding to c-isomers are totally
resolved with regard to the corresponding to the t-ones. On
the other hand, c-isomers are less polar than the t-ones,
probably due to the intra-molecular interaction type
hydrogen-bond between hydroxyl groups.
In Fig. 3B, the FLD-chromatogram corresponding to a
commercial red wine sample 20-times diluted, and a standard mixture of t-resveratrol and t-piceid 30 s exposed to
the sunshine, are shown. In both cases the photoreactor
is turned ON, and the corresponding uorescent photoproducts from t- and c-isomers are successfully obtained.
3.2. Inuence of the temperature

In a study of the interday precision, a poor reproducibility in the retention times for both compounds, and in the
resolution of the peak corresponding to t-piceid with
regard to the wine interferences, was observed when injections were carried out without xing the column temperature, and because of this, the inuence of the temperature
was thoroughly studied at this point.
Thus, a standard sample containing 1.0 lg mL1 of tresveratrol and t-piceid, and a commercial red wine sample
three-times diluted with ultrapure water, were eluted under
optimum conditions, keeping constant the column temperature by a coil with re-circulating water, which temperature
was controlled through a thermostatic bath. The assayed
values were 10, 15, 20, 25, and 30 C.
An increase in the capacity factors of both compounds
was observed as decreasing the temperature. On the other
hand, it was found that when the temperature was higher
than 15 C, a wine interference coeluted with t-piceid.
Finally, a temperature of 15 C was selected as optimum,
and it was xed for further analysis.
0
240
6
A290 nm (mAu)
t-Res
t-Pic
0
240
0.5
360
c-Res
360
c-Pic
0
240
0.5
0
240
360
360
0
-2
0
10
20
30
40
t (min)
200
F. I. (exc/em 260/364 nm)
160
t-Res
t-Pic
120
Unknown
80
c-Pic
c-Res
40
0
0
10
20
30
40
t (min)
Fig. 3. (A) A290 nm-proles corresponding to a sample containing 0.80 lg mL1 of trans-resveratrol and trans-piceid before ( ) and after (-) a 30 s
exposure to the sunshine, and apex-spectra on-line registered. (B) FLD-proles corresponding to a sample containing 1.40 lg mL1 of trans-resveratrol
and trans-piceid 30 s exposed to sunshine ( ) and a commercial red wine 20-times diluted (-).
MEN
SALIR
As it is observed, the four isomers are present in the real

sample. It is also observed a total resolution between the
four compounds of interest and the wine interferences,
and because of that it was not considered to change the
mobile phase.
It has been proven that intense ultraviolet irradiation,
under a high pressure mercury lamp, totally transform
t- and c-resveratrol and t- and c-piceid in highly uorescent
photoproducts. A single photoproduct (FR) is originated
from resveratrol, and two photoproducts (FP1 and FP2),
isomers between them, from piceid (Galeano-Daz et al.,
2007b). It is very important to highlight that the exposition
to the sunshine has to be carried out for a time not so long
in order to avoid the appearance of the corresponding uorescent photoproduct FP1, FP2, and FR, and thus avoiding errors in the c-quantication. It has been proven that
only c-isomers, and not the uorescent forms, are generated when samples are exposed for 30 s under the sunshine,
by comparing the chromatograms obtained for a sample
irradiated under a high pressure mercury lamp in the necessary conditions to obtain the uorescent compounds,
and the corresponding to a 30 s exposed to the sunshine.
This fact has also been proven by following the photoreaction at the wavelength (275 nm) corresponding to the isobestic point of the on-line obtained spectra for each pair
of t- and c-isomers. This isobestic point is shown in
Fig. 4, where the spectra obtained in the peak apex for
the pair c- and t-piceid are represented. Since at this wavelength the molar absorptivity of both isomers is the same,
21
A (mAu)
A (mAu)
14
831
the peak area vs. concentration ratio is also the same for
the two peaks. Thus, the total area must be kept constant
as the concentration of each pair cistrans does. This has
been proven to be true in the present case, and it was also
conrmed by the absence of any other photoproducts.
With the aim of quantifying the four isomers in wine,
the corresponding calibration graphs for the c-isomers
were obtained by relating the area of the new peak attributed to the c-isomers, with the dierence between the concentrations of t-isomers, prior and after exposure to
sunshine.
3.4. Method validation: analytical parameters
The linearity of the method, was assessed by preparing
calibration standards with concentration from 0.10 to
1.50 lg mL1 of t-resveratrol and t-piceid and from 0.10
to 1.00 lg mL1 of c-resveratrol and c-piceid, as previously
explained. Each standard was introduced in the chromatographic system in triplicate, and eluted under optimum
conditions. Calibration curves for each one of the four analytes, were built by plotting the mean of the obtained area
for the phototransformed analytes as a function of the
standard concentration. The results obtained are summarized in Table 1.
The limits of detection (LOD) and quantication (LOQ)
were obtained as 3 and 10 times, respectively, the ratio signal/noise. So, the average amplitude of the baseline of standard chromatograms, measured in dierent zones, for time
intervals around 2 min, was multiplied by 3 or 10, and the
concentrations of the respective analyte to these signals,
were calculated with the respective calibration curves constructed employing the peak height as analytical signal.
The obtained values are summarized in Table 1.
3.5. Determination of resveratrol and piceid isomers in wine

samples
3
2
1
240
280
320
(nm)
360
240
280
320
(nm)
360
Fig. 4. Apex-spectra on-line obtained corresponding to a solution

containing trans-piceid before exposure to sunshine (-), and after a
exposure of 30 s (-) and 60 s ( ). Isobestic point, at 275 nm, is rounded
in the right gure.
The optimized method was applied to the analysis of

wine samples.
Firstly, a standard addition was carried out on commercial red and white wines pools in order to examine the possible matrix eect. Within the assayed whites wines it was
proven the absence of matrix eect, and because of that,
further analysis were carried out by external calibration.
Table 1
Analytical and statistical parameters for the chromatographic determination of resveratrol and piceid isomers (FLD kexc/em 260/364 nm)
1
Linearity range (lg mL )

Calibration curve
(peak area vs. lg mL1)
r
LODa (lg mL1)
LOQb (lg mL1)
a
b
S/N = 3.
S/N = 10.
t-Resveratrol
c-Resveratrol
t-Piceid
c-Piceid
0.101.50
y = (10581 355)x
(673 340)
0.9944
0.0012
0.0041
0.101.00
y = (2820.2 185.1)x
+ (320.3 104.7)
0.9957
0.014
0.046
0.101.50
y = (4366.9 112.6)x
(432.9 117.0)
0.9967
0.0014
0.0047
0.101.00
y = (1902.5 241.5)x
+ (166.4 116.7)
0.9843
0.0071
0.023
MEN
SALIR
832
Table 2
Concentration of resveratrol and piceid isomers found in the analyzed wines. Analysis was done in triplicate in all cases
Commercial red wines POOL 1

Commercial red wines POOL 2
Commercial white wines POOL
Noble rot white wine (Tokaji)
t-Piceid
(lg mL1)
c-Piceid
(lg mL1)
t-Resveratrol
(lg mL1)
c-Resveratrol
(lg mL1)
6.5 0.5
1.2 0.1
0.099 0.013
0.29 0.05
2.9 0.3
1.5 0.1
0.42 0.02
0.70 0.02
1.4 0.1
0.070 0.050
0.054 0.009
0.070 0.010
0.21 0.12
0.060 0.020
0.068 0.010
0.064 0.050
In red wines, unlike in the white ones, it was found the existence of matrix eect, which implies that the analysis has to
be carried out by the standard addition method. Besides it
was deducted that the origin of this matrix eect is in the
photochemical process, because no matrix eect was
observed when peak areas were measured in the DAD-prole, being this detector before the photochemical reactor in
the experimental device.
Two commercial red wines pools and a white one were
analyzed. Besides a noble rot white wine, from Hungary
(Tokaji) was also analyzed. Results are summarized in
Table 2. Higher levels of the four compounds, mainly of
piceid isomers, are found in this wine than in an ordinary
white wine, because this one is made from botrytized grapes.
4. Conclusions
Resveratrol and piceid molecules are stilbenoids ones,
and as such they suer interesting photochemical reactions.
Our research group following with the aim of exploiting
this photochemical behaviour, proposes an isocratic-LC
method with post-column on-line photoderivatization,
which let us rstly separate the cistrans-pairs, and then
phototransform each compound in a highly uorescent
one. The photochemical reaction has been doubly exploited
in this case, rstly to obtain the c-compounds, which are
not commercially available, and secondly to improve the
uorimetric detection.
As far as we know this is the rst time that an on-line
post-column photoderivatization system is proposed for
resveratrol and piceid isomers analysis.
The analysis of four compounds in wine samples has
been carried out in a total time of 35 min, without sample
treatment.
Acknowledgement
The authors acknowledge to Ministerio de Educacion y
Ciencia (Project CTQ2005-02389) for nancial support.
Diego Airado Rodrguez is grateful to Consejera de Infraestructura y Desarrollo Tecnologico de la Junta de Extremadura for a fellowship (DOE 22/06/04).
References
Abril, M., Negueruela, A. I., Perez, C., Juan, T., & Estopanan, G. (2005).
Preliminary study of resveratrol content in Aragon red and rose wines.
Food Chemistry, 92, 729736.
Bravo, M. N., Silva, S., Coelho, A. V., Vilas Boas, L., & Bronze, M. R.
(2006). Analysis of phenolic compounds in Muscatel wines produced in
Portugal. Analytica Chimica Acta, 563, 8492.
Castellari, M., Sartini, E., Fabiani, A., Arfelli, G., & Amati, A. (2002).
Analysis of wine phenolics by high-performance liquid chromatography using a monolithic type column. Journal of Chromatography A,
973, 221227.
Corder, R., Douthwaite, J. A., Lees, D. M., Khan, N. Q., dosSantos, A.
C. V., Wood, E. G., et al. (2001). Endothelin-1 synthesis reduced by
red wine. Nature, 414, 863864.
Duran Meras, I., Galeano Daz, T., & Airado Rodrguez, D. (2008).
Determination of piceid by photochemically induced uorescence and
second-derivative. Response surface methodology for the optimization
of a liquidliquid extraction procedure for its analysis in wine samples.
Talanta, 74, 675682.
Fremont, L. (2000). Biological eects of resveratrol. Life Sciences, 66,
663673.
Galeano Daz, T., Duran Meras, I., & Airado Rodrguez, D. (2007a).
Determination of resveratrol in wine by photochemically induced
second-derivative uorescence coupled with liquidliquid extraction.
Analytical and Bioanalytical Chemistry, 387, 19992007.
Galeano-Daz, T., Duran-Meras, I., & Airado-Rodrguez, D. (2007b).
Isocratic chromatography of resveratrol and piceid after previous
generation of uorescent photoproducts: Wine analysis without
sample preparation. Journal of Separation Science, 30, 31103119.
Hollman, P. C. H. (1997). Bioavailability of avonoids. European Journal
of Clinical Nutrition, 51, 6669.
Jackson, R. S. (1994). Wine science. New York: Academic Press.
Kolouchova Hanzlkova, I., Melzoch, K., Filip, V., & Smidrkal, J. (2004).
Rapid method for resveratrol determination by HPLC with electrochemical and UV detections in wines. Food Chemistry, 87, 151
158.
Lamuela-Raventos, R. M., Romero-Perez, A. I., Waterhouse, A. L., & de
la Torre-Bororat, M. C. (1995). Direct HPLC analysis of cis- and
trans-resveratrol and piceid isomers in Spanish red Vitis vinifera wines.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 43, 281283.
Lamuela Raventos, R. M., & Waterhouse, A. L. (1999). Resveratrol and
piceid in wine. Methods in Enzymology, 299, 184190.
Loredana La Torre, G., Saitta, M., Vilasi, F., Pellicano, T., & Dugo, G.
(2006). Direct determination of phenolic compounds in Sicilian wines
by liquid chromatography with PDA and MS detection. Food
Chemistry, 94, 640650.
Moreno-Labanda, J. F., Mallavia, R., Perez-Fons, L., Lizama, V., Saura,
D., & Micol, V. (2004). Determination of piceid and resveratrol in
Spanish wines deriving from Monastrell (Vitis vinifera L.) grape
variety. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, 5396
5403.
Pineiro, Z., Palma, M., & Barroso, C. G. (2006). Determination of transresveratrol in grapes by pressurised liquid extraction and fast highperformance liquid chromatography. Journal of Chromatography A,
1110, 6165.
lvarez, P. J., & Polo, M.
Pozo-Bayon, M. A., Hernandez, M. T., Martn-A
C. (2003). Study of low molecular weight phenolic compounds during
the aging of sparkling wines manufactured with red and white grape
varieties. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, 20892095.
Roggero, J. P. (2000). Study of the ultraviolet irradiation of resveratrol in
wine. Journal of Food Composition and Analysis, 13, 9397.
MEN
SALIR

Roggero, J. P., & Garca-Parrilla, C. (1995). Eects of ultravioletirradiation on resveratrol and changes in resveratrol and various of its
derivatives in the skins of ripening grapes. Sciences des Aliments, 15,
411422.
Savouret, J. F., & Quesne, M. (2002). Resveratrol and cancer: A review.
Biomedicine & Pharmacotherapy, 56, 8487.
Soleas, G. J., Diamandis, E. P., & Goldberg, D. M. (1997). Resveratrol: A
molecule whose time has come? and gone? Clinical Biochemistry, 30,
91113.
833
Vitrac, X., Bornet, A., Vanderline, R., Valls, J., Richard, T., Delaunay, J.
C., et al. (2005). Determination of stilbenes (delta-viniferin, transastringin, trans-piceid, cis- and trans-resveratrol, epsilon-viniferin) in
Brazilian wines. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53,
56645669.
Vitrac, X., Monti, J. P., Vercauteren, J., Deeux, G., & Merillon, J. M.
(2002). Direct liquid chromatographic analysis of resveratrol derivatives and avanonols in wines with absorbance and uorescence
detection. Analytica Chimica Acta, 458, 103110.
MEN
SALIR
USEFULNESS
OF
FLUORESCENT
LANDSCAPES
IN
COMBINATION WITH PARAFAC AS FINGERPRINTS OF RED

WINES
1.- INTRODUCTION
The interest in studying the chemical composition of wine is prompted by
its importance for the assessment of wine quality. It is important to develop
fast analytical methods without sample pre-treatment. In the last years the
quality of wines has been highly improved by the wine industry and also
the customers are raising their demand on the quality. Tools to handle and
address the chemical analysis of these wines are becoming a necessity in
wine industry in order to automate the production and stabilize the quality.
Tools that allow classification of the wine depending on the region of
origin, type of grapes used in the elaboration, or winemaking process can be
helpful for this industry.
Multidimensional fluorescence techniques, such as total luminescence is
particularly useful for the analysis of complex food matrices. Total
luminescence spectroscopy involves sequential acquisition of excitation or
emission spectra at multiple emission or excitation wavelengths,
respectively. The resulting emission-excitation data matrix (EEM) provides
a total intensity profile of the sample over the range of excitation and
emission wavelengths scanned. These methods are fast, non-invasive,
sensitive and relatively low-cost. In addition, these techniques provide
information about fluorescent molecules and their environment in
biological and food samples, and are reported to be 100-1000 times more
sensitive than other spectroscopic techniques1.
1
G.M. Strasburg, R.D. Ludescher, Trends Food Sci. Technol. 6 (1995) 69-75
MEN
SALIR
In recent years, research has focused on the development of rapid and nondestructive techniques for the assessment of authenticity and classification
of food products. Fluorescence spectroscopy is widely used to characterize
the food quality, because of its high sensitivity and specificity and its
possible use as non-destructive technique.
Conventional right angle fluorescence is as a common detection technique
mostly used in transparent and diluted solutions extracted from the sample,
either directly or after chromatographic separation. More recently, front
face fluorescence is recorded directly on the turbid or solid intact samples
to rapidly and non-destructively assess food authenticity or monitor some
parameters. The front-face illumination angle may vary between 30 and
60. Thus, fluorophores such as riboflavin, chlorophyll, tryptophan, tyrosin,
phenylalanine, NADH, collagenous connective tissue and various oxidation
products can be detected and quantified non-destructively.
Dufour and co-workers have previously assayed the usefulness of single
excitation (250-350 nm, em 376 nm) and emission (275-450 nm, exc 261
nm) spectra of wines for the purpose of investigating the variety, typicality
and vintage of French and German wines. Emission spectra were
characterized by a maximum at 376 nm, with a shoulder at 315 nm. The
most important variation within the set of registered spectra for the studied
samples, was found in the ratio peak/shoulder intensity. This preliminary
study shows that front-face fluorescence spectroscopy combined with
chemometrics offers a promising approach for the authentification of
wines2.
Bilinear models have been successfully applied to evaluate single
autofluorescence spectra of meat3, fish4, dairy products5, cereals6, fruit
2
. Dufour, A. Letort, A. Laguet, A. Lebecque, J.N. Serra, Anal. Chim. Acta 563 (2006)
292-299
3
J. P. Wold, M. Mielnik, M. K. Pettersen, K. Aaby, P. Baardseth, J. Food Sci. 67 (2002)
2397-2404
MEN
SALIR
juices7 and honey8. EEMs, however, have been shown to follow the threeway PARAFAC (PARAllel FACtor analysis) decomposition model9,10, and
such multiway models have been applied to autofluorescence landscapes of
intact food systems11, such as sugar12, meat13, fish oil14, cheese15, yogurt16
and edible oils17,18. Nevertheless, no previous references to the usefulness
of fluorescence landscapes of wines have been found. The potential of
fluorescent signals for the classification purpose is most likely increased
when increasing the dimensionality of the data, thus 3D-data would often
be more powerful than 2D ones, especially for interpretation purposes. Thus
the total excitation-emission fluorescent matrices of red wines have been
deeply studied in the present paper.
The main aim of this work was to detect the main fluorescent components
in red wine in order to improve the interpretation of the rather complex
fluorescence spectra, as well as better understand the potential of the
method. This was done by the use of a PARAFAC model applied on
fluorescence landscapes of different wine samples. A wide variety of red
C. M. Andersen, J. P. Wold, J. Agric. Food Chem. 51 (2003) 470-476

J. P. Wold, A. Veberg, A. Nilsen, V. Iani, P. Jucenas, J. Moan, Int. Dairy J. 15 (2005)
343-353
6
A. Kissmeyer-Nielsen, S. A. Jensen, L. Munck, J. Cereal Sci. 3 (1985) 181-192
7
P. Seiden, R. Bro, L. Poll, L. Munck, J. Agric. Food Chem. 44 (1996) 3202-3205
8
K. Ruoff, R. Karoui, E. Dufour, W. Luginbuhl, J. O. Bosset, S. Bogdanov, R. Amado, J.
Agric. Food Chem. 53 (2005) 1343-1347
9
R. Bro, Chemom.Intell.Lab.Syst. 38 (1997)149-171
10
C. M. Andersen, R. Bro, J.Chemom. 17 (2003) 200-215
11
J. Christensen, L. Norgaard, R. Bro, S. B. Engelsen, Chemical Reviews 106 (2006) 19791994
12
R. Bro, Chemom. Intell. Lab. Syst. 38 (1997) 149-171
13
J. K. S. Moller, G. Parolari, L. Gabba, J. Christensen, L. H. Skibsted, J. Agric. Food
Chem. 51 (2003) 1224-1230
14
D. K. Pedersen, L. Munck, S. B. Engelsen, J. Chemom. 16 (2002) 451-460
15
J. Christensen, E. M. Becker, C. S. Frederiksen, Chemom. Intell. Lab. Syst. 75 (2005)
201-208
16
J. Christensen, V. T. Povlsen, J. Sorensen, J. Dairy Sci. 86 (2003) 1101-1107
17
E. Sikorska, A. Romaniuk, I. V. Khmelinskii, R. Herance, J. L. Bourdelande, M.
Sikorski, J. Koziol, J. Fluoresc. 14 (2004) 25-35
18
F. Guimet, J. Ferre, R. Boque, F. X. Rius, Anal. Chim. Acta 515 (2004) 75-85
5
MEN
SALIR
wine samples from different origins were collected in order to span the
quality variation and reveal corresponding differences in fluorescence
properties. A tentative identification of the fluorophores in wine was done
by matching the PARAFAC-scores from each sample, with HPLC results,
laying down qualitative principles for further development of quantitative
methods for the fast measure of the concentration of such fluorophores.
Furthermore, taking into account that wines from different countries are
included in the model, the capability of the intrinsic fluorescence of wines
for the purpose of classification, according to the origin, is assessed. This
purpose is highly important for wine importing countries.
2.- MATHERIALS AND METHODS
2.1.- WINE SAMPLES
57 red wines from different origin were included in this study. Two samples
from France, 16 from Chile, 3 from South Africa, 6 from Australia (2 of
them from the Western zone), 3 from Spain, 6 from Argentina, 3 from
USA, 15 from Italy, 1 from Tunisia, and 2 from Portugal. Samples were
stored at 4 C, and the fluorescence landscape was registered immediately
after opening the bottle. Origin of samples and type of grape, when this data
is available is summarized in Table 1.
2.2.- FLUORESCENCE SPECTROSCOPY
Fluorescence measurements were collected with a Perkin Elmer LS50B
fluorescence spectrophotometer mounted with a variable angle front-face
accessory to ensure that reflected light, scattered radiation and
depolarisation phenomena were minimised. The angle of incidence, defined
as the angle between the excitation beam and a perpendicular to the cell
surface, was 30. Wine samples were placed in a 3 mL quartz cell and
spectra were recorded at 15C. Slits at excitation and emission
MEN
SALIR
monochromators were set at 15 and 5 nm, respectively. Acquisition speed

was fixed at 500 nm/min, as a compromising solution between noise in the
spectra and collection time. Excitation and emission wavelengths ranges
were 245-340 and 300-498.5 nm, respectively, with wavelengths
increments of 5 and 0.5 nm, respectively. The landscape was registered as
multiple emission spectra at decreasing excitation wavelengths, starting at
340 and finishing at 245 nm, to avoid sample alteration by the UV
excitating beam. Total scanning time per sample was approximately 10
minutes. Measurements were performed within a short period of time (6
days) to minimize the effect of instrumental fluctuation (e.g. lamp
intensity).
2.3.- FLUORESCENCE MEASUREMENTS ON STANDARDS
All chemicals were of analytical grade. Ultrapure water, obtained from a
Millipore Milli-Q System, was used throughout.Gallic acid, p-coumaric
acid, ellagic acid, ferulic acid, gentisic acid, trans-resveratrol, trans-piceid,
quercetin, rutin, catequin and epicatequin were obtained from Sigma.
Vanillic acid, caffeic acid and sinapic acid, were obtained from Fluka.
Stock solutions of standards were prepared in ethanol. Diluted solutions
were prepared in a synthetic wine matrix, containing 3 g/L of tartrate buffer
at pH 3.7, and 13 % v. of ethanol. Instrumental settings were similar to
those employed in wine analysis, but in the 90 geometry.
2.4.- HPLC ANALYSIS
With the objective of reaching a better knowledge of fluorescent molecules
in wine samples, the 57 samples were chromatographied and the eluate was
fluorimetrically monitored at the excitation/emission wavelengths pairs
corresponding to the resulting PARAFAC components. An appropriate
gradient program was chosen to carry out the elution of samples, with the
MEN
SALIR
objective of getting a good separation and a good profile of the fluorescent

compounds in wine at each specific excitation/emission pair. Thus, three
injections were made of each sample, monitoring the eluate at exc/em
260/360 (compromising wavelengths for PARAFAC component 1 and 4),
275/320 (PARAFAC component 2) 330/410 nm (PARAFAC component
3), respectively.
The chromatographic separation was carried out using as mobile phase
methanol-formic acid-water (10:2:88, v:v) as solvent A and methanolformic acid-water (90:2:8, v:v) as solvent B with the following gradient
program: 0 min 100 % A; 15 min 85 % A : 15 % B; 25 min 50 % A : 50 %
B; 34 min 30 % A : 70 % B. The flow rate was set at 0.25 mLmin-1.
All solvents were gradient grade for liquid chromatography (Merck). All
other chemicals were of analytical reagent grade and used without further
purification. Ultrapure water, obtained from a Millipore Milli-Q System,
was used throughout.
2.5.- MATHEMATICAL ANALYSIS OF DATA
2.5.1.- PRETREATMENT OF DATA SET
Rayleigh signals in all of the EEM were removed by inserting the Matlab
term NaN (Not a Number) in the Rayleigh zones and zeros in the zones
where em<exc, because there is no emission at wavelengths below the
excitation wavelength as this would correspond to higher energy being
emitted than the energy causing the excitation. Zeros in this zone speeds up
the calculations.10
2.5.2.- PARAFAC analysis
When a sample produces a J x K matrix (a second order tensor), such as an
EEM (J = number of emission wavelengths, K = number of excitation
MEN
SALIR
wavelengths), the corresponding set obtained by stacking all the

registered matrices is a cube. Appropriate dimensions of such a cube are I x
J x K (I = number of samples). Since EEMs follow a trilinear model, the
cube can be written as a sum of tensor product of three vectors for each
fluorescent component. If An, Bn, and Cn collect the relative concentration
(I x 1), emission (J x 1), and excitation (K x 1) profiles for component n,
respectively, the data cube F can be written as19,20
N
F=
An Bn Cn + E
n =1
where indicates the tensor product, N is the total number of fluorescent

components, and E is a residual error term of the same dimensions as F.
The column vectors An, Bn, and Cn are usually collected into the three
loading matrices A, B, and C.
A characteristic property of F is that it can be uniquely decomposed,
providing access to spectral profiles (B and C) and relative concentrations
(A) of individual components in the I mixtures, whether they are chemically
known or not. This constitutes the basis of the so-called second-order
advantage (second-order refers to the tensor order of a single sample data
matrix, in contrast to third-order, as referred to the cube formed by the
matrices of I samples).
The PARAFAC analysis was performed in Matlab ver. 7.1.0 (The
Mathworks Inc., MA, USA) by use of the PLS_Toolbox (Eigenvector
Research Inc., WA, USA).
To look into the whole set of fluorescence data, the EEMs of the 57 samples
were arranged in a three-dimensional structure of size 57 x 398 x 20
(samples x number of emission wavelengths x number of excitation
19
Ewing, G.W. Instrumental methods of chemical analysis; Mc. Graw-Hill; New York,
1985
20
Leurgans, S; Ross, R.T. Stat Sci. 1992, 7, 289-319
MEN
SALIR
wavelengths). The array was decomposed by PARAFAC using different

number of factors. In all cases non-negative constrains for the resolved
profiles in all modes were applied. This was done to obtain a realistic
solution, because the concentrations and the spectra should be positive.
2.5.3.-
PRINCIPAL
COMPONENT
ANALYSIS
OF
SCORE VALUES
Principal component analysis (PCA) is a powerful visualisation tool for
data evaluation, which can graphically represent inter-sample and intervariable relationships and provides a way to reduce the dimensionality of
the data. PCA is an unsupervised method of pattern recognition in the sense
that no grouping of the data has to be known before the analyses. Using
PCA, class membership is easy to indicate on a score plot.
The set of sample score values obtained in the PARAFAC decomposition
were analysed by PCA, to analyse possible discrimination among origin
and type of grape. PCA was run by means of The Unscrambler software
package21.
3.- RESULTS AND DISCUSSION
3.1.- EXCITATION-EMISSION MATRICES OF RED WINES
The EEMs corresponding to four of the analysed wines samples are shown
in Figure 1 in the form of landscapes, and also the emission and excitation
spectra, extracted from these matrices, at the specified wavelengths in the
Figure caption. All samples fluoresce in the emission region between 300
and 400 nm, when they are excited at wavelengths under 290 nm. The
excitation and emission spectra previously published by Dufour et al2 for
discrimination of French and German wines, belong to this fluorescent
21
Unscrambler v. 6.11b, CAMO A/S Olav Tryggvasonsgt, N-7011, Trondheim, Norway
MEN
SALIR
zone. However, as shown in Figure 1, this region is too complex to obtain a

full overview by using sets of single pairs of excitation and emission
spectra. Another fluorescent region can be found in some of these maps,
more red-shifted in the excitation axis, in the emission zone around 350 and
450 nm, when exciting the sample at wavelengths longer than 290 nm.
In the emission spectra at an excitation wavelength of 260 nm (blue), a
wide band centred to 372 nm is observed, in which two maxima can be
distinguished at 363 and 380 nm. The intensity ratio for these two maxima
is dependent on the sample, as previously described by Dufour et al2. Thus,
for example in sample number 19, the fluorescence intensity at 380 nm is
higher than at 363, unlike in samples 7 and 17, or in sample 1, in which the
intensity ratio is close to one. Regarding the excitation spectra obtained at
363 nm (blue), two excitation maxima can be located at 260 and 280 nm.
The relative intensities of these two peaks vary with the samples, like the
emission do, being for example the ratio F.I. (260 nm) / F.I. (280 nm)
higher than 1 for sample 19 and smaller than 1 for sample 1; also, in other
cases, like in samples 7 and 17, the maximum excitation is centred at 280
nm, and a simple shoulder is observed at 260 nm.
Interesting emission spectra are obtained at an excitation wavelength of 280
nm (black). In this case the highest fluorescent emission is reached around
363 nm, but in some cases, like for example in samples 1 and 17, a second
maximum is observed around 325 nm, as important as the first one.
Furtermore, a single excitation maximum at 275 nm is observed at em= 325
nm, for all samples.
Lastly, the third typical emission spectra can be obtained, more red-shifted
in the excitation axis, around 320 nm (red). A wide emission maximum is
obtained in this case, centred at 388 nm. An excitation maximum is
observed at 325 nm when the emission wavelength is fixed at 388 nm,
MEN
SALIR
being the shape of these excitation spectra below 300 nm similar to the
previously described excitation spectra at em = 363 nm.
3.2.- PARAFAC RESULTS
The excitation and emission profiles of pure components where extracted
from the set of fluorescent landscapes, by applying PARAFAC. Choosing
the appropriate number of components is the first step for constructing the
PARAFAC model, and this decision may be done under different criteria10,
among them, the so-called core consistency diagnostic. Core consistency
percentages of 100 and 99.7 % were calculated for one and two
components, respectively, and 50.9, 40.4 and -3.3 % for the three, four and
five-component models, respectively. It seemed to be clear that a one or
two-components model was not adequate, and also a number of five
components was excessive, and it could originate an overfitting situation.
The visual appearance of the loadings was helpful to finally decide that the
optimal number of components in the present case was four, because it was
observed that in the 5-component model, the fifth component was a
combination of the first and the fourth, while in the four-components case,
all of the excitation and emission profiles seemed to be independent from
each other.
It was deducted that there were no outlier samples by observing the score
values in the sample mode, because no extreme values were found.
Lastly, the stability and appropriateness of the built model was tested by
split-half analysis22. Thus, different subsets of data were extracted
according to several split criteria (even-odd, Italian - non-Italian, and
Chilean - non-Chilean samples), and each one of them was independently
22
Harshman RA and de Sarbo WS. An application of PARAFAC to a small sample

problem, demonstrating preprocessing, orthogonality constraints, and split-half diagnostic
techniques. In Research Methods for Multimode Data Analysis, Law HG, Snyder CW,
Hattie JA, McDonald RP (eds). Praeger:New York, 1984; 602-642
MEN
SALIR
analysed. The same spectral profiles were obtained in all cases,

demonstrating the validity of the constructed model.
The results from the PARAFAC model are shown in Figures 2 and 3, in the
form of PARAFAC loadings in excitation and emission modes, and 3D
structure of PARAFAC components, respectively. 3D structures of factors
were obtained by multiplying the corresponding excitation and emission
profiles of each component. First component excitation profile is the more
hypsochromically shifted, showing a narrow maximum centred around 260
nm, and a sharp emission maximum at 380 nm, with a shoulder at 365 nm.
The optimum excitation / emission wavelength pair for the second
component is 275 / 323 nm. An important bathochromic shift and an
increase in the band width is observed in the excitation and emission
profiles corresponding to the third component, being centred at 330 and 410
nm, respectively. And lastly, the fourth component is situated close to the
first and the second one, which implies that this component models the
more blue-shifted region of landscapes, namely the excitation profile
centred at 280 nm with a shoulder at 260, and the emission one at 364 nm.
3.3.- PCA ANALYSIS OF SCORES VALUES COLLECTION
PCA was performed on the 57 x 4 data matrix, corresponding to the
PARAFAC scores of the 57 samples. Category variables were included in
the data set, corresponding to the origin of samples and type of grape, when
these last data were available. The similarity maps defined by the principal
components 1 (PC1) and 2 (PC2), and also PCA loadings are shown in
Figure 4, grouping samples according to the origin and to the type of grape
(explaining 79 and 90 % of total variance, respectively). These two models
are slightly different, due to the fewer samples included in the grape PCA,
because the grape data is not available for all samples, as reflected in Table
1. Regarding the loadings, it is important to highlight how factor 1 and 4
MEN
SALIR
span the variation in PC1, while PC2 represents a variation component

where factor 1 and 4 are opposed to factor 2 and 3.
When the origin is taken into account as category variable (figure 4A),
including all the samples in the PCA, some discrimination for samples
coming from different countries is observed. According to PC1, Chilean
samples have the most negative score values, making up the cluster on the
left side of the map, and the rest of samples on the right. WesternAustralian and Spanish samples have the higher scores values in this
component, being different from them because of the higher scores values
of Western-Australian samples in PC2. Lastly, regarding Italian, French,
South African and American samples, all of them have low score values in
both PCs, being different from the two previously described clusters. Not
all samples are included in clusters, which is natural.
There are other factors, apart from the origin, affecting the total fluorescent
population in wines. Fluorescent compounds are mostly generated in the
grape pulp, seeds and skins, and they are partially extracted into wine in the
winemaking process, and therefore the variety of grapes should influence in
their relative amounts. Other factors influencing are the environmental
conditions in which grapes have grown, the treatment of the vineyard (e.g.
irrigation and pruning), the ripeness of the fruit in the vintage moment, the
fermentation techniques employed in the winemaking, the maceration
process, the ageing of wine in barrels, among others, are factors, which
might affect the fluorescent properties in wine. As summarized in table 1,
the type of grape was specified for some of the analysed wines, some of
them being monovarietal and some others multivarietal. Thus the PCA
similarity map defined by the two first principal components can also be
studied from the point of view of type of grape, including just samples in
which this parameter is known, as represented in figure 4B. A clear
evidence of the effect of grape variety can be observed within Chilean
MEN
SALIR
wines. Samples 9, 53 and 54, made from Merlot grapes are grouped
separated from the rest of Chilean samples. Also the influence of the origin
is evidenced in the group of samples made from the same grape variety:
samples 18 and 19 from Australian-Western are far away from samples 30,
31 and 32, from Argentina, and sample 33 from USA, even though all of
them are made from Shiraz grapes.
Finally a PCA was performed on the Chilean wines group, and the
similarity map for the two first components (90 % of explained variance) is
represented in figure 4C. Again, a clear discrimination between wines from
Merlot grapes (samples 9, 53 and 54) and the rest of wines is observed.
These samples are parted from the Chilean cluster in figure 4A, possibly
caused by the different type of grape. Besides, as it can be observed in the
loading plot, the third PARAFAC component contributes in a higher
extension to PC2, than in the models represented in 4A and 4B, and an
inversion in the relative positions of factor 1 and factor 4 is observed, as a
consequence, samples 9, 54 and 53 are in the left side of the scores plot,
unlike in maps represented in 4A and 4B.
3.4.- IDENTIFICATION OF FLUOROPHORES
3.4.1.- FLUORESCENCE OF TYPICAL FLUORESCENT
COMPOUNDS PRESENT IN WINE
Fluorescent properties of compounds present in wines are highly dependent
of the working medium, being influenced by variables such as the acidity or
the composition of the medium. It is known that fluorescent behaviour is
highly affected by the pH of the medium and sometimes by the content of
organic solvents such as ethanol. Thus, a chemical environment similar to
wine matrix has been looked for, and fluorescent measurements of
MEN
SALIR
standards were therefore in all cases made in a synthetic wine matrix,

containing 3 g/L of tartrate buffer at pH 3.7, and 13 % v. of ethanol.
The fluorescent properties of assayed fluorophores are summarized in table
2, in the form of maximum excitation and emission wavelengths, together
with the maximum wavelengths corresponding to the four PARAFAC
components. It is deducted from this table that catechin and epicatechin
wavelengths match well with those of PARAFAC component 2. pCoummaric acid, trans-resveratrol, trans-piceid, and gentisic acid
fluorescent properties are close to PARAFAC component 3. Lastly, vanillic
acid could be related with PARAFAC component 4, because of the
proximity of emission spectra and various maxima in the excitation one.
Excitation and emission spectra for these candidates are presented in Figure
5. Except for catechin and epicatechin, no exact match with the PARAFAC
loadings is found, which support the idea that each PARAFAC component
does not correspond to a single fluorescent molecule, but more probably to
a conglomerate or family of fluorescent molecules.
3.4.2.- HPLC ANALYSIS OF WINE SAMPLES
Three chromatograms corresponding to the same sample, monitoring the
eluate at the three different wavelengths pairs: exc/em 260/360
(compromising wavelengths for PARAFAC component 1 and 4), 275/320
(PARAFAC component 2) 330/410 nm (PARAFAC component 3), are
represented in Figure 6. The global fluorescent intensity when exciting at
330 nm is quite small compared to those obtained for excitation at 260 nm
or even at 275 nm.
Once the chromatograms had been registered for all samples, possible
correlations between PARAFAC score values of each component and the
heights of single peaks in the corresponding chromatogram were looked for.
Regarding to the first PARAFAC component, it was found high
MEN
SALIR
correlations between scores for this component and the heights of peaks at
30 and 34.5 minutes in the FLD-profiles at exc/em 260/360 nm. Between
these two peaks, the better correlation was found with the second one, as
shown in Figure 7A. Besides, the emission spectra (exc= 260 nm) in these
peaks were on-line registered. It was found that the emission profile at 34.5
minutes is very similar to factor one. The molecular weight of this
compound was deducted by LC-MS, resulting to be 534, a very high value,
suggesting a condensation compound. Regarding the spectrum at 30
minutes, it was located in the same wavelengths region as the PARAFAC
component one, but the shape of the peak was not the same that this
component. By spiking samples with the assayed standards, it was stated
that these peaks did not correspond with any of them. With the set of
chromatograms at exc/em 260/360 nm, it was proven, by plotting the scores
of PARAFAC component 4 vs the height of the peak corresponding to
vanillic acid (retention time = 25 minutes), that these components are
correlated, (Figure 7B). Very good correlations were found between the
scores corresponding to the second PARAFAC component and the heights
of the peaks corresponding to catechin and epicatechin (retention time =
22.2 and 27.7 minutes, respectively) in the set of chromatograms obtained
at exc/em = 275/320 nm, (Figure 7C), indicating the identity of this
PARAFAC component. Lastly, regarding to the third component, good
correlations were found with some of the peaks in the chromatograms
obtained at exc/em 330/410 nm, namely peaks at 28.7, 30.2 (p-coummaric
acid), 33, and 36.3 minutes.
MEN
SALIR
CONCLUSIONS
The potential of fluorescence excitation emission matrices as fingerprints of
red wine samples has been demonstrated. Evidently, chemometric tools are
necessary to handle this kind of complex data, and PARAFAC
decomposition has proven to work properly.
The same methodology could be applied to study wines from an appellation
in order to develop chemical tools to avoid the fraud in a field highly
controlled like this.
A better knowledge of the fluorescent properties of red wines has been
achieved, establishing basis for further studies. Certain identification of all
the detected PARAFAC components is one of the main future challenges.
ACKNOWLEDGEMENTS
We would like to thank Arcus AS (Oslo, Norway) for supplying the
carefully selected set of red wines.
MEN
SALIR
Table 1.- Origin and type of grape in analysed wine samples.
Sample
Number
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
Origin
Type of Grape
France
France
Chile
Chile
Chile
Chile
Chile
Chile
Chile
Chile
Chile
Chile
Chile
Chile
South Africa
South Africa
South Africa
Australia
(Western)
Australia
(Western)
Australia
Australia
Australia
Australia
Spain
Spain
Spain
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
USA
USA
USA
Italia
Italia
Italia (Sicilia)
Italia
Italia
Italia
Italia
Italia
Tunisia
Italia
Italia
Italia
Italia
Italia
Italia
Cabernet Sauvignon
Cabernet Sauvignon
Cabernet Sauvignon
Cabernet Sauvignon
Cabernet Sauvignon
Cabernet Sauvignon
Cabernet Sauvignon
Merlot
Cabernet Sauvignon
Cabernet Sauvignon
Cabernet Sauvignon
Cabernet Sauvignon
Cabernet Sauvignon
Cabernet Sauvignon
Shiraz
Shiraz
Shiraz Cabernet Sauvignon
Shiraz Cabernet Sauvignon
Malbec Syrah Bonarda

Syrah
Syrah
Syrah
Syrah
Ruby Cabernet
Ruby Cabernet
Sangiovese
Sangiovese
MEN
SALIR
51
52
53
54
55
56
57
Chile
Chile
Chile
Chile
Portugal
Portugal
Italia
Merlot
Merlot
Sangiovese
MEN
SALIR
Table 2.- Fluorescent properties of assayed fluorescent molecules, in 3 g/L

tartrate buffer at pH 3.7 and ethanol 13 % v, and PARAFAC four
components.
Compound
exc (nm)
em (nm)
gallic acid
p-coumaric acid
241
348
241, 282,
305
262
333
297, 335
320
318
318
427
279
280
350
410
vanillic acid
NonFlavonoids
Phenolic
Acids
Stilbenes
Flavonols
Flavanols
caffeic acid
ellagic acid
sinapic acid
ferulic acid
gentisic acid
trans-resveratrol
trans-piceid
quercetin
rutin
catechin
epicatechin
354
433
422
446
446
390
390
480
317
316
malvidine-3-O-glucopyranoside
280
355
delphinidin-3-O-glucopyranoside
280
355
petunidin-3-O-glucopyranoside
280
355
PARAFAC Component 1
260
380
PARAFAC Component 2
275
323
PARAFAC Component 3
330
410
PARAFAC Component 4
260, 280
364
Flavonoids
Anthocyanins
MEN
SALIR
Sample 1
Sample 7
Sample 17
Sample 19
Figure 1.- LEFT: Fluorescence landscapes (as contour plots) corresponding

to wine samples number 1 (French Wine), 7 (Chilean Wine), 17 (South
African Wine) and 19 (Australian Wine). MIDDLE: Extracted excitation
spectrum at em= 325 (black), 363 (blue), and 388 nm (red). RIGHT:
Extracted emission spectra at exc= 260 (blue), 280 (black), and 320 nm
(red).
MEN
SALIR
EXCITATION
EMISSION
Figure 2.- PARAFAC fluorescent loadings for the four components

(FIRST: Blue; SECOND: Green; THIRD: Red; FOURTH: Light Blue) of
the non-negativity constrained PARAFAC model constructed, based on the
fluorescent landscapes of 57 wine samples.
MEN
SALIR
Figure 3.- 3D structure of PARAFAC first (blue), second (pink), third

(orange) and fourth (green) factors, obtained by multiplying the
corresponding loading-vectors.
MEN
SALIR
A) Sample grouping according to origin
B) Sample grouping according to type of grape
C) Chilean wines grouped according to type of grape
Figure 4.- PCA loadings (left) and scores (right) defined by principal
components 1 and 2 for the set of PARAFAC scores values, according to
different grouping criteria.
MEN
SALIR
800
500
Catechin
Epicatechin
400
600
F. I.
F. I.
300
400
200
200
100
0
200
300
300
(nm)
400
500
200
1000
p-Coumaric Acid
300
(nm)
400
500
Gentisic Acid
800
200
F. I.
F. I.
600
400
100
200
0
0
200
1000
300
(nm)
400
200
500
t-Resveratrol / t-Piceid
300
300
(nm)
400
500
Vanillic Acid
800
600
F. I.
F. I.
200
400
100
200
0
200
300
(nm)
400
500
0
200
300
(nm)
400
500
Figure 5.- Excitation and emission spectra of some of the assayed standards
in 3 g/L tartrate buffer at pH 3.7 and ethanol 13 % v.
MEN
SALIR
ADC1 B, ADC1 CHANNEL B (D:\RESVER~1\MATFORSK\BERIT\DA2111A\013-0601.D)

mAU
90
80
70
60
50
10
20
30
40
min
10
20
30
40
min
30
40
min
mAU
75
70
65
60
55
50
45
mAU
39.8
39.7
39.6
39.5
39.4
39.3
39.2
10
20
Figure 6.- FLD-profiles at exc/em 260/360 (top), 275/320 (middle), and

330/410 nm (bottom), corresponding to the same sample, eluted under
specified gradient conditions.
MEN
SALIR
Figure 7.- Correlations between scores values and single peaks in the
chromatograms.

Dialnet UtilizacionDeSenalesFluorescentesParaElAnalisisYCa 18504

Загружено:

Сведения о документе

Оригинальное название

Авторское право

Доступные форматы

Поделиться этим документом

Поделиться или встроить документ

Параметры публикации

Этот документ был вам полезен?

Это неприемлемый материал?

Авторское право:

Доступные форматы

Dialnet UtilizacionDeSenalesFluorescentesParaElAnalisisYCa 18504

Загружено:

Авторское право:

Доступные форматы

MEN

DEPARTAMENTO DE QUMICA ANALTICA

UTILIZACIN DE SEALES FLUORESCENTES PARA EL

USEFULNESS OF FLUORESCENCE SIGNALS FOR ANALYSIS

Diego Airado Rodrguez

Edita: Universidad de Extremadura

UTILIZACIN DE SEALES FLUORESCENTES PARA EL

Dra. D Teresa Galeano Daz

Dra. D Isabel Durn Martn-Mers

Memoria de Investigacin presentada para optar al Grado de Doctor Europeo,

Fdo.: Diego Airado Rodrguez

DEPARTAMENTO DE QUMICA ANALTICA

ARSENIO MUOZ DE LA PEA CASTRILLO, Catedrtico y Director del

Badajoz, 30 de Abril de 2008

OBJETO DE LA TESIS DOCTORAL

Por una parte se centra en el desarrollo de nuevos mtodos

Otro objetivo de este trabajo es aportar nuevas

DOCTORAL THESIS OBJECTIVE

On the one hand, the development of new analytical

On the other hand, new methodologies for wine

Captulo III: Anlisis de piceido en vinos mediante fluorescencia fotoinducida

Captulo V: Anlisis de los ismeros de resveratrol y piceido en vinos mediante

Captulo VII: Anlisis de resveratrol en vinos tintos mediante voltamperometra de

PARTE I: RESVERATOL. EL COMPUESTO

Figura 1.- Frmula estructural de trans-resveratrol

Respecto al origen del nombre resveratrol, el profesor Yutaka Ebizuka, de

res: puede estar relacionado con la clase de molculas a las que

veratr: abreviatura del nombre de la planta Veratrum grandiflorum,

ol: indicativo de la presencia de grupos hidroxilo.

La sntesis de resveratrol en el laboratorio, puede llevarse a cabo a travs

medicina tradicional china y japonesa en el tratamiento de enfermedades tales

la fase en la que intervienen todos los procesos degradativos y que es

la fase constructiva o biosinttica del metabolismo conocida como

Infecciones fngicas como la Botrytis Cinerea14, la Plasmopara Vitcola15, la

Tratamiento con sales como tricloruro de aluminio18.

Tratamiento con ozono19.

p-cumaril-CoA y el malonil-CoA, en una relacin molar de 1:3.

Figura 2.- Ruta biosinttica desde p-cumaril-CoA hasta resveratrol

El p-cumaril-CoA se genera a partir de la fenilalanina, la cual, en las

El tratamiento post-cosecha de la uva con luz ultravioleta (concretamente

Figura 3.- Fuentes de resveratrol en la naturaleza

En la uva, los mayores niveles de resveratrol se encuentran en las pieles,

los arndanos29, la Reynoutria

Japonica, las moras y en especies herbceas (Poaceae incluyendo Festuca,

autores llevan a cabo la cuantificacin de este compuesto en vinos tintos y blancos,

Los mismos autores40 proponen en 1996 un mtodo para la cuantificacin

Concentracin de Resveratrol (g.mL-1) (1)

Pinot noir, entre 0.4 - 2

Pinot noir, entre 0.2 - 0.7

Todos contienen entre 0.1 - 12

< 0.02-1.7 (mximas concentraciones en Pinot noir, 5)

Beaujolais (Gamay), entre 3.2 - 3.6

concentracin de trans-resveratrol donde no se indique otra cosa

Concentracin de Resveratrol (g.mL-1) (1)

Reccioto y Amarone (area de Verona), entre 0.05 - 0.8

concentracin de trans-resveratrol donde no se indique otra cosa

Debido a la generalmente alta razn entre las concentraciones de trans a

Este compuesto, como otros polifenoles, es un antioxidante muy efectivo

Proteccin de las lipoprotenas de baja densidad (LDL) frente a la

Inhibicin de la agregacin plaquetaria y la sntesis de eicosanoides31, 53.

Proteccin del hgado de peroxidacin de lpidos54.

Estudios recientes en ratones han demostrado que ratones obesos cuya

Reduccin de la muerte celular por estrs oxidativo56.