Optimisation du dosage dun COV par HPLC

CHAPITRE VII : Optimisation du dosage dun COV par HPLC

Introduction
Dans les cas o la sparation obtenue aprs quelques essais prliminaires nest pas
satisfaisante, que la rsolution soit insuffisante ou que la dure de lanalyse soit excessive, on
est amen optimiser les conditions exprimentales. Lidal serait dobtenir une rsolution
leve associe une grande dtectabilit avec un temps danalyse trs court et sans perte de
charge prohibitive, mais ces diffrentes exigences sont contradictoires.
Loptimisation des conditions dune analyse ne puisse rsulter que dun compromis entre
plusieurs exigences contradictoires faisant intervenir : la rsolution, une grande dtectabilit,
le temps danalyse et la perte de charge.
Dans la pratique, le choix sera fonction du but poursuivi. Ainsi, dans le cas de sparations
trs difficiles, on pourra tre amen sacrifier la dure dune analyse lobtention dune
rsolution suffisamment leve, alors que pour des analyses plus faciles, mais ayant un
caractre rptitif, on cherchera surtout rduire le temps danalyse aux dpens de la
rsolution, en augmentant la vitesse de lluant.
Dans notre prsent travail, on sintressera loptimisation de la rsolution afin davoir
une bonne sparation des soluts. [26]

1. Optimisation de la rsolution
Le problme pratique le plus important est la recherche dune rsolution assurant une
sparation suffisante des soluts du mlange.
Daprs la relation (6) (paragraphe 1.3- chapitre 6), pour accrotre la rsolution R on peut
augmenter lun des trois facteurs suivants : slectivit, rtention des soluts ou lefficacit de
la colonne. [26]

1.1 La slectivit
La rsolution augmente avec la slectivit qui mesure les diffrences de distribution des
deux substances entre les deux phases.
Quelle que soit lefficacit de la colonne, la sparation nest possible que si est diffrent
de lunit. Toutefois, les progrs rcents en matire de phases stationnaires permettent de
raliser des sparations mmes pour des valeurs de aussi faibles que 1,02.
La slectivit tant fonction des coefficients de distribution des constituants du mlange
analyser, elle peut tre modifie :
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En changeant la nature et la composition de la phase mobile (effets secondaires du
solvant en chromatographie dadsorption, polarit de lluant en chromatographie de
partage, etc.
En changeant la nature de la phase stationnaire,
En modifiant la temprature.
La faon la plus courante doptimiser la slectivit consiste faire varier la nature et la
composition de la phase luante en mettant en uvre les proprits spcifiques des solvants
considrs (pH, composition, etc.). [26]

1.2 Le facteur de capacit

Le second paramtre qui intervient dans loptimisation de la rsolution est le facteur de
capacit
de la substance la plus retenue.
Si
est nul, les deux soluts sortent simultanment de la colonne aprs coulement du
volume mort et la rsolution est nulle. La rsolution augmente au mme temps que ,
cependant le gain en rsolution devient ngligeable au-del dune valeur de lordre de 5 10
du facteur de capacit. Dautre part, le temps danalyse augmente, lui, beaucoup plus
rapidement avec .
Ainsi, lorsque le facteur de capacit passe de 5 10, la rsolution naugmente que de 9 %
alors que le temps danalyse augmente, lui, de 80 %. Cet exemple illustre bien la ncessit de
trouver un compromis entre lobtention dune bonne rsolution, qui exige une forte rtention
des composs, et dune analyse rapide qui exige prcisment le contraire.
Notons dautre part que pour des valeurs trs leves de , les pics dlution deviennent
trs larges ce qui, outre linconvnient de la dure de lanalyse, peut rendre difficile la
dtection de ces composs. [26]

1.3 Lefficacit
Augmenter lefficacit N est souvent un moyen damliorer la rsolution. Accrotre N en
augmentant la longueur de la colonne L prsente les inconvnients prcdemment voqus, en
particulier daccrotre le temps de rtention ; on cherchera donc diminuer H, ce qui amliore
lefficacit sans augmenter pour autant la dure de lanalyse. En effet, la HEPT dpend de
nombreux paramtres parmi les quels on peut citer :
Vitesse de la phase mobile,
Granulomtrie de la phase stationnaire,
Caractristiques gomtriques de la colonne,
Nature du solut et du couple phase stationnaire-phase mobile. [26]

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1.3.1 Influence de la phase mobile
Le tableau 1 montre que la mise en uvre de fines particules permet dutiliser des
vitesses de phase mobile grandes (donc de diminuer dautant la dure de sparation) tout en
conservant une efficacit maximale pour la granulomtrie considre. Dautre part on
remarquera lintrt, force luante gale, doprer avec la phase mobile ayant la plus faible
viscosit (Dm est inversement proportionnel ) ce qui permet, de diminuer la dure de
lanalyse. [26]
Tableau 1 : Variations de la vitesse optimale de la phase mobile (mm.s -1 ) en
fonction du diamtre des particules de la phase stationnaire d p (m)
et du coefficient de diffusion Dm (m.s-1 ).
d p (m)

20

10

0,045

0,09

0,18

0,3

10 -9 (eau)

0,15

0,3

0,6

3.10 -9 (hexane)

0,45

0,9

1,8

Dm (m.s-1 )
0,3.10 -9 (n-propanol)

1.3.2 Influence du diamtre des particules

Lobtention dune grande efficacit associe une faible dure danalyse implique
lutilisation de particules ayant un diamtre nominal de 5 m. La mise en uvre de particules
dun diamtre infrieur 5 m entrane des difficults de remplissage des colonnes
chromatographiques et des pertes de charge excessives. De mme, lutilisation de particules
dun diamtre suprieur 20 m nest pas recommande car elle entrane des dures
danalyse prohibitives et des efficacits faibles. [26]

1.3.3 Influence des caractristiques gomtriques de la colonne

chromatographique
a) Longueur de la colonne
Si le remplissage tait parfait, la HEPT serait indpendante de la longueur de la
colonne et lefficacit serait proportionnelle sa longueur. En effet, selon la granulomtrie
utilise, le remplissage de la colonne est plus ou moins homogne.
Avec des fines particules (5 ou 10 m) on peut remplir actuellement de faon aise et
reproductible que des colonnes ayant une longueur maximale de 50 cm. Autrement dit,
lorsquun trs grand nombre de plateaux est ncessaire, il est prfrable de mettre bout bout

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des colonnes courtes (en utilisant des connexions sans volume mort) plutt que de remplir des
colonnes de grande longueur avec un support de fine granulomtrie.
b) Diamtre de la colonne
Le diamtre de la colonne chromatographique a peu dinfluence sur son efficacit ; en
effet, on sait remplir de faon satisfaisante aussi bien des colonnes de petit calibre que des
colonnes prparatives industrielles. En revanche, ltat de surface interne des parois de la
colonne est trs important et leffet des asprits est dautant plus prononc que la phase
stationnaire est de plus fine granulomtrie. A cet gard, les tubes de silice fondue se rvlent
un excellent matriau pour la confection des colonnes. [26]

1.3.4 Influence du couple phase stationnaire-phase mobile

Lefficacit optimale est obtenue lorsque les coefficients de diffusion des molcules de
solut dans les phases mobile et stationnaire sont maximaux. On a intrt utiliser des phases
mobiles de faible viscosit et des phases stationnaires non polymrises. [26]

2. Optimisation de la dure de lanalyse et de la perte de charge

Pour une sparation donne, le problme doptimisation pos est, rsolution fixe, de
dterminer les conditions conduisant au temps danalyse minimum.

2.1 Diamtre optimal des particules de la phase stationnaire

Pour diminuer la dure dune analyse il faut diminuer la taille des particules ce qui
entrane une augmentation de la perte de charge.
Pour maintenir la mme dure danalyse lorsque la viscosit du solvant augmente, le
diamtre des particules doit diminuer. [26]

3. Optimisation multiparamtre
Loptimisation dune sparation chromatographique ne se limite pas celle de la
rsolution ; dautres critres doivent tre pris en considration telles que la perte de charge et
la dure de la sparation que nous avons de discuter ; il faut leur adjoindre le nombre de pics
spars et la dtectabilit. Il en rsulte la ncessit dune optimisation multiparamtre,
laquelle prsente alors un caractre complexe du fait du grand nombre et de linterdpendance
des paramtres exprimentaux.
Les cinq critres dapprciation de la qualit dune sparation chromatographique sont : la
dtectabilit, la perte de charge, la dure de la sparation, le nombre de pics dtects et la
rsolution.

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A titre dexemple, la figure 1 montre linfluence du nombre de paramtres pris en compte
pour loptimisation de la sparation dun mlange de six phnothiazines en chromatographie
dadsorption.
TR

5
L
+

3
L
+

+
dp

L
+

+
B
+
T
*

L
+

+
B
+
dp

L
+

+
B
+
dp
+
T

4
4
5
No mbre de variables choisies

Figure 1 : Influence du nombre de variables sur loptimisation de la dure

de la sparation, par chromatographie dadsorption,
dun mlange de six phnothiazines.
Paramtres chromatographiques :
L : Longueur de la colonne ; : vitesse de la phase luante ; dp : diamtre des
particules ; B : Fraction volumique du solvant fort ; T : temprature.
* On remarquera que dans ce cas le diamtre des particules na pas t optimis.
De nombreuses mthodes automatises sont proposes pour aboutir aux conditions
optimales et lapprciation de la qualit dune analyse utilise souvent un nombre sans
dimension appel fonction de rponse chromatographique , lequel permet au
chromatographiste de privilgier certains critres, par exemple, le nombre de pics dtects
dans le cas de lanalyse dun mlange complexe. [26]

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3.1 Fonctions de rponse chromatographique
Le problme doptimisation ne se pose pas dans les mmes termes selon quil sagit de
lanalyse dun mlange de soluts connus et de celui dun mlange dun nombre inconnu de
soluts. Cest la raison pour laquelle les fonctions de rponse chromatographiques, partant de
la qualit de la sparation, ont volu avec la prise en compte de la dure de la sparation et
du nombre de pics dtects.

3.2 Techniques doptimisation informatises

Les principales mthodes sont :
Mthodes du Simplex.
Plans factoriels.
Mthode ORM (Overlapping Resolution Map). [26]

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