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Aplicaciones biomdicas de la microscopia electrnica y el anlisis elemental con

espectrmetro de Rayos X
Resumen

La microscopio electrnica ha avanzado mucho desde su invencin hace 60 aos y su aplicacin


en las ciencias biomdicas ha sido muy grande. Paralelo al desarrollo de nueva tecnologa en este
campo y que ha permitido alcanzar una resolucin de 1,4. A para el microscopio de transmisin y
de 30 a 70 A para el microscopio de rastreo, se le han adaptado a estos microscopios otros
aparatos que permiten realizar un anlisis elemental de la muestra que est siendo examinada en
el microscopio. La ventaja de este procedimiento es que la muestra que est siendo observada en
tiempo real puede ser analizada en su composicin qumica sin ser destruida. Adicionalmente es
posible realizar un anlisis de la distribucin de sus elementos en toda la muestra. La aplicacin de
este nuevo mtodo en las ciencias biolgicas es muy amplia. Podemos detectar materiales
inorgnicos como el plomo, arsnico, calcio, mercurio, aluminio, etc, en diferentes tejidos
de cuerpo, obtenidos de biopsia o autopsia. Una aplicacin prctica es el anlisis de la
composicin de clculos vesiculares o urinarios determinando de esta manera la fisiopatogenia del
proceso.
Palabras clave
Microscopia electrnica de rastreo, Espectrmetro de rayos X, nefrolitiasis, clculos urinarios.

Introduccin
Un haz de electrones puede considerarse como constituido por partculas u ondas. En este ltimo
caso, la longitud de onda (X) asociada depende del voltaje con que fue acelerado dicho haz; as, a
100KV X es aproximadamente de 0,1 , o sea unas 50 000 veces menor que X de la luz visible.
Recordemos que la resolucin del microscopio de luz tiene como limitante la longitud onda de la luz
visible (1 ).
En 1934 Ernest Ruska desarroll un sistema de electroimanes para concentrar y enfocar un haz de
electrones de manera anloga a la accin que ejerce un lente de vidrio sobre un haz de luz. Este
dispositivo, que luego se denominara "lente electromagntico" le permiti construir el primer
microscopio electrnico, cuyo aumento mximo era de 16 X. Sin embargo, este fue el inicio de la
era de la microscopio electrnica, que se bifurcara en os grandes corrientes, la microscopio
electrnica de transmisin y la microscopio electrnica de rastreo. En paralelo se desarroll otra
metodologa, que permite el anlisis elemental de la muestra mediante el patrn de dispersin de
rayos X generados por la interaccin del haz de electrones con la muestra ( 2 ).El objetivo de esta
revisin es mostrar la aplicacin biomdica de la microscopio electrnica en conjunto con el
microanlisis elemental, empleando un detector de rayos X, que permite conocer la composicin
qumica de la muestra en la micro-rea irradiada sin que esta tenga que ser destruida.
Microscopio electrnico de transmisin
El microscopio electrnico de transmisin (MET), al igual que ocurre en el microscopio de luz,
forma una imagen con el haz de energa que atraviesa la muestra; que en el caso de MET se trata
de electrones acelerados a muy alto voltaje y en el microscopio de luz se trata de luz visible. Por
eso, a este microscopio electrnico se le denomin de transmisin y siguiendo tal razonamiento, al
microscopio de luz: microscopio de luz transmitida ( 3 ).

Para que los electrones atraviesen la muestra sin destruirla por calentamiento debe seguirse un
procesamiento, que resulta un tanto similar al que se sigue para obtener los cortes histolgicos
para microscopio de luz. En resumen, los tejidos deben fijarse qumicamente, deshidratarse e
incluirse en un medio de soporte para hacer los cortes. En el caso de microscopia electrnica, la
fijacin se realiza con aldehdos (usualmente glutaraldehdo y paraformaldehdo) y el medio de
inclusin ms corriente son resinas epxicas de gran dureza. Los cortes deben tener un grosor
mximo de unos 100 nm; recordemos que para luz se usa parafina como medio de inclusin y los
cortes usualmente son de alrededor de 5 m de espesor, o sea unas 50 veces ms gruesos que lo
requerido en MET. Luego los cortes deben contrastarse, lo que usualmente se denomina "tincin",
aunque en microscopio electrnica no se maneja el concepto de color, pues este corresponde a
una pequea porcin del espectro electromagntico ( de 0,4 a 0, 7 m). El contraste en realidad
consiste en una impregnacin del tejido con sales de metales pesados, como acetato de uranilo o
citrato de plomo, que aumentan la electrondensidad en el sitio de deposicin, esto hace que
algunas zonas aparezcan oscuras o negras en la pantalla, lo que contrasta con lo claro de las
zonas no impregnadas con esos metales ( 4 ).La gran diferencia en los aumentos logrados en el
MET estriba en el lmite de resolucin (d). Tanto en et microscopio de luz como el MET la
resolucin obedece ala ecuacin de Abbe: d = 0,62
/ 2 AN. Donde ~ se refiere a la longitud de
onda empleada para generar la imagen y AN es la abertura numrica del lente. En el caso del
microscopio de luz,
corresponde a 0,55 m (promedio del espectro visible humano) y la AN oscila
alrededor de 1,3. El valor 2 se refiere a que suma la AN del objetivo y la del condensador que
deben ser iguales segn la ley de Rayleigh. Esto produce un lmite de resolucin de
aproximadamente 0,22 m para el microscopio de luz (1). La limitante en el poder de resolucin del
microscopio de luz es la propia longitud de onda de la luz; lo que fue superado en el ME
empleando electrones acelerados a gran velocidad (alto voltaje) de manera que se mueven en
forma ondulatorio, con una
que depende del voltaje de aceleracin. A 100 000 v,
es de
aproximadamente 0,1
; no obstante, debido a las imperfecciones o aberraciones de los lentes
electromagnticos, la resolucin del MET es de 1,4 (5 ). Se comparan las imgenes obtenidas de
secciones de colon de un caso de balantidiasis, observadas al microscopio de luz ( Fig. l ), al MER
(Fig. 2 y 3 ) y al MET (Fig 4 y 5 ).
Microscopio electrnico de rastreo o barrido
El haz de electrones que impacta a la muestra interacciona con ella, unos electrones la atraviesan
y son los utilizados en MET, otros emergen de la superficie; entre stos estn los electrones
secundarios, que son arrancados de los orbitales de tomos de alto nmero atmico y generan las
imgenes con carcter tridimensional que caracterizan a la microscopio electrnica de rastreo
(MER). Para generar ests imgenes el haz de electrones debe desplazarse sobre la superficie de
la muestra de un lado a otro, haciendo un barrido o rastreo de su superficie, de donde deriva el
nombre de este equipo (6 ). La figura 1c corresponde a una muestra de colon del mismo caso
ilustrado en las figuras 1a y 1b, pero en esta ocasin fotografiada al MER.
La resolucin del MER depende del dimetro final de la sonda electrnica que barre la superficie
de la muestra, pues la seal generada lleva ese dimetro. La mayora de los MER tienen
resolucin es que oscilan entre 70 y 30 A (7 a 3 nm), dependiendo entre otras cosas de la distancia
de trabajo y el recubrimiento metlico que se d a las muestras ( 6 ).
Rayos X caractersticos
Al igual que la luz visible los rayos X son parte del espectro electromagntico. Cuando el haz de
electrones impacta la muestra genera una serie de seales; que como mencionamos previamente
incluyen , electrones transmitidos, electrones reflejados y electrones secundarios; adems de esas
se producen dos tipos de seales de rayos X. Una denominada rayos X blanco o no
caractersticos, que para nuestros propsitos no interesan y por el contrario representan un

contaminante de la otra seal, que corresponde a los rayos X caractersticos cuya longitud de onda
es de 0,01 a 1 0 nm (6 ).
La generacin de los rayos X caractersticos depende de los electrones del tomo que los generan.
Recordemos que un tomo es neutro, pues tiene un nmero de electrones igual al nmero de
protones del ncleo (designado como Z) y que esos electrones estn dispuestos en orbitales con
diferentes niveles energticos, que ordenados del ncleo hacia fuera, son denominados K, L, M
etc, y que esos orbitales deben irse llenando ordenadamente. El orbital K acepta dos electrones, el
L 8, el M 18, el N 32 y as sucesivamente. Esto significa que un elemento con doce electrones,
debe llenar primero las dos plazas en el orbital K que seran ocupadas por los electrones cuya
energa de en lance es mayor y luego se alojaran los otros ocho electrones del orbital L y
finalmente los dos electrones con menos energa de enlace ocuparan su lugar en el orbital M.
Cuando un electrn es removido de un orbital, su lugar ser ocupado por otro electrn de un orbital
ms externo, o sea que su energa de enlace aumentar. Esa diferencia energtica es eliminada
como un fotn de rayos X cuya energa es equivalente a la diferencia existente entre ambos
orbitales (6 ). Por ejemplo, si la vacante qued en el orbital K y fue llenada por un electrn que
provena de L se estara generando una emisin de rayos X denominada K; pero si fue llenado
por un electrn de dos orbitales ms atrs, o sea de M, la radiacin ser K otra posibilidad sera
una emisin K si proviene de tres orbitales atrs. Si la vacante hubiese quedado en L, los
ejemplos anteriores corresponderan a L , L L y as sucesivamente. Esas diferencias
energticas son caractersticas de cada elemento; por lo tanto, si la cuantificamos sabremos de
qu elemento proviene. Por ejemplo para el hierro tenemos los siguientes valores en kiloelectrones
voltio (KeV) Fe K 6 403, Fe K 6 390, Fe K 7 057, etc ( 5 ).
Los equipos analizadores de rayos X en microscopio electrnica cuentan con programas de
computacin cuya base de datos tiene esta informacin, de manera que el programa identifica
automticamente el elemento responsable de la emisin. Esto significa, que empleando un detector
de rayos X en un microscopio electrnico es posible hacer un anlisis qumico de la muestra en
escala puntual, indicando qu elementos estn presentes en determinada rea de la muestra.
Los detectores de rayos X ms utilizados en microscopio son el "Energy Dispersive Spectroscopy"
(EDS) y el "Wavelength Dispersive Spectroscopy" (WDS) ste permite un anlisis rpido y
simultneamente puede detectar varios elementos, gracias a que segrega o dispersa las diferentes
seales de. Acuerdo a su energa empleando un detector de cristal semiconductor. La figura
6 muestra un equipo EDS acoplado a un MER y la figura 7 muestra unos cristales obtenidos de
orina de un paciente.
Cuando los fotones de rayos X golpean el cristal semiconductor, este absorbe una cantidad de
energa determinada, que es convertida en una seal elctrica, la cual es emitida, amplificada y
digitalizada para alimentar un analizador multicanal, que identifica los elementos que originaron esa
seal y la despliega grficamente, como se muestra en la figura 8 que corresponde a un clculo
renal.
Aplicaciones biomdicas
Entre las aplicaciones del anlisis elemental con rayos X en la biomedicina est la identificacin de
depsitos de metales pesados en tejidos, como el cobre en tejido heptico de pacientes con
enfermedad de Wilson (7 ), el plomo en eritrocitos de pacientes con saturnismo, el mercurio en piel
(8 ), el arsnico en las intoxicaciones y carcinomas de piel, el tetraxido de osmio en traumatismos
de piel (9 ), etc. Tambin, es posible analizar la composicin de cristales urinarios y litiasis renal y
vesicular (10 ). El anlisis de la etiologa de la microlitiasis renal representa un ejemplo de
aplicacin de esta tcnica. Esta patologa puede ser multicausal y representa uno de los problemas
de salud cuya importancia se reconoce cada da ms. Entre las posibles causas se mencionaron
las infecciones bacterianas debidas a agentes ureasa positivos,
principalmente Klebsiella penuemoniae, Proteus spp yUreaplasma urealyticum. La ureasa de estas

bacterias hidroliza la urea excretada por la orina, produciendo amonio que eleva el pH, lo que
favorece la precipitacin de cristales de fosfato de calcio. Esto unido a otros problemas
subyacentes como alteraciones anatmicas o reduccin del flujo urinario induce la formacin de
microlitiasis y clculos renales ( 11 , 12 ). Actualmente, otra teora infecciosa involucro
a Nanobactera, un gnero de bacterias 10 a 100 veces ms pequeas que la mayora de las
bacterias conocidas. En todo caso, se destaca que el tamao y nmero de cristales urinarios de
oxalato de calcio o fosfato de calcio, cuya relacin con la porosidad de las clulas de los
canalculos pueden llevar a la formacin de ncleos de precipitacin sobre los que se seguir
depositando ms calcio, lo que agrava el problema (13 , 14 ). Para comprender mejor la gnesis de
las urolitiasis es importante conocer la composicin y distribucin del calcio en la matriz de los
clculos y poder demostrar los sitios de deposicin de fosfato de calcio amorfo en relacin con la
deposicin de cristales de oxalato de calcio ( 10 ). Este tipo de informacin se puede obtener con
un espectrmetro de Rayos X acoplado a un microscopio electrnico de rastreo. Pues el anlisis
qumico solo brinda la composicin ya sea cualitativa o cuantitativa de elemento en cuestin; pero
no brinda informacin sobre su distribucin en la muestra. En tanto, las imgenes de MER brindan
una visin tridimensional de la muestra, incluyendo su patrn cristalino y el espectrmetro de rayos
X indica la composicin qumica en el rea seleccionada. Al mismo tiempo, el anlisis de materiales
de ciruga o autopsia, en los cuales se obtenga el tejido renal con el clculo puede brindar
informacin concerniente a la deposicin de cristales dentro de los canalculos. Las figura 7
muestra un cristal urinario cuyo anlisis elemental puede ser obtenido mediante un analizador
EDS. En la figura 8 se muestra el patrn de composicin de un clculo renal.
Cuando los fotones de rayos X golpean el cristal semiconductor, este absorbe una cantidad de
energa determinada, que es convertida en una seal elctrica, la cual es emitida, amplificada y
digitalizada para alimentar un analizador multicanal, que identifica los elementos que originaron esa
seal y la despliega grficamente, como se muestra en la figura 8 que corresponde a un clculo
renal.
Conclusin
El avance acelerado de los conocimientos cientficos y la tecnologa han permitido a la microscopio
electrnica tener una gran capacidad de anlisis ultraestructural en organelas, clulas, tejidos y
materiales inorgnicos. Se ha podido llegar a aumentar imgenes hasta casi un milln de veces
con una resolucin de 1.4 A. Esto ha permitido conocer ultraestructuralmente los materiales y
sistemas biolgicos ayudando a entender mejor su funcionamiento. Sin embargo, esta tcnica no
permita conocer la composicin qumica elemental de los objetos que estbamos viendo. Para ello
necesitbamos realizar un anlisis qumicos de la muestra lo que implicaba su destruccin. El
desarrollo de sistemas de deteccin de rayos X y programas de computacin de inteligencia
artificial que permiten analizar gran cantidad de informacin en forma eficiente y amigable, ha
permitido que la microscopio electrnica de un gran salto en su capacidad de anlisis. Debido a
que el microscopio electrnico produce un has de electrones que impacta la muestra que estamos
observando y que en este proceso se liberan rayos X, los cuales son caractersticos de cada
elemento, podemos entonces determinar qu elementos estn presentes en la imagen que
estamos viendo en el microscopio. Adems, podemos ver su distribucin en la muestra, lo cual nos
permite hacer diagnstico de intoxicacin por metales o elementos inorgnicos debido a que la
presencia de estos no natural en los tejidos. Tambin, nos permite entender mejor la fisiopatogenia
de procesos que incluyen el depsito de materiales orgnicos o inorgnicos como es el caso de la
formacin de clculos en diferentes rganos.

Referencias
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2 . Facultad de Microbiologa.
3 . Escuela de Fsica.
4 . Centro de Investigacin en Ciencia de Materiales (CICIMA), Universidad de Costa Rica. San
Jos.
Costa Rica.
* Correspondencia. CIEMIC, Ciudad de la Investigacin, Universidad de Costa Rica, CP 2060 , San
Jos, Costa Rica.hchavarr@cariari.ucr.ac.cr Fax: 207 3182