MANUAL DE

LABORATORIO - Versin 2015

Practica N 1:

ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA AMILASA

I. INTRODUCCIN.
La saliva es un fluido biolgico de gran importancia, ya que, adems de mantener la homeostasis
en la cavidad oral, es un medio perfecto para monitorear la salud en general , debido a que est
compuesta de una variedad de protenas, enzimas, hormonas, anticuerpos, constituyentes
antimicrobianos y citosinas , muchos de los cuales pasan de la sangre a la saliva, a travs de
sistemas de transporte intra y extracelular . Dentro del contenido proteico de la saliva, el
componente de mayor concentracin es la -amilasa, la cual es secretada por el pncreas y por
las glndulas salivales, ambas de carcter enzimtico. La variabilidad en la concentracin o
actividad de la -amilasa salival o la pancretica permite detectar anomalas en los rganos que la
producen. La -amilasa encontrada en la saliva humana (AASH) es la suma de la secretada por
las glndulas salivales y de la secretada por el pncreas que, por mecanismos de transporte
celular, entra a formar parte de la saliva.
El almidn es un polisacrido de una estructura compleja est formado por dos tipos de cadenas:
amilosa y amilo pectina. La amilosa abunda en las leguminosas y la amilosa en los cereales. Las
propiedades del almidn de una especie vegetal dependen del % relativo de cada cadena. Su
estructura permite que al penetrar el yodo se forme una disolucin en presencia de un color azul
esta caracterstica no permite identificar la presencia del almidn. El almidn puede romperse o
hidrolizarse por medios qumicos o enzimticos, por medio de la amilasa (saliva) y el jugo
pancretico. La amilasa rompe los enlaces entre los azucares que conforman al almidn y
finalmente despus de su accin deja glucosa libre y maltosa.
Las enzimas son catalizadores proteicos que aceleran la velocidad de las reacciones
metablicas que ocurren tanto a nivel celular como fuera de ellas, sin sufrir ellas cambios en su
estructura. Para el proceso de digestin, las biomolculas ingeridas en la dieta deben ser
degradadas a sus componentes ms sencillos para ser absorbidas a nivel del tubo digestivo y
as llegar al lugar correspondiente a nivel celular donde participarn en diversos procesos
metablicos indispensables para el mantenimiento de una adecuada homeostasis. La digestin
de los carbohidratos comienza en la boca, donde los alimentos se mezclan con la Amilasa salival
que degrada los enlaces del almidn liberndose Maltosa, Glucosa y dextrinas de almidn que
poseen todos los enlaces. La accin de las enzimas, por sus caractersticas fsico-qumicas,
puede afectarse por las condiciones presentes en el lugar de accin de stas. Entre los
principales factores que pueden modificar la accin enzimtica tenemos:
a. La temperatura: Todas las enzimas muestran cierta termolabilidad, aunque para muchas de
ellas el aumento de la temperatura, hasta cierto lmite, acelera la velocidad de la reaccin. Sin

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embargo, por que la mayora de stas son estructuras proteicas, pueden ser desnaturalizadas a
medida que se aumenta la temperatura y as perder su actividad biolgica. La temperatura a la
cual se observa la mxima actividad enzimtica se denomina Temperatura ptima.
b. El pH:Por su caracterstica proteica, muchas enzimas por el pH de donde se encuentran
pueden cambiar desde un estado ionizado ( Con carga ) a uno no ionizado ( sin carga),
afectando as la actividad biolgica de las mismas.
Cada enzima posee un pH caracterstico donde puede realizar su funcin
( pH ptimo), cualquier variacin del mismo puede afectar la accin enzimtica y as afectar la
velocidad de las reacciones qumicas.
c. Inductores e inhibidores: Existen sustancias qumicas que pueden afectar la interaccin del
sustrato y la enzima, ya sea aumentando la actividad enzimtica (Inductores) o disminuyndola
(Inhibidores). Los inhibidores tienen gran utilidad en bioqumica, ya que ayudan a determinar la
especificidad de la enzima por el sustrato, la naturaleza de los grupos funcionales en el
mantenimiento de la estructura activa de la enzima. Estos compuestos no son alterados
qumicamente por la enzima.De acuerdo al tipo de inhibicin que ejerzan estas sustancias, se
han clasificado en:
Inhibidores Reversibles.
Inhibidores Irreversibles

II. OBJETIVOS.
Determinar cualitativamente la actividad enzimtica de la Amilasa que cataliza la
hidrlisis del almidn a maltosa (disacrido reductor)
III. EQUIPOS Y MATERIALES DE LABORATORIO.
III.1.

Material Biolgico.
Amilasa
III.2. Materiales y Equipos.
Pipetas
Tubos de ensayos
Bao mara
Cocina elctrica
Balanza
III.3. Medios de cultivos.
Solucin de almidn al 1% en buffer fosfato 0.1 M pH 6.9 conteniendo NaCl
0.01 M
Solucin de enzima al 1%
HCl 0.05 M
Solucin cprico alcalino yodada
Sol. Cprico alcalino
Sol. Fosfanolibdica
IV.PROCEDIMIENTO.
4.1.

OBTENCION DE ENZIMA AMILASA

En un matraz colocar saliva aproximadamente 20 -30 Ml

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Mezclar a la misma proporcin con buffer fosfato

Con una gasa o algodn proceder a filtrar la mezcla
El filtrado corresponde a la enzima

4.2.
DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD AMILASICA
Se proceder de acuerdo al siguiente sistema de incubacin enzimtica:
COMPONENTES
T1 (testigo)
T2 (problema)
Solucin de almidn al 1% (mL)
2.5
2.5
Agua destilada (mL)
2.5
2.5
Colocar en bao mara a 37C por 5 minutos
Enzima al 1% (mL)
-----0.5
Colocar en bao mara a 37C por 10 minutos
4.3 CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA POR SUSTRATO RESIDUAL
Simultneamente con el proceso de incubacin de 10 minutos colocar HCl en dos
tubos adicionales y continuar de acuerdo al siguiente esquema
COMPONENTES
T1 (testigo)
T2 (problema)
HCl 0.05 M (mL)
5
5
De los tubos que fueron trabajados
0.5
0.5
en la etapa A (mL)
Sol. Yodada (mL)
0.5
0.5
MEZCLAR
OBSERVAR EL COLOR RESULANTE EN CADA TUBO Y
ANALIZARLO EXPLICANDO SI SE DEMUESTRA ACTIVIDAD
ENZIMATICA O MO
4.4 CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA POR PRODUCTOS FORMADOS
(azcares reductores)
Simultneamente con el proceso de incubacin de 10 minutos, en el tercer par de
tubos, procedes de acuerdo al sgte esquema. Mediante el mtodo de FOLIN-WU
COMPONENTES

Blanco

T1

T2

(testigo) (problema)
Agua destilada
1
0.5
0.5
T1 de la parte A
----0.5
----T2 de la parte A
-------0.5
Sl. Cprica alcalina
1
1
1
Mezclar y colocar en bao de agua hirviendo por 8 minutos. Al termino
de este tiempo enfriar en agua corriente
Sol. Fosfomolibdica
1
1
1
Mezclar enrgicamente y dejar reposar 3 minutos
Agua destilada
7
7
7
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Mezclar por inversin y dejar en reposo durante 10 minutos. Evaluar los resultados
de manera cualitativa.
V. ESQUEMAS
OBTENCION DE LA AMILASA

Se escupi en un vaso
de precipitacin hasta
obtener t20 ml de
saliva

Se filtr la saliva con un

algodn y un embudo

DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD AMISILICA

Se procede a vaciar
2.5ml de almidn en
dos tubos de ensayo

Se procede llevar a
bao mara a una
temperatura de 37C
en un tiempo de 5

Se extrae los tubos del

bao mara y se llena
0.5ml de la enzima T2

CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA POR SUSTRATO RESIDUAL

Se procede a llenar con

5ml de HCl los dos
tubos de ensayo

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Se llena 0.5ml de la
parte A

Se agrega 0.5ml de
solucin
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4 yodada y se
observa el cambio de
color

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CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA POR PRODUCTOS FORMADOS

Se llena en cada tubo de

ensayo; en el primero agua
destilada, el segundo la T1 y
la ultima la T3

Se lleva al agua
hirviendo por un tiempo
de 8 minutos

Se enfra y se agrega la
solucin fosfomilibdica

VI.RESULTADOS
VI.1. Control de la Actividad Enzimtica por SUSTRATO RESIDUAL
INDICADOR
Color resultante
Presencia de almidn residual (abundante,
moderado, escaso, ausente)
Diferencia entre testigo y problema
(SI,NO)
Actividad amilsica (presente o ausente)

T1 (testigo)
Oscuro
Abundante

T2 (problema)
Claro
Escaso

Si

Si

Ausente

Presente

VI.2. Control de la Actividad Enzimtica por PRODUCTOS FORMADOS

INDICADOR
Color resultante
Precipitado (presencia y color)
Presencia de azucares reductores
Diferencia entre testigo y problema
(SI,NO)
Actividad amilsica (presente o ausente)

VII.

T1 (testigo)
Celste
Amarillo
No
Si

T2 (problema)
Azul oscuro
Azulino
Si
Si

Ausente

Presente

DISCUSION.
En la actividad enzimtica se agrega el almidn en dos tubos uno con la enzima amilasa y
se lleva al bao maria por 10 minutos para que vaya hidrolizndose con el almidn.

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El cido clorhdrico se encuentra presente en los jugos gstricos, por lo tanto ayuda a
degradar los carbohidratos (almidn)
En la solucin yodada nos debi dar dos colores distintos, debido a que un tubo tiene
sustrato residual (almidn), mientras que el otro tubo no debi reaccionar con el yodo al no
encontrar sustrato. Lamentablemente en la prctica no se obtuvo la diferencia de color en
los tubos
La solucin cprica reacciona con los productos enzimticos, que son los azucares
reductores como glucosa y maltosa, los cuales actan sobre el cobre reducindolo.
Al agregar solucin fosfomolbdica ocurre que al no encontrarse producto en el T1 no
reacciona y se queda de color celeste, en el T2 cambia a color azul oscuro debido a que la
enzima hidroliza el almidn y como resultado se obtiene un producto.

VIII.

CONCLUSIONES.
Se logr determinar cualitativamente la actividad enzimtica de la Amilasa
Se concluy en la actividad de control de la actividad enzimtica por
productos formados (azcares reductores) de que cuando no hay actividad
enzimtica en el almidn se muestra la maltosa y la glucosa cualitativamente

IX.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.

Bravo G. (2011). Accion de la amilasa sobre el almidn . 02 de septiembre del 2015,

de Universidad Nacional Autnoma de Mxico Colegio de Ciencias y Humanidades
Plantel Sur Sitio web: http://tere-suarez.blogspot.pe/2011/11/informe-practica-2-

accion-de-la-amilasa.html
Patio M. (2010). La Accion de la amilasa sobre el almidon . 04 de septiembre del
2015,

de

UNAM

CCH-SUR

Sitio

web:

https://docs.google.com/document/d/1LdKVFCw2WUAaSfd4VxLAPoUmpS04ViBbxv
hKhfRMY5g/edit?pli=1

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