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Ministerio de Medio Ambiente y Agua

Estado Plurinacional de Bolivia

Ministerio de Medio Ambiente y Agua


Viceministerio de Recursos Hdricos y Riego

Con el apoyo de:

Viceministerio de Recursos Hdricos y Riego

Ministerio de Medio Ambiente y Agua

Gua para

la evaluacin

genotxica de

cuerpos de agua
utilizando clulas de
races de

www.cuencasbolivia.org
Calle: Hroes del Acre esquina Conchitas N 1778
Telf. (591-2) 2124484 2117391

cebollines

Gua para la Evaluacin Genotxica en Cuerpos de Agua Utilizando Clulas de Races de Cebollines

Autor
Ministerio de Medio Ambiente y Agua (MMAyA)
Edicin y diseo
Viceministerio de Recursos Hidricos y Riego (VRHR)
Texto:
Gloria Rodrigo Lira

El presente documento fue elaborado en el marco del Programa Plurianual de Gestin Integrada de Recursos Hdricos y Manejo
Integral de Cuencas 2013 2017 y su impresin fue posible gracias al apoyo de la Cooperacin Suiza en Bolivia a travs de
HELVETAS Swiss Intercooperation, programa CONCERTAR miembro de GESTOR.
Est permitida la reproduccin del presente documento, siempre que se cite la fuente..
La Paz Bolivia
2014

Contenido


1
Recordando la divisin celular 1

2
Qu es genotoxicidad
? 5

3 Cmo se evala genotoxicidad en cuerpos de agua?

11


4
Protocolo de evaluacin 15

4.1
Reactivos y material 18

4.2
Procedimiento de muestreo 19

4.3
Medicin de microncleos 22

4.4
Datos y clculos 26

4.5
Interpretacin de resultados 28

5
Glosario 30

6
Bibliografa consultada 31

Presentacin
Con el objetivo de facilitar la labor de vigilancia, control y monitoreo de la calidad de los cuerpos
de agua, en cumplimiento con los artculos 9, 10 y 11 del Reglamento en Materia de Contaminacin
Hdrica, de la ley del Medio Ambiente (Ley 1333), el Ministerio de Medio Ambiente y Agua (MMAyA),
a travs del Viceministerio de Recursos Hdricos y Riego (VRHR), elabor la presente cartilla que se
espera pueda ser difundida y aplicada de manera efectiva y concreta por tcnicos de medio ambiente
de los gobiernos municipales y departamentales, monitores comunales, empresas y cooperativas
prestadoras de servicios de agua potable y saneamiento bsico e instituciones u organizaciones
involucradas y comprometidas con este tema.
Como resultado de su aplicacin, se espera que se pueda mejorar y ampliar el presente documento,
por lo que ser de mucho valor toda observacin, sugerencia y comentario que se pueda hacer llegar
al VRHR para su incorporacin en sus prximas ediciones con los reconocimientos que correspondan.

Ing. Carlos Ortuo Yez


VICEMINISTRO DE RECURSOS HDRICOS Y RIEGO

Recordando la divisin celular

Las plantas y los animales estn formados por miles de


millones de clulas individuales organizadas en tejidos
y rganos que cumplen diferentes funciones especficas
y que se reproducen duplicando tanto su contenido nuclear como el citoplasmtico para luego dividirse en dos
nuevas clulas.

nes de nuevas clulas cada segundo simplemente para


mantener su estado de equilibrio. Si la divisin celular se
detiene el individuo morira en pocos das.

En especies unicelulares, como las bacterias, hongos,


algas, protozoos y las levaduras (Figura 1), cada divisin
de la clula nica produce un nuevo organismo.
En especies pluricelulares se requieren muchas secuencias de divisiones celulares para crear un nuevo individuo.
En cuerpos adultos, la divisin celular es tambin necesaria para reemplazar las clulas perdidas por su desgaste,
deterioro o por muerte celular programada o envejecimiento. Un humano adulto debe producir muchos millo-

Protozoo
Alga

Bacterias
Hongos

Figura 1. Organismos unicelulares

El ciclo celular comprende el conjunto de procesos que


una clula debe realizar para replicar de manera exacta
el ADN1 y separar o dividir los cromosomas replicados
en dos nuevas clulas distintas.
La gran mayora de las clulas tambin doblan su masa
y duplican todos sus orgnulos citoplasmticos en cada
ciclo o divisin celular. De este modo, durante el ciclo
celular un conjunto complejo de procesos citoplasmticos y nucleares tienen que coordinarse unos con otros.
Dependiendo del tipo de clula, existen dos variantes
en la divisin celular: la mitosis y la meiosis.
Mitosis. La mitosis es la divisin celular asociada a las
clulas somticas. Las clulas somticas representan la
totalidad de las clulas del organismo excepto las clulas germinales o sexuales y las clulas embrionarias, que
La molcula de ADN (cido desoxirribonucleico) tiene la estructura de una escalera formada
por azcares, fosfatos y cuatro bases nucleotdicas llamadas adenina (A), timina (T), citosina (C) y
guanina (G). El cdigo gentico queda determinado por el orden de estas bases, y cada gen tiene
una secuencia nica de pares de bases. Los cientficos utilizan estas secuencias para localizar la
posicin de los genes en los cromosomas y elaborar el mapa del genoma humano. En casi todos
los organismos celulares el ADN est organizado en forma de cromosomas, situados en el ncleo
de la clula.

son el origen de los gametos. Por lo tanto, se encuentran


en los huesos, la piel, los tejidos, los rganos y la sangre.
Se componen de 23 pares de cromosomas2. Las clulas
somticas pueden mutar sin transmitir sus modificaciones a los futuros descendientes. Las clulas somticas
que mutan pueden, sin embargo, ser la causa de diferentes tipos de cncer.
La mitosis, entonces, es el proceso de divisin o reproduccin nuclear de cualquier clula que no sea germinal.
Meiosis. Se debe recordar que los organismos superiores que se reproducen de forma sexual se forman a partir
de la unin de dos clulas germinales o sexuales especiales denominadas gametos. Cada clula germinal es
diferente genticamente por la recombinacin gentica
que se da durante la meiosis.
Las clulas germinales son las responsables de la formacin de las clulas reproductoras o gametos, los esperDentro del ncleo, una de las estructuras ms importantes son los cromosomas, formados por el
ADN y las protenas presentes en el ncleo. Los cromosomas son semejantes a dos brazos, unidos
por el centrmero, donde se ordena el ADN.

matozoides en los hombres y los vulos en las mujeres.


Las clulas germinales contienen toda la informacin
gentica de un individuo y la transmiten al embrin, incluyendo eventuales mutaciones genticas.

diferentes combinaciones de genes. La meiosis consta de


dos divisiones sucesivas de la clula con una nica rplica
del ADN. El producto final son cuatro clulas con n cromosomas.

Estas clulas estn situadas en las gnadas de los aparatos reproductores femenino y masculino. Los gametos
contienen la mitad de la informacin gentica de un individuo, es decir 23 cromosomas, por lo que se dicen
que son clulas haploides. Estas clulas necesitan unirse
al gameto complementario, que ocurre en el proceso de
fecundacin, para completar as la informacin para dar
lugar a un individuo humano completo.

En la meiosis, a diferencia de la mitosis, slo se transmite a cada clula nueva un cromosoma de cada una
de las parejas de la clula original. Por esta razn, cada
gameto contiene la mitad del nmero de cromosomas
que tienen el resto de las clulas del cuerpo, es decir, 23
cromosomas.

Los gametos se originan mediante meiosis, proceso exclusivo de divisin de las clulas germinales o tambin llamadas clulas sexuales. La meiosis es un mecanismo de
divisin celular que, a partir de una clula diploide (2n),
permite la obtencin de cuatro clulas haploides (n) con

Cuando en la fecundacin se unen dos gametos, la clula resultante, llamada cigoto, contiene toda la dotacin
doble de cromosomas. Es decir, 46 cromosomas. La mitad de estos cromosomas proceden de un progenitor y la
otra mitad del otro. La meiosis, entonces, consiste en dos
divisiones sucesivas de una clula diploide acompaadas
por una sola divisin de sus cromosomas (Figura 2).

Tabla 1. Diferencias entre la mitosis y la meiosis


Mitosis

Meiosis

2n

2n

2n

2n

A nivel gentico
Reparto exacto del material
gentico

Segregacin al azar de los cromosomas homlogos y entrecruzamiento como fuente de


variabilidad gentica.

Como consecuencia de lo anterior se forman clulas genticamente iguales.

Produce una reduccin del juego de cromosomas a la mitad


exacta de los cromosomas homlogos.

Meiosis I

Mitosis

A nivel celular

1n

1n
Meiosis II

2n

2n

1n

1n

1n

1n

A nivel orgnico
Se da este tipo de divisin en
los organismos unicelulares
para su reproduccin asexual y
en pluricelulares para su desarrollo, crecimiento y la reparacin y regeneracin de tejidos
y rganos.

Sirve para la formacin de las


clulas reproductoras sexuales.

Figura 2. Procesos de divisin del ncleo en clulas


somticas (mitosis) y clulas germinales o sexuales
(meiosis).

Qu es genotoxicidad?

Genotoxicidad es la capacidad relativa que tiene un


agente fsico, qumico o biolgico de ocasionar un dao
en el material gentico, originando efectos biolgicos
adversos en los seres vivos.

De acuerdo a su modo de accin o efectos que puede


ocasionar se clasifican en mutgenos3, carcingenos4 y
teratgenos5 , dando lugar a los procesos de mutagnesis, carcinognesis y teratognesis respectivamente.
El dao en el material gentico se da en el ADN y en todos aquellos componentes celulares que se encuentran
relacionados con la funcionalidad y comportamiento de
los cromosomas dentro de la clula, como son las protenas y el ARN6.
Agente qumico, fsico o biolgico capaz de causar dao al ADN
Agente qumico, fsico o biolgico qu acta sobre los tejidos vivos, causando cncer.
5
Agente o sustancia que acta sobre el embrin en desarrollo causando alteraciones morfo-fisiolgicas.
6
cido ribonucleico, es la molcula que dirige la sntesis de protenas a partir de la informacin
contenida en el ADN.
3
4

A objeto de sistematizar e interpretar estos fenmenos,


se desarroll la Gentica Toxicolgica, que se constituye
como una de las ramas de las ciencias biolgicas encargada de evaluar el dao causado en el ADN (Figura 3)
por distintos tipos de exposicin a potenciales agentes
genotxicos y que se evala a partir del monitoreo ambiental y humano.
Los primeros estudios llevados a cabo por Ames7, en
bacterias que presentaban mutaciones en genes especficos y el desarrollo de la fraccin S98 para activacin
La prueba de Ames se utiliza en la evaluacin de mutagenicidad de muestras problema (agua,
aire, lixiviados de residuos slidos, extractos acuosos, etc.). Es considerada parte esencial de las
pruebas toxicolgicas para la deteccin y localizacin de fuentes que generen un dao potencial
por la presencia de compuestos genotxicos.
8
Fraccin sobrenadante obtenido del hgado de rata a partir de un homogeneizado por centrifugacin a 9000 g durante 20 minutos en un medio adecuado; esta fraccin contiene citosol y microsomas. Las ratas utilizadas son de las lneas Sprague-Dawley y Wistar. La fraccin S9 se utiliza en
conjuncin con la prueba de Ames para evaluar el potencial mutagnico de compuestos qumicos
debido a que permite predecir el posible comportamiento del compuesto a evaluar en su paso por
la va heptica.
7

metablica, permiti demostrar, en experimentos con


animales de laboratorio, que entre el 60 y el 90% de las
sustancias carcinognicas fueron mutagnicas.
En la dcada de los 80s se confirma la funcin de las mutaciones en el desarrollo del cncer con el descubrimien-

to de los oncogenes por activacin de protooncogenes.


Ahora se sabe que adems de las sustancias denominadas carcingenos genotxicos, existen tambin otros
carcingenos no genotxicos o epigenticos que actan
por otros mecanismos.

Copia mutada

Adenina
Timina
Citosina
Guanina
Cadena
azcar - fosfato

Figura 3. Esquema del proceso de mutacin en la


cadena del ADN.

El descubrimiento de la relacin entre mutagnesis y el


desarrollo de tumores permiti establecer la necesidad
de evaluar el riesgo de carcinogenicidad por exposicin
a sustancias qumicas mediante la evaluacin de mutagenicidad.
Por tanto, las pruebas para la deteccin de mutgenos
adquirieron su importancia debido a que estos compuestos tienen la capacidad de alterar el material gentico en los organismos y producir: malformaciones en
el embrin o feto, mutaciones en las clulas germinales
reduciendo la fertilidad, enfermedades cardacas, arte-

rioesclerosis, influir en los procesos de envejecimiento y


provocar mutaciones que pueden generar cncer (Majer
et al., 2005).
Segn Fiskesjo (1985), los organismos biolgicos tienen
la capacidad de detectar cambios en la calidad del agua
y expresar las alteraciones ms sutiles que operan durante cierto tiempo en un ecosistema mediante respuestas
individuales o de conjunto. En este sentido, los ensayos
o test biolgicos se estn transformando en herramientas valiosas para la evaluacin del impacto ambiental generado por los compuestos mutgenos.

Mitocondria

Citoesqueleto

Ncleo

Ribosomas

Retculo
endoplasmtico

Centriolo

Membrana
plasmtica

Citoplasma
Peroxisoma
Aparato de Golgi

Figura 4. Clula eucariota animal

Nuclelo

Aparato de Golgi

Citoesqueleto
Reticulo
Endoplasmtico

Cloroplasto
Ncleo

Nucleolo

Mitocondria

Ribosomas

Vacuola

Citoplasma
Membrana
Plasmtica
Pared celular

Figura 5. Clula eucariota vegetal

Telofase

Anafase

Interfase

Metafase

Profase

Clulas de raiz de cebollin en diferentes estadios de divisin

Cmo se evala genotoxicidad en


cuerpos de agua?

Los ensayos de genotoxicidad estn diseados para detectar compuestos que inducen directa o indirectamente
a daos genticos por diferentes mecanismos. Generalmente, se considera que este dao produce efectos heredables y provocan la formacin de tumores.
Actualmente, se dispone de pruebas con las que se
puede determinar un dao gentico y as detectar compuestos genotxicos. Muchas de estas pruebas son
bioqumicas, in vivo o in vitro, con micro o macro organismos. Mediante estos ensayos se pueden determinar
daos microscpicos o moleculares, o bien la formacin
de aductos, es decir, complejos que se forman cuando
un compuesto qumico se une a una molcula biolgica,
como el ADN o a ciertas protenas.

Para detectar con exactitud o predecir confiablemente


los efectos genotxicos de una sustancia en el ser humano no es suficiente una sola prueba, sino que se debe
disponer de por lo menos dos o ms alternativas.
La correlacin entre mutagenicidad y carcinogenicidad
es cada da ms evidente. Se ha demostrado que 157
de los 175 carcingenos conocidos tambin son mutgenos. De ah la conveniencia de saber con precisin
el posible dao que un compuesto puede tener sobre
nuestro organismo o sobre otros seres vivos.
El monitoreo de los contaminantes por anlisis directo
requiere conocer el agente qumico a verificar, y su evaluacin est limitada por la sensibilidad y especificidad
del mtodo utilizado

11

Ante esto, los bioensayos ofrecen ventajas considerables debido a que un organismo puede metabolizar un
compuesto cualquiera y convertirlo en otro que puede
ser an ms txico que el original.
Actualmente, a nivel mundial, las agencias reguladoras
de medio ambiente exigen una batera o conjunto estndar de estudios de genotoxicidad antes de dar autorizacin para liberar productos de consumo humano,
entre ellos el agua potable debido a que el proceso de
potabilizacin requiere de cloro, el mismo que ha mostrado ser mutagnico en diferentes ensayos.
La batera estndar para determinar genotoxicidad incluye el llamado test de Ames, que es un ensayo biolgico
rpido utilizado para determinar el potencial mutagnico
y cancergeno de compuestos qumicos9. El procedimiento se describe en una serie de documentos de principios
de 1970, escritos por Bruce Ames y su grupo de investigacin de la Universidad de California, Berkeley. En este
Las pruebas estndar para la carcinogenicidad hechas sobre roedores toman aos para completarse y son caras de realizar.

12

sentido, el test de Ames es utilizado mundialmente como


un ensayo inicial para discriminar nuevos qumicos y frmacos por su potencial mutagnico.
En varios estudios, las aguas contaminadas han mostrado que pueden inducir dao gentico en mamferos y
organismos acuticos (Minissi y Lombardi, 1997). El efecto mutagnico de estas aguas y sus sedimentos puede
ser evaluado bajo condiciones de laboratorio usando
sistemas biolgicos como bacterias, levaduras, plantas y
peces (Minissi et al., 1996).
El protocolo mejorado para microncleos en races de
Vicia y Allium (races de habas y cebollas) fue establecido
como un ensayo estndar internacional por el International Program on Plant Bioassays bajo el auspicio del
Programa Ambiental de las Naciones Unidas (Ji et al.,
1999; Majer et al., 1999)
Entre los diferentes ensayos citogenticos en plantas,
el test de microncleos (MCN) en races de Vicia faba
(haba) es el ms sensible para agentes aneugnicos y

clastognicos, adems de ser simple, barato y requerir


condiciones mnimas de laboratorio (Minassi y Lombardi,
1997). En China el test de MCN en Vicia faba (haba) es
un mtodo estndar en monitoreo ambiental (Kong et
al., 1998).

Sin embargo, en este tipo de ensayos con MCN tambin


puede utilizarse races de Tradescantia paludosa (purpurina o amor de hombre) y Allium cepa (cebolla) debido
a que resultaron ser bioindicadores altamente sensibles,
fciles de aplicar en diferentes situaciones empleando
procedimientos y protocolos sencillos y de bajo costo.

Figura 6. Plantines de purpurina (Tradescantia


paludosa)

Figura 7. Cebollines (Allium cepa)

13

Figura 8. Cebollines en proceso de ensayo

Protocolo de evaluacin

Los microncleos son fragmentos de cromosomas o cromosomas completos que, espontneamente o por causa de agentes que rompen cromosomas o que alteran
el huso10 de divisin, quedan fuera del ncleo durante
la mitosis11. Entre estos agentes estn las radiaciones,
sustancias qumicas, plaguicidas, frmacos y otros contaminantes ambientales.
Los microncleos son conocidos, en el campo de la hematologa, como cuerpos de Howell-Jolly. Su forma es
generalmente redonda u ovalada, con un dimetro que
vara desde 0,4 a 1,6 micras. Su formacin ocurre en la
anafase de la mitosis12 donde el fragmento cromosDurante la divisin celular se forma una estructura especial para desplazar a los cromosomas
que recibe el nombre de huso acromtico. Despus de la divisin, el huso se desmonta porque
no es necesario.
11
La mitosis es la divisin de la clula en la que, previa duplicacin del material gentico, cada
clula hija recibe una dotacin completa de cromosomas.
12
Durante la anafase, los centrmeros se dividen, lo que permite que cada una de las cromtidas
idnticas que formaban el par se separen (cromosomas hijos) y se dirijan a los dos polos de la
clula arrastradas por los microtbulos del huso mittico.
10

mico que no posea centrmero o el cromosoma desorientado no podr integrarse a un ncleo por carecer
del elemento indispensable para orientarse en el huso
acromtico.
Luego, en la telofase, los cromosomas normales, as
como los fragmentos que posean centrmeros, dan origen a los ncleos de las clulas hijas. Sin embargo, los
elementos rezagados, que pueden ser fragmentos o cromosomas completos, quedan incluidos en el citoplasma
de las clulas hijas y una proporcin de ellos se transforma en uno o varios ncleos secundarios. Tales ncleos
son mucho ms pequeos que el ncleo principal, de
ah su nombre de microncleos (Figura 9, Figura 10). Si
el compuesto estudiado es un clastgeno, se formarn
microncleos pequeos, pero si es un aneuploidgeno,
lo que se observar ser la formacin de microncleos
grandes (Terradaset. al. 2010).

15

eritrocitos policromticos de la mdula sea, cultivos


de linfocitos de sangre perifrica, clulas de la mucosa
bucal, hepatocitos de rata, eritrocitos en peces y aves.
Como se indic antes, en clulas vegetales, las ms utilizadas son las clulas meiticas de la purpurina amor de
hombre y las clulas meristemticas de cebolla y haba.
Como ventajas de la tcnica de microncleos estn:
Figura 9. Formacin de ncleos y microncleos a partir
de una clula madre

Los microncleos son ncleos citoplasmticos redondos


y de tamaos variables con las mismas caractersticas histoqumicas que el ncleo principal, pero estn envueltos
dentro de un pedazo separado de membrana nuclear.
Para la realizacin de esta prueba es indispensable utilizar un tejido en constante divisin, pero debe considerarse que en las clulas con poco citoplasma los microncleos no son fcilmente distinguibles de los lbulos o
proyecciones del ncleo normal.
La prueba se realiza en diferentes tipos celulares como:

16

- La posibilidad de probar un slo agente o


sustancia qumica sin otros compuestos,
- La posibilidad de probar mezclas o
muestras complejas en su composicin,
- La abundancia de clulas analizables en
diferentes periodos del ciclo celular y el
que los microncleos formados durante la
divisin celular persisten al menos durante
la siguiente interfase.
Adicionalmente, la prueba no deja lugar a dudas sobre
el dao producido, pues lo que se observa como microncleos es claramente una prdida de ADN.

Entre las principales desventajas estn:


- La prueba no detecta agentes que no
producen prdidas de material gentico o
rezagos anafsicos, y

- Tampoco es til en poblaciones celulares


que no se dividen.

Figura 10. Formacin de microncleos en races de


habas (Vicia faba) que fueron germinados en aguas
con arsnico.

17

4.1

Reactivos y material

Los reactivos y material requeridos para el ensayo de una


muestra se presentan en las Tablas 2 y 3. Sin embargo,
stos pueden ser utilizados hasta para 10 muestras, con
excepcin de los recipientes para la toma de muestras y
las copas de coctel.
Tabla 2. Reactivos requeridos para uno a diez ensayos
Reactivos

Cantidad

cido actico 99%

100 mL

Solucin de cido clorhdrico 1 N

50 mL

Etanol 70%

500 mL

Solucin Etanol: cido actico (3:1)

Tabla 3. Material requerido


Material

Bistur o gillete

Cantidad
3u

Copas de coctel de 100 mL

24 u*

Cubreobjetos

1 caja 100 u

Gradilla para tubos largos

1u

Jarra plstica de 1 L

1u

Lpiz negro con goma

1u

Marcador indeleble 1 u
Masking de 1 pulgada

1u

Microscopio con objetivos 4x a 120x

1u

Pinza metlica de punta fina

1u

Piseta para agua de 500 mL

1u

100 mL

Portaobjetos

1 caja 50 u

H2O hervida de grifo

1 000 mL

Probeta de 100 mL

3u

H2O destilada

1 000 mL

Recipiente plstico de 5 L

1 u*

Solucin de orcena13 actica 45%

50 mL

Servilletas de papel o papel filtro rpido

1u

Tubos de ensayo de boca ancha

40 u

Vaso de precipitados de 250 mL

7u

Viales o frascos de 5 mL con tapa

10 u

Contmetro o contador de clulas

1u

Colorante de color rojo violceo, extrado de lquenes y que tie con preferencia ncleos y cromosomas.
13

*Material requerido por muestra a ensayar

18

4.2

Procedimiento de muestreo

Durante el muestreo de agua se recomienda tomar las


siguientes precauciones14:
a) Las muestras no deben incluir partculas
grandes, desechos, hojas u otro tipo de
material accidental, salvo cuando se trate
de muestras de sedimentos. Adems,
deben ser filtradas para la realizacin de los
ensayos o determinaciones. Si no hubiera
papel filtro, se puede usar servilletas de
papel.
b) Para minimizar la contaminacin de la
muestra, conviene recogerla con la boca
del frasco en la misma direccin de la
corriente (Figura 11).

14

c) Se debe tomar un volumen suficiente


de muestra, se recomienda entre 2 a 3

litros para eventuales necesidades de


repeticiones.

d) Se debe realizar todas las determinaciones


posibles de campo, como las mediciones
de pH, temperatura y conductividad. Para
evitar riesgos de contaminacin, estas
determinaciones deben realizarse en
alcuotas de muestras separadas de las que
sern enviadas al laboratorio.

e) Se deben limpiar muy bien los frascos


y dems materiales de recoleccin. Es
importante recordar que en gran parte de
los casos la contaminacin de los frascos
no es visible ni siquiera al microscopio.
f) La parte interna de los frascos no debe
ser tocada con la mano ni debe quedar
expuesta al polvo, humo u otras impurezas.

Litter et al., 2009.

19

g) Las personas encargadas de la recoleccin


de muestras deben mantener las manos
limpias y usar guantes.

para evaluar el grado de contaminacin o


asimilacin de carga orgnica a lo largo del
tramo en estudio.

h) Los frascos deben ser llenados completamente y de manera rpida con la muestra y
luego resguardadas fuera del alcance de la
luz solar.

l) En el caso de aguas subterrneas, deben


considerarse protocolos especficos para
evitar la alteracin de las muestras. Entre
los datos que se debern registrar estn:

i) En lo posible, para la preservacin en su


traslado al laboratorio (Figura 12), las
muestras deben ser refrigeradas en cajas
de poliestireno de manera inmediata.
Para evitar posible contaminacin de las
muestras, no debe aadirse sal al hielo de
refrigeracin.

- Tiempo de bombeo,

- Profundidades de donde se realizaron las recolecciones,

- Profundidad del pozo,

- Profundidad de los niveles esttico y dinmico,

- Tipo de bomba,

- Profundidad del ranurado, etc.

j) Se debe mantener un registro de toda la


informacin de campo. Para esto se deber
llenar una ficha de recoleccin por muestra
o conjunto de muestras de las mismas
caractersticas.
k) El muestreo en pequeos cursos de agua
debe hacerse aguas arriba y aguas debajo
de las fuentes de contaminacin, con la
inclusin opcional de puntos adicionales

20

Para determinar si existe una relacin de dosis efecto,


la muestra de agua debe evaluarse considerando las siguientes proporciones de dilucin:

- Sin dilucin (100% la muestra),

- Dilucin al 50%,

- Dilucin al 25%,

- Dilucin al 12,55%, y

- Dilucin al 6,25%.

Figura 11. Toma de muestra para ensayos.

Las diluciones pueden realizarse con agua hervida de


grifo o agua destilada, la misma que deber utilizarse
tambin para el control negativo o blanco.

Figura 12. Lectura de microncleos en microscopios.

21

4.3

Medicin de microncleos

Para el ensayo con bulbos de Allium cepa (cebollines),


se debe seleccionar el nmero necesario o suficiente de
bulbos con el mismo tamao y apariencia. Se recomienda bulbos con dimetro de 1 cm. Mnimamente deber considerarse un nmero de 140 bulbos, 20 para el
control negativo o blanco (agua de grifo o destilada), 20
para el control positivo (muestra sin dilucin) y 20 para
cada una de las diluciones de la muestra (80 bulbos). Los
restantes 20 servirn para reemplazar algn imprevisto.
En cada caso debern realizarse 2 rplicas de 10 bulbos cada una. Si se ve por conveniente, tambin puede
hacerse 3 rplicas para facilitar luego la aplicacin de
anlisis estadstico. De usarse cabezas de cebollas ms
grandes, tres son suficientes por tratamiento.
Para proceder con los ensayos se deber seguir la siguiente secuencia de acciones:

22

1) Preparacin de cebollines: Con un estilete


u cuchillo muy fino, de la zona radicular se
debe quitar o cortar con cuidado todas las
races. Se debe evitar lastimar la cofia o
lugar de nacimiento de las races. Luego se
debe retirar la cascara externa de la cabeza
del cebolln y finalmente cortar las hojas
dejndolas con unos 5 a 7 cm de longitud
(Figura 13).
2) En vasos de precipitados o en copas
de coctel con agua hervida de grifo o
destilada (2 rplicas por tratamiento), se
debe colocar 10 bulbos, asegurndose
que la zona radicular quede en contacto
con el agua (Figura 14), pero nunca
tocando la base o fondo del vaso porque
se inhibira el crecimiento radicular. Se
puede insertar y sujetar los 10 tallos con
palitos mondadientes.

la muestra de agua que se est evaluando


(control negativo, 6,25%, 12,5%, 25%,
50% y 100%, si fuera necesario tambin
en control positivo) todo por duplicado o
triplicado).

Figura 13. Cebollines preparados para ser


ensayados

3) Dejar reposar en esta agua, a temperatura


ambiente, por 48-72 horas hasta que las
races alcancen una longitud de 1 1,5 cm.

4) Al segundo o tercer da, segn el


crecimiento de las races (en invierno estas
suelen crecer ms lentamente), sacar el
manojo de cebollines del agua, lavarlos
con agua hervida de grifo y colocarlos en

Figura 14. Bulbos de cebollines en


agua hervida de grifo

23

5) Dejar el ensayo corriendo por 24 o 48


horas. Anotar en el reporte este dato de
tiempo.
6) A las 24 o 48 horas, sacar el manojo de
cebollines de las muestras de agua, lavar
con agua hervida de grifo o destilada y
observar inicialmente las caractersticas de
las races como color, grosor y forma de la
terminacin, Se debe contar y medir las
races, reportar los datos en una tabla para
procesarlos.
7) Cortar y colectar las races de los 20
cebollines de cada tratamiento en viales
con tapa conteniendo la solucin de
etanol: cido actico 3:1. Se puede utilizar
tambin botellitas de antibiticos. Se debe
guardarlos por un mximo de 22 horas
para que se fijen y detengan los procesos
metablicos.
8) A las 22 horas se debe cambiar las races
colectadas a otro vial con etanol al 70%
y rotular cada muestra con cuidado. Se
puede colocar dentro del vial, junto con

24

las races, un papel cebolla con el nombre


de la muestra, cdigo, fecha, etc. escrito
con lpiz negro. Estas races estn listas
para evaluar microncleos. La muestras as
preparadas se pueden guardar hasta tres
meses en refrigeracin.

9) Colocar unas cuantas races, pueden


ser 5, en un tubo con solucin de cido
clorhdrico (HCl) 1 N, tapar y dejar en bao
Mara de 3 a 5 minutos. Si no se cuenta
con bao Mara, se puede usar un vaso con
agua hervida. Se debe cuidar que el vial no
se abra cuando est en el bao Mara.

10) Sacar 1 a 2 races sobre un portaobjetos,


cortar aproximadamente los 3 mm finales
de la raz y eliminar el resto.
11) Cortar las races con el gillete o bistur,
de manera transversal en forma de micro
rodajas, lo ms finamente posible.
12) Aadir una gota de orcena actica y dejar
10 a 15 minutos. Si se seca, aadir ms
orcena actica.

13) Tapar con un cubreobjetos, presionar fuertemente y repiquetear con la goma de un


lpiz.
14) Observar al microscopio, ubicar campos
donde las clulas estn dispersas, contar

1 000 clulas por placa. Esta accin debe


realizarse por duplicado.
15) Reportar las clulas que contengan uno o
ms microncleos (Figura 15).

Figura 15. Clulas binucleadas presentando ms de 3


microncleos

25

4.4

Datos y clculos

El recuento de microncleos se realiza en microscopio


binocular con el objetivo de 40X. El criterio para anlisis
de microncleos de las clulas debe cumplir con los siguientes requisitos (Fenech 2000; Figura 16):

7) No debe estar sobrepuesto a ninguno de


los ncleos,

8) El microncleo dudoso ser descartado en


el anlisis.

1) Debe tener morfologa idntica a los


ncleos principales,

2) Debe tener una forma redonda u ovalada,

3) Su dimetro debe estar entre 1/16 y 1/3 de


los ncleos principales,

4) Debe tener el mismo color, textura y retraccin que el ncleo principal,

5) No debe presentar refringencias (ncleos o


partes de ncleos brillosos),

6) Debe estar claramente separado del


ncleo principal,

26

Figura 16. Clula con ncleo y microncleo


identificado.

9) Cuando la frecuencia de microncleos sea


menor de 3/1 000 (0,3%) se deber evaluar
un mximo de 3 000 clulas. Esto para disminuir la probabilidad de que la presencia
de los microncleos se pudiese deber a un
evento al azar.
La frecuencia de Microncleos (MCN %) se calcula como
sigue:
MCN%=

Nmero de clulas con micronucleos


Nmero total de celulas contadas

x 100

Para el anlisis estadstico se puede hacer uso de Microsoft Excel y determinar medias y error estndar en cada
grupo experimental, as como el clculo de la varianza
de todos los tratamientos. Asimismo, se puede utilizar el
t-test Dunnett, que se aplica para determinar la diferencia significativa entre medias del control y los grupos de
tratamiento (Duan et al, 1999).

Interpretacin de

27

4.5

Resultados

Los resultados son considerados positivos cuando se


observa un aumento significativo en la frecuencia de
clulas con microncleos respecto al grupo de control
negativo o blanco. En este entendido, si el nmero de
microncleos (MCN) formados en el agua evaluada es
igual o mayor al doble de los formadas en el ensayo en
blanco, se dir que el agua tiene riesgos genotxicos.

hay un aumento significativo en la presencia de microncleos. Es decir, si en el agua evaluada el nmero de microncleos formados es menor al doble de microncleos
formados en el grupo de control negativo o blanco, se
dir que el agua no tiene riesgos genotxicos.

MCN muestra 2MCN blanco => Tiene riesgo genotxico

La Figura 17 muestra parte de los resultados con clulas


de races de haba (Vicia faba) y la Figura 18 resultados
con races de cebollines (Allium cepa).

Los resultados son considerados negativos cuando no

28

MCN muestra < 2MCN blanco => No tiene riesgo genotxico

Figura 17. Microncleos desarrollados en ensayos con


clulas de races de Vicia faba (haba).

Figura 18. Microncleos desarrollados en ensayos con


clulas de races de Allium cepa (cebolla).

29

Glosario

Aneugnicos: Agente capaz de producir en la clula


que uno o ms cromosomas completos de un conjunto
normal falten o se presenten ms de una vez.

Mutagenicidad: Propiedad de agentes fsicos o qumicos de inducir cambios en el material gentico que se
transmiten durante la divisin celular.

Clastognicos: Agente que causa rotura de los cromosomas y/o consecuentemente, ganancia, prdida o reordenamiento de los fragmentos cromosmicos

Mutgenos: Un agente qumico, fsico o biolgico que


altera o cambia la informacin gentica de un organismo y causa un incremento en la frecuencia de mutaciones espontanea. Cuando numerosas mutaciones causan
cncer, se denominan carcingenos.

Microncleos: Fragmentos de cromosomas o cromosomas completos que espontneamente o por causa de


agentes que rompen cromosomas, como las radiaciones
(agentes que se denominan clastgenos) o que daan
el huso mittico, como la vincristina (aneuploidgenos),
quedan fuera del ncleo durante la mitosis.
Mutacin: Alteracin en la secuencia de ADN. Puede
ser causado por daos producidos por qumicos, por
radiacin o por errores durante la replicacin y la reparacin del ADN. Entre sus consecuencias estn las enfermedades genticas y el cncer.

Genotxico: Txico o daino para el ADN. Las sustancias genotxicas pueden unirse directamente al ADN
o actuar indirectamente mediante la afectacin de las
enzimas involucradas en la replicacin del ADN y causando, en consecuencia, mutaciones que pueden o no
desembocar en un cncer. Las sustancias genotxicas no
son necesariamente cancergenas, pero la mayor parte
de los cancergenos son genotxicos.

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