Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
ISSN: 1665-2738
amidiq@xanum.uam.mx
Universidad Autnoma Metropolitana Unidad
Iztapalapa
Mxico
AMIDIQ
Resumen
Los balances estequiomtricos en procesos de fermentacin son esenciales para su entendimiento y/o aplicacin. El
clculo de flujos metablicos resulta fundamental en estudios cuantitativos de fisiologa celular. Una poderosa
herramienta para la determinacin de los flujos en la red de reacciones bioqumicas es el anlisis de flujos
metablicos, en el cual los flujos intracelulares son calculados usando un modelo estequiomtrico que describe la
bioqumica del microorganismo. El anlisis de flujos metablicos es particularmente til en conexin con estudios de
produccin de metabolitos, donde el objetivo es dirigir tanto carbono como sea posible desde un sustrato hacia un
producto metablico, adems de permitir el clculo de flujos extracelulares no medidos y rendimientos tericos
mximos, identificacin de vas metablicas alternas y puntos ramificados de control metablico En este trabajo se
presenta una revisin de las metodologas de anlisis de consistencia y anlisis de flujos metablicos y su aplicacin
a sistemas de fermentacin.
Palabras clave: balances elementales, metabolismo, modelo estequiomtrico.
Abstract
Stoichiometric balances in fermentation processes are esential for their understanding and/or application. The
calculation of metabolic flows is fundamental in quantitative studies of cellular physiology. Metabolic flux analysis
is a powerful tool for the determination of the flows in the network of biochemical reactions. Intracellular fluxes are
calculated using a stoichiometric model that describes the biochemistry of the microorganism. Metabolic flux
analysis is particularly useful in connection with studies of metabolite production, where the objective is to direct as
much carbon as it is possible from a substrate towards a metabolic product, besides to allow the calculation of nonmeasured extracellular fluxes and maximum theoretical yields, identification of alternating metabolic pathways and
branched nodes of metabolic control. This work presents a revision of methodologies of consistency and metabolic
flux analysis and their application to fermentation systems.
Keywords: elemental balances, metabolism, stoichiometric model.
1. Introduccin
Los procesos de fermentacin, son
caracterizados por el crecimiento de una
poblacin de microorganismos, que degradan
un sustrato, formando algn(os) producto(s)
de fermentacin, por lo que los balances del
proceso son esenciales para su entendimiento
y/o aplicacin. El clculo de flujos
metablicos es una herramienta de la
ingeniera metablica y una determinacin
fundamental en estudios cuantitativos de
fisiologa celular, ya que permite organizar el
*Autor para la correspondencia: E-mail: soto@itdurango.edu.mx
Tel/Fax: (61) 88186936
conocimiento
metablico
de
un
microorganismo en una red de reacciones
bioqumicas y provee una medida del grado
de ajuste entre varias vas metablicas
(Varma y Palsson, 1994; Stephanopoulos y
col., 1998; Nielsen, 2001). El grado de ajuste
entre vas metablicas se entiende como la
produccin de intermediarios en unas y el
consumo de los mismos en otras, por
ejemplo, cuando las condiciones ambientales
cambian los flujos metablicos son
redistribuidos de manera que se mantenga el
0.500
0.750
0.900
0.950
0.975
0.990
0.46
1.32
2.71
3.84
5.02
6.63
1.39
2.77
4.61
5.99
7.38
9.21
2.37
4.11
6.25
7.81
9.35
11.30
3.36
5.39
7.78
9.49
11.10
13.30
4.35
6.63
9.24
11.10
12.80
15.10
i =1
i =1
X + Y XPi Pi Y SPi S i = 0
(1)
Dnde:
X = Biomasa
Y XPi =
rPi
YSPi =
rSi
rX
Si = Sustrato i
Como el coeficiente estequiomtrico de
la biomasa es uno, la tasa de reaccin est
dada por la tasa especfica de crecimiento de
la biomasa, la cual, junto con los coeficientes
de rendimiento especifican completamente el
sistema. En la aplicacin del modelo de caja
negra para el anlisis de consistencia, se
puede utilizar cualquiera de los siguientes
conjuntos de datos (Stephanopoulos y col.,
1998):
1. Un conjunto de coeficientes de
rendimiento como los que aparecen en la
reaccin global, junto con la tasa especfica
de crecimiento.
2. Un conjunto de coeficientes de
rendimiento con respecto a otra referencia
(por ejemplo un sustrato), junto con la tasa
especfica de consumo/formacin de ese
compuesto de referencia.
3.
Un conjunto de tasas especficas de
todos los sustratos y productos, incluida la
biomasa.
4.
Un conjunto de tasas volumtricas de
todos los sustratos y productos, incluida la
biomasa.
Cualquiera de los arreglos anteriores
proporciona los mismos resultados. Lo ms
usual es utilizar coeficientes de rendimiento
expresados con respecto a uno de los
sustratos, usualmente la fuente de carbono.
Antes de presentar los balances elementales,
es conveniente introducir la expresin de las
frmulas elementales de los compuestos
involucrados, normalizados con respecto a su
contenido de carbono. Por ejemplo, la
frmula elemental de la glucosa, que es
C6H12O6, se expresa como CH2O en base a un
tomo de carbono. As, el balance de
carbono, en base C-mol y considerando un
solo sustrato, es expresado como:
M
Y
i =1
SPi
+ YSX + YSC = 1
(2)
Dnde:
Y SP i =
rPi
Y SX =
rX
= Coeficiente de rendimiento de
rS
Y SC =
rCO 2
Y
i =1
SP i
P + Y SX
i
(3)
Dnde:
Er = 0
(4)
Balance de carbono:
rlactato + rbiomasa + racetato + rpropionato + rbutirato + rvalerato + rCO2 = 0
(5)
Balance de hidrgeno:
2rlactato + 1.81rbiomasa + 2racetato + 2rpropionato + 2rbutirato + 2rvalerato + 3rNH3 + 2rH2O = 0
(6)
Balance de oxgeno:
rlactato + 0.52rbiomasa + racetato + 2/3rpropionato + 1/2rbutirato + 2/5rvalerato + 2rCO2 + rH2O = 0
(7)
Balance de nitrgeno:
0.21rbiomasa + rNH3 = 0
(8)
Estas cuatro Ecs. constituyen un sistema lineal similar a la Ec. 4, que en este caso se escribe:
2
1
1
1 . 81
0 . 52
0 . 21
1
2
1
0
1
2
2/3
0
1
2
1/ 2
0
1
2
2/5
0
0
3
0
1
1
0
2
0
r Lactato
rBiomasa
r
Acetato
0
rPr opionato
2
rButirato
1
rValerato
0
r NH 3
rCO
2
rH 2 O
=
0
(9)
2
1
1
1 . 81
1
2
0 . 52
0 . 21
1
0
1
2
1
2
2 / 3 1/ 2
0
0
1 0
2 3
2 / 5 0
0 1
1
0
2
0
rLactato
rBiomasa
r
Acetato
0
rPr opionato
2
rButirato
1
rValerato
0
rNH 3
r
CO 2
rH O
2
(E m
(11)
0
0
=
0
0
(10)
o bien:
0
rm 0
E c ) =
rc 0
0
(12)
rc = E cT E c
E CT E m rm
(13)
(14)
R = E m E c E cT E c
E Tc E m
(15)
(16)
(17)
h = TP
(18)
rm = rm +
(19)
= FR rT P 1 R r rm
(20)
(21)
Dnde:
= alguna norma matricial
A# = pseudoinversa, dada por:
A# = AA
(22)
(23)
rLactato =x1 - x2 - x4 = 0
(24)
rPropionilCoA = x2 - x3 - 3/5x7 = 0
(25)
(26)
rNADH=-1/3x2+1/3x4+1/3x5-2/5x7-1/2x8-1/3x12+1/3x15+1/5x18-0.2652x19 =0
(27)
(28)
(29)
(30)
(31)
(32)
(33)
(34)
(35)
(36)
(37)
(38)
Para el caso de la tasa global de cambio de cada metabolito en la red metablica propuesta, las
Ecs. 24 a 38, se expresan en forma matricial como:
1
0
00
0
0
0
0
0
0
00
0
0
0
x1
x2
x
3
0
1
0 1
0
0
0
0
0
0
0
0
0 0
0
0
0
0
0
0
x
1
1 0
0
0 3 / 5
0
0
0
0
0
0 0
0
0
0
0
0
0 4 0
x5
0
0
0
0
2 / 3 1 2 / 5
1
0
0
0
0
0 0
0
0
0
2 / 5 0.164
0
x
1/ 3 0 1 / 3
0
0 2 / 5 1 / 2
0
0
0 1 / 3 0 0
0
0
0
1 / 5 0.2652 0 6 0
x
7
0
0
0
1
1
0
0
0
3 / 4
0
0
0
0 0
0
0
0
0
0.094
0
x8
0
0
0
0
0 1 / 2 1/ 5 1/ 4 1/ 4 1/ 4 0 1 / 3 0 0
0
0
0
0
0.9752 1
x9
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
0
0
0 0
0
0
0
4 / 5 0.1063 0
x
0
0
0
0
0
0
0
0
3 / 4 1
0
0 0
0
0
0
0
0.039
0 10 = 0
x
11
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
0 0
0
0
0
0
0.1128 0
x 12
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1 0
0
0
3 /9
0
0.0097 0
0
x 13
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1 1
0 3 /5 6 /9
0
0.0107 0
x 14
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0 1 1
0
0
0
0.0308 0
x 15
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0 0 5 / 6 1 5 / 9
0
0.1126 0
x
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0 0
0 2 / 5 4 / 9
0
0.036
0 16 0
x 17
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0 0
0
0
0
1
0.0727 0
x 18
x
19
x 20
O bien:
Ax = 0
(40)
(39)
(41)
x1 rLactato
x3 rPr opionato
x r
6 = Acetato
x7 rValerato
x r
8 Butirato
x r
19 Biomasa
(42)
xm
1
=
Am
0 x m
A c x c
= Tx
(43)
x1 1
x3 0
x6 0
x7 0
x8 0
x19 0
00 01
0 0
0 0
0 = 0
0 0
0 0
0 0
0 0
0 0
00 00
0 0
0 0
0 0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
3 / 5
1 2 / 5
0.164
2/3
2 / 5
0
0
0
0
0
1
0
3 / 4
0
0
0
0
1/ 3 0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1/ 5
0
0
0
1/ 4 1/ 4
1
1
0
0
1/ 3 0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
4 / 5
2 / 5 1/ 2 0.2652 1/ 3 1 / 3
0.094
0
0
0
1
0 1/ 2
0 0
1/ 5
0
0.9752
0.1063
1/ 4
0
0
0
0
0
0.039
3/ 4
0.1128
0.0097
1 0
3/ 9
0
0
0
0
0
0
0
0
0.0107
0.0308
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
1
0
1
3/ 5
0
6/ 9
0
0
0
0.1126
5/ 6
5 / 9
0.036
2 / 5 4 / 9
0.0727
x m T11
=
0 T21
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
1
3 / 5
2 / 5
0
1
0
0.164
1
0
0
0
0
2/3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2 / 5
0
0
0
0
2 / 5 1 / 2 0.2652 1 / 3 1 / 3
0.094
0
0
0
1
0
0
0
0
1 / 3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1/ 5
0
0
0
1/ 2
0
1/ 5
0
1/ 4
0
0
0
1 / 3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
4 / 5
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
3 / 4
0.9752
0.1063
0
0
0
0
0
0
1 / 4 1/ 4
1
1
0.039
3/ 4
0
0
0.1128
0.0097
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
1
0
1
0
0
0
0
0
0
0
3/ 9
0
0
0
0
0.0107
0.0308
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
1
0
1
3/ 5
0
6/9
0
0
0
5 / 9
2 / 5 4 / 9
0.1126
5/ 6
0.036
0.0727
x 1 = TrT F 1Tr
TrT F 1 x m
(47)
(44)
(45)
T12 x 1
= Tx
T22 x 2
x1
x
3
0
x6
0
x7
0
x
0 8
x
0 19
x
0 2
x
0 4
x
0 5
x
0 9
x
1 10
x
0 11
x
0 12
x
0 13
x
0 14
x15
0
x
0 16
x
0 17
x
0 18
x20
0
0
0
x1
x
3
0
x6
0
x7
0
x
0 8
x
0 19
x
0 2
x
0 4
x
0 5
x
0 9
x
1 10
x
0 11
x
0 12
x
0 13
x
0 14
x
0 15
x
0 16
x
0 17
x
0 18
x
0 20
0
0
(46)
donde:
Tr = T11 T12 T221T21
(48)
y la matriz F es la matriz de
varianza-covarianza que se utiliz en el
modelo de caja negra. Finalmente, la mejor
estimacin del vector x2, que contiene todos
los flujos metablicos desconocidos, se
calcula:
x 2 = T221T21 x 1
(49)
Tabla 2. Reacciones de la red metablica para M. elsdenii creciendo sobre lactato. Los nmeros antes de
cada reaccin corresponden a los indicados en la Fig. 1. Tomada de Soto-Cruz (2002).
3.
4.
L - Lactato Lactato
1
Lactato + 3 NADH2 PropionilCoA
PropionilCoA Propionato
1
Lactato Piruvato + 3 NADH 2
5.
Piruvato
1.
2.
2
3
6.
AcetilCoA Acetato +
7.
3
5
PropionilCoA +
8.
AcetilCoA +
9.
3
4
Piruvato +
1
1
4
AcetilCoA +
2
5
1
2
AcetilCoA +
CO2 +
1
1
4
CO2
ATP
2
5
NADH 2 Valerato +
NADH 2 Butirato +
NADH 2 +
1
4
16.
Ribosa5P
17.
18.
19.
20.
9
4
Ribosa5P +
5
4
9
Eritrosa4P +
Eritrosa4P
2
ATP
ATP Oxalacetato
13.
14.
15.
11.
12.
ATP
10.
3
5
Fructosa6P
6
9
Fructosa6P +
3
9
Gliceraldehido3P
AcetilCoA ( )cetogutarato +
NADH 2 + 5 CO 2
0.0308Glucosa6P + 0.0107Fructosa6P + 0.1126Ribosa5P
+ 0.0362Eritrosa4P + 0.0097Gliceraldehido3P
+ 0.1128(3Fosfoglicerato) + 0.039Fosfoenolpiruvato
Biomasa
Oxalacetato +
Al
trabajar
con
un
sistema
sobredeterminado, es posible eliminar de
manera selectiva una de las tasas medidas del
vector xm, para validar el modelo. Cuando se
selecciona cualquiera de los compuestos
medidos, el error de estimacin debe ser
similar al correspondiente error de medicin.
Conclusiones
measurement
data.
Biotechnology
Bioengineering 32, 713-715.
Vallino, J. J. y Stephanopoulos, G. (1990). Flux
determination in cellular bioreaction
networks:
applications
to
lysine
fermentation.
En:
Frontiers
in
bioprocessing. (S. K. Sikdar, M. Bierand y
P. Todd eds.) Pp. 205-219. CRC Press.
Boca Raton, Florida, EUA.
van der Heijden, R. T. J. M., Romein, B.,
Heijnen, J. J., Hellinga, C. & Luyben, K.
Ch. A. M. (1994a). Linear constraint
relations in biochemical reaction system: I.
Classification of the calculability and the
balanceability
of
conversion
rates.
Biotechnology Bioengineering 43, 3-10.
van der Heijden, R. T. J. M., Romein, B.,
Heijnen, J. J., Hellinga, C. & Luyben, K.
Ch. A. M. (1994b). Linear constraint
relations in biochemical reaction system:
II. Diagnosis and estimation of gross
errors. Biotechnology Bioengineering 43,
11-20.
van der Heijden, R. T. J. M., Romein, B.,
Heijnen, J. J., Hellinga, C. & Luyben, K.
Ch. A. M. (1994c). Linear constraint
relations in biochemical reaction system:
III. Sequential application of data
reconciliation for sensitive detection of
systematic
errors.
Biotechnology
Bioengineering 44, 781-791.
van Gulik, W. M. y Heijden, J. J. (1995). A
metabolic network stoichiometry analysis
of microbial growth and product formation.
Biotechnoloy Bioengineering 48, 681-698.
Vanrollegem, P. A. y Heijnen, J. J. (1998). A
structured approach for selection among
candidate metabolic network models and
estimation of unknown stoichiometric
coefficients. Biotechnology Bioengineering
58, 133-138.
Varma, A. y Palsson, B. O. (1994). Metabolic
flux balancing: basic concepts, scientific
and practical use. Biotechnology 12, 994998.
Varma, A., Boesch, B. W. y Palsson, B. O.
(1993a).
Biochemical
production
capabilities
of
Escherichia
coli.
Biotechnology Bioengineering 42, 59-73.
Varma, A., Boesch, B. W. y Palsson, B.O.
(1993b). Stoichiometric interpretation of