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UNIDAD III

DETECCIN, ENUMERACIN E IDENTIFICACIN


3.1 RECOLECCIN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS NATURALES
3.1.1. SUELOS Y SEDIMENTOS

Los suelos son ambientes discontinuos y heterogneos que contienen un gran numero de
diversos organismos (bacterias, hongos, protozoos y micro algas).
Las comunidades microbianas varan segn el tipo de suelo y la profundidad.
Los microorganismos del suelo contribuyen al mantenimiento de la fertilidad qumica, fsica y
biolgica del suelo. Transforman nutrientes inorgnicos, que de otra forma no pueden ser
absorbidos por la planta; adems favorecen la descomposicin y mineralizacin de la materia
orgnica.

En la microbiologa de los suelos se puede determinar:


Recuento de bacterias, hongos, levaduras o actinomicetos.
Presencia o ausencia de bacterias fitopatgenas.
Presencia o ausencia de hongos fitopatgenos.
Presencia o ausencia de hongos saprfitos/benficos.
Biomasa microbiana.
Respiracin microbiana.
Cundo tomar muestras del suelo?
Cuando se desee cuantificar la poblacin microbiolgica.
Para confirmar la presencia o ausencia de fitopatgenos que pueden afectar un cultivo. O
bien la presencia o ausencia de microorganismos benficos.
Para identificar y aislar microorganismos (benficos y patgenos) del suelo.
Para obtener curvas de mineralizacin de un terreno.
Cuando se desee conocer la actividad enzimtica del suelo.
Para conocer el efecto de prcticas agronmicas sobre la poblacin de microorganismos.
Para evaluar la calidad de los suelos.
TOMA DE MUESTRAS
El muestreo constituye la etapa inicial y fundamental para la adecuada interpretacin de los
resultados. Sin embargo, debido a que el suelo es un material muy heterogneo, con diferentes
condiciones de origen, topografa, manejo, tipos de vegetacin, etc.; es necesario definir unidades
con caractersticas ms o menos similares, que permitan establecer lo que se conoce como unidades
de muestreo.
Es importante sealar que la tcnica con que se realiza el muestreo, depende del objetivo del estudio,
teniendo en cuenta que existen diferentes tcnicas para el muestreo de suelos en aspectos como
fertilidad, clasificacin, fsica, mineraloga, determinacin de micro y macroorganismos, mecnica, etc.
Recoleccin de muestras.
Una muestra es una fraccin representativa del rea total de suelo que se desea estudiar.
Condiciones para la toma de muestra.
Seleccionar las reas caractersticas o representativas del estudio que se quiere realizar.
Levantar un croquis con las condiciones del terreno (planos, pendientes, cercanas a ros, con
o sin cultivo, reas de bosque, reas encharcadas, drenajes, etc).
Materiales a utilizar.
La herramienta ms apropiada para el muestreo es el barreno, ya que garantiza una cantidad
y profundidad de muestra homognea, son rpidos y causan menos dao a la superficie del

terreno. La nica desventaja es que no son muy tiles en suelos muy secos, compactos o con
mucho material rocoso. De no contar con esta herramienta, el muestreo puede hacerse con
una pala o paln y un balde limpio, procurando tomar una cantidad similar de suelo en cada
punto y a la misma profundidad.
Para la toma de muestras con pala, remover la vegetacin superficial y abrir un hoyo de
aproximadamente 25 x 25 cm de lado y 20 cm de profundidad, retirar los primeros 2 cm del
suelo y extraer la muestra. En general la profundidad de muestreo est entre 2 y 20 cm, que
es el rea de accin de las races. En zonas de pastos el muestreo puede hacerse a menor
profundidad (0-10 cm) y para algunos cultivos perennes puede ser importante realizar
muestreos ms profundos.
Un balde para mezclar las submuestras hasta obtener una muestra compuesta homognea.
Empacar en bolsas plsticas o de papel encerado, que no hayan sido usadas antes, o en
frascos de vidrio estriles, con tapa de cierre hermtico y de boca ancha para facilitar la toma.

Cmo tomar las muestras del suelo?


El muestreo representativo de un lote es esencial para obtener datos vlidos. Se recomienda
muestrear en zig-zag o al azar. Se utiliza una pala para una recoleccin superficial (0-10 cm).
Tomar de 10 a 20 sub-muestras a lo largo y ancho del terreno, las cuales se juntan, se homogenizan
bien en una bolsa o balde y se obtiene una muestra de unos 200 a 500 gramos.
Depositar las muestras en una bolsa plstica nueva, sellar y rotular adecuadamente o en un frasco
de vidrio.
Colocar las muestras en un sitio fresco (puede ser en una hielera) para evitar perdida de humedad y
modificaciones de temperatura.

Cuidados especiales.
Al estudiar microorganismos vivos, que se estn reproduciendo constantemente, se debe tomar en
cuenta lo siguiente para no alterar la representatividad de los resultados.
Si la muestra no va a ser enviada rpidamente al laboratorio para su anlisis, la misma puede ser
almacenada en refrigeracin a una temperatura de 5-10 C por 24 horas.
La contaminacin tambin se puede dar entre muestras. Esto puede ser evitado limpiando la barrena
despus de cada toma de muestra. La barrena se lava con agua y despus se enjuaga con etanol al
75% o cloro al 10% y dndole un enjuague final con agua estril.
Informacin de la muestra
La muestra deber tener las siguiente informacin:
Nombre de quien realizo el muestreo.
Localizacin finca, nombre, lote etc.
rea muestreada.
Croquis del muestreo (de ser necesario).
Cultivo.
Agroqumicos utilizados.
Otros datos que se requieran.
MUESTREO PARA ANLISIS DE MICORRIZAS
Esporas en suelo:

Se procede de la manera indicada para el muestreo de suelos, pero teniendo en cuenta que
si el muestreo se realiza en cercana a una planta, tendern a predominar las esporas de
micorrizas asociadas a ella.
De preferencia enve las muestras refrigeradas o garantizando un lapso de tiempo inferior a
72 horas desde la toma de la muestra hasta la llegada al laboratorio para evitar efectos
negativos en los resultados.

Colonizacin de races:

Seleccione la(s) planta(s) a muestrear.


Determine la forma de crecimiento de las races (superficial o profunda) y trate de llegar a
ellas de manera cuidadosa. Corte dos o tres puados de las races o raicillas ms finas.
Retire el exceso de suelo enjuagndolas con agua y seque ligeramente con papel
absorbente. Empquelas en bolsa plstica de cierre hermtico, aadiendo 3 cucharadas de
vinagre de cocina y 3 cucharadas de alcohol antisptico.

Muestreo de compost:

Con el fin de conocer la condicin promedio del compost, colecte pequeas cantidades de
muestra de iguales proporciones en diferentes zonas de la pila o tonel de compost;
seleccione no menos de 15 puntos diferentes a lo largo del permetro y tambin desde la
base hacia la superficie.
Evite colectar muestras con humedad atpica (>60%).
Emplee nicamente implementos limpios y estriles o cuando menos, desinfectados.
Empaque en bolsas de cierre hermtico o bolsas zip, agitando o aireando la muestra lo
menos posible.
Mantenga la muestra refrigerada hasta su entrega.
Para identificar puntos de variabilidad extrema o zonas problemticas tome la muestra solo
en el(los) sitio(s) especfico(s) de la pila o tonel, no es recomendable para evaluacin de la
calidad del compost, solo para estandarizacin.

3.1.2 AGUA
El muestreo consiste en tomar una muestra homognea que sea representativa del cuerpo de agua o
de la seccin de cuerpo de agua que se requiera muestrear.
Para decidir el tipo de muestra que se debe tomar, se debe considerar primeramente el objetivo del
estudio, el cual se requiere que la muestra conserve las concentraciones relativas de todos los
componentes presentes en el material original y que no hayan ocurrido cambios significativos en su
composicin, y los anlisis a ser efectuados. Tambin deben tomarse en cuenta las condiciones de
flujo (continuo o intermitente) y la variabilidad de los elementos del sistema con respecto al tiempo.
En algunos casos, el objetivo del muestreo es demostrar que se cumplen las normas especificadas
por la legislacin (resoluciones de las autoridades ambientales). Las muestras ingresan al laboratorio
para determinaciones especficas, sin embargo, la responsabilidad de las condiciones y validez de las
mismas debe ser asumida por las personas responsables del muestreo, de la conservacin y el
transporte de las muestras. Las tcnicas de recoleccin y preservacin de las muestras tienen una
gran importancia, debido a la necesidad de verificar la precisin, exactitud y representatividad de los
datos que resulten de los anlisis.
Las muestras se clasifican en dos grandes grupos:
Muestras simples
Estas muestras representan las condiciones y caractersticas de un cuerpo de agua en el instante en
que son tomadas. Son tiles cuando se aprecian descargas no usuales, o flujos intermitentes.
La muestra ser representativa siempre y cuando se tomen en cuenta factores tales como:
homogeneidad del agua, volumen colectado y mtodo de muestreo utilizado.
Estas muestras tambin se emplean cuando se considera que las caractersticas del sitio de
muestreo son homogneas, es decir, cuando el cuerpo de agua no presenta alteraciones en su
composicin espacio-temporal.
Muestras compuestas
En la mayora de los casos, el trmino "muestra compuesta" se refiere a una combinacin de
muestras sencillas o puntuales tomadas en el mismo sitio durante diferentes tiempos. Algunas veces
el trmino "compuesta en tiempo (time-composite)" se usa para distinguir este tipo de muestras de
otras. La mayor parte de las muestras compuestas en el tiempo se emplean para observar
concentraciones promedio, usadas para calcular las respectivas cargas o la eficiencia de una planta
de tratamiento de aguas residuales; tambin suelen usarse para conocer las condiciones de un sitio
grande, por ejemplo: lagos o ros. El uso de muestras compuestas representa un ahorro sustancial en
costo y esfuerzo del laboratorio comparativamente con el anlisis por separado de un gran nmero de
muestras y su consecuente clculo de promedios.
Para estos propsitos, se considera estndar para la mayora de determinaciones una muestra
compuesta que representa un perodo de 24 h. Sin embargo, bajo otras circunstancias puede ser
preferible una muestra compuesta que represente un cambio, o un menor lapso de tiempo, o un ciclo
completo de una operacin peridica. Para evaluar los efectos de descargas y operaciones variables
o irregulares, tomar muestras compuestas que representen el periodo durante el cual ocurren tales
descargas.
No se debe emplear muestras compuestas para la determinacin de componentes o caractersticas
sujetas a cambios significativos e inevitables durante el almacenamiento; sino hacer tales
determinaciones en muestras individuales lo ms pronto posible despus de la toma y
preferiblemente en el sitio de muestreo. Ejemplos de este tipo de determinaciones son: gases
disueltos, cloro residual, sulfuros solubles, temperatura y pH. Los cambios en componentes como

oxgeno o dixido de carbono disueltos, pH, o temperatura, pueden producir cambios secundarios en
determinados constituyentes inorgnicos tales como hierro, manganeso, alcalinidad, o dureza. Las
muestras compuestas en el tiempo se pueden usar para determinar solamente los componentes que
permanecen sin alteraciones bajo las condiciones de toma de muestra, preservacin y
almacenamiento.
Tomar porciones individuales del cuerpo de agua en estudio en botellas de boca ancha cada hora (en
algunos casos cada media hora o incluso cada 5 min.) y mezclarlas al final del perodo de muestreo, o
combinarlas en una sola botella al momento de tomarlas. Si las muestras van a ser preservadas,
agregar previamente las respectivas sustancias a la botella, de tal manera que todas las porciones de
la composicin sean preservadas tan pronto como se recolectan. Algunas veces es necesario el
anlisis de muestras individuales.
Es deseable, y a menudo esencial, combinar las muestras individuales en volmenes proporcionales
al caudal. Para el anlisis de aguas residuales y efluentes, por lo general es suficiente un volumen
final de muestra de 2 a 3 L. Para este propsito existen muestreadores automticos, que no deben
ser empleados a menos que la muestra sea preservada; limpiar tales equipos y las botellas
diariamente, para eliminar el crecimiento biolgico y cualquier otro depsito.
Muestras integradas
Para ciertos propsitos, es mejor analizar mezclas de muestras puntuales tomadas simultneamente
en diferentes puntos, o lo ms cercanas posible. Un ejemplo de la necesidad de muestreo integrado
ocurre en ros o corrientes que varan en composicin a lo ancho y profundo de su cauce. Para
evaluar la composicin promedio o la carga total, se usa una mezcla de muestras que representan
varios puntos de la seccin transversal, en proporcin a sus flujos relativos. La necesidad de
muestras integradas tambin se puede presentar si se propone un tratamiento combinado para varios
efluentes residuales separados, cuya interaccin puede tener un efecto significativo en la tratabilidad
o en la composicin. La prediccin matemtica puede ser inexacta o imposible, mientras que la
evaluacin de una muestra integrada puede dar informacin ms til.
Los lagos naturales y artificiales muestran variaciones de composicin segn la localizacin horizontal
y la profundidad; sin embargo, estas son condiciones bajo las cuales las variaciones locales son ms
importantes mientras que los resultados promedio y totales no son especialmente tiles. En tales
casos se deben examinar las muestras separadamente antes que integrarlas.
La preparacin de muestras integradas requiere generalmente de equipos diseados para tomar
muestras de una profundidad determinada sin que se contaminen con la columna de agua superior.
Generalmente se requiere conocer el volumen, movimiento, y composicin de varias partes del
cuerpo de agua a ser estudiado. La toma de muestras integradas es un proceso complicado y
especializado que se debe describir adecuadamente en el plan de muestreo.

Aplicacin
Se aplicarn a todos los tipos de aguas, cualquiera que sea su procedencia, ya sean de grifos, pozos,
depsitos, lagos, ros, manantiales, bocas de riego, etc.
Tipos de muestras: En el caso de anlisis microbiolgicos de aguas, la muestra para analizar debe
ser siempre simple, sin que se puedan obtener muestras compuestas ni integradas, de modo que la
muestra para el laboratorio sea la obtenida en el punto de muestreo
Material
Exceptuando el material o aparatos especficos que puedan utilizarse para determinadas tomas
especiales, los frascos ms adecuados son los de vidrio neutro con tapn esmerilado o roscado, muy
limpios y esterilizados en autoclave a 120C durante treinta minutos o en horno de Pasteur a 180C
durante dos horas.

Tambin pueden utilizarse frascos de plstico con tapn roscado, esterilizados mediante etileno xido,
radiaciones gamma u otros sistemas adecuados. El tapn y el cuello del frasco se protegern con una
cubierta de papel, papel de aluminio u otro similar.
Los recipientes empleados han de tener una capacidad mnima de 250 ml, si bien es til disponer de
otros de mayor capacidad cuando la tcnica analtica as lo exija.

Tcnica de muestreo
Las operaciones que comporta la toma de muestras varan segn la naturaleza del agua a analizar y
el punto de muestreo elegido.

Grifos

Una vez retirados filtros u otros accesorios se proceder a una cuidadosa limpieza con agua o
alcohol. Con el grifo cerrado se flamear el extremo del mismo. Se abrir el grifo para que el agua
fluya abundantemente y se renueve la contenida en la tubera que la alimenta. Se destapar el frasco
esterilizado sin tocar la boca del mismo ni el interior del tapn. Todos los movimientos debern
realizarse sin interrupciones, al abrigo de corrientes de aire y con las mximas precauciones de
asepsia.

Pozos y depsitos

Si se dispone de bomba de captacin se opera como se ha indicado en el caso del grifo. Si no existe
sistema de bombeo, no es posible obtener una muestra representativa. Con esta salvedad se
introducir en la masa de agua el frasco de muestreo o un cubo lo ms limpio posible, sostenidos con
una cuerda y tomando la muestra tras haber agitado la superficie del agua con el mismo recipiente.
Tambin podrn utilizarse aparatos especiales lastrados que permiten introducir el frasco esterilizado
y destaparlo a la profundidad deseada. En estos casos debern utilizarse frascos con tapn a presin.

Lagos, ros

En ros o cursos de agua ser preciso considerar diversos factores, tales como: profundidad, caudal,
distancia a la orilla, etc. La muestra se tomar lo ms lejos posible de la orilla, procurando no remover
el fondo y evitando los remansos o zonas de estancamiento. Para tomar una muestra del agua de un
lago o de un ro se sujetar el frasco por el fondo en posicin invertida, sumergindolo completamente
y dndole la vuelta en sentido contrario a la corriente (ro) o desplazndolo horizontalmente en la
direccin de la boca del frasco (lago).

Manantiales

En manantiales naturales, o fuentes de caudal continuo, sin dispositivos de intermitencia, se tomar la


muestra directamente sin adoptar medidas especiales de drenaje.

Bocas de riego

Para el muestreo en bocas de riego se utilizarn acoplamientos especiales que permitan operar como
en el caso de un grifo.

Descargas residuales.

Para la toma de muestra de las descargas, si es posible se llena directamente el frasco con la
muestra a la cada del vertimiento, de no ser as, se recepciona la muestra en un bote y despus se
traspasa al recipiente correspondiente.
En todos los casos la muestra de agua no deber llenar totalmente el frasco, siendo necesario
dejar un espacio interior a fin de facilitar su homogenizacin en el momento de iniciar los
anlisis. Tambin se debe purgar mnimo dos veces los frascos que se utilizaran para colocar
la muestra.

Volumen de la muestra
El volumen a tomar debe ser el adecuado para que en una sola muestra se puedan efectuar
simultneamente la totalidad de los anlisis microbiolgicos y estar en funcin de la tcnica analtica
a utilizar. Para los anlisis que utilicen la tcnica del NMP se tomarn, como mnimo, 250 ml y para
los que empleen la de membranas filtrantes, como mnimo, 500 ml.

Cerrado y precintado
Las muestras se cerrarn convenientemente y se precintarn, en su caso, de formas que quede
garantizada su inviolabilidad.

Rotulacin
Antes de la toma de la muestra se marcar el frasco mediante rotulador resistente al agua, con una
referencia que permita su identificacin. En todo caso la muestra se acompaar de una ficha o
etiqueta en la que se consignen los datos necesarios que, como mnimo, sern los siguientes:

Nombre de la persona o Entidad y direccin completa.


Origen de la muestra (pozo, manantial, grifo, cisterna, ro, etctera). Denominacin y/o
referencia. Direccin o emplazamiento exactos, trmino municipal y provincia. Fecha y hora
de la captacin.
Consignar si el agua es natural o est sometida a algn tratamiento de depuracin (cloro,
filtracin, carbn activo, etc.). Identificacin de la persona que ha tomado la muestra.

Acondicionamiento y conservacin
Una vez tomada la muestra se acondicionar de modo que quede en la oscuridad, debiendo remitirse
cuanto antes al laboratorio. Es conveniente iniciar el anlisis antes de que transcurran seis horas
desde la toma de la muestra. Sin embargo, podr demorarse su anlisis hasta veinticuatro horas
cuando haya sido conservada en refrigeracin a 4C (2C).
Precauciones especiales
Cuando se estime probable que el agua a analizar contenga trazas de cloro, cloraminas u ozono, ser
necesario neutralizar su efecto bactericida en el momento del muestreo. Para ello, antes de la
esterilizacin del frasco, se le aadir una cantidad suficiente de sodio tiosulfato. Para un volumen de
250 ml son suficientes 0,2 ml de una solucin acuosa al 3% de sodio tiosulfato 5-hidrato
(S2O3Na2.5H2O).
Esta solucin puede aadirse sistemticamente a todos los frascos, ya que en caso de que el agua
no contenga cloro, la presencia de tiosulfato a estas concentraciones no posee efectos nocivos sobre
el contenido bacteriano del agua.
3.1.3 AIRE
La atmsfera es un medio para la dispersin de muchos tipos de microorganismos (esporas,
bacterias, virus y hongos), procedentes de otros ambientes. Algunos han creado adaptaciones
especializadas que favorecen su supervivencia y permanencia.
Los microorganismos dispersados por el aire tienen una gran importancia biolgica y econmica
porque producen enfermedades en plantas, animales y humanos, causan alteraciones en los
alimentos y materiales orgnicos y contribuyen al deterioro y corrosin de monumentos y metales.
El transporte se realiza sobre partculas de polvo, fragmentos de hojas secas, piel, fibras de ropa, en
gotas de agua o en gotas de salivas eliminadas al toser, estornudar o hablar.
El nmero de microorganismos de la atmsfera cambia segn la altura, obtenindose el ms alto
junto al suelo, (sobre todo en los dos metros inferiores, que constituyen el microclima del hombre),
disminuyen hasta los 200 metros y luego se hacen ms escasos hasta los 5000 metros. Su presencia
es rara hasta el limite de la troposfera y no se encuentran en la estratsfera.
El nmero de microorganismos del aire en las zonas pobladas depende de la actividad en esa zona,
tanto industrial o agrcola como de los seres vivos y la cantidad de polvo.

El nmero de microorganismos es mayor en las zonas pobladas y despus en el mar, cerca de las
costas. En las zonas desrticas no hay ms que aportan los vientos de las zonas habitables prximas
y en los casquetes polares no hay nada. En las zonas con clima seco, el aire contiene numerosos
microorganismos y el nmero desciende despus de la lluvia debido a que sta los arrastra por
lavado del aire.
Mtodos de muestreo.
La eleccin de un muestreador de bioaerosoles depende del agente biolgico objeto de inters, de la
informacin que se desee obtener, de la concentracin previsibles de bioaerosol y del dimetro
aerodinmico de las partculas. Otros aspectos que pueden condicionar la eleccin del equipo de
toma de muestra son las condiciones ambientales y determinados factores ligados al equipo.
No existe un mtodo estandarizado de muestreo de bioaerosoles; algunos muestreadores que
pueden ser apropiados para algunas situaciones lo son en menor medida para otras. Por lo tanto, la
mejor forma de elegir un muestreador es conocer sus caractersticas de funcionamiento y escoger en
consecuencia. No se debe olvidar, por su importancia en la eleccin del equipo muestreador, el
anlisis al que se van a someter las muestras. El estudio terico de la situacin puede dar como
resultado la necesidad de medir un determinado componente del bioaerosol que puede caracterizar
perfectamente la exposicin; la disponibilidad del equipo de muestreo idneo y/o de la tcnica
analtica apropiada pueden marcar las limitaciones de la medicin y, en consecuencia, de la
evaluacin.
Los mtodos de anlisis ms importantes:
Gravitacin o impactacin natural.
Es la forma ms simple de toma de muestra de bioaerosoles, en la cual la partculas biolgicas
aerotransportadas son recogidas sobre una superficie adherente (agar en una caja Petri o
recubriendo un portaobjetos, placas RODAC, etc) por su capacidad de sedimentar por gravedad.
Es un procedimiento til para estudios iniciales y para la estimacin aproximada de la carga
microbiolgica tanto desde el punto de vista cuantitativo como cualitativo, si se eligen adecuadamente
los medios de cultivo.

Impactacin.

El aire, aspirado por una bomba de vaco que forma parte del muestreador, pasa a travs de un
orificio y es dirigido a la superficie del medio de cultivo contenido en una placa adecuada.
Muchos muestreadores emplean este mtodo, algunos recogen las partculas sobre una superficie
nica, mientras otros las recogen por diferentes fracciones de tamao de dimetro, en superficies
sucesivas (impactacin en cascada).

La identificacin especfica del agente biolgico supone habitualmente que se proceda a su


resiembra, en medio idneo, y la posterior aplicacin de reacciones de identificacin o estudios por
morfologa directa o tinciones especficas.

Aspergillusbrasiliensis

Cossidioidesimmitis

Centrifugacin.

Estos muestreadores de impactacin utilizan la fuerza centrfuga para ayudar a la separacin de las
partculas de la corriente de aire de aspiracin. Operan creando un remolino en el cual las partculas
con suficiente inercia dejan la corriente de aire para impactar sobre la superficie (medio de cultivo) de
recogida.

Burbujeo o impinger.

El aire a muestrear para a travs de un volumen conocido de lquido (suero salino, agua de peptona
con agentes humectantes, medios lquidos, etc.). las partculas abandonan la corriente de aire por
impactacin en el lquido, quedando retenidas en el mismo. Posteriormente, y en el medio de cultivo
adecuado, se transfiere una alcuota del liquido de captacin, procedindose a su cultivo, recuento y
en su caso a su identificacin (viables o cultivables).

Filtracin.

El aire es aspirado a travs de un medio de filtracin en el cual las partculas se depositan. El tipo de
filtro ms utilizado es el de membrana de policarbonato ya que las partculas pueden ser removidas
fcilmente de su superficie por agitacin en lquidos adecuados, procedindose a la posterior
inoculacin de la suspensin formada en los medios de cultivos especficos.

Muestreo de superficies.

Adems del muestreo areo, puede tambin determinarse el nmero de agentes biolgicos
depositados en una superficie. Este tipo de muestreo es utilizado fundamentalmente en estudios de
higiene alimentaria, pero tiene otras aplicaciones como, por ejemplo, comprobar la eficacia de los
productos de desinfeccin o evaluar la presencia de agentes biolgicos en el interior de los conductos
de aire de un sistema de ventilacin- climatizacin, industria de la piel y cuero.
La toma de muestras se hace fundamentalmente mediante el empleo de torundas o por contacto
directo de la superficie a muestrear con una placa RODAC preparada con el medio de cultivo
adecuado y su posterior incubacin e identificacin, en su caso.
Una vez que los microorganismos se han asentado en un substrato (reservorio) e iniciado su
desarrollo (amplificacin), su paso al aire (diseminacin), estar condicionado por varios factores,
como pueden ser: su arrastre provocado por el movimiento del aire, de las personas o de la
maquinaria; la alteracin del reservorio debida principalmente, a obras de demolicin, al movimiento
de tierras o a las operaciones de limpieza.
3.2 Tcnicas microscpicas
Las tcnicas microscpicas son esenciales para la observacin de los microorganismos as como de
sus estructuras.
La gran mayora de los microorganismos no se pueden observar a simple vista y por lo tanto se
requiere el uso de un equipo o instrumento muy conocido, el microscopio (micro = pequeo; scopio =
observar) el cual permite visualizar objetos de estudios que a simple vista sera imposibles de percibir
por el ojo humano.
Si bien el microscopio es el elemento central de la microscopa, el uso del mismo se requiere para
producir las imgenes adecuadas, de todo un conjunto de mtodos y tcnicas afines pero extrnsecas
al aparato. Algunas de ellas son, tcnicas de preparacin y manejo de los objetos de estudio, tcnicas
de salida, procesamiento, interpretacin y registro de imgenes, etc.
Los microscopios son, bsicamente, de dos tipos: de luz y electrnicos, segn el principio en que se
basa su poder de magnificacin.
Tanto el microscopio de luz como el electrnico requieren de la adecuacin de la muestra por ser
observada, para lo cual se han desarrollado diversas tcnicas.

3.2.1. Microscopio ptico.


Un microscopio ptico usa la luz visible para iluminar las estructuras celulares. En microbiologa se
utilizan varios tipos de microscopios pticos: de campo claro, contraste de fases, campo oscuro y
fluorescencia.
Al estudiar el microscopio de luz, la posibilidad de obtener mayores aumentos tiene un limite
establecido por el poder de resolucin.

Microscopio de campo claro.

Con el microscopio de campo claro las muestras se visualizan gracias a las diferencias de contraste
entre ellas y el medio que las rodea, y estas diferencias se producen porque las clulas absorben o
dispersan la luz en diferentes grados. El microscopio de fondo claro es el que generalmente se
emplea en cursos bsicos de biologa y microbiologa y se compone de dos series de lentes (lentes
del objetivo y lentes del ocular) que funcionan conjuntamente para producir la imagen. La fuente de
luz se enfoca sobre la muestra por una tercera lente llamada lente del condensador. Muchas clulas
bacterianas son difciles de observar debido a su falta de contraste con el entorno. Los
microorganismos pigmentados son una excepcin, pues su color aade contraste y mejora la

visualizacin de las clulas. En el caso de clulas sin pigmentos hay varios modos de aumentar el
contraste.

Microscopio de contraste de fase

Un microscopio de contraste de fase es especialmente til por que permite la observacin detallada
de estructuras internas en los microorganismos vivos. Adems, no es necesario fijar (adherir los
microbios al portaobjeto) ni teir la muestra, procedimientos que podran distorsionar o destruir a los
microorganismos.
El principio de la microscopia de contraste de fase se basa en la naturaleza ondulatoria de los rayos
de luz y en el hecho de que esos rayos pueden estar en fase (sus picos y sus valles coinciden) o
fuera de fase. Si el pico de la onda de los rayos de luz de una fuente coincide con el pico de la onda
de los rayos de luz de otra fuente, los rayos interactan para producir un reforzamiento (brillantez
relativa). En cambio, si el pico de la onda de una fuente de luz coincide con la depresin de la onda
de otra fuente de luz, los rayos interactan para producir interferencia (oscuridad relativa). En un
microscopio de contraste de fase un conjunto de rayos luminosos proviene directamente de la fuente
de luz. El otro conjunto proviene de la luz que se refleja o difracta por una estructura particular de la
muestra. (La difraccin es la dispersin de los rayos de luz cuando los tocan el borde de una
muestra. Los rayos difractados se separan de los rayos paralelos de luz que atraviesan la muestra).
Cuando los dos conjuntos de rayos de luz rayos directos y rayos reflejados o difractados- se unen
forman una imagen de la muestra en el ocular, que contiene reas que van desde relativamente
luminosas (en fase) a matices de gris hasta el negro (fuera de fase). En la microscopia de contraste
de fase las estructuras internas de una clula se definen con mayor claridad.

Microscopio de campo oscuro

El microscopio de campo oscuro se utiliza para examinar microorganismos vivos que no son visibles
con el microscopio ptico comn, que no pueden teirse con los mtodos estndares o que resultan
tan distorsionados por la tincin que sus caracteristicas no pueden identificarse. En lugar del
condensador normal el microscopio de campo oscuro tiene un condensador especial que incluye un
disco opaco. El disco bloquea la luz que llegara directamente el objetivo, en el que slo ingresa la luz
reflejada (desviada hacia afuera) por la muestra. Como no hay una luz de fondo directa, la muestra
aparece iluminada contra un fondo negro, es decir el campo oscuro. Esta tecnica se utiliza con
frecuencia para examinar microorganismos no teidos suspendidos en un lquido, por ejemplo
espiroquetas muy delgadas como Treponema pallidum, el agente casual de la sfilis.

Microscopio de fluorescencia

El microscopio de fluorescencia aprovecha las ventajas de la fluorescencia, es decir la capacidad de


ciertas sustancias de absorber luz de longitudes de onda corta (ultravioleta) y emitir una luz de una
longitud de onda mayor (visible). Algunos organismos fluorescen naturalmente bajo la luz ultravioleta;
si la muestra que se debe examinar no fluorescen de modo natural, se le tie con alguno de los
colorantes fluorescentes denominados fluorocromos. Cuando los microorganismos teidos con un
fluorocromo se examinan mediante un microscopio de fluorescencia con una fuente de luz ultravioleta
o cercana a ella aparecen como objetos luminiscentes y brillantes contra un fondo oscuro.
Diferentes microorganismos tienen afinidad especial por distintos fluorocromos.

3.2.2 Microscopio electrnico.


El microscopio electrnico tiene prcticamente el mismo fundamento terico que el microscopio
ptico, pero en lugar de trabajar con rayos luminosos como lo hace el microscopio ptico, trabaja con
haces de electrones que se enfocan con campos magnticos, cuya longitud de onda es muy
pequea, el poder de resolucin es muchsimo mayor, lo que permite aumentos hasta de 500,000
dimetros.
Cuando un haz de electrones incide en el vaco sobre un objeto, las partculas incidentes pueden ser
absorbidas y transmitidas a modificarse de distintas formas. La imagen de los objetos no se observa
directamente, como en el microscopio de luz, sino que la imagen se forma en una pantalla. De la
imagen en la pantalla se obtiene electromicografas (similares a una fotografa) las cuales son muy
tiles para llevar a cabo estudios especializados sobre los detalles estructurales del objeto que se
est analizando.
Por la naturaleza de este instrumento, solo en objetos extremadamente delgado se pueden observar
detalles estructurales internos. Aun en bacteria, que mide aproximadamente una milsima parte de un
milmetro, resulta demasiado gruesa para este fin. Por lo tanto, se requiere de tcnicas especializadas
para preparar las muestras por observar.
A pesar de las grandes ventajas que ofrece la microscopa electrnica, tambin tiene sus limitaciones.
Por ejemplo, las clulas no se pueden estudiar vivas. Adems, los procedimientos de preparacin de
la muestra pueden alterar algunas de las caractersticas de las clulas. Debido a esto, los resultados
de la microscopa electrnica deben ser interpretadas slo por los especialistas en este campo y con
ciertas precauciones.
Fundamentalmente, existen dos tipos de microscopio electrnico: el de transmisin (MET) y el de
barrido (MEB).

Microscopio electrnico de transmisin (MET).

El funcionamiento bsico del MET, el cual utiliza, para formar la imagen, los electrones transmitidos, o
sea aquellos que logran atravesar la muestra, la cual debe ser delgada. La imagen as obtenida es
plana.
El MET suele emplearse para el examen de estructuras celulares a muchos aumentos y elevada
resolucin. El poder de resolucin de este microscopio es mucho mayor que el del microscopio ptico,
lo que permite ver estructuras a nivel molecular. Esto se debe a que la longitud de onda de los
electrones es mucho ms corta que la de la luz visible y a que el valor de la longitud de onda afecta a
la resolucin. Por ejemplo, mientras que el poder de resolucin de un microscopio ptico de calidad
es de unos 0.2 micrmetros, el de un microscopio electrnico de transmisin es de unos 0.2
nanmetros (nm, 10-9). Por tanto, con este tipo de microscopa se pueden ver incluso molculas
individuales como protenas y cidos nucleicos.
Sin embargo, a diferencia de la luz visible, los haces de electrones tiene escaso poder de penetracin
e incluso una clula aislada es demasiado gruesa para que su contenido pueda visualizarse
directamente. Por este motivo, se emplean tcnicas especiales para obtener cortes ultrafinos a fin de
poder ver las muestras. Una clula bacteriana, por ejemplo, se corta con una cuchilla especial en
varios cortes ultrafinos (de 20-60 nm de espesor) y se examinan stos de modo individual en el
microscopio electrnico. Para obtener suficiente contraste, las preparaciones se tien antes con
colorantes como cido smico, permanganato o sales de uranio, de lantano o de plomo, que son
sustancias que poseen tomos pesados capaces de desviar los electrones y aumentar por tanto el
contraste.

Microscopio electrnico de barrido (MEB)

El MEB utiliza los electrones dispersados a partir de la superficie de la muestra, ya sean secundarios
o retrodispersos. En este caso, la muestra puede ser voluminosa como por ejemplo una bacteria
entera, pequeos insectos o fragmentos de tejido. La imagen obtenida con el MEB no es plana, sino
tridimensional.
En el microscopio electrnico de barrido, la muestra a estudiar se recubre primero con una fina capa
de un metal pesado, como el oro. El haz de electrones de este instrumento barre la superficie de la
muestra y los electrones desviados por la capa de metal se recogen y proyectan sobre una pantalla
para producir una imagen. En este microscopio se pueden observar muestras de cierto tamao y la
profuncidad de campo excelente. Adems, permite obtener un amplio rango de aumentos, desde 15
hasta 100000 veces, pero slo se puede ver la superficie de los objetos.

Las micrografas electrnicas tomadas por el microscopio electrnico de transmisin o por el de


barrido proporcionan imgenes en blanco y negro. A estas imgenes se les puede aadir un falso
color adicional manipulando la micrografas en una computador. Pero estos colores no mejoran la
resolucin de la micrografa, que depende de los aumentos logrados en la micrografa original.

Diferencia entre MEB y MET


Microscopio electrnico de barrido (MEB)
El haz de electrones atraviesa la muestra
La imagen se forma por la dispersin de los
electrones en funcin del espesor, de la
densidad molecular y del n atmico de los
tomos de la muestra
Se le aaden tomos pesados para acentuar la
dispersin electrnica.

Microscopio electrnico de transmisin


(MET)
El haz de electrones no atraviesa la muestra
La imagen se forma por el reflejo del haz de
electrones al incidir sobre la superficie de la
muestra en funcin del relieve- imagen
tridimensional
Previamente a la observacin se realiza la
vaporizacin de un metal pesado.