Resumen Articulo Bioquimica

Cctel de lipasa para la conversin eficiente de los aceites que contienen

fosfolpidos a biodiesel
Biodiesel;El biodisel (biocombustible) es un lquido que se obtiene a partir
de lpidos naturales
como aceites vegetales
o grasas animales,
con
o
sin
uso
1
previo, mediante procesos industriales de esterificacin y transesterificacin, y que se aplica
en la preparacin de sustitutos totales o parciales del petrodisel o gasleo obtenido
del petrleo.
El biodiesel es un producto combustible que se compone de steres metlicos o
etlicos (molculas orgnica) de los aceites vegetales o grasas animales o
aceites comestibles en desuso, obtenidos por reaccin qumica (de
transesterificacin) de los mismos con metanol o etanol respectivamente,
produciendo glicerina como producto secundario.
ACIDO GRASO + GLICEROL = triglicrido

Transesterificacion.
TRIGLICERIDO + ALCOHOL------- GLICERINA + METIL ESTERES

Las grasas de animales y plantas estn hechas tpicamente de triglicridos, que son steres
de cidos grasos libres con glicerol. En el proceso, el alcohol es deprotonado (removido de
un catin hidrgeno de una molcula) con una base para formar un nuclefilo (anin con un
par de electrones libres) ms fuerte. Comnmente son usados etanol y metanol. Como se ve
en el diagrama, la reaccin no tiene otros reactivos ms que el triglicrido y el alcohol.
En condiciones ambientales normales, la reaccin puede no ocurrir o hacerlo de manera muy
lenta. Se usa el calor para acelerar la reaccin, adems de un cido o una base.

LA BASE AADIDA, El hidrxido debe ser muy seco: cualquier cantidad de agua en el
proceso aumenta las probabilidades de saponificacin, y producir jabones consumiendo
la base. Una vez hecha la mezcla de alcohol ybase, es agregada al triglicrido.
El tomo de carbono del grupo carbonilo del ster del triglicrido soporta una densidad de
carga positiva y el tomo de oxgeno del grupo carbonilo, ms electronegativo, presenta una
mayor densidad de carga, con lo cual el enlace se encuentra polarizado <debilitado>.
Esta polarizacin del grupo C=O da lugar a que el anin alcxido (RO-) ataque al centro
positivo del enlace.

R1
Atraccin polarizada |
RO- > C=O
|
O-CH2-CH-CH2-O-C=O
|
|
O-C=O
R3
|
R2

GENERANDOSE UN COMPUESTO TETRAEDRICO

R1
|
RO-C-O- (par de electrones libres)
|
O-CH2-CH-CH2-O-C=O
|
|
O-C=O
R4
|
R2

Estos electrones vuelven a unirse con el carbono y desplazan al diacilglicerol formando

un ster.

R1

|
RO-C=O
+
-O-CH2-CH-CH2-O-C=O
|
|
O-C=O
R3
|
R2
El proceso se repite para los otros dos steres restantes unidos al glicerol. Esta reaccin tiene
unos factores limitantes:
1. El grupo RO- tiene que encajar en el espacio donde est la carga positiva en el grupo
carbonilo.
2. Al aumentar el tamao de la cadena del alcohol la Velocidad de reaccin disminuye.
Este fenmeno es llamado efecto estrico y es la razn primaria del uso
de alcoholesde cadenas cortas.
3. Pueden ocurrir muchas otras reacciones diferentes, por esto, se agrega un exceso
de alcohol para asegurar que la transesterificacin ocurra.

La lipasa es una enzima que se usa en el organismo para disgregar las grasas de los
alimentos para que se puedan absorber. Se han hecho una gran cantidad e investigaciones
usando enzimas como catalizador. Las mismas muestran que se puede obtener un muy buen
rendimiento. El uso de lipasas hace la reaccin menos sensible a grandes cantidades de AGL
(que son un problema en la produccin comn).

ARTICULO
1. Introduccin
El biodiesel, una alternativa al combustible fosisl continua ganado atencin de
los investigadores debido a su naturaleza ambientalmente amigable, entre
otras ventajas. Es una mezcla de metilesteres de acidos grasos (FAME) que se
ha producido convencionalmente a partir de trasesterificacion alcalina de
aceites animales y vegetales. En investigaciones avanzadas, se ha desarrollado
un mtodo de dos pasos de esterificacin de aceite que cintienenacidos grasos
libres con catalizadores acidos antes de la tranesterificacion con el catalizador

alcalino. Esto para prevenir la formacin de jabon. Otros catalizadores alcalinos

heterogneos y catalizadores acidoscomo CaO / Al 2 O 3 y Li-CaOFe 2 (SO 4 ) 3
se han desarrollado durante los ltimos aos para la produccin de

biodiesel. Aunque estos catalizadores pueden ofrecer algunas ventajas

sobre los convencionales, el propocito benigno ambientalmente de
sustituir el combustible fosil con biodiesel se debilita. Estos qumicos
causan corrosin a los reactores y el posprocesamiento necesario para
finalizar la produccin de biodiesel causa una situacin peligrosa
ambientalmente. Por este motivo, la investigacin actual en la
produccin de biodiesel se ha encaminado a la utilizacin de lipasas
EC.3.1.1.3 estas lipasas son hidrolazas que actan sobre los enlaces
ester en esteres carboxlicos. Hay cientos de estas lipasas y muchas de
ellas de varios microorganismos se sabe que se pueden aplicar a la
produccin industrial de biodiesel. Unas bacterias bien conocidas para la
produccin de lipasas son la Burkholderiaglumae ( Jaeger y Reetz,
1998 ). Thermomyceslanuginosus yRhizopusoryzaeson lipasas populares de
hongos y candida rugosa es una levadura comn para la produccin de
lipasa. Estas lipasas pueden utilizarse bien sea en forma inmovilizada o
en la forma liquida. La utilizacin de lipasa inmovilizadas ofrece una
ventaja de separacin fcil del producto y reutilizacin de la lipasa.
Desafortunadamente, a escala industrial la inmovilizacin de la ,ipasa
purificada agrega un costo significativo a la produccin de biodiesel y la
inmovilizacin de las lipasa con frecuencia altera la especificidad
deseada de la lipasa. Adems, la inmovilizacin de la lipasa conduce a
un incremento de la resistencia a la tranferencia de masa debido a la
naturaleza solida de la enzima y a la naturaleza liquida de los otros
reativos y esto con frecuencia conduce a periodos de reaccionmas
lentos. Esto le da a las lipasas liquidas una ventaja sobre las lipasas
inmovilizadas. La atencin que se le ha puesto a la produccin enzimtica de
biodiesel se debe al hecho de que, las enzimas pueden convertir los aceites en
biodiesel bajo condiciones muy suaves de temperatura y presin, son
altamente amigables con el medio ambiente y debido a las especificidades
nicas de las lipasa, la produccin de productos no deseados se elimina.
Aunque la naturaleza regioespecifica de las lipasas elimina la produccin de
productos no deseados, estas especificidad puede conducir tambin a baja
produccin de producto como la mayora de los sustratos de aceite estn
elaborados de triglicridos, digliceridos, monogliceridos y acidos grasos libres
de varias longitudes de cadena. Se sabe que algunas lipasas son
regioespecificas de sn-1,3 lo cual puede partir al ester en las posiciones 1 y 3
del triglicrido solo. Se sabe que
Otras lipasas actan
sobre di y
monoglicridos solamente y algunas son efectivas nicamente con cidos
grasos libres.
Adicionalmente, con el objetivo de reducir el costo de la materia prima, se ha
considerado la utilizacin de aceites no refinados para laproduccion de

biodiesel y estos von frecuencia contienen altos niveles de acidos grasos libres
como tambin fosfolpidos, haciendo al sustrato de aceite aunmas complicado.
Se sabe que los fosfolpidos aceleran la inhibicin de la lipasa con la formacin
de micelas recersas que alteran la naturaleza de la mezcla de reaccion. El
desgomado del aceite crudo se ha propuesto para resolver este problema sin
embargo, esto agrega costo adicional, aumenta los pasos de procesamiento y
causa perdida de materia prima. Varias lipasas comunes se han utilizado para
la conversin de aceite vergetal refinado a biodiesel pero su aplicacin exitosa
en aceites que contienen fosfolpidos aun no se ha investigado ADACHI y otros
reportaron la utilizacin exitosa de la lipasa de C-RUGOSA para la hidrolisis de
aceite de soya para una convesion de biodiesel en dos pasos. Oda y otros tm
reportaron la utilizacin de una lipasa regioespecifica en sn-1,3 donde la
migracin del acilo se facilito aumentando el contenido de agua resultando en
un produccin de efectiva de FAME. Debido a las propiedades nicas de las
lipasas individuales, el concepto del coctel de lipasa que involucra la
combinacin de dos o mas lipasas ha conducido a resultados interesantes. LEE
y otros encontraron que una convinacion de las lipasas de C-rugosa y R. orizae
en un dixido de carbono supercrtico mejoro la produccin en comparacin
con el uso de una sola lipasa. Una combinacin de CaIT,RML y CaIB mejoraron
la produccin de conversin de aceite de oliva hasta un 95% en 18 horas, en
comparacin con lipasa individual que fue CaIB,
mientras que una
combinacin entre CaIT y RML mejoro la conversin del aceite de palma en un
80%. En la etanolisis de aceite de palma usado, la utilizacin combinada de la
lipasa AY y la lipasa AK dio una produccin mayor de biodiesel que la
utilizacin de AK solamente en este trabajo, se empleo el concepto del coctel
de lipasas para reducir la carga total de lipasa para reducir a su vez el costo de
la lipasa. La primera parte se ocupa de la seleccin de 6 lipasas utilizadas
comnmente en la industria de alimentos, y se exploro su aplicabilidad en la
produccin de biodiesel a partir de aceites que contienen fosfolpidos. Despus
de esto, se llevo a cabo una anlisis comparativo de varios cocteles de lipasa y
se selecciono la mejor combinacin de lipasa basndose en la velocidad de la
reaccion, la produccin final de FAME y la composicin de glicridos parciales
residuales. Finalmente, se demostr el mejoramiento de la velocidad de
reaccion para una produccin eficiente de fame a partir de aceite que contenia
fosfolpidos.

MATERIALES Y METODOS.
MATERIALES Y CEAS DE LIPASA
La calera trans ll, una formulacin liquida de la lipasa de T-lanuginosus (KIT) se
obtuvo de novosimiens. Dinamarca, las lipasas pulverizadas DF y MER DE RORIzae, ai de candida-cilindracea (anteriormente conocida como C-rugosa), R
de penizilium, y A de aspergillus nigel se obtuvieron de Amano . la lipasa
pulverizada A-10D de la especie Risopus, se obtuvo de nagaseenzimes. El

aceite de soya refinado y los fosfolpidos de soya fueron obtenidos de wakopurechemichaindustris.

Preparacion de la solucin de lipasas.
Un gramo de cada una de las 6 lipasas en polvo se disolvi por separado en 10
ml de solucin amortiguadora de fosfato a pH =7. Se virtieron en un agitador a
30 C y 200 rpm por 30 minutos. Las actividades de las solciones de lipasa
obtenidas se provaron y se utilizaron nuevamente para la reaccion de
transesterificacion .
1.Essayo de la ACTIVIDAD DE LA LIPASA
Se llevaron a cabo los ensayos de la actividad de la lipasa tanto para la
transesterificacion como para la hidrolisis. Las actividades
de
transesterificacion se probaron utilizando p-nitrofenilbutirato (Pnpb) como
sustrato cromogenico. Se preparon una solucin de reserva o solucin stock
disolviendo 5microlitros de pNPB en 250 microlitros de etanol y diluyendo
nuevamente a 50 mL con agua destilada. Se llevaron a cabo las actividades
hidrolticas de la lipasa a 35C de varias lipasas, incubando por 10 minutos en
un agitador. Despus de la incuvacion, se agregotricloroacetato al 5% para
terminar la reaccion. La absorbancia del paranitrofenol producido (pNP) se
midio a 400 nm (espectrofotmetro uv-vis). Se definio una unidad (U2) de
actividad de lipasa como la cantidad de lipasa que libera una micromol de pNP
a partir de pNPB por minuto. Para la hidrolisis, la mezcla de la reaccion contuvo
2 gramos de aceite de oliva, 9 mL de una solucin amortiguadora de acetato
0.1M (pH=5,6) y 1mL de KCl2 0.05M en una botella con tapa de rosca de 50
mL. Esta se agito en un bao de agua a 250 rpm. A 30c y la reaccion fue
terminada agregando etanol. La emulcion obtenida fue titulada contra NaOH
0.1 A pH=10. Esta actividad hidrolituca (U1) se define como la cantidad de
lipasa que libera 1 micromol de FFA de aceite de oliva a pH=10 y 37C.

Resultados y anlisis
1.Evaluacion de la actividad de la lipasa.
En las reacciones de metanolisis que involucran lipasas se sabe que alguna
enzimas hidrolizan a los triglicridos en acidos grasos libres ( FFA) lo cual luego
es seguido por la esterificacin de loa acidos grasos libres en metilesteres de
acido graso ( FAME). En otros casos los acidos grasos de los triglicridos son
transesterificados directamente a metilesteres de acidos grasos. Esto ,uestra
que algunas lipasas tienen mayor actividad hacia la hidrolisis que hacia la
transesterificacion y viceversa. Para verificar esto para las 6 lipasas, se
emplearon 2 metodos diferentes para la determinacin de la actividad de la
lipasa ( tabla1). En prueba de la primera actividad se utilizo p nitrofenilbutirato
como el sustrato para la transesterificacion, la actividad de la lipasa depende

de su capacidad para romper el enlace ester en este sustrato y esto permite

una evaluacin sin sesgo donde las eficiencias de las lipasas no son limitadas
por sus regioespecificidades o longitudes de cadena. Con este mtodo, se
encontr que la lipasa A era la mas eficiente en romper el enlace ester en
comparacin de las otras lipasa bajo estudio con una actividad de 19400u/mL
.las lipasas de diferentes fuentes tienen diferentes propiedades estructurales
que afectan su actividad, y la nica estructura de la lipasa A podra ser la razn
de su alta actividad. Se encontr que las actividades de las 4 lipasas DF , A10D,R y AY eran casi las mismas, mietras que MER, mostro la menor, con una
actividad menor a la mitad del primedio de las otras 2. El segundo metodo
involucra la actividad hidroltica utilizando el aceite de oliva como sustrato
donde fue determinada la existencia de la hidrolisis por parte de las lipasa
individuales. La lipasa AY de c-cilindracea claramente demuestra una mayor
extensin de hidrolisis que es mas de dos veces la de la lipasa DF, el siguiente
mejor candidato. Esto esta de acuerdo con los reportes de otros investigadores
acerca de la alta efectividad de hidrolisis de la lipasa AY. MAS DEL 90% Del
acido graso libre se ha producido en 24 horas utilizando A-C cilindracea. EL
RESTO De las lipasas mostro una actividad relativamente pobre para la
hidrolisis a pesar de su alta actividad de transesterificacin. Esto explica la alta
preferencia de la transesterificacin sobre la hidrlisis para estas lipasas. Con
una actividad muy alta hacia la hidrlisis y una actividad muy comparativa
hacia la transesterificacin, la lipasa AY tiende a ser una lipasa verstil en una
conversin bioenzimtica de biodiesel.

2.Seleccin de la lipasa
Aunque se han determinado las actividades de estas lipasas, el rendimiento de
la lipasa en el sustrato verdadero de materia prima de biodiesel puede variar
debido a la variacin de las regio-especificidades de las lipasas. Se utiliz para
seleccionar las lipasas para la produccin de biodiesel, aceite de soya refinado,
que se sabe que es un sustrato de alta calidad para la produccin de biodiesel
(Fig. 1). Los resultados de esta seleccin claramente muestran la mayor
preferencia para la hidrlisis sobre la transesterificacin para AY en las etapas
finales de la reaccin. En el transcurso de las primeras 3 horas, la produccin
de FAME alcanz solamente el 29% mientras que la produccin de FFA alcanz
ms del 45%. Esta es una indicacin de, que en las condiciones de reaccin, la
lipasa AY promueve considerablemente la preferencia de absorcin de agua
que el metanol, conduciendo a la formacin de ms FFA en vez de FAME.
Tericamente, un equivalente de 1 molar de etanol produce un mximo de 33%
de FAME. Bajo las condiciones de reaccin dadas, hay una posibilidad, de que
despus de que la mayor parte del metanol agregado inicialmente, se ha
utilizado en la produccin de FAME, la lipasa AY con una alta actividad de
hidrlisis, siga convirtiendo los triglicridos a FFA. Los cidos grasos libres
producidos fueron convertidos a FAME rpidamente en 6 horas duplicando la
cantidad de FAME hasta alrededor de 60% que tambin es la cantidad ms alta
entre las lipasas probadas. Se sabe que la mayora de las lipasas exhiben un

mayor rendimiento en los sustratos ricos en cidos grasos libres tales como los
residuos de aceite de cocina que con los aceites ricos en TAG (No. 2011). Esto
permiti una conversin ms rpida a FAME, alcanzando casi el 60% en 6
horas. No obstante, al final de la reaccin, la cantidad de FFA restante en el
sistema de reaccin fue mayor al 20%. Esto indica la limitacin de la lipasa AY
para convertir efectivamente todo el FFA producido a FAME. La Fig. 1 tambin
muestran que los glicridos parciales permanecieron bajos durante toda la
reaccin con AY indicando una liberacin rpida de cidos grasos desde el
segmento principal del gricerol. La lipasa DF, la cul se conoce como una lipasa
regioespecfica del sitio enzimtico sn.1,3, tambin mostr una velocidad de
produccin de FAME relativamente buena. Tuvo la velocidad de reaccin inicial
ms alta entre las lipasas probadas, alcanzando alrededor de 33% en 3 horas.
Sin embargo, sta velocidad se redujo en las siguientes 3 horas. Esto se
esperaba a causa de que la cantidad de cidos grasos en las posiciones 1 y 3
en la mezcla de reaccin, se haba reducido bastante y con una concentracin
reducida de reactivo, la velocidad de la reaccin se redujo. La Fig. 1b muestra
una produccin inicial de una pequea cantidad de cido graso libre lo cul
significa que, aunque la lipasa DF tiene algo de efecto de hidrlisis, es mas
favorable a la esterificacin. Con esto, cantidades significativas de glicridos
parciales pudieron observarse a lo largo del progreso de la reaccin con una
meseta de 9 horas que puede ser un resultado de las limitaciones de la
regioespecificidad. Se observ un patrn similar para las lipasas A-10D y MER
con una velocidad de reaccin y produccin final de FAME ligeramente inferior.
La lipasa R, que es una lipasa especfica del sitio , tiene una
regioespecificidad similar a la de la lipasa MER. Sin embargo se observ que la
lipasa MER tiene un rendimiento significativamente mejor que la lipasa R,
aunque la lipasa R muestra una actividad ms alta de transesterificacin (Tabla
1). Esto nuevamente muestra el efecto que tienen las longitudes de cadena de
los cidos grasos sobre la efectividad de las lipasas. La lipasa MER
efectivamente hidroliza cidos grasos de cadena larga, media y corta y esto le
permite actuar sobre una mayor variedad de longitudes de cadena en
comparacin con la lipasa R la cul es especfica solamente de cidos grasos
de cadena corta y media. Ya que la materia prima del biodiesel tiene longitudes
variables de cadena de cido graso, incluyendo C16 y C18, es mas efectivo
utilizar lipasas que tengan la habilidad de romper enlaces de longitud variable
de cadena de cido graso. Aunque, a partir de la Tabla 1, la lipasa A tuvo la
actividad hidroltica ms alta, casi no produjo nada durante toda la reaccin.
Esto puede deberse a la poca tolerancia al metanol de la lipasa A bajo las
condiciones de reaccin dadas.

3.Efecto del PL sobre las lipasas

Para aplicar lipasas baratas a materia prima barata y no refinada, se utilizaron
los tres candidatos de lipasa de los experimentos de seleccin para convertir
aceite de soya que contena fosfolpidos. Las lipasas seleccionadas incluyeron a
AY, DF y A-10D. Sorprendentemente, a partir de la Fig. 2, el orden de

rendimiento cambi significativamente con DF produciendo tanto como un 69%

de FAME en 9 horas. El rendimiento de A10-D tambin mejor ligeramente en
comparacin con el caso del aceite refinado. Se haba reportado anteriormente
una mejora similar en la produccin de FAME utilizando lipasa lquida en 2% de
fosfolpido por parte de Li y otros (2013). La propiedad amfiptica del
fosfolpido se cree que contribuy con la emulsificacin total de la mezcla de
reaccin lo cual consecuentemente estimul el rendimiento cataltico de la
lipasa libre. Desafortunadamente, AY que dio una velocidad de reaccin y una
produccin de FAME ms alta produjo solamente un 21% de FAME. Esto indica
una desactivacin rpida de la lipasa AY en aceite que contiene fosfolpidos al
contrario de DF y A10-D. Rendimiento pobre de C. cylindracea (lipasa AY), en
presencia de alta cantidad de compuestos polares se haba reportado por parte
de varios investigadores. La alta concentracin de fosfolpidos de la materia
prima conduce a la formacin de micelas reversas de fosfolpido que luego
hacen que tanto la lipasa lquida como el metanol se solubilicen dentro de las
micelas reversas. Esto aumenta la concentracin de metanol alrededor de la
localidad de la lipasa AY. La mala tolerancia del compuesto polar metanol, por
parte de la lipasa AY causa una gran prdida de la actividad de
transesterificacin, resultando as en la reduccin de la produccin de FAME
despus de la posterior adicin de metanol.

4.Coctel de lipasas para la conversin de aceites que contienen fosfolpidos

El mejor candidato entre las lipasas baratas para la transesterificacin de
aceite refinado mostr un redimiento muy pobre en presencia de fosfolpidos.
Por esta razn, se emple el concepto de coctel de lipasas para remediar este
problema. En este sistema, se agreg una pequea porcin de una lipasa mas
robusta para la produccin de biodiesel, a varias lipasas por separado. En la
primera etapa de los experimentos, el proceso de utilizar esta lipasa
industrializada, Callera Trans L (CalT), se optimiz una formulacin lquida de
lipasa de T. lanuginosus. Los resultados de la optimizacin se han resumido en
la Tabla 2. Aunque el 0,5% (p/p de aceite refinado) de la lipasa produjo ms del
90% de FAME, la optimizacin se llev a cabo utilizando el 0.3% de carga de
lipasa para reducir la cantidad de lipasa por razones econmicas. Se puede
observar que, al variar las condiciones experimentales, la eficiencia de la
conversin no pudo ser mejorada significativamente utilizando el 0.3% de CalT.
La utilizacin de la lipasa lquida esta asociada con la presencia inevitable de
una fase acuosa, que tambin se requiere para la creacin de una interfase
acuosa-no acuosa necesaria para la activacin de la lipasa. Una agitacin
eficiente es un cofactor para la creacin de esta rea de interfase. Aunque se
han reportado concentraciones inferiores de agua para T. lanuginosus, la
utilizacin de una agitacin mas eficiente puede ser la razn para una
concentracin de agua ms alta. Debido al mayor costo de esta lipasa, se
explor la posibilidad de utilizar una cantidad an menor de esta lipasa y
combinarla con otras lipasas baratas para un uso de lipasas ms econmico
pero efectivo. En la utilizacin de lipasas mas baratas, se encontr que el 0.4%

de la lipasa AY (p/p de aceite refinado) fue la carga de lipasa mayor que fue
incapaz de asimilar efectivamente el equivalente molar inicial de 1:1 de
metanol a aceite en la conversin de aceite a FAME (Fig. 1 complementaria).
De aqu que, se llevaron a cabo nuevos experimentos combinando 0,1% de
CaIT con 0.4% de otras lipasas individuales (Fig. 3). Bajo esta condicin de
coctel de lipasa y reduccin de la carga total de lipasa, La produccin de FAMEy
y las velocidades de reaccin fueron generalmente ms altas. De modo
interesante, el poco rendimiento de AY en un aceite que contiene fosfolpidos
ha mejorado con la adicin de CaIT. La mejora de la produccin d FAME, al
mezclar la lipasa AY con CaIT probablemente se debe a la habilidad de CaIT
para convertir efectivamente los triglicridos en FAMEs an en presencia de
fosfolpidos. Se sabe que CaIT tiene una alta velocidad de conversin inicial del
cido graso sn-1,3 lo cul est asociado con un consumo rpido de metanol.
Esto resulta en una reduccin ms rpida del metanol, que est solubilizado en
el interior de las micelas reversas fosfolpidas. Con la rpida reduccin del
metanol polar de la localidad de la localidad del la lipasa AY dentro de las
micelas reversas, el riesgo de la inhibicin por el metanol disminuye
considerablemente. Esta eliminacin de la inhibicin habilita as a la lipasa AY
para contribuir con el proceso de produccin de FAME conduciendo a una
mejora sobre la utilizacin de la lipasa AY sola en un medio de reaccin
altamente polar. Adems, el coctel de lipasa AY-CaIT result en la reduccin
drstica de los glicridos parciales residuales y cidos grasos libres (Fig. 3b). la
alta actividad de hidrlisis y la no especificidad de la lipasa AY pueden haber
contribuido con la liberacin eficiente de cidos grasos conduciendo a la
ausencia de di- y monoglicridos los cules mas bien persistieron en otras
combinaciones o cuando se utiliz solamente CaIT. Aunque los di- y triglicridos
son buenos sustratos para la conversin por parte de CaIT, la baja carga de
CaIT puede ser la razn de la persistente cantidad mas alta de di- y
triglicridos para la utilizacin de slo CaIT por 24 horas. Tambin se
encontraron altas cantidades de FFA, MAG, DAG y TAG en los productos del
coctel DF-CaIT y del coctel de lipasa A10D-CaIT. Estas sin embargo, fueron
inferiores que en el caso de 0.1% de CaIT a causa de que la presencia de la
lipasa DF o A10-D contribuy adicionalmente a la conversin total de los
glicridos parciales y los cidos grasos libres a FAME. El rendimiento del coctel
DF-CaIT fue significativamente mejor que el del coctel A10-D-CaIT lo cual
corresponde con la mayor actividad de la lipasa DF en comparacin con la
lipasa A10D. aunque la especificidad de la lipasa A10D no es bien conocida,
este resultado sugiere que podra ser una lipasa especfica de sn-1,3 debido a
las altas cantidades de MAG restantes en forma similar a la lipasa DF. Los MAGs
y DAGs son molculas higroscpicas que absorben humedad del ambiente. Su
presencia en el biodiesel incrementa el contenido de humedad en el mismo, lo
cual es una propiedad indeseable. Se han recomendado respectivamente
concentraciones menores a 0.2% y 0.8%. la ausencia de estos componente en
la conversin que utiliza la lipasa AY-CaIT es una ventaja adicional de utilizar
este coctel.

5. Impacto de la velocidad de adicin de metanol en el coctel de lipasa

Aunque en la produccin de biodiesel los alcoholes de cadena corta son
esenciales para la metilacin de los cidos grasos, la alta concentracin de
estos alcoholes posee efectos negativos sobre la mayora de las lipasas. Se
sabe que la metanolisis de triglicridos mediada por lipasas progresa con una
reaccin de adicin nucleoflica para formar un complejo enzima-sustrato. El
metanol luego se adhiere a s mismo a este intermedio de acil enzima y a
travs de una serie de transferencia de electrones, se producen los FAMES. Se
sabe que la alta concentracin de alcohol causa una inhibicin competitiva
donde una molcula de alcohol reacciona directamente con la enzima para
producir un complejo de alcohol-enzima de extremo muerto en vez de darse la
situacin de un alcohol reaccionando con un intermediario de cido grasoenzima. La mayora de las lipasas tienen una tolerancia muy baja al metanol tal
que una estrategia de adicion en dos pasos de metanol se ha utilizado para
convertir exitosamente a los triglicridos en FAMES. La alta velocidad de
adicion del metanol con frecuencia conduce a una alta concentracin de
metanol lo cual posteriormente conduce a la desactivacin de la lipasa
mientras que una baja adicin de metanol con frecuencia conduce a
prolongados tiempos de reaccin. La Fig. 3c muestra el rendimiento de los tres
cocteles de lipasa bajo una velocidad de adicin de metanol ms alta. La
velocidad usual de un equivalente molar agregado en intervalos de 3 horas
aument a un equivalente molar a intervalos de 2 horas. Pudo observarse que
las velocidades iniciales de reaccin para todos los tres sistemas de lipasa
fueron similares, que la velocidad comenz a bajar significativamente despus
de 6 horas excepto para el coctel AY-Ca. El coctel de lipasa A10-D-CaIT no
mostr ningn cambio significativo en comparacin con la baja velocidad de
adicin y as, la baja velocidad general de reaccin y produccin no mejoraron
con
el
incremento
de
la
velocidad
de
adicin
del
metanol.
Desafortunadamente, el coctel de lipasa DF-CaIT que tuvo una produccin
comparable con la de la lipasa AY-CaIT baja velocidad de adicin de metanol, se
retard significativamente con una velocidad de adicin de metanol ms alta
produciendo solamente un 73% en 24 horas.
1Esto indica una limitacin de la lipasa DF para una concentracin mas alta de
metanol dentro de este intervalo. De modo interesante, para el coctel AY-CaIT,
la reaccin continu progresando a una alta velocidad alcanzando ms de 90%
de FAME por 12 horas. La reduccin usual de la velocidad de la reaccin
despus de la adicin de 3 y 4 equivalentes molares de metanol no se observ
en este caso. Esto ocurre a causa de que se sabe que el CaIT tiene una alta
actividad de transesterificacin y esterificacin pero una conversin ms lenta
de monoglicridos. Con la combinacin de las dos lipasas que poseen
diferentes rutas de reaccin, ocurre simultneamente un alto nivel de
transesterificacin y un alto nivel de hidrlisis.

Tanto la metanlisis como la hidrlisis se han explicado utilizando el

mecanismo bi bi ping pong donde la metanolisis usualmente es preferida a la
hidrlisis en la presencia de cantidades suficientes de metanol. En el sistema
de reaccin donde estn presentes tanto CaIT como AY, an en el momento
donde la concentracin de metanol es baja, la lipasa AY que tiene una alta
actividad de hidrlisis perpeta el progreso de la reaccin conduciendo a la
produccin de alto nivel de FFA. Se sabe que CaIT funciona mejor bajo
concentraciones bajas de agua (Tabla 2). Mediante la formacin de FFA, la
concentracin de agua se reduce en la mezcla, lo cual crea un mejor ambiente
tanto para la esterificacin de los FFA producidos como para la
transesterificacin de los dems glicridos restantes por parte del CaIT. Esta
esterificacin tambin libera el agua que fue utilizada en la hidrlisis lo cual de
nuevo sostiene la actividad de la hidrlisis de la lipasa AY. La eliminacin del
paso limitante de la velocidad de migracin de acilo por parte de la lipasa AY,
sumado a la produccin constante de FFA los cuales son mas miscibles con el
metanol en comparacin con los triglicridos, permite alcanzar un consumo
mas eficiente del metanol conduciendo a una velocidad de adicin de metanol
ms rpida y a una reaccin ms rpida.
6.Optimizacin de la velocidad de adicin del metanol
Ya que la combinacin de la lipasa AY-CaIT mostr muy bajos glicridos
residuales y una mejor tolerancia a la alta velocidad de adicin del metanol,
por lo tanto se optimiz la velocidad de adicin de metanol para esta
combinacin. El intervalo probado para la serie de experimentos fue 4 veces la
adicin de metanol de 1:1 de equivalente molar del aceite a intervalos de
tiempo de 120 minutos, 60 minutos, 30 minutos y 10 minutos como tambin la
adicion por una vez de 1:4 equivalentes molares del aceite a 0 minutos. En la
Fig. 4 pueden observarse el incremento consistente de la velocidad de reaccin
con el aumento de las velocidades de adicin del metanol de intervalos de 120
minutos a intervalos de 30 minutos. Aunque tanto las velocidades de adicin
de intervalos de 60 minutos como las de intervalos de 30 minutos alcanzaron
ms del 90% en 6 horas, las en el intervalo de 30 minutos produjeron 88.1% en
dos horas en comparacin con solamente 57.8% para las adiciones a intervalos
de 60 minutos. Esto se debe a la disponibilidad del metanol y al suficiente
tiempo de reaccin. En las adiciones a intervalos de 30 minutos, un total de 1:4
equivalentes molares de metanol pudieron agregarse exitosamente por 1.5
horas y debido a la alta presencia de FFA resultante de la hidrlisis por parte de
la lipasa AY, 0.5 horas fueron suficientes para la rpida conversin a FAME por
parte de CaIT en dos horas. Sin embargo, para las adiciones a intervalos de 60
minutos, la adicin de solamente 1:2 equivalentes molares se logra en 2 horas.
Tericamente, se requieren un mnimo de 1:3 equivalentes molares de metanol
para completar la produccin de FAME pero ya que la reaccin es reversible,
usualmente es necesario un exceso de metanol. Con una cantidad insuficiente
de metanol en este intervalo de adicion, podra producirse nicamente menos
del 60%.
El incremento adicional de la velocidad de adicin a 1:1
equivalente molar a intervalos de 10 minutos muestra una reduccin
significativa en la velocidad de la reaccin especialmente en la ltima parte.

Esto probablemente se debe a la acumulacin de metanol mas all de la

tolerancia de este sistema de lipasa. La concentracin de metanol en este
punto tal vez es tan alta que, aunque CaIT efectivamente transesterifica los
cidos grasos en las posiciones 1 y 3, la cantidad de metanol an es suficiente
para desactivar la lipasa AY. Esto se revela de nuevo en la ultima parte de la
reaccin donde aunque la reaccin procede, lo hace muy lentamente. La
produccin terica para las lipasas regioespecficas en sn-1,3 es de 66.7%,
pero la habilidad de algunas de estas lipasas para inducir la migracin de acilo
asegura una produccin ms alta pero a un ritmo mas lento. Ya que la actividad
no especfica del coctel de lipasas se perdi en la parte inicial de la reaccin, se
llev a cabo el paso limitante de la velocidad de la migracin de acilo por
medio de CaIT conduciendo a una produccin mas lenta de FAME despus de
ms del 55% de FAME se haba producido. La adicin de una vez de 1:4 de
equivalentes molares nuevamente muestra una velocidad de reaccin mas
lenta conduciendo a una produccin de FAME de solamente 66.9% en 24 horas.
Esta es una indicacin de que dentro del intervalo de concentracin de
metanol, CaIT tambin se enfrenta a una inhibicin por parte del metanol y
reduce su efectividad en las etapas iniciales de la reaccin y de la migracin de
acilo. La velocidad ptima de adicin de metanol para la combinacin de lipasa
AY-CaiT por lo tanto es de 4 veces la adicin de 1:1 equivalentes molares al
aceite en intervalos de 30 minutos.

CONCLUSIONES

La presencia de 5% de fosfolpidos en los aceites inhibe a la lipasa AY. Una

combinacin de 0.4% de lipasa AY y 0.1% de CaIT condujo a una mejora de la
produccin de Biodiesel. Esto result en una alta velocidad inicial de reaccin
de CaIT y en alta actividad de hidrlisis de la lipasa AY y de su no
regioespecificidad. Las diferentes rutas de reaccin de las lipasas individuales
condujeron a una asimilacin eficiente del metanol y reducen la desactivacin
de las lipasas. Se logr un 88.1% en dos horas con la adicin de 1:1
equivalentes molares de metanol al aceite en intervalos de 0.5 horas. Este
sistema econmico de lipasa podra ser til para la conversin de aceites
refinados.