INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

Unidad Profesional Interdisciplinaria De Ingeniera Campus

Guanajuato

LABORATORIO DE BIORREACTORES
5MB1

Prctica: 4

Cultivo por Lote y Lote Alimentado

PROFESORES:
Rosa Isela Jimnez Castillo
Juan Carlos Rodrguez Sierra
Guillermo Garibay Bentez

Equipo 1 Seccin 1

Integrantes:
Lozano Ramrez Yadira Elizabeth
Mndez Viramontes Claudia
Marmolejo Prez Omar
Marmolejo Prez Viridiana
Morales Carmona Estefana
Yez Retes Flor Anglica

Fecha:

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Resumen

Introduccin
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis es una bacteria gram positiva, estas bacterias producen endosporas
las cuales proporcionan mayor resistencia a factores ambientales como por ejemplo
la temperatura, esta bacteria puede sobrevivir en un lmite de temperaturas de 55C
a 70C y puede soportar pH hasta de 2 a 3 (Lisboa, 2003).
B. subtilis es una de las 40 especies reconocidas del gnero Bacillus que tiene la
capacidad de moverse. Esta bacteria produce enzimas hidroflicas extracelulares
que degradan polisacridos, cidos nucleicos y lpidos, los que utiliza como fuente
de energa. (Sierra, 2008).
B subtilis presenta una mayor resistencia al final de la fase exponencial debido a la
formacin de endosporas, y el grado de resistencia de stas depende de las
condiciones ambientales en las que se encuentre (Len, 2001).
Una de las sustancias producidas por las endosporas, es el cido dipicolnico, el
cual se localiza en el ncleo de la endospora, adems tambin de este compuesto
tambin son ricas en iones Ca+ las cuales forman un complejo el cual representa el
10% del peso seco de la endospora (Len, 2001).

Cultivo por lote

Un cultivo por lote es un sistema de cultivo cerrado en el que existe una cantidad
inicial limitada de nutriente. El inoculo pasa por 4 diferentes fases, la de adaptacin
o fase lag, una fase de crecimiento exponencial o fase log, otra en la que la
velocidad de muerte y la de crecimiento son iguales, fase estacionaria, y una fase
de muerte, en la que la velocidad de muerte es mucho mayor que la de crecimiento.
La fase exponencial puede describirse por la siguiente ecuacin:

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Donde:
=
=
Para determinar la concentracin de biomasa en un intervalo especfico de tiempo,
la ecuacin anterior se puede integrar, de tal forma que:
= +
El incremento o decremento en la velocidad de crecimiento est dado por el
agotamiento de la concentracin de sustrato, observndose en una grfica que
relacione con la concentracin de sustrato limitante residual, representado por la
siguiente ecuacin (Monood):
=

Donde:
=
=

1

2

Una manera de determinar estos parmetros cinticos mediante los datos

experimentales de un quimiostato es con la linealizacin de la ecuacin de Monood:
1

1
=
+
max()
Realizando un anlisis similar al de biomasa, es posible expresar el cambio de la
concentracin del producto microbiano, en funcin de la concentracin de biomasa:

= ()

= () +

Donde:
=
=
Los patrones o modelos de flujo de sustrato en clulas que sintetizan productos
dependen de si la formacin de producto se encuentra asociada o no al metabolismo
energtico. En cultivos donde la sntesis del producto est asociado solo de forma
indirecta al metabolismo energtico, la velocidad de consumo de sustrato es funcin
de 3 factores: la velocidad de crecimiento, la velocidad de formacin de producto y
la velocidad de consumo de sustrato necesario para el crecimiento y el
mantenimiento.

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= (
+
+ )

Donde:
=

Cultivo por lote alimentado

La operacin por lote alimentado se utiliza con el fin de controlar la concentracin
de sustrato en el medio, ya sea para mantenerlo bajo si se desea una baja
concentracin de biomasa o para mantenerlo alto ya que grandes cantidades de
sustrato pueden producir vas metablicas alternas deseadas.
En este tipo de operacin se comienza con un volumen bajo de medio inoculado,
en el que el sustrato es alimentado y no existe corriente de producto. Por esta razn
el volumen dentro del tanque no es constante y es funcin del tiempo.

Entonces la masa de clulas en el reactor es igual V*(x) y la variacin con respecto

al tiempo considerando una muerte celular despreciable, es igual a:
()
= +

Integrando y dividiendo entre el volumen, V, toda la expresin se obtiene:

= ( )

Donde:

= ( )

La velocidad de consumo de sustrato en un cultivo por lote alimentado depende

adems de las variables ya mencionadas en el cultivo por lote, del factor de dilucin:

= ( ) (
+
+ )

Pirt (1979) ha expresado el cambio de la concentracin de producto en un reactor
con volumen variable igual que para un reactor en cultivo continuo como se muestra
a continuacin:

= () ()

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Entonces, la concentracin de producto cambia de acuerdo a la relacin entre la
velocidad de produccin y la de dilucin.

OBJETIVO GENERAL

OBJETIVO ESPECFICO

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MATERIAL Y EQUIPO

Material

Equipo

Matraz Erlenmeyer de 250 mL (2)

Autoclave

Micropipeta de 1000 L (2)

Biorreactor Tanque agitado

Puntas para micropipeta de 1000 L (1 caja) EZ-Control

Probeta 1000 mL (1)

Potencimetro

Tubos eppendorf (40)

Parrillas elctricas

Micropipeta de 100 a 1000 L (1)

Incubadora rotatoria de temperatura controlada

Frasco de taparrosca de 1 L (1)

Bombas peristltica (0 a 2 L/h)

Manguera de silicn (varias)

Balanza analtica

Torundas de algodn-alcohol

Electrodos de pH, temperatura y oxgeno disuelto.

Celdas de 1 L (18)

Espectrofotmetro

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Preparacin de Medio inicial e inculo 2L

Reactivo

Cantidad (g)

Extracto de Levadura 40.0096

Glucosa

10.0093

Sulfato de Magnesio

1.0025

Cloruro de Calcio

0.0208

*Se tomaron 200 ml de sta solucin como medio de inculo de B. subtillis (2 l) y se llev a un pH
7.

Preparacin de Medio para lote alimentado 2.85L

Reactivo

Cantidad (g)

Extracto de Levadura 57
Sacarosa

14.5

Sulfato de Magnesio

1.425

Cloruro de Calcio

0.0285

*Se prepar por partes y se llev a un pH de 7.

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Descripcin Del Sistema

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Metodologa
Preparacin de medios de cultivo (Da 1)

Preparacin
de 1.8 L de
medio de
cultivo
(glucosa)
inicial y 0.2 L
para inocular

Esterilizar los
200 ml de
medio en
autoclave (15
min, 121C y
15 psi)

Dejar enfriar
e inocular en
campana con
2 L de
Bacillus
Subtillis

Dejar incubar
el medio
inoculado
por 10 h
aprox. A 37C
y 200 rpm

Guardar los
1.8 L de
medio
glucosa en
refrigeracin
hasta el da
siguiente

Preparar 2.85
L de medio
de cultivo
(sacarosa)

Dejar en
refrigeracin
hasta el da
siguiente

Cultivo por Lote (Da 2)

Sellar Biorreactor con
mangueras e introducir los
sensores de pH y oxgeno
dejando un escape para la
presin.

Esterilizar Biorreactor con

medio inicial en autoclave
(15 min, 121C y 15 libras)

Dejar enfriar en Campana

Vaciar el medio inoculado

en Campana cuidando las
condiciones estriles

Conectar Biorreactor a EZControl

Monitorear condiciones
de medio y establecer una
agitacin de 100 rpm

Tomar muestra inicial

para medir densidad
celular en
espectrofotmetro a 600
nm

Realizar DNS y Bradford

leyendo
espectrofotmetro a 540
y 595 nm respectivamente

Tomar muestra cada hora

y realizar Bradford, DNS y
densidad celular a cada
muestra

Realizar curva de
protenas, azcares
reductores y densidad
celular

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Resultados
Se realizaron toma de muestras cada hora, y a cada una de las muestras se le hicieron mediciones de
biomas, azucares reductores y protena total, los datos obtenidos se muestran en la tabla 1.
Tabla 1.- Datos experimentales de absorbancia y concentracin para cultivo por lote y lote alimentado de B.
Absorbancia
Concentracion
Tiempo Azucares
Azucares
Configuracin
Proteina Biomasa
Proteina Biomasa
(h)
reductores
reductores
(g/mL) (Clulas/mL)
A= 595nm A= 660 nm
(g/mL)
A= 540nm
1
2
0.157
0.197
0.047
24.40
107.89
9907
3
0.208
0.16
0.073
24.40
87.33
10928
Cultivo por Lote
4
0.268
0.213
0.15
8.71
116.78
13951
5
0.742
0.267
0.203
6.68
146.78
16031
6
0.138
0.266
0.408
2.96
146.22
24080
7
0.126
0.232
0.267
2.49
127.33
18544
8
-0.053
0.127
0.215
2.43
69.00
16503
9
3
0.208
0.205
2.09
114.00
16110
10
0.201
0.213
0.217
1.94
116.78
16581
Cultivo por Lote
11
0.047
0.243
0.012
1.93
133.44
8533
Alimentado
12
3
0.312
0.028
1.85
171.78
9161
13
0.137
0.46
0.159
1.23
254.00
14304
1
0.733
14
0.523
0.44
405.67
28595

El comportamiento de los datos experimentales con respecto al tiempo, y modo de operacin se muestran
en la figura 1.

Figura 1.- Cambio de concentracin de biomas, azucares reductores y protena total con el tiempo

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Determinacin de

max (h-1)

0.6

y = 0.0638x

0.06

0.4 R = 0.9379
0.3

(h-1)

Ln(X/Xo)

0.5

0.0746

0.08

0.2

0.04
0.02

0.1
0

0
0

Tiempo (h)

Tiempo (h)

Figura 2.- Determinacin grfica de parmetros cinticos A) determinacin de la velocidad especifica de crecimiento . B) Determinacin de la
velocidad mxima de crecimiento max.

Por definicin la constante Ks es numricamente igual a la concentracin de

sustrato necesaria para llegar a de max, entonces se graficaron las con
respecto a la concentracin de sustrato consumido y se ajust un modelo para
determinarla.

Figura 3.- Obtencin de la constante de sustrato Ks.

Sustituyendo el valor de la max/2 en el modelo y despejando x se obtuvo Ks.

= 6.026 /

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Mediante los parmetros cinticos obtenidos con los datos experimentales, se

realiz una simulacin del lote alimentado y se calcul el % de error absoluto para
cada una de las mediciones tal como se muestra en la tabla siguiente:
Tabla 2.- Datos experimentales y simulados de concentracin de biomasa, protena y azucares reductores durante la alimentacin.

Factor de
Azucares reductores (g/mL)
Proteina (g/mL)
Biomasa (Clulas/mL)
Configura
dilucin D
cin
(h-1)
Experimento Simulacin %Error Experimento Simulacin %Error Experimento Simulacin %Error
2.089
1.940
1.932
1.845
1.225
0.440

2.009
1.666
1.356
1.122
0.939
0.795

4.0
16.4
42.5
64.5
30.5
44.6

114.00
116.78
133.44
171.78
254.00
405.67

114
138.44
165.48
195.33
228.22
304.08

0.0
15.6
19.4
12.1
11.3
33.4

16109.9
16581.02
8532.72
9160.88
14303.94
28594.58

16109.90
19907.82
24144.87
28848.10
34044.90
39763.00

Posteriormente se graficaron estos datos y se observ el comportamiento de la

concentracin de los compuestos

3.000

450.00
400.00

2.500

350.00

2.000

300.00
250.00

1.500

200.00

1.000

150.00
100.00

0.500

50.00

0.000

0.00
7

10

11

12

13

Concentracin de protena total

g/mL

Datos experimentales vs Simulacin

Lote alimentado
Concentracin de aucares reductores
g/mL

Cultivo por
Lote
Alimentado

2
2.194
2.372
2.538
2.693
2.84

14

Tiempo (h)
Azucares reductores

Azucares reductores simulacin

Protena

Proteina simulacion

Figura 4.- Simulacin de la concentracin de protena y de azucares reductores durante el tiempo de alimentacin.

0.0
16.7
64.7
68.2
58.0
28.1

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Datos experimentales y simulacin

Lote alimentado
45000

Concentracin de biomasa
Clulas/mL

40000
35000
30000
25000
20000
15000
10000
5000
0
7

Biomasa

10
11
Tiempo (h)

12

13

Biomasa (simulacin)

Figura 5.- Simulacin de la concentracin de la concentracin de biomasa durante el tiempo de alimentacin.

Discusin
Conclusin

14

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CUESTIONARIO.
1. Investigue y explique algunas alternativas para controlar el pH, que no
sean las mencionadas durante la prctica (p.e. sales amortiguadoras,
produccin de metabolitos secundarios, etc.).

2. Realiza un diagrama de flujo para obtener ron con el uso de un

biorreactor empleando un sustrato seleccionado por usted.

3. Menciona 5 modificaciones que le realizaras al biorreactor para mejorar

el proceso.

Anexos

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Referencia