UNIVERSIDAD DE ORIENTE

ESCUELA DE CIENCIAS DE LA SALUD

"Dr. Francisco Virglio Battistini Casalta"
CENTRO DE MICROSCOPIA ELECTRONICA

FRECUENCIA ALELICA Y HAPLOTICA DE LOS MARCADORES STRs DYS392

Y DYS393 UBICADO EN EL CROMOSOMA Y EN UNA POBLACION INDIGENA
DE LOS PIJIGUAO, UBICADA EN CIUDAD BOLIVAR, ESTADO BOLIVAR.

Asesores:

Anteproyecto presentado por:

Dr. Jos Antonio Nastasi Catanese

Br. Marn Coa, Yelitza Josefina

Lic. Alberto Nolasco Parrilla lvarez

C.I.21.675.535
Br. Flores Ramrez, Yennys Carolina
C.I. 19.656.814

Ciudad Bolvar, noviembre 2014

INDICE

Pg.
Introduccin... 1
Justificacin..................................................................................................
Objetivos...................................................
Metodologa..........................................................
Actividades preparatorias.......................................................
Instituciones y personal participante.........................................................
Calendario y horario de actividades......................................................
Referencia bibliogrficas.

INTRODUCCION

Para comprender la estructura del cido desoxirribonucleico (ADN), es

preciso conocer los elementos bsicos que lo integran. Por ello se va a describir de manera
muy somera en qu consiste el ADN, es una macromolcula polimrica de cido nucleico
que, en su estructura lineal, cuenta con una serie de monmeros denominados nucletidos.
A su vez cada uno de los nucletidos se unen conformando una doble hlice, un nucletido
consta de: (Carey et al 2011).
1. Un azcar desoxirribosa que tiene 5 tomos de carbonos enumerados del 1 al 5.
2. Un grupo fosfato (P), unido al azcar por el carbono 3
3. Una base nitrogenada unida al azcar por el carbono 1.

Figura 1.Esquema de la Estructura Molecular del ADN, tomado de Gentica mdica (4ta edicin)
(Carey et al 2011).

Generalmente se identifica cada nucletido con la base nitrogenada que contiene, las
purinas, que corresponden a dos bases que conforman el ADN, la adenina y citosina y las
pirimidinas que contienen guanina y timina. Que se representan por las iniciales
correspondientes: A, C, G, T (Nussbaum et al., 2008).
Una de las herramientas que se han utilizado para poder realizar identificaciones de
los genes e inferir su funcin en el organismo ha sido la determinacin de la secuencia de

nucletidos, que forman parte de cada gen. Esto se da a partir del descubrimiento de la
estructura del ADN y del cdigo gentico. Esta ha influido de manera directa en los
proyectos genomas durante los ltimos aos, con la intencin de poder determinar de
manera correcta la secuencia completa de nucletidos del genoma que posee una especie en
particular (Novo et al., 2006).
En la actualidad existen muchos mtodos para la determinacin de la secuencia de
nucletidos de un fragmento de ADN. En ese mismo sentido todas estas tcnicas se
conciben bajo el principio de la tcnica original ideado por Fred Sanger y Alan Coulson el
cual lleva por nombre mtodo de terminacin de cadenas o di-desoxi, los cuales son
un cconjunto de mtodos y tcnicas bioqumicas cuya finalidad es determinar el orden de
los nucletidos A, G, C y T en un fragmento de ADN, ya que este se fundamenta en la
interrupcin del proceso de extensin de un cebador, dando origen a cadenas de todas las
posibles longitudes, puesto que cada una ha sido interrumpida en una posicin distinta; la
separacin de las cadenas de distintos tamaos y la deteccin de qu nucletido llevan en
su extremo 3' nos permite deducir la secuencia de la molcula original (Arrambide, 2012).
Los cambios en la secuencia del ADN, se define como mutacin, originando as un
cambio en el material gentico que pueden pasar a la descendencia, existen varios tipos,
entre ellas, segn las clulas afectadas: mutaciones somticas, las cuales no son heredadas y
mutaciones germinales que afectan a los gametos, estas si se transmiten de generacin en
generacin (Ruiz, 2011)
Segn la extensin del material gentico afectado se clasifican en:
1. Mutaciones gnicas: variaciones en la secuencia de ADN que puede tener un gen
distinto entre distintos individuos, pueden ser por sustitucin, se cambia una base
nitrogenada por otra ( transiciones-transversiones) y perdida o insercin, entre ellas:

Adiciones gnicas: es la suma de una base en la secuencia de ADN.

Delecin gnica: es la prdida de una o ms pares de bases.

2. Mutaciones cromosmicas: afectan al nmero total de cromosomas y por ende su

estructura y la disposicin de los genes en el mismo:

Deleciones: prdida de un segmento cromosmico.

Duplicaciones: un segmento de ADN aparece ms de una vez, por error en la

duplicacin del mismo.

Inversiones: un segmento cromosmico tiene un giro de 180 grados.

Translocaciones: es el cambio de localizacin de un segmento cromosmico,

entre otros.

3. Mutaciones genmicas: son aquellas que aumentan o disminuyen el nmero de

cromosomas tpicos de una especie pueden ser poliploidias (Ruiz, 2011).
La palabra genoma contiene la raz griega gen que significa origen y la extensin
oma empleada en sustantivos del vocabulario biolgico y mdico. El concepto de gen ha
ido cambiando a medida que ha avanzado el estado de su conocimiento. Una de las
definiciones ms amplias del gen seria secuencia de informacin que produce un producto
funcional. Al nivel ms elemental el genoma humano est compuesto por cuatro tipos
distintos de bases. Es precisamente en la secuencia de bases de estas molculas de ADN
contenida en los cromosomas que componen al genoma humano en donde se halla la
informacin necesaria para determinar todas las caractersticas con base hereditaria al ser
humano (Oliva et al., 2008).

El genoma se encuentra clasificado en dos partes, las cuales son genoma nuclear y
el genoma mitocondrial.
El genoma nuclear posee un tamao aproximado de 3.200 Mb (mega base) es lineal
y est organizado en 23 pares de cromosomas, formado por ADN gnico o secuencias

relacionadas con los genes

(ADN codificante y ADN no codificante)

y el ADN

extragnico (ADN repetitivo, ADN de copia nica y poco repetitivo) que se encuentra entre
los genes y no codifica ninguna protena pero si ocupando el 63% del genoma mientras que
el asociado a genes ocupa el 37%. Cabe destacar que podemos encontrar ADN repetitivo
tanto en el ADN codificante (en los genes y secuencias relacionadas) como en el ADN no
codificante, pero la mayor parte se encuentra en el ADN no codificante (Escribano, 2011).
Hasta un 50 por ciento del genoma humano est constituido por ADN repetitivo,
antiguamente conocido como ADN basura. Por su importancia, a continuacin
estudiamos con mayor detalle su composicin y los distintos tipos de secuencias que lo
forman. Ya se ha mencionado que podemos encontrar ADN repetitivo tanto en el ADN
codificante (en los genes y secuencias relacionadas) como en el ADN no-codificante, pero
la mayor parte se encuentra en el ADN no-codificante. Quizs el nico ejemplo de ADN
repetitivo codificante que merece la pena resear es el correspondiente al ADN ribosomal,
que se concentra en los brazos cortos de los cromosomas acrocntricos (13, 14, 15, 21 y 22)
y est formado por tres genes que dan lugar a los tres ARN ribosomales de 5,8S, de 18S y
de 28S. Los tres genes estn juntos formando un bloque que mide unas 13 kilobases. Estos
bloques se encuentran repetidos unas 50 veces, separados entre s por un espaciador
intergnico que mide unas 30 kilobases. En conjunto, el ADN ribosomal ocupa un tamao
de unas dos megabases. (Novo et al, 2006).
El ADN repetido en tndem se divide en varios grupos segn el tamao total que
origina la repeticin:
ADN satlite el cual comprende un total de 250 Mb del genoma humano, formado
por la repeticin de una secuencia de ADN, miles de veces en tndem, es decir unas copias
pegadas consecutivamente, que contiene ms de 100 pares de bases. Denominado as
porque al separar los fragmentos de ADN genmico que contienen secuencias repetidas en
tndem en gradientes de densidad por centrifugacin aparece como tres bandas satlites
de la banda principal, dichas bandas estn formadas, por no menos de cuatro tipos de

repeticin diferentes. Este tipo de ADN suele encontrarse en zonas prximas a los
centrmeros cromosmicos (Brown, 2008).
El ADN de tipo Minisatlite formado por secuencias de 6-25 nucletidos que se
repiten en tndem hasta dar un tamao total entre 100 nucletidos. Un ejemplo de ADN
Minisatlite es la repeticin que forma los telmeros de los cromosomas humanos, el cual
cumple una funcin en la replicacin del ADN. Algunas repeticiones de este tipo son
polimrficas, y dan lugar a los marcadores de tipo de repeticiones en tndem en nmero
variable (VNTR, siglas en ingls, variable number of tndem repeats) (Brown, 2008).
El ADN de tipo Microsatlite son secuencias repetitivas de porciones de ADN de
pequeo tamao, que se repiten hasta dar bloques con un tamao total habitualmente no
superior a 150 nucletidos, incluyen dos a cinco pares de bases por lo que son denominadas
secuencias cortas en tndem (STR, siglas en ingls, short tndem repeats). (Romeo,
2009).
En lo que respecta al genoma mitocondrial este trata de un ADN circular de
pequeo tamao, el cual posee alrededor de 16.569 pares de bases, formando 37 genes,
mientras que nuestro ADN nuclear posee ms de veinte mil, codificando de esta forma dos
cidos ribonucleicos ribosmicos (ARNr), 22 ARN de transferencia (ARNt) y 13 protenas
que forman parte de cuatro de los cinco complejos que constituyen la cadena de transporte
de electrones. Se localiza dentro de la mitocondria, estructura que le facilita a la clula la
energa necesaria para su funcionamiento permitindole as un sistema gentico propio y la
maquinaria necesaria para sintetizar el ADN, ARN y las protenas que codifica (Matthew,
2008).
Otra caracterstica fundamental del ADN mitocondrial es que este es heredado
estricta y exclusivamente por lnea materna. Este patrn tan especial de herencia molecular
permite comparar tipo de relaciones familiares maternales: hermanas, abuelas, primas,
sobrinas, tas e hijas, Ese 100% de la informacin del ADN mitocondrial proviene de un
proceso denominado fecundacin, el cual no es ms que la unin ovulo-espermatozoide,

cuyas mitocondrias de origen paterno se pierden durante esa unin, es por ello que ese
100% de ADN mitocondrial proviene de la madre y se mantiene de generacin en
generacin, de manera que todos los individuos de un mismo linaje materno exhiben la
misma secuencia del ADN mitocondrial, denominado genricamente como matrilinaje.
(Bernath, 2013).

No obstante a ello ocurre la variacin inter-individual la cual garantiza la adaptacin

de una especie a condiciones ambientales cambiantes, a expensas de producir algunos
individuos con mutaciones ms graves, que desencadenan una enfermedad. En humanos, la
variacin entre individuos se genera principalmente durante el proceso de reproduccin
sexual (por recombinacin meitica).La variacin observable en los individuos se debe en
gran medida a la variacin gentica. Y esta a su vez se debe a la presencia de cambios
genticos heredables. (Novo et al., 2006; Nussbaum et al., 2010).
Todo lo contrario a las mutaciones los polimorfismos genticos son segmentos de
ADN que muestran variabilidad y el cual se encuentra distribuido en un porcentaje
determinado entre los individuos de una determinada poblacin y es considerado como tal
cundo la frecuencia de uno de sus alelos en dicha poblacin es mayor al 1% por ello es
que se utiliza como marcador para el estudio del patrn de herencia de un determinado
rasgo al igual que para la bsqueda de genes que confieren susceptibilidad a padecer
ciertas enfermedades, existe una variedad de polimorfismos, entre ellos los que se deben a
inserciones, deleciones y cambios en el nmero de secuencias repetidas (Checa, 2007).
Los polimorfismos de nucletido sencillo (SNP), como su nombre lo indica es el
ms sencillo, ya que se debe al cambio de una base nitrogenada por otra en una secuencia
gentica, son los ms abundantes que pueden encontrarse en el genoma humano.

Los polimorfismos de secuencias repetidas, involucran los minisatlitesVNTR y los microsatlites STR, que no es ms que repeticiones en tndem

en nmero variable una detrs de la otra, los cuales tiene mayor aplicacin
en el mbito gentico. Los minisatlites son polimorfismos que presentan
una desventaja no se encuentran distribuidos en todo el genoma aunque se
utiliza principalmente en la determinacin de paternidad. En cambio los
STR-microsatlites si se encuentran homogneamente por todo el genoma y
se utilizan en el diagnstico gentico (Checa, 2007).

El estudio de estos polimorfismos genticos pueden ser analizados mediante la

reaccin en cadena de la polimerasa (siglas en ingls, PCR), la cual es una tcnica de
amplificacin in vitro de molculas especficas de ADN. La cual utiliza ciclos de
desnaturalizacin, apareamiento con cebadores y extensin por una ADN polimerasa
termoresistente. Una reaccin de PCR consta de 20 a 30 ciclos idnticos, y cada ciclo
consta a su vez de tres fases. La primera fase consiste en desnaturalizar mediante un
calentamiento (95 C durante un minuto) se separan las dos cadenas del ADN molde. La
segunda fase consiste en hibridar dos oligonucletidos diseados de tal forma que sean
complementarios a los extremos de la regin que se quiere amplificar; la hibridacin suele
realizarse a 55C durante un minuto, la temperatura de incubacin se reduce para permitir
el apareamiento de las bases de ambos cebadores en el sitio donde encuentran una
secuencia complementaria. La tercera fase, consiste en sintetizar el complemento
correspondiente a la regin a amplificar, esta ltima fase puede tener una duracin de un
minuto a 72C. (Oliva et al., 2008).
En el caso de investigacin sobre la lnea paterna, se usa es el cromosoma Y, el cual
es de pequeo tamao, aunque el 21 y 22 son ms pequeos, forma parte del par de los
cromosomas sexuales, ya que el resto forman los cromosomas autosmicos, que son 22
parejas, formando as un total de 46 cromosomas que forman 23 parejas, es el responsable
junto al cromosoma X, de la determinacin del sexo de un individuo. Dicho proceso se
origina en el momento en que el ovulo es fecundado por un espermatozoide, es decir la

mujer aporta el cromosoma sexual X y el hombre el X o Y. l cromosoma Y porta el gen

SRY, el cual es el responsable de generar el progreso fenotpico a hombre durante la
embriognesis, si este gen no est presente, el individuo ser una mujer. Esto explica de
forma significativa porque el cromosoma Y tiene un papel fundamental en la determinacin
del sexo (Blanco, 2008).
Una de las caractersticas ms interesantes del cromosoma Y es el modo en el que
va pasando de generacin en generacin. nicamente pasa de padre a hijo varn siendo,
por tanto, especfico del gnero masculino. La ausencia de recombinacin en prcticamente
la totalidad del cromosoma le permite pasar de generacin en generacin como un bloque
haplotpico, esto nos lleva a tener una estructura idntica que pasa de una generacin a la
siguiente, denominado patrilinaje (Blanco, 2008).
Los STR-Y, aunque son secuencias cortas de ADN, se encuentran ampliamente
distribuidos en el genoma, y por dichas razones, el papel ms importante que tiene, es el
uso que se le da como marcadores genticos ya sea en la identificacin de criminales,
probar paternidad y otras relaciones familiares, identificar restos encontrados en reas de
desastres y la identificacin de personas mediante huellas dactilares. Todo ello mediante el
uso de la tcnica PCR o reaccin en cadena de la polimerasa, que permite la amplificacin
de ese fragmento de ADN que contiene secuencias repetidas cortas. Debido a la elevada
variabilidad que presentan los STR-Y, como principal ventaja y aunado a que la tcnica
empleada es ms rpida y exacta por su longitud estos se utilizan como marcadores en estos
estudios genticos (Pierce, 2009).
Es por ello que se estudiara esa variabilidad que puede presentarse en la comunidad
los Panare o E'eps los cuales son una etnia indgena venezolana que habita en el
municipio Cedeo, ubicado en el extremo oeste del estado Bolvar, al norte del estado
Amazonas, de Venezuela, pertenecen a la tribus de habla caribe, afiliacin que todava no
ha sido desmentida, posee alrededor 390 habitantes, se fund 1973. La subsistencia de
estos est basada en la agricultura de corte y quema, siendo las cosechas ms importantes;

yuca, maz, cambures y arroz. Otras plantas importantes que se cultivan son totumas usadas
como recipientes y algodn que se usa para la manufactura de guayucos. La caza y pesca,
aunque de importancia secundaria para la economa alimentaria, se practica entre los
Panare de forma extensiva. Los principales implementos de casera son la cerbatana y la
lanza, para los peces usan mallas de mano, anzuelo, el arco y la flecha (Wilibert, 2015).

Entre los animales cazados se incluyen: el bquiro, el hormiguero, el venado el

mono el morrocoy, la iguana y pjaros. La mayor parte de las actividades en conexin con
la agricultura se realizan por las mujeres; los hombres solo preparan la tierra y los nios
ayudan con frecuencia a sus madres. La caza y pesca son casi exclusivamente practicadas
por los hombres quienes generalmente cazan por parejas en tanto que la pesca siempre se
realiza en comunidad, con la mayora de los hombres de la aldea. Para elegir un rea de
habitacin, los Panare tienen en cuenta varios factores. (Wilibert, 2015).

A fin de evitar inundaciones, levantan sus ranchos en repechos y colinas y para sus
campos han de encontrar un lugar en los valles de los ros donde puedan contar con el agua,
pero fuera del alcance de las inundaciones. De acuerdo al sistema democrtico y liberal
completo de la sociedad Panare, los matrimonios son muy flexibles y cualquier compaero
puede romper la unin con solo alejarse del lugar de la familia o de su rea, para contraer
matrimonio deben ser primos cruzados primos segundos y no primos hermanos( Wilibert,
2015).
Frecuencia Allica del locus STRs DYS392 Y DYS393 a nivel mundial

LOCALIDAD
Brasil

Blancos
Mulatos

Mxico

10
11
12
0.083 0,376 0,050

ALELO
13
14
0,433 0,033

15
0,025

0,040 0,340 0,020

0,014 0,207 0,130

0,500
0,302

0,020
0,091

0,080
0,193

Taiwn
Venezuela (Zulia)

Maracaibo
Isla de Toas
Wayuu
San Jos de Heras
Bari
Yukpa

Venezuela(Bolvar)

0,006 0,012

0,035

0,947 -----

----0,009 0,324 0,045

0,417 -----

0,567
0,477

0,360
0,044

0,018
0,059

----------- 0,208 0,062

------ 0,657 0,078
------ -------------- --------0,018 0,413 0,090

0,458
0,236
0,250
----0,350

0,208
---0,750
0,160
0,100

0,062
0,026
-0,833
0,022

En estudios realizados en Mxico y Brasil para el marcador DYS392, se encontr

que el alelo ms frecuente fue el 13. En cambio en la poblacin de Taiwn, se determin
que el alelo ms frecuente es el 14. Otros estudios se realizaron en Venezuela pero en
ciudades distintas, en el caso de (ciudad bolvar-estado bolvar) el alelo ms frecuente fue
el 11,en el Estado Zulia se analizaron seis poblaciones diferentes,las poblaciones indgenas
Bar y Yukpa el alelo ms frecuente es el 14 y 15, para la poblacin indgena Wayu el alelo
ms frecuente fue el 13, para las poblaciones de Maracaibo e Isla de Toas que son
poblaciones predominantemente blancas el alelo ms frecuente fue el 13 y en la poblacin
de San Jos de Heras que es una poblacin descendiente de africanos el alelo ms frecuente
fue el 11. (Alcal et al. 2012; Brando et al. 2006; J.R Padilla Gutirrez et al. 2008; Wu et
al. 2009).
Frecuencia Allica del locus STRs DYS392 Y DYS393 a nivel mundial

LOCALIDAD
Brasil
Taiwn
Venezuela (Zulia)

10
---------Maracaibo
0,009
Isla de Toas
---Wayuu
---San Jos de Heras ---Bari
---Yukpa
---Blanco
Mulato

11
----------------------------

12
0,158
0,140
0,035
0,198
0,194
0,125
0,131
0,062
--

ALELO
13
14
0,676 0,141
0,780 0,080
0,947 0,018
0,693 0,090
0,656 0,119
0,520 0,333
0,631 0,105
-0,937
0,166 0,833

15
0,025
--------0,009
0,029
0,020
0,131
---

Venezuela(Bolvar)

----

----

0,178

0,694

0,105

0,022

Con respecto a las frecuencias allicas del marcador DYS393, se observ que en la
poblacin de Taiwn, Brasil, Venezuela (Ciudad Bolvar) el alelo ms frecuente es el 13.
En cambio un estudio realizado en Venezuela en el Estado Zulia se analizaron seis
poblaciones diferentes de dicho estado dos poblaciones mezcladas predominantemente
blancas, Maracaibo e Isla de Toas, tres poblaciones indgenas Wayu, Bar y Yukpa y una
poblacin descendiente de africanos, San Jos de Heras; en las poblaciones indgenas Bar
y Yukpa el alelo ms frecuente es el 14, para la poblacin indgena Wayu el alelo ms
frecuente fue el 13,siendo la poblacin de Bari y Yukpa las que tuvieron menor diversidad
allica, mientras que en las poblaciones de Maracaibo e Isla de Toas que son poblaciones
predominantemente blancas el alelo ms frecuente fue el 13, y en la poblacin de San Jos
de Heras que es una poblacin descendiente de africanos el alelo ms frecuente fue el 13
(Alcal et al. 2012; Borjas et al 2011; Brando et al. 2006; Wu et al. 2009).
Con base a lo anteriormente expresado, el objetivo de esta investigacin ser
determinar la frecuencia allica de los loci STRs DYS392 y DYS393, ubicados en el
cromosoma Y en la poblacin de los pijiguao, ubicada en ciudad Bolvar, estado Bolvar.

JUSTIFICACION
Los estudios que se realizan en la actualidad tomando en cuenta al ADN, han sido
de mucha utilidad e importancia para comprobar el parentesco bien sea del padre o de la
madre con respecto a un individuo que se cree existe algn vnculo. Los Y-STRs juegan un
papel fundamental en la gentica forense, ya que son aplicados en un gran nmero de
pruebas de identificacin humana, incluyendo anlisis forenses de evidencias de agresiones
sexuales, investigacin de personas desaparecidas, adems de complementar pruebas de
paternidad deficientes en investigaciones genealgicas. Estas pruebas son posibles debido a
que la biologa molecular ha tenido grandes avances en el campo cientfico, utilizando la
tcnica de PCR para el anlisis de los marcadores STRs.
Se puede hablar bsicamente de dos razones principales por la que es interesante el
estudio del cromosoma (Y); una de ellas es la especificad masculina, til sobre todo para
las pruebas forenses en la que se encuentra diferentes tipos de ADN y, la otra razn es la
capacidad que presenta el cromosoma (Y) que permite determinar o poder realizar un
rastreo de linajes paternos.
La prueba de linaje paterno Y-STR se utiliza para determinar si dos o ms varones
tienen parentesco mediante su linaje masculino. El cromosoma-Y pasa del padre al hijo y se
mantiene igual durante varias generaciones porque tiene un grado de mutacin
relativamente poco frecuente. Por lo tanto, la prueba del linaje paterno Y-STR puede
determinar una relacin de padre-hijo. La prueba Y-STR tambin puede ayudar a
establecer una relacin biolgica entre varones de una familiares lejanos (como mediohermanos, primos, entre otros.).
La mayor parte de los casos de investigacin de parentesco estn relacionados con
la determinacin de la paternidad biolgica, sin embargo, se dan muchos casos en que es
necesario abordar otros desafos, como son los que conciernen a estudios de
paternidad/maternidad indirectos (abuelidad), hermandad o pertenencia a una determinada
lnea de parentesco paterna o materna.

Con respecto a lo planteado, se puede decir que la investigacin de los STRs del
cromosoma Y tienen gran relevancia actualmente y se hace necesario investigar sobre el
tema especficamente en el Estado Bolvar, para profundizar a un ms y generar bases de
datos que faciliten en cierta forma el anlisis de pruebas forenses, paternidad o encaminar
una investigacin mdica prominente.
A pesar de la importancia actual que tiene la investigacin de los STRS del
cromosoma Y, en el pas se han hechos muy pocos anlisis, especialmente en la comunidad
indgena de los pijiguao no se ha hecho ningn estudio de estos marcadores, lo que
dificulta el anlisis cientfico de las pruebas ya sean de paternidad, forense, o de
investigacin mdica.

De acuerdo con lo expresado es necesario determinar las frecuencias allicas de los

loci STR DYS392 y DYS393 del cromosoma Y en varones habitantes de la comunidad
de pijiguao del Estado Bolvar, la cual podr ser utilizada como gua de referencia para el
anlisis molecular de paternidad, forense y antropolgico, permitiendo de esta manera el
desarrollo progresivo de la biotecnologa para ser eficientes en la bsqueda de soluciones a
las diferentes dificultades que se pueden presentar durante el anlisis en el rea de gentica

METODOLOGIA

TIPO DE ESTUDIO:
Estudio de tipo descriptivo.
UNIVERSO:
Personas del sexo masculino residentes en la comunidad de pijiguao. Ciudad
Bolvar, Estado Bolvar.
MUESTRA:
25 muestras de ADN de hombres residentes de la comunidad indgena quebrada
seca, pijiguao perteneciente a Ciudad Bolvar, Estado Bolvar, que se encuentran
almacenadas en el Laboratorio de Biologa Molecular del Centro de Microscopia
Electrnica de La Universidad de Oriente, Ncleo Bolvar.
MATERIALES.
a.- Materiales para la extraccin de ADN:
-

Torniquete

Guantes

Marcador

Jeringas

Algodn

Alcohol isoproplico

Tubos con anticoagulante EDTA (cido etilendiaminotetractico)

Micropipetas

Gradillas

Puntillas para Micropipetas

Tubos eppendorf de 1,5 ml

Wizard Genomic DNA purification Kit, Cat #A1120

Isopropanol

Etanol al 70%

Descarte para las puntillas

b.- Materiales para PCR:

-

Gradillas

Guantes

Tubos para PCR de 0,2 ml

Micropipetas

Puntillas para micropipetas

Tirro

Exacto

Marcador

Recipiente refrigerante para las muestras

Tubos eppendorf de 1,5 ml

Master Mix para PCR 2X

Primers

Agua Ultra pura

Descarte para las puntillas

c.- Materiales para la Electroforesis:

-

Detergente

Esponjas

Papel absorbente

Etanol puro

Gradillas

Tubos Eppendorf de 1,5 ml y 0,2 ml

Buffer de carga (Loading Buffers) que contiene Xilencianol y azul de bromofenol.

Placas de vidrio para Electroforesis

Cinta adhesiva

Tijeras

Pinzas de metal

Pinzas de plstico

Separadores

Peine dentado

Agitador magntico

Exacto

Pipetas

Micropipetas

Puntillas para micropipetas

Urea 7M

Agua destilada

TBE 10X Buffer

Poliacrilamida al 40% (acrilamida + poliacrilamida 19:1)

Persulfato de Amonio al 10%

TEMED

Buffer TBE 0.5X

Recipiente Plstico para la coloracin

Etanol al 10%

Acido Ntrico 0.16 M.

Nitrato de plata 12 Mm...

Carbonato de sodio anhidro al 2.5%

Formaldehdo al 37%

cido actico al 10%

EQUIPOS
Termociclador Gene Amp PCR (AppliedBiosystem) modelo 9700
MicrocentrifugaEppendorf centrifuge 5415C
Cmara de electroforesis vertical SIGMA-Aldrich. Techware.

 Generador de voltaje (E-C ApparatusCorporation) EC4000P Serie 90

programable.
Mesa con lmpara.
Balanza electrnica Denver InstrumentCompany.
Calentador y agitador magntico Fisher Thermix.
Refrigerador General Electric.
Nevera Samsung.
Bao de Mara con ultrasonido.
Estufa Memmert.
Buchler Vortex - Evaporador
MTODOS
1) Carta de consentimiento y hoja de recoleccin de datos.
2) Toma de muestra sangunea.
3) Extraccin de ADN.
4) Tcnica de PCR.
5) Electroforesis.

Carta de consentimiento y hoja de recoleccin de datos:

Se elabora una hoja en la cual se le participa al paciente en qu consiste la

investigacin, de qu forma prestara su colaboracin y los riesgos que esta conlleva. Luego
se procede a obtener los datos del paciente necesarios para la investigacin por medio de un
formato de datos.

Toma de muestra de sangre perifrica

Se realiza la asepsia en la fosa cubital del brazo con alcohol isoproplico al 70%,
luego se procede a la puncin de la vena, la muestra extrada es vertida en un tubo para
hematologa con anticoagulante EDTA.
Extraccin de ADN:

1. En un tubo eppendorf se vierte 300 l de sangre y 900 l Buffer de lisis,

se mezclan y se esperan 10 min.
2.

Luego es centrifugado durante 10 seg.

3. Se descarta el sobrenadante y se le vierte 300 l de lisis de ncleo durante 2

min.
4. Luego se le colocan 50 l de la solucin de precipitacin de protenas y se
centrifuga durante 10 min.
5. Se trasvasa el sobrenadante a otro tubo para eppendorf limpio y el
sedimento se descarta.
6.

Una vez trasvasado el sobrenadante se le colocan 200 l de Isopropanol.

7. La solucin creada se centrifuga durante 8min.

8. Finalmente se lava con etanol al 70% fro 4 veces, siendo en cada lavado
centrifugado durante 8min y preservando el sedimento que es en si la
molcula de ADN.
9. Luego se deja secar el ADN y se rehidrata con (50 l) de Solucin
rehidratante de ADN (Buffers TE).
Tecnica de PCR: (R.L Nussbaum., 2010)
La PCR consiste en una amplificacin enzimtica de un fragmento de DNA (la
diana) localizado entre dos oligonucletidos cebadores (fi g. 4-9). Estos cebadores estn
diseados de forma que uno de ellos es complementario a una cadena de una molcula de
DNA en uno de los lados de la secuencia diana, y el otro es complementario a la otra
cadena de la molcula de DNA en el lugar opuesto de la secuencia diana.
Pasos para la PCR:
a.- Identificacin: Se realiza marcando tubos estriles para PCR con el nmero
correspondiente de ADN que se desea analizar en cada tubo, esto se realiza colocando en

tirro dicho nmero y luego pegndolo al tubo para PCR. Luego se deben colocar los tubos
en una gradilla mientras se preparan los dems materiales.
b.- Preparacin de los Primers DYS92 y DYS93: estos oligonucletidos sintticos,
son liofilizados, para poder ser utilizados se deben mezclar con TE 1X.
-

DYS92-Forward (de concentracin final 10 mM)

DYS92-Reverse (de concentracin final 10 mM)

DYS93-Forward (de concentracin final 10 mM)

DYS93-Reverse (de concentracin final 10 mM)

c.- Mezcla del Pool para PCR: en un tubo eppendorf de 1.5 ml se le agregan los
siguientes reactivos:
-

PCR Master mix 2X de promega 12,5 l

H2O ultra pura (desionizada) 7,75 l

Mezcla de Primers 2,75 l

Posteriormente, el tubo eppendorf deber ser llevado al Vrtex para dar lugar a la
homogeneizacin de los lquidos que contiene.
d.- Unin del ADN y el Pool para PCR: en cada uno de los tubos que estn
previamente identificados se deben agregar 23 l de Pool para PCR y 2 l de ADN, para
tener un volumen total de 25 l. Los tubos estarn ordenados en la gradilla en forma
ascendente de acuerdo al nmero de muestra y as sern colocados en el termociclador.
e.- Con la organizacin descrita anteriormente, los tubos con ADN y Pool para PCR,
son ubicados en el termociclador, donde llevarn a cabo una serie de 30 ciclos para cumplir
con la amplificacin de la regin de ADN deseada.
Condiciones en el Termociclador:
1. Incubacin inicial: 94C durante minutos.
2. Desnaturalizacin: 94C durante 20 segundos.
3. Acoplamiento: 57C durante 20 segundos.
4. Extensin: 72C durante 20 segundos

5. Extensin final: 72C durante 10 minutos.

f.- Concluidos los ciclos en el termociclador, se sacan los tubos y se mantienen a una
temperatura estable en la nevera.
Electroforesis en gel: (Lodiget al.2006)
Es una tcnica de separacin de molculas en una por aplicacin de un campo elctrico. Las
molculas disueltas se desplazan o migran en un campo elctrico a

una

velocidad

determinada por su relacin carga-masa. (Lodiget al.2006)

Dado que muchas protenas o cidos nucleicos de tamaos y formas
diferentes tienen relaciones carga-masa idnticas, la electroforesis de estas macromolculas
en solucin se traduce en muy escasa o nula separacin. No obstante, es posible lograr la
separacin de protenas y cidos nucleicos mediante la electroforesis en distintos geles. La
separacin electrofortica de protenas se suele efectuar en geles de policriamida. Cuando
una mezcla de protenas se aplica a un gel y se le pasa una corriente elctrica, las protenas
ms pequeas migran mas rpido a travs del gel que las protenas mas grandes (Lodiget
al.2006).
a.- Tincin de las muestras: las muestras de ADN amplificadas, son mezcladas con el
buffer de carga, utilizando 2,5 l del buffer y 2,5 l del ADN amplificado, este proceso se
lleva a cabo en tubos esterilizados y organizados de la misma manera en que los tubos para
PCR fueron llevados al termociclador, tambin son integrados los Lader que servirn como
gua para la identificacin de los alelos.
b.- Preparacin del gel de Poliacrilamida al 4%: La poliacrilamida es un polmero de
monmeros de acrilamida, este gel posee la particularidad de ser desnaturalizante. La
migracin de las partculas depender del tamao del poro, el cual a su vez est relacionado
con la concentracin de acrilamida y la relacin acrilamida-bisacrilamida.
La mezcla del gel contiene los siguientes reactivos dispuestos en un matraz de 250 ml,
los cuales son agregados gradualmente, mientras se van homogeneizando en el rotador, con
la ayuda de un agitador magntico.
-

Urea 7M 25 gr.,

Agua destilada 32.5 mL,

TBE 10X Buffer 5 mL

11.25 ml de poliacrilamida al 40% (acrilamida + poliacrilamida 19:1)

Se agregan los catalizadores Persulfato de Amonio al 10% (500L) y (50L) de

TEMED(agregados en el ltimo momento, ya que de ellos depende la
gelificacin de la mezcla)

c.- Armado de la Cmara Electrofortica:

- Son necesarias dos placas de vidrio limpias, las cuales son tratadas con Etanol
puro, para asegurar la eliminacin de impurezas y polvo, este procedimiento se realiza con
la ayuda de toalln absorbente, el cual debe ser cambiado cada vez que finaliza un ciclo de
limpieza (son 8 por cada vidrio).
- Uno de los vidrios se trata con una solucin adherente o BindSilane, luego de ser
diseminado por todo el vidrio se esperan 5 min hasta que seque totalmente. Es necesario
retirar el exceso con etanol puro, cambiando los toallines cada vez que se realice un ciclo
de limpieza, esta vez solo se realizaran 7.
- Los vidrios deben ir dispuestos uno sobre el otro, teniendo entre ellos separadores
ubicados en los extremos derecho e izquierdo, de estos separadores depender el grosor
final del gel.
- Una vez que han sido alineadas ambas placas de vidrio, se sellan con cinta
adhesiva, cubriendo los extremos laterales e inferior. Para garantizar que no se muevan los
vidrios, son fijados con pinzas metlicas, ubicadas a cada lado de la cmara electrofortica.
d. Vaciado del gel:
- La preparacin de poliacrilamida al 4%, se vierte en el espacio que queda entre
ambas placas de vidrio de la cmara electrofortica, este proceso requiere de precisin, ya
que no deben quedar burbujas en la cmara para asegurar que sea uniforme el resultado
final y no interfieran con la migracin de las molculas. En este momento, se precisa la
introduccin del peine entre los dos vidrios, el cual dar forma a los pocillos en los que se
agregarn las muestras.

- La cmara descansa por 30 min aproximadamente, en un soporte que le permite

mantenerse de forma horizontal, hasta completar el proceso de gelificacin.
e.- Corrida de las muestras:
- Luego de la gelificacin, se retiran las pinzas metlicas y la cinta adhesiva que est
fijada en el extremo inferior de la cmara, sta se lava para retirar el exceso de gel que haya
quedado.
- Se coloca el gel en la cmara de electroforesis vertical, la cual debe poseer un
buffer TBE 0.5X, dispuesto en la parte superior e inferior de la cmara.
- El peine se retira con cuidado, evitando que salga inclinado, ya que los pocillos
podran romperse.
- Se realiza una limpieza de los pocillos, con la ayuda de una jeringa, se toma el
mismo Buffer que contiene la cmara y uno a uno se limpian para quitar el exceso de gel
que se haya depositado.
- La precorrida se realiza durante 15 minutos.
- Se lleva a cabo la desnaturalizacin del ADN durante 2 minutos a 95C y luego se
refrigera a 4C hasta el momento en que las muestras sern servidas en los pocillos
correspondientes.
- Cargar en cada pocillo las muestras y escalera allica respectivos e iniciar la
corrida electrofortica.
- Se dejan migrar las muestras de ADN, durante 2 horas aproximadamente.
f.- Migracin: debido a que la molcula de ADN est Cargada negativamente, las partculas
van movindose a travs del gel, del polo negativo al positivo, los alelos ms ligeros
migraran con mayor facilidad por la malla de poliacrilamida hasta llegar lo ms cercano
posible al polo positivo, los alelos ms pesados quedaran rezagados ubicndose ms cerca
del polo negativo.
g.- Revelado y tincin con plata:
- La corrida es detenida y con la ayuda de una pinza metlica son separados los 2
vidrios.
- El vidrio donde queda adherido el gel, es colocado en un recipiente plstico

- Se Agrega 1 litro de Etanol al 10% durante diez minutos.

- Se realiza un lavado con 1 litro de agua destilada.
- Se Agrega 1 litro de Acido Ntrico 0.16 M durante 5 minutos.
- El gel es lavado nuevamente con agua destilada.
- 1 Litro de Nitrato de Plata 12 mm, es vertido en el recipiente y se dejar actuar por 10
minutos.
- Se Lava con agua destilada.
- Para lograr el revelado de las bandas es necesario agregar, Carbonato de Sodio
anhidro al 2.5% ms 500 L de Formaldehdo por 5 min aproximadamente.
- Teniendo el resultado requerido debe agregarse la solucin stop o cido Actico al
10% durante 3 minutos y luego dejar en agua destilada durante 2 minutos.
En este punto se hace posible la lectura de las placas.

Actividades preparatorias

Seleccin del tema: Frecuencias allicas de los polimorfismos STRs DYS392 y DYS393
ubicados en el cromosoma Y en una poblacion indigena de los pijiguao, ubicada en
ciudad Bolvar, estado Bolvar.
-

Ciudad Bolvar Estado Bolvar.

Asesores: Dr. Jos Antonio Nastasi Catanese y Lic. Alberto Nolasco Parrilla
lvarez.

Bsqueda de informacin:

Solicitud de materiales, reactivos y equipos.

Entrevistas: Durante la recoleccin de la muestra se instruy y entrevisto a

los hombres participantes para fines de la investigacin.

Entrenamiento especial en las siguientes tcnicas:

Extraccin de ADN.

Tcnica de Reaccin en Cadena de la Polimerasa.

Electroforesis.

Instituciones y personal participante

Laboratorio de Biologa Molecular del Centro de Microscopia electrnica de la

Escuela de Ciencias de la Salud Dr. Francisco Battistini Casalta.
Universidad de Oriente.

Dr. Jos Antonio Nastasi Catanese (TUTOR)

Lic. Alberto Nolasco Parrilla lvarez (TUTOR)

Br. Flores, Yennys (TESISTA)

Br. Marn, Yelitza (TESISTA)

Calendario y horario de actividades

FECHAS

ACTIVIDADES
Nov

Dic

Ene

Feb

Mar

Abr

May

Seleccin del tema y de los

asesores.
Bsqueda de informacin
Recoleccin de las muestras
Entrenamiento especial en la
extraccin de ADN.
Extraccin de ADN de los hombres
participantes.
Entrenamiento especial en la
tcnica de Reaccin en Cadena de
la Polimerasa (PCR).
Entrenamiento especial en
electroforesis.
Realizacin de PCR a los ADN
extrados.
Corrida electroforetica de los ADN
amplificados
Anlisis y discusin de resultados
Entrega del Proyecto

Calendario: Inicio (Noviembre 2014); Final (Octubre 2015)

Jun

Jul

Ago

Sep

Oct

Referencias bibliogrficas
Alcal, A., Rodrguez, J. 2012. Frecuencias allicas y haplotipicas de los polimorfismos
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