Mtodos Rpidos para el

control Microbiolgico de
Alimentos
Vigo, 8 de septiembre del 2011
1

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Necesidades en el anlisis de alimentos

Contaminacin
microbiana:
principales
problemas
asociados al consumo
Las toxiinfecciones alimentarias conllevan un elevado
impacto econmico (patgenos)
Las alteraciones de alimentos tambin preocupan a las
industrias alimentaria (indicadores
(
de calidad))
Sistemas APPCC es la herramienta de seguridad
alimentaria ms reconocida
Requiere de un gran nmero de anlisis y obtencin
rpida
p
de resultados

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Necesidades en el anlisis de alimentos

Mtodos
M
d cada
d vez ms
rpidos
id (industrias,
(i d
i
l b
laboratorios)
i )
Mtodos sencillos
Mtodos fiables
Mtodos reconocidos
Mtodos trazables
Mtodos sensibles
Mtodos econmicos

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Mtodos tradicionales/oficiales:

Largos
Surgen los mtodos
alternativos
(rpidos y/o
Elevada
manipulacin
automatizados)
Tediosos

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Mtodos rpidos:
y
uno o varios das frente a los
Disminuyen
protocolos tradicionales

Mtodos automatizados:
Utilizacin de un equipo que realiza una o varias
tareas que habitualmente realiza un tcnico

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Mtodos Rpidos: Consideraciones generales

CARACTERISTICAS DE UN MTODO RPIDO/AUTOMATIZADO
IDEAL
Preciso
Rpido
p
yp
productivo
Econmico
Aceptable
Realizacin simple
Entrenamiento
Reactivos comunes
R
Reputacin
t i d
de lla compaa

Buen servicio tcnico

Requerimientos de espacio y utilidad ptimos
6

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Mtodos Rpidos

Clasificacin en reas de acuerdo a lo que se busca:

Sistemas para facilitar la toma de muestras
Mtodos para ayudar al procesamiento de las muestras
Sistemas de cuantificacin microbiolgica
Mtodos para identificacin y cuantificacin de microorganismos
Sistemas especiales para anlisis de muestras de aguas, ambientales y
superficies
Sistemas de identificacin mediante mtodos moleculares
Mtodos inmunolgicos para deteccin y/o cuantificacin de microorganismos
Otros mtodos miscelneos

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

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Mtodos rpidos para ayudar a la toma de

muestras
t
MUESTREADORES, APLICADORES
Muestreo dinmico
Estandarizacin
Concepto de trazabilidad

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

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Mtodos rpidos para ayudar al procesamiento

de la muestra
DILUIDORES
Estandarizacin
Aumentan productividad
Trazabilidad

PREPARADORES y DISPENSADORES DE MEDIOS DE CULTIVO

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Indicadores de calidad

Recuentos

10

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Mtodos rpidos aplicados a Indicadores

microbiolgicos
FILM HIDRATABLE: PETRIFILM: 3M
Optimizan el espacio de incubacin
Manual
Algunos protocolos Express

Lminas
deshidratadas que
se rehidratan al
inocular la muestra

Posibilidad de lector automtico

Validaciones internacionales

Recuento total
Enterobacterias
E.coli/Coliformes
Mohos y levaduras
Staph. Aureus
Listeria ambiental
11

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Mtodos rpidos aplicados a Indicadores

microbiolgicos
g
SISTEMA TEMPO: bioMerieux
Fcil preparacin de muestra
Trazabilidad
Trazabilidad
Mismo protocolo para diferentes parmetros
Validaciones internacionales

Recuento Total
Enterobacterias
E t
b t i
Sistema totalmente
automatizado
NMP miniaturizado
i i t i d
Lectura por
fluorescencia

Coliformes
E.coli
E.coli
S. Aureus
Mohos y levaduras
Bacterias Lcticas

12

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Protocolo de trabajo
dilu
ent
X g (or ml)

9X ml

10-1 suspension

Sample
p preparation
p p
Inoculation

Reading & interpretation

13

Mtodos rpidos para el control

microbiolgico de alimentos
Incubation

Protocolo de trabajo

dilu
ent
X g (or ml)

9X ml

10-1 suspension

Sample
p preparation
p p

WIFI

Reading & interpretation

14

Inoculation

Mtodos rpidos para el control

microbiolgico de alimentos
Incubation

Protocolo de trabajo

dilu
ent
X g (or ml)

9X ml

10-1 suspension

Sample
p preparation
p p

WIFI

Reading & interpretation

15

Inoculation

Mtodos rpidos para el control

microbiolgico de alimentos
Incubation

Protocolo de trabajo

dilu
ent
X g (or ml)

9X ml

10-1 suspension

Sample
p p
preparation
p

WIFI

Inoculation

RESULTS
READING
REPORT
Reading & interpretation
16

Mtodos rpidos para el control

microbiolgico de alimentos
Incubation

Mtodos rpidos aplicados a Indicadores

microbiolgicos
g
SISTEMAS BASADOS EN IMPEDANCIA: BACTRAC
Fcil
F il preparacin
i de
d muestra
t
Lectura automtica
Ms sencillo cuando es mono-producto
mono producto
Ms
Necesaria calibracin para recuento
Esterilidad comercial (pasa/no pasa)

Recuento total
E t
Enterobacterias
b t i
E.coli/Coliformes
Hongos y levaduras
Staph. Aureus
cido Lcticas

17

Mide los cambios que producen

los microorganismos de un
cultivo que alteran las
substratos cambiando su
conductividad elctrica y esto
vara la impedancia

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Mtodos rpidos aplicados a Indicadores

microbiolgicos
g
SISTEMAS BASADOS EN CITOMETRIA DE FLUJO
AES: Bactiflow
Fcil preparacin de muestra
Lectura automtica
Rpido
Utilidad:
Utilid d yogures, champs,
h
cremas,
refrescos, zumos de frutas

Marcaje de las clulas,

deteccin una una y contaje
R
Recuento
t ttotal
t l
Enterobacterias
Hongos y levaduras
Salmonella
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Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

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Mtodos rpidos aplicados a Indicadores

microbiolgicos
Sembradores en espiral y lectores automticos de colonias
Deposicin
p
automtica de la
muestra lquida en la superficie
de un placa rotatoria de agar

Estandarizacin
Eliminacin de diluciones
Lectura automtica
Ahorro de tiempo
Ahorro
Trazabilidad

Lectores
automticos de
colonias
19

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Mtodos rpidos aplicados a Indicadores

microbiolgicos
SISTEMA SimPlate: Biocontrol
. Fcil de leer
Consistente y reproducible
Rpido
Fcil
F il de
d preparar
Menos interferencia
Amplio rango de conteo
Tecnologa
g innovadora

Placa de p
plstico circular de 84 pocillos
p
Lectura por fluorescencia

Recuento total

El nmero de positivos se convierten en

valores
l
NMP

Coliformes/E.coli
Mohos y levaduras
Campylobacter

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Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Mtodos rpidos aplicados a Indicadores

microbiolgicos
g
SISTEMAS BASADOS EN ATP
Econmico
Rpido
Utilizacin en el entorno lcteo: esterilidad comercial
Utilizacin
Ms utilizado en control de limpieza y desinfeccin

Mide niveles de ATP

Lo relaciona con niveles de
contaminacin

21

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Patgenos

Ausencia/presencia

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Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Mtodos rpidos aplicados a la deteccin de

Patgenos
g
PROTOCOLOS CORTOS
Salmonella:
Pre-enriquecimiento y placa

SESAME (BIOSER)

Manuales

IBISA ((AES))

Medios cromognicos o semislidos

Validaciones internacionales
Econmicos
E
i

SMS (AES)
SALMONELLA PRECIS (OXOID)
RAPID SALMONELLA (BIORAD)
Listeria Monocytogenes:

Salmonella
Listeria spp
Listeria monocytogenes

ALOA ONE DAY (AES)

LISTERIA PRECIS (OXOID)
RAPID LMONO (BIORAD)
COMPASS LISTERIA (BIORAD)
CHROMOID LMONO (BIOMEREIUX)

23

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

24

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

25

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

26

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Mtodos rpidos aplicados a la deteccin de

Patgenos
g
SISTEMAS BASADOS EN PRUEBAS ELISA:

27

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Mtodos rpidos aplicados a la deteccin de

Patgenos
g
SISTEMAS BASADOS EN PRUEBAS ELISA
Si
Sistema
VIDAS (bi
(bioMerieux)
M i
)
Salmonella
Listeria
Li t i spp/Listeria
/Li t i
monocytogenes

Equipo automatizado

Campylobacter
py
spp
pp

Tecnologa ELFA
(elisa+fluorescecia) e
inmunoconcentracin

E.coli O157:H7

Resultados en 16-24 horas

Toxina Staph aureus

Validaciones internacionales
Lectura automtica, no calibracin,
no interpretacin
Procesado de muestras: 12-30
simultneamente cada 45 minutos

28

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Mtodos rpidos aplicados a la deteccin de

Patgenos
g

29

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Mtodos rpidos aplicados a la deteccin de

Patgenos
g
SISTEMAS BASADOS EN ELISA
Sistema TECRA (Biotrace)
Salmonella
Listeria spp
Campylobacter spp

Manual
Desarrollo
Desarrollo de color
Resultados : 1-2 das

Validaciones internacionales
Posibilidad de realizarlo
automticamente con el UNIQUE
PLUS

30

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Mtodos rpidos aplicados a la deteccin de

Patgenos
g
SISTEMAS BASADOS EN ELISA
Sistema TRANSIA
(Biocontrol)
Salmonella
Listeria Monocytogenes
Listeria spp

Automtico
Manejo de elevados volmenes
Procesado de muestras: 93
muestras simultneamente
Resultados rpidos: 1-2 das
Validaciones internacionales
31

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Mtodos rpidos aplicados a la deteccin de

Patgenos
g
SISTEMAS BASADOS EN ELISA
L
Lateral
l fl
flow
Rapid test (Oxoid)
VIP (BioControl)
RayAl (Rayal Ltd)
REVEAL (Neogen)
Rapidcheck (Bioser)

Manual
La
L muestra
t difunde
dif d por
capilaridad hacia la zona de Ac
Lectura habitual p
por una lnea
de color
Validaciones internacionales

32

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Mtodos rpidos aplicados a la deteccin de

Patgenos
g
SISTEMAS BASADOS EN PCR

33

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Mtodos rpidos aplicados a la deteccin de

Patgenos
g

34

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Mtodos rpidos aplicados a la deteccin de

Patgenos
g
SISTEMAS BASADOS EN Real Time PCR (BAX System: Oxoid)

Procotolos diferentes segn

matriz
Validaciones internacionales
Salmonella spp
Listeria spp
Listeria Monocytogenes

Resultados
R
lt d en 24-33
24 33 h
horas
Sonda Sybr Green

Campylobacter
E.coli O157:H7
Enterobacter sakazakii
Mohos y levaduras
S.aureus

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Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Mtodos rpidos aplicados a la deteccin de

Patgenos
g
SISTEMAS BASADOS EN REAL TIME PCR (Applied Biosystem):
2 tipos de kits: Taqman y Microseq
Validaciones internacionales

Salmonella spp

Resultados en 20-28 horas

Salmonella entrica
Listeria spp
Listeria Monocytogenes
E.coli O157:H7
Campylobacter jejuni
Cronobacter sakazakii
E. coli O157:H7
Listeria monocytogenes
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus

36

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Mtodos rpidos aplicados a la deteccin de

Patgenos
g
SISTEMAS BASADOS EN PCR (Adia food: AES)
Salmonella spp

Termociclador: Stratagen

Listeria spp

Resultados en 19-21 horas

Listeria Monocytogenes
E.coli O157:H7
E coli O157:H7 y Salmonella
E.

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Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Mtodos rpidos aplicados a la deteccin de

Patgenos
g
SISTEMAS BASADOS EN REAL TIME PCR (iQ-CHECK: Biorad)
Sondas: Molecular Beacons
Varios termocicladores:iCycler iQ, chrom 4,
Varios
iQ 5 y miniOpticon.
En algunos software de interpretacin de
resultados
lt d
Validacin 16140

Salmonella spp
y g
Listeria Monocytogenes
Listeria spp
Campylobacter
E.coli 0157:H7
38

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Mtodos rpidos aplicados a la deteccin de

Patgenos
g
SISTEMAS BASADOS EN REAL TIME PCR (Assurance GDS:
Biocontrol)
Salmonella
Listeria spp
Listeria monocytogenes
E.coli O157:h7
Shiga
Shiga Toxin
To in

Combina concentracin de muestra

y deteccin
d t
i de
d DNA
Termociclador:Assurance GDS
Rotor-Gene.

39

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

40

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

41

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Mtodos rpidos aplicados a la deteccin de

Patgenos
g
SISTEMAS DE DETECCIN CON FAGOS
Salmonella
E.coli 0157:H7

Deteccin rpida y
automtica de patgenos
mediante FAGOS ligada
g
a
fluorescencia.
Salmonella

+
42

Deteccin
D t
i rpida
id y
manual de patgenos
mediante FAGOS (lateral
flo )
flow)
Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Food & envt.

225 ml of BPW +
supplement (green)

41.5 +/- 1 C
18-24 h

Heat & Go 5 min*

min
*Except for poultry & egg products

VIDAS UP Salmonella
48 min
43

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Identificacin

44

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

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Mtodos rpidos aplicados a la identificacin de

microorganismos
g
IDENTIFICACIN CON SISTEMAS MINIATURIZADOS
Manual
Miniaturizacin de pruebas bioqumicas
Diferentes formatos: galeras, tubos de plstico,

API: bioMerieux
BBL
BBL Enterotube: BD
BBL Crystal: BD
RapID
RapID System: REMEL

45

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Mtodos rpidos aplicados a la identificacin de

microorganismos
g
SISTEMAS AUTOMTICOS DE IDENTIFICACIN
Fenotpica:
VITEK: bioMerieux
BIOLOG: AES
PHOENIX: BD
Resultados a partir de 4 horas
Combinan reacciones enzimticas y
bioqumicas

Genotpica:
MICROSEQ:
C OS Q ABI
46

Secuenciacin del
ARN 16 S
Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Mtodos rpidos aplicados a la identificacin de

microorganismos
CLASIFICACIN FILOGENTICA
Family

VITEK, API, BIOLOG, PHOENIX

Genus

Species

Subspecies Strain

DNA sequencing
MicroSeq

16S rDNA sequencing

ARDRA

Riboprinter

Riboprinting
tRNA PCR
tRNA-PCR
ITS-PCR

BioRad

PFGE, LFRFA, RLFP

Multilocus Isozyme
Whole cell protein profiling

ABI

AFLP
RAPD APPCR

Diversilab
G
Genetic
ti Differences:
Diff
Technique Discrimination:

47

rep-PCR
M
More

F
Fewer

Low

High

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Mtodos rpidos aplicados a la identificacin de

microorganismos
Genera huellas genticas nicas y reproducibles para cada
una de las muestras
13 muestras en 4 horas

1. Extraccin de ADN: Extraccin de ADN a partir de cultivos aislados.

2. Amplificacin mediante rep-PCR: Amplificacin de muestras con la tcnica rep-PCR y los
correspondientes kits de identificacin gentica DiversiLab (DiversiLab DNA Fingerprinting kits).
3. Deteccin: Separacin de fragmentos mediante electroforesis de microfluidos en chip (DNA
LabChip Kits).
4. Anlisis de datos: Anlisis de los datos en tiempo real, con informes a los que se puede
acceder a travs de un sitio web individual y seguro.

48

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Mtodos rpidos aplicados a la

identificacin de microorganismos
ESPECTROMETRA DE MASAS

Tcnica analtica para determinar la composicin elemental de

una muestra

El principio de MS consiste en la ionizacin de compuestos

qumicos p
q
para g
generar molculas cargadas
g
y medir su relacin
masa/carga (m/r)

MALDI-TOF
MALDI
TOF (Matrix
(M t i Assisted
A i t d Laser
L
Desorption
D
ti / Ionisation
I i ti Time of Flight), es un tipo de espectrometra de masas que
permite el screening de protenas directamente a partir de
bacterias intactas
Ionization
Mass
Ion
InletDetector
Analyzer
System
System

Sample
Under Vacuum
49

Data
Analysis
S
System

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time

Of Flight.
Flight MALDI is the Ionization System-TOF is
the Mass Analyzer system.

Una muestra en una solucin matriz absorbe energa de un haz lser. El resultados
es una ionizacin de la muestra.

Todos los iones son acelerados a la misma energa cintica, entran en el tubo y
son separados de acuerdo con su masa

Deteccin al final del tubo

50

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Mtodos rpidos aplicados a la

identificacin de microorganismos
ESPECTROMETRA DE MASAS

3775
3

<<C:\Dokumente und Einstellungen\m.erhard\Eigene Dateien\AnagnosTec-dc\Zwischenablage\Dokument Banner.txt>> Spec [BP = 3

5000

7000

10939
11000

11572

11
1906

10226
1

10347
9000

10
0608

9330

10
0
3000

9994

7980

20

8450
8

30

7863

40

6837
7092
7367
7

50

5931

5015

60

3581

% Intensity

70

9654

80

8744

8074

90

9453

1648.1

7075

100

13000

Mass (m/z)

51

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Mtodos rpidos aplicados a la

identificacin de microorganismos
ESPECTROMETRA DE MASAS
Fungi, yeast and mycobacteria:
On-target extraction
addition of
1.0 L matrix solution
di t
direct

solvent evaporation
at room temperature
Target slide

No seleccin previa de la colonia

Identificacin en solo 2
minutos
automated
MS analysis

52

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Mtodos rpidos aplicados a la

identificacin de microorganismos
VITEK MS RUO:
bioMerieux
Maldi Biotyper: Bruker

Pow e r

53

Ionis ing

V a cuum

N eg ative

Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos

MUCHAS
GRACIAS POR
SU ATENCIN

Ana Mara Fuertes Barrio

ana-maria.fuertes@biomerieux.com

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Mtodos rpidos para el control microbiolgico de alimentos