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mobilis)
BUCARAMANGA
UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA
QUMICA
2004
mobilis)
BUCARAMANGA
UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA
QUMICA
2004
AGRADECIMIENTOS
Dedicatoria
Agradezco a Dios , por darme la oportunidad de
existir y realizarme como persona.
A mis padres por brindarme su apoyo,
comprensin
y paciencia a lo largo de estos aos
y a quien les debo todo lo que soy.
Gracias a todos por brindarme
La oportunidad de ser y por haber aportado su granito
de arena
para lograr la meta propuesta.
TABLA DE CONTENIDO
Pg.
INTRODUCCIN
1.
1.1
LA YUCA
La yuca amarga
10
12
14
1.2
15
EL ALMIDN
1.2.1 Historia
15
17
19
Amilosa
19
Amilopectina
20
1.3
HIDRLISIS
22
22
23
1.4
HONGOS
26
27
27
Clasificacin taxonmica
28
30
1.5
30
FERMENTACIN
32
34
35
36
1.6
37
1.6.1 Bacterias
38
39
39
Antecedentes
40
41
1.7
Zymomonas mobilis
42
ETANOL
43
43
1.7.2 Usos
44
45
2.
METODOLOGA
47
2.1
47
2.2
HIDRLISIS
48
48
48
Medio de cultivo
48
48
48
49
50
50
2.3
52
FERMENTACIN
52
52
Medio de cultivo
53
53
53
Curva estndar
54
54
55
55
3.
59
3.1
59
3.2
3.3
60
62
62
65
Grfica residual
66
66
3.4
73
3.6
72
74
75
75
78
% conversin experimental
Grfica Residual
78
79
CONCLUSIONES
85
RECOMENDACIONES
87
BIBLIOGRAFA
88
ANEXOS
92
10
LISTA DE TABLAS
Pg
Tabla 1
Tabla 2
10
Tabla 3
12
Tabla 4
13
Tabla 5
17
Tabla 6
18
Tabla 7
Tabla 8
Tabla 9
38
44
45
51
55
Aspergillus niger
59
11
61
63
64
64
64
67
68
68
68
71
Zymomonas mobilis
72
73
74
75
77
77
77
79
80
80
81
83
12
LISTA DE FIGURAS
Pg
Fig. 1
21
Fig. 2
21
Fig. 3
28
Fig. 4
29
Fig. 5
30
Fig. 6
Fig. 7
Fig. 8
46
Fig. 9
47
57
58
13
LISTA DE GRAFICAS
Pg
59
65
66
69
69
70
70
72
78
79
de
la
superficie
81
de
respuesta
de
fermentacin
la
82
82
83
14
LISTA DE ANEXOS
Pg.
ANEXO A PORCENTAJE DE CONVERSIN DE ALMIDN A
GLUCOSA
93
94
97
98
ANEXO E
101
ANEXO F
102
15
RESUMEN
TITULO*:
OBTENCIN DE ETANOL A PARTIR DE ALMIDN YUCA VARIEDAD CHILE EN UN
PROCESO DE 2 ETAPAS: HIDRLISIS (Aspergillus niger) - FERMENTACION
(Zymomonas mobilis)
Landazbal Delgado Paola, Carreo de Arango Mariela** y Molina Velasco Daniel R.
Palabras claves: Aspergillus niger, Almidn, Hidrlisis enzimtica, Fermentacin, Zymomonas
mobilis, diseo experimental, superficie de respuesta.
La yuca es uno de los cultivos no convencionales ms prometedores para la obtencin de
etanol en nuestro pas, debido a su alto porcentaje de rendimiento ya que contiene de
hidratos de carbono fcilmente fermentables.
En la actualidad, los procesos ms rentables para la obtencin de etanol a partir de almidn
son aquellos que realizan una hidrlisis previa para transformarlo a glucosa y,
posteriormente, convertirla a etanol mediante una fermentacin con bacterias.
Este trabajo fue desarrollado en dos etapas: La primera etapa, hidrlisis se llev a cabo con
el hongo Aspergillus niger, ya que es uno de los mejores productores de amilasas, enzimas
necesarias para la hidrlisis del almidn, y la segunda etapa, de fermentacin en la cual se
utiliz la bacteria gram negativa, Zymomonas mobilis pues esta presentaba mejores
resultados que la levadura.
En la etapa de hidrlisis se determinaron las variables que influyen en el porcentaje de
conversin de almidn de yuca a glucosa, utilizando el diseo experimental 33 cuyas variables
fueron la concentracin de almidn, temperatura y pH. Se determin que la concentracin
de almidn y pH, bajo las condiciones de trabajo son las que ejercen mayor influencia en el
porcentaje de conversin de almidn a glucosa. Con el propsito de encontrar las mejores
condiciones, se realiz una superficie de respuesta teniendo como variable de respuesta el
porcentaje de conversin de almidn de yuca a glucosa.
En la etapa de fermentacin se determinaron las variables que influyen en el porcentaje de
rendimiento de etanol, utilizando el diseo experimental 33 cuyas variables fueron la
concentracin de glucosa, temperatura y pH. Se observ que la concentracin de glucosa y
pH, bajo las condiciones de trabajo son las que presentaban mayor influencia en el
porcentaje de rendimiento del etanol.
*Proyecto de grado
**Facultad de Ciencias, Escuela de Biologa, Directora: Mariela Carreo de Arango, Msc en
Microbiologia
16
SUMMARY
TITLE *:
ETHANOL OBTAINING From STARCH YUCCA CHILE VARIETY IN A PROCESS OF 2
STAGES:
HYDROLYSIS (Aspergillus niger) - FERMENTATION (Zymomonas
mobilis)
Landazbal Delgado Paola, Carreo de Arango Mariela **y Molina Velasco Daniel R.,
Key words: Aspergillus niger, Starch, enzymatic Hydrolysis, Fermentation, Zymomonas
mobilis, experimental design, surface of answer.
The yucca is one of the more promising non conventional cultures for the ethanol obtaining
in our country, due to its high percentage of yield since it contains easily fermentables
carbon hydrates. At the present time, the most profitable processes for the ethanol
obtaining from starch, are those that make a previous hydrolysis to transform it to glucose
and, later, to turn it to ethanol by means of a fermentation with bacteria.
This work was developed in two stages: The first stage, Hydrolysis was carried out with the
fungus Aspergillus niger, since this is one of the best amylase producers, necessary enzymes
for hydrolysis of the starch, and the second stage, fermentation in which the gramnnegative
bacterium Zymomonas mobilis was used, then this presented better results than the yeast.
In the hydrolysis stage the variables were determined that influence in the percentage of
starch conversion of yucca to glucose, using the experimental design 33 whose variables
were the concentration of starch, Temperature and pH. It was determined that the starch
concentration and pH, under the conditions of work are those that exert greater influence in
the percentage of starch conversion to glucose. In order to find the best conditions, made
an answer surface having like answer variable the percentage of starch of yucca to glucose
conversion.
In the fermentation stage the variables were determined that influence in the percentage of
ethanol yield, using the experimental design 33 whose variables were the concentration of
glucose, Temperature and pH. It was observed that the glucose concentration and pH,
under the conditions of work are those that presented greater influence in the percentage of
yield of the ethanol.
___________________
*Project of degree
** Sciences Faculty, School of Biology, Director:
Microbiology
17
Msc in
INTRODUCCIN
La biotecnologa es un rea que ha ganado terreno actualmente en el
desarrollo industrial; causando gran repercusin en medicina, agricultura,
suministro energtico y produccin de alimentos entre otras. Gracias a esto
se ha logrado avanzar en puntos como el ahorro de energa, eliminacin de
residuos contaminantes, disminucin de precios, sustituir productos y aditivos
en la alimentacin humana y animal.
El alcohol etlico es un producto de consumo masivo en el pas y su
produccin actual no logra satisfacer la demanda, por lo tanto es necesario
importarlo.
Adems
de
principios
txicos:
los
glucociangenos
linamarina
glutamato
monosdico,
encapsuladores
de
fragancia
entre
otras.(MONTALDO, 1996)
El principal objetivo de la presente investigacin es el aprovechamiento de un
recurso agrcola, como lo es el almidn de yuca, ya que es una fuente
energtica importante en la produccin de etanol. El bioproceso se desarrolla
mediante monocultivo con Aspergillus niger y Zymomonas mobilis quienes
son los encargados de realizar la hidrlisis y fermentacin respectivamente
del hidrolizado a alcohol.
1.1
LA YUCA
debi
ocurrir
simultneamente
en
varios
lugares.(VILLA,1996;
DOMNGUEZ, 1996)
La distribucin de la yuca a otros continentes se inici a partir del
descubrimiento de Amrica. Los portugueses la llevaron desde Brasil a las
costas occidentales de frica en el siglo XI, a finales del siglo XVIII se
introdujo a Madagascar y luego por la costa oriental, lo cual explica la amplia
dispersin de esta especie en el continente africano. Al sureste asitico se
llev a principios del siglo XVII.(DOMNGUEZ, 1996)
Hasta hace pocos aos este cultivo estuvo marginado de la investigacin; sin
embargo, su reconocida importancia tanto en alimentacin humana y animal
como en procesos industriales (produccin de almidones, alcohol, etc.) ha
generado la necesidad de adoptar o implementar estrategias de estudio e
investigacin que han permitido incrementar los rendimientos de manera
considerable, mejorar las tcnicas de cultivo, ampliacin de su uso
aumentando su beneficio social.(VILLA,1996)
Existen tres enfermedades que afectan notoriamente el cultivo de yuca las
cuales son: el aublo bacteriano (en hojas y tallos), las pudriciones de la raz
y el virus del mosaico africano (solo en Africa). Varios insectos chupadores
(caro verde, piojo harinoso, mosca blanca) y algunos fitfagos (gusano
cachn) atacan las hojas y un piojo subterrneo daan a veces las races
Espermatophyta
Subdivisin:
Angiospermae
Clase:
Dicotiledoneae
Subclase:
Archiclamydea
Orden:
Geranielaes o Euphorbiales
Familia:
Euphorbiaceae
Subfamilia:
Crotonidae
Tribu:
Manihoteae
Genero
Manihot
Especie
Esculenta Crantz
trpico despus del arroz, maz y caa de azcar; en esta misma zona su
demanda como fuente de energa bsica ha crecido en los ltimos aos, por
su alto contenido de carbohidratos, debido a esto, para 500 millones de
personas que viven en los trpicos es la ms importante de las races y
tubrculos. La produccin diaria de caloras por hectrea es mucho ms alta
que cualquier cultivo bsico. En la actualidad se cultiva en ms de 80 pases,
sin embargo 2/3 de la produccin mundial se alcanza en slo 5 pases ellos
son: Brasil, Indonesia, Zaire, Nigeria e India. (DOMNGUEZ,1996)
1.1.1.1 La yuca amarga: La yuca amarga recibe este nombre debido a su
contenido de cido cianhdrico libre y de cianoglucsidos. La yuca amarga
posee aproximadamente 30% (p/p) de almidn y un contenido de humedad
del 53%.
PARMETRO
ALMIDN
% HUMEDAD
8,82
74,58
58,05
% MATERIA SECA
91,38
25,42
41,95
% ALMIDON
80,6
% CENIZAS
0,235
1,84
1,79
% EXTRACTO ETREO
0,31
0,29
0,36
% PROTEINAS
1,15
10,4
3,86
% FIBRA CRUDA
0,37
5,85
2,45
CIANURO (mg/Kg)
524,8
67,57
NITRITOS (mg/Kg)
11,87
8,58
NITRATOS (mg/Kg)
32,1
312,8
194,81
HIERRO (mg/Kg)
8,95
29,8
13,25
POTASIO (g/Kg)
0,183
1,74
5,21
1.1.2
Aunque la yuca
tropicales
que
ms
absorbe
nutrientes
en
el
suelo:
(DOMNGUEZ,1996)
Tabla 2. Absorcin de nutrientes del suelo
CULTIVO
PRODUCCIN N (Kg)
P(Kg)
K (Kg)
Mg (Kg)
(6 Meses)
YUCA
18,6 ton/ha
87
37,9
117
35,1
PALMA
18 ton/ha
61
9,9
84
13,6
CAUCHO
1,13 ton/ha
2,0
11
2,3
MAIZ
3,4 ton/ha
82
20,7
69,2
14,7
ACEITERA
actualmente en operacin una planta que usa yuca como fuente de biomasa.
Este inters se ha generado tambin en pases como Colombia, Tailandia y
Australia. La yuca es una posibilidad bastante atractiva ya que puede ser
sembrada en reas marginales para la agricultura, lo que ayudara al no
desplazamiento de otros cultivos como por ejemplo la caa de azcar.
(DOMNGUEZ, 1996)
De la yuca se aprovecha el almidn, que tiene importancia como cola, para
hacer muclago, para obtener azcares, alcohol y jarabes.
A nivel industrial, se emplea en gran cantidad de productos procesados
siendo uno de los ms importantes el almidn.
11
1.1.4
12
PAISES
PRODUCCIN
AREA
RENDIMIENTOS
1996
1996
1996
MILES DE TON
MILES DE Ha
TON/Ha
INDIA
5800
245
23,4
CHINA
3500
230
15,1
PARAGUAY
2600
178
14,6
TAILANDIA
17700
1315
13,9
BRASIL
26400
1876
12,9
INDONESIA
15800
1341
11,9
NIGERIA
34600
2889
10,7
TANZANIA
6000
645
10,3
GHANA
7000
540
10,0
COLOMBIA
1800
187
9,9
VIETNAM
2200
274
8,6
ZAIRE
18800
2225
8,3
UGANDA
2400
346
7,6
MADAGASCAR
2400
36
6,9
ANGOLA
1400
260
5,7
MOZAMBIQUE
4700
912
4,0
2587
11,9
47800
3712
13,1
TOTAL AFRICA
87600
9837
8,3
13
1.1.5
EVALUACION
rea
MUNICIPIO Sembrada
(Hectreas)
Aratoca
75
AO 2001
Produccin
Obtenida
(Toneladas)
490
PRONOSTICO AO 2002
rea
a
Produccin a Obtener
Sembrar
(Hectreas)
(Toneladas)
70
490
Barichara
160
1120
180
1260
Charal
130
2600
200
4400
Coromoro
150
840
100
560
Curiti
220
1760
220
2640
Encino
115
900
115
900
Mogotes
190
1900
200
2000
Ocamonte
80
1050
80
1050
Onzaga
200
1125
100
1520
Pinchote
100
1200
100
1500
San Gil
270
3780
270
3780
San Joaquin 63
630
63
630
800
100
800
14
1.2 EL ALMIDON
1.2.1 Historia
Exactamente no se sabe desde qu poca es conocido el almidn.
Los
griegos los llamaron Anylon quizs debido a que al contrario de lo que sucede
con la harina, se obtena no por el molino, sino por el lavado. Segn rastros
arqueolgicos hallados en las tumbas de los reyes Egipcios, presentan
muestras de pegantes a base de almidn, los cuales datan aproximadamente
del ao 3500 A.C.
En la industria del almidn se conoce muy poco acerca de su aparicin. Se
admite probablemente que los Holandeses en el siglo XVI haban fabricado
almidn a gran escala, pero usando como materia prima el trigo; el desarrollo
debi efectuarse muy lentamente al igual que en otros pases. . (LINDEN et
all, 1996)
Despus de la celulosa, el almidn es la sustancia orgnica ms ampliamente
distribuida en la naturaleza; la celulosa forma parte del armazn de las
plantas, mientras que el almidn representa su reserva de carbohidratos,
transformndolos por hidrlisis en glucosa la cual es transformada por medio
de la savia, aprovechando su solubilidad. En las plantas existen tres clases
de almidn:
Almidn de asimilacin, transitorio y de reserva. El Almidn de asimilacin es
aquel que ha de servir en la nutricin de la planta y el cual se encuentra en
forma de almidn soluble.
15
16
PROPIEDAD
ESPECIFICACION
4 - 35
17 - 20
80 83
52 65
Alta
Clara
Media
Inspido
17,6
LUZ SOLAR
Es insoluble en agua,
17
Ejemplo: la
papa.
Ejemplo: la yuca.
Ejemplo: el arroz.
En la tabla 6 podemos observar el % de almidn presente en diferentes
productos agrcolas.
Tabla 6 Contenido de almidn en productos agrcolas
CLASE DE PLANTA
EN
ALMIDON
Papa
8 29
Patatas
12 - 59
Maz
65 - 78
Trigo
55 - 78
Arroz
50 89
Cebada
38 42
Centeno
54 69
Avena
30 40
Frjol
38
Yuca
38 80
18
PESO
DE
menos soluble y que contiene un ster fosfrico, el cual es un ster amilofosfrico. Es difcilmente atacada por enzimas, necesitndose para ello un
calentamiento. Con dicho calentamiento forma una pasta y con una solucin
alcohlica de yodo-yoduro da una coloracin violeta.
Amilosa
19
20
C H 2O H
H
O H
O H
C H 2O H
O H
O H
C H 2O H
O H
O H
O H
O H
CH2O
o
H
OH
OH
H
O
CH2O
o
H
OH
OH
H
O
CH2OH
OH
OH
OH
H
O
H
H
OH
C H2OH
H
OH
H
H
CH2O H
CH2O
o
H
OH
H
H
OH
H
O
CH2O
o
H
OH
H
H
O
C H2OH
OH
H
OH
OH
OH
H
O
H
H
OH
C H2OH
H
OH
H
H
OH
CH2O H
H
H
OH
CH2O H
H
H
O
H
OH
21
CH2O
H
H
O
O
H
H
OH
CH2OH
H
H
O
H
OH
CH2OH
H
H
O
H
OH
CH2O
H
H
O
H
OH
1.3
HIDRLISIS
Los
22
en
el
jarabe
es
muy
difcil
su
separacin
por
filtracin.(FERMENA, 2000)
1.3.2 Hidrlisis enzimtica (sacarificacin de materiales amilceos):
La sacarificacin es el proceso que tiene por objeto la transformacin del
almidn de las materias primas amilceas en azcares. Dicha transformacin
es catalizada por enzimas.
23
Las amilasas actan muy lentamente sobre el almidn, por lo que debe ser
sometido a un proceso de coccin para obtener una buena dispersin y
rompimiento de los granos de almidn llevndose a cabo una hidrlisis
rpida. La accin de la amilasas sobre el almidn depende del origen del
mismo; ya que el almidn consta de una mezcla de 75 80% de
amilopectina y el resto de amilosa.
24
25
1.4
HONGOS
Los hongos son organismos vivos, que poseen un cuerpo que puede ser
filamentoso multicelular o no filamentoso unicelular. Antiguamente Los
hongos figuraban en como una divisin del reino Plantas (Plantae). Se
pensaba que eran plantas carentes de tallos y de hojas que, en el trascurso
de su transformacin en organismos capaces de absorber su alimento haban
perdido la clorofila, y con ello, su capacidad para realizar la fotosntesis.
La mayora de los hongos se reproducen por esporas, las cuales son
diminutas partculas de protoplasma rodeadas de pared celular.
Las esporas
(Basidiomycota)
Deuteromicetes
(Deuteromycota),
26
Plasmodioforomicetes
(Plasmodiophoromycota),
1.4.1
Aspergillus Nger
27
Eucharya
SUBDOMINIO
Fungi
DIVISIN
Eumycota
SUBDIVISIN
Deuteromycotina
FAMILIA
Moniliaceae
ORDEN
Moniliales
GNERO
Aspergillus
ESPECIE
niger
28
m de
Esterigmatas
(fialides):
Clulas
formadoras
de
conidias
Se
encuentran en dos series (biseriadas). Las primeras son largas (30 m por
6m) de color pardo y pueden ser tabicadas. Las segundas son cortas (8m
por 3 m) y brotan conidias.
fuertemente coloreadas.
Figura 4. Caractersticas morfolgicas del Aspergillus niger
29
1.5
FERMENTACIN
30
(bacterias,
van
bacilos,
acompaadas
de
levaduras
un
mohos),
desprendimiento
que
gaseoso
produccin de energa.
Actualmente, el trmino fermentacin tiene varias interpretaciones:
Cuando
los
microorganismos fermentan
los
componentes
de
los
31
32
Las primeras
33
34
35
especficamente
sobre
el
crecimiento
desarrollo
de
los
36
utilizado,
aunque
la
Zymomonas
mobilis
es
un
Saccharomyces cerevisiae
Los nutrientes o las sustancias asimilables por los microorganismos, que
contribuyen a su crecimiento y desarrollo, ejercen tambin su influencia en el
proceso de fermentacin, en el rendimiento del alcohol, en la eficiencia y la
velocidad.
37
Comparacin
respecto a
Rendimiento
Saccharomyces
cerevisiae
Zymomona
mobilis
88%
94%
Cantidad biomasa
Mayor
Menor
de Mayor
Menor
Cantidad
subproductos
Concentraciones
de Soporta
alcohol
menos Soporta
concentraciones
mayores
concentraciones
1.6.1 BACTERIAS
Las bacterias son microorganismos unicelulares, que no contienen clorofila;
presentan mltiples formas, siendo las ms comunes: la esferoidal, cilndrica
o en forma de bastn y la espiral. La multiplicacin bacteriana tiene lugar
por divisin; las formas esfricas denominadas cocos, se dividen siguiendo
cualquier plano; mientras que las que tienen forma de bastn lo hacen
transversalmente.
38
No alteran los
alimentos.
b. Hetertrofos: son aquellas que necesitan materiales orgnicos como
fuente necesaria de carbono y energa. En este grupo estn los organismos
patgenos o agentes causantes de enfermedades.
1.6.1.1 Composicin qumica de las bacterias
Las bacterias contienen una gran proporcin de agua del 75 85 %.
Datos de bacterias deshidratadas:
Carbono
50% aproximadamente
Nitrgeno
8 15 %
Cenizas
2 15%
39
1.6.2.1 Antecedentes
Desde que fue aislada como contaminante durante la produccin de sidra en
1912, Zymomonas mobilis ha sido objeto de numerosos estudios.
Su
40
Anaerbio y microaeroflico.
41
Zymomona mobilis.
La produccin de alcohol a gran escala requiere de microorganismos con
ciertas caractersticas:
Capacidad de metabolizar varios sustratos
Tasas de crecimiento y de produccin de etanol elevadas
Mxima eficiencia para la conversin del sustrato
Tolerancia a altas concentraciones de sustrato y de etanol
Tolerancia a altas temperaturas
Un microorganismo que reune todas estas caractersticas es la Zymomona
42
La proporcin de
lipdica,
que
es
el
valor
ms
elevado
descrito
para
un
en
la
estabilizacin
de
la
membrana
en
presencia
de
etanol.(LEVEAU et all,2000)
1.7
ETANOL
Propiedades Fisicoqumicas.
43
CONSTANTE
ETANOL
ABSOLUTO
ETANOL
95%
-112,3
78,4
Gravedad Especifica
0,785
1,3633
1,3651
0,0122
0,0141
22,3
22,8
Calor Especifico
0,581
0,618
24,9
204
328
1,35E-09
1.7.2 Usos
El etanol se emplea como disolvente, extractor y anticongelante. Sirve de
sustrato para la sntesis de otros compuestos orgnicos con funcin
disolvente o extractora, colorante, farmacutica, lubricante, detergente,
pesticida, plastificante y cosmtica entre otras.
44
Se oxida
RENDIMIENTOS
CAA DE AZUCAR
YUCA
Ton/Ha
80
30
Lit alcohol/ton
60
170
Tiempo de Cosecha
18 meses
12 meses
Lit alcohol/ao
3200
5000
5.800.000
2.000.000
110000
70000
30000
20000
3.300.000.000
1.400.000.000
Produccin
requerida
ton/ao
Extensin de terrenos
requerida (Ha)
Inversin requerida para
adecuar nuevas tierras
$/ha
Total $
En un
proceso qumico comn, el etileno derivado del petrleo o del gas natural se
45
A L M ID O N
H ID R O L IS IS
H ID R O L IS IS
Q U IM IC A
H ID R O L IS IS
B IO L O G IC A
F E R M E N T A C IO N
D E S T IL A C IO N
A L C O H O L E T IL IC O
46
V IN A Z A S
2. METODOLOGA
2.1
pasos; figura 9
Figura 9. Procedimiento para la extraccin de almidn de yuca variedad chile
YUC A
LAVAD O
D E S C O R T IZ A D O
R ALLAD O
T A M IZ A D O
S E D IM E N T A C IO N
5 ,9 m L D E A G U A / g A L M ID O N
D IA M E T R O T A M IZ 0 ,1 m m
T IE M P O : 1 2 H O R A S
T = 4 0 C E N E S T U F A
t = 24 H OR AS
SEC AD O
47
2.2
2.2.1
HIDRLISIS
Microorganismo empleado en la hidrlisis
48
numeral
2.2.1.2
con
una
concentracin
de
almidn
de
4%p/v.
2.2.2
49
Esta
10,.
Estos niveles,
V-m
M
ECUACIN 1
Donde:
X = Variable normalizada
V = variable sin normalizar
m = Valor 0,5 de la variable sin normalizar
M = diferencia entre el valor +1 y el valor 0,5 de la variable sin normalizar.
50
Tabla 10. Valores para las variables normalizadas para los experimentos de
hidrlisis del almidn de yuca
NIVEL
VARIABLE
-0,20
0,5
1,20
3,58
6,4
25
30
35
4,89
4,5
5,0
5,5
5,6
CONCENTRACIN
DE ALMIDN
(% P/V )
TEMPERATURA
(C)
pH
o variable dependiente el % de
el
programa
de
computacin
STATGRAPHICS
PLUS
4.0
51
Estos
52
53
2.3.2.
Zymomonas mobilis/mL.
Los
bioreactores
fueron
incubados
temperatura.
54
bajo
condiciones
controladas
de
2.3.3.
Esta
NIVEL
VARIABLE
-0,20
0,5
1,20
139,6
100
150
200
210,3
30
34
38
4,79
4,0
5,0
6,0
6,20
CONCENTRACION
DE GLUCOSA
(g/L )
TEMPERATURA
(C)
pH
55
o variable dependiente el % de
el
programa
de
computacin
STATGRAPHICS
PLUS
4.0
56
Estos
Incubar a 25, 30 y 35 C
segn indica cada
experimento
Identificacin microscpica y
Macroscpica del crecimiento
del hongo en los medios
Determinacin de azucares
Reductores, Glucosa y %
Almidn en el medio
57
Figura 11. Metodologa usada para la preparacin del medio para la fermentacin
Azcares producto de la
hidrlisis del almidn con el
A. niger
Identificacin microscpica y
macroscpica del crecimiento
de la bacteria en el medio.
Destilar el producto de la
fermentacin (etanol) a una
temperatura de 70C
58
TIEMPO
0
12
24
36
48
60
72
84
96
108
CANTIDAD DE
BIOMASA (g/50 mL)
50
100
TIEMPO (HORAS)
59
150
Est mtodo
DATOS
OBTENIDOS
EXPERIMENTALMENTE
EN
LA
el Aspergillus se
60
T
(C)
25
25
25
25
25
25
25
25
25
30
30
30
30
30
30
30
30
30
35
35
35
35
35
35
35
35
35
PH
Concent
Almidn
(g/L)
Glucosa
(g/L)
4,5
4,5
4,5
5,0
5,0
5,0
5,5
5,5
5,5
4,5
4,5
4,5
5,0
5,0
5,0
5,5
5,5
5,5
4,5
4,5
4,5
5,0
5,0
5,0
5,5
5,5
5,5
2
4
6
2
4
6
2
4
6
2
4
6
2
4
6
2
4
6
2
4
6
2
4
6
2
4
6
3,65
38,30
36,85
11,70
12,20
47,65
19,35
36,85
38,05
0,32
1,15
22,15
1,21
9,63
18,45
2,03
8,89
13,35
0,41
12,70
23,11
0,99
1,82
24,00
0,46
24,85
30,65
Azcares
Reductores Almidn
(g/L)
(%)
3,94
40,40
39,12
13,22
13,43
51,12
22,42
44,21
40,92
0,46
2,31
23,68
2,41
10,68
21,20
4,05
9,38
14,34
0,53
14,17
25,73
1,75
3,41
25,73
0,96
26,93
32,95
61
0,31
0,14
1,09
0,18
0,46
1,22
0,10
1,39
0,92
0,52
2,18
1,48
0,48
0,34
1,86
0,26
0,78
1,87
0,42
0,31
1,36
0,56
1,78
1,19
0,56
0,18
0,78
Cantidad
Biomasa
(g)
0,306
1,326
1,308
0,341
0,475
1,415
0,844
1,332
1,361
0,167
0,233
0,937
0,297
0,315
0,799
0,549
0,321
0,422
0,175
0,327
0,957
0,27
0,311
0,76
0,205
0,679
0,978
Modelo Obtenido:
% CONVERSIN: 36.8903 + 31.9139*C 118.81*T 40.9684*T*pH
42.3665*C*pH + 88.516*T^2 + 41.7998*pH^2 196.457*T^2*C*pH +
260.162*C^2*T*pH 341.725*C^2*T*pH^2 + 331.667*C*T^2*pH^2
(Ecuacin 3)
62
T
(C)
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
1
1
1
1
1
1
1
1
1
pH
0
0
0
0,5
0,5
0,5
1
1
1
0
0
0
0,5
0,5
0,5
1
1
1
0
0
0
0,5
0,5
0,5
1
1
1
Concentracin
almidn (%p/v)
0
0,5
1
0
0,5
1
0
0,5
1
0
0,5
1
0
0,5
1
0
0,5
1
0
0,5
1
0
0,5
1
0
0,5
1
% Conversin
16,44
86,26
55,33
52,70
27,48
71,55
87,16
83,00
57,13
1,42
2,58
33,26
5,45
21,68
27,70
9,14
20,01
20,05
1,85
28,60
34,69
4,44
4,09
36,04
2,07
55,97
46,02
63
Parmetro
Valor
Calculado
36,8903
31,9139
Error
Standard
5,03984
6,86557
Valor - P
7,31974
4,64839
0,0000
0,0000
-118,81
18,3553
-6,41276
0,0000
T * pH
-40,9684
12,4844
-3,28158
0,0021
C * pH
-42,3665
12,3497
-3,43057
0,0013
T2
88,516
17,227
5,1382
0,0000
PH2
41,7998
8,35316
5,00406
0,0000
T2 * C * pH
-196,457
116,853
-1,68124
0,1000
C2 * T * pH
260,162
115,929
2,24415
0,0300
C2 * T * pH2
-341,725
122,756
-2,78377
0,0080
C * T2 * pH2
331,677
122,995
2,69668
0,0100
CONSTANTE
C
Fuente
Modelo
Residual
Total
10
43
53
3259,36
174,803
---
18,65
Valor F
Valor F de Tablas (10/43)
F (95%)
F (99,9%)
3,87
3,54
Ecuacin 3
F (experimental)
18,65
64
R
81,2603
Error
13,2213
% Conversin Obtenida
99
79
59
39
19
-1
-4
16
36
56
76
% Conversin calculado
65
96
3.3.1.2 Grfica Residual. Los residuales nos indican la relacin entre las
variables independientes (pH, T y C. Alm) con la variable dependiente (%
conversin a glucosa). La grfica 3 muestra que los residuos para el modelo
matemtico (ecuacin 3) no estn relacionado con el nivel de la variable
dependiente, esto se deduce porque no se presenta una tendencia
sistemtica
Grafica 3. Residuales etapa de hidrlisis
RESIDUALES
Y exp - Y cal
3
2
1
0
-1
-2
-3
0
20
40
60
80
100
% Conversin Calculado
3.3.2
66
pH
0.5
0.5
1.0
1.0
0.5
1,20711
0.0
-0.207107
0.5
0.0
CONC
ALMIDN
(%p/v)
-0.207107
0.5
0.0
1.0
1,20711
0.5
1.0
0.5
0.5
0.0
%
CONVERSIN
49,2
27,475
87,165
57,135
61,07
66,98
55,33
70,74
27,475
16,445
67
Parmetro
Valor
Error
Valor - P
Calculado
Standard
CONSTANTE
18,3377
2,24785
8,15788
0,0000
74,6037
10,0527
7,42128
0,0000
C * pH
-229,885
17,8728
-12,8623
0,0000
C2
-32,8464
10,0281
-3,27543
0,0055
pH2
72,4813
3,71521
19,5093
0,0000
C2 * pH
159,208
17,7621
8,96336
0,0000
Fuente
Modelo
8537,09
1707,42
Residual 298,514
14
21,3224
Total
19
8835,61
80,08
Valor F
Ecuacin 4
2,96
7,92
(99,9%)
(experimental)
80,08
Error
96,62
4,61
68
% Conversin Obtenido
100
80
60
40
20
0
0
20
40
60
80
100
% Conversin Calculado
Grfica 5. Residuales etapa de hidrlisis.
RESIDUALES
Y exp - Ycal
2.7
1.7
0.7
-0.3
-1.3
-2.3
0
20
40
60
80
100
% Conversin Calculado
69
% Conversin
230
190
150
110
70
30
-10
-0.2
0.1
0.4
0.7
1.3
1.3
1
0.7
0.10.4
-0.2 Conc de
pH
Almidn
% p/v
pH
1.5
1.2
0.9
0.6
0.3
0
-0.3
-0.6
-0.9
-1.2
-1.5
Function
0.0
20.0
40.0
60.0
80.0
100.0
[Almidn] (g/L)
%p/v
En la grfica 6 se identifican las condiciones para una mxima conversin del
almidn de yuca.
70
Condiciones
% Conversin
% Error
pH
Calculado
4,07
3,99
96,3
99,71
4,0
4,42
4,61
92,6
99,04
6,5
4,52
4,94
95,2
98,71
3,5
6,1
4,14
91,8
98,49
8,1
71
3.4
Tiempo
(horas)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Concentracin de Bacterias
3.99E+08
4,26E+08
4,56E+08
4,86E+08
5,29E+08
6,16E+08
7,09E+08
7,52E+08
8,76E+08
9,19E+08
9,95E+08
8,56E+08
8,19E+08
CONCENTRACIN DE
BACTERIAS
TIEMPO (HORAS)
72
10
11
12
13
3.4.1
Pruebas Bioqumicas
Negativa
X
X
X
X
Dbil
Donde:
TSI: Triple azcar: Lactosa, glucosa, sacarosa con produccin de gas.
LIA: Lisina descarboxilasa
CIT: Citrato, consiste en un cambio de pH
UREA: Urea
NIT: Nitratos no reduce nitratos a nitritos
RM: Rojo de metilo
VP: Voger Proscawer (produccin de Acetil metil carbinol)
MAL: Malonato consiste en un cambio de pH
MOT: Movilidad
PPA: fenil alanina
CAT: Catalasa
OXI: Oxidasa
73
3.5
T
(C)
30
30
30
30
30
30
30
30
30
34
34
34
34
34
34
34
34
34
38
38
38
38
38
38
38
38
38
pH
4,0
5,0
6,0
4,0
5,0
6,0
4,0
5,0
6,0
4,0
5,0
6,0
4,0
5,0
6,0
4,0
5,0
6,0
4,0
5,0
6,0
4,0
5,0
6,0
4,0
5,0
6,0
C. GLUCOSA
INICIAL
(g/L)
100
100
100
150
150
150
200
200
200
100
100
100
150
150
150
200
200
200
100
100
100
150
150
150
200
200
200
C. GLUCOSA
FINAL
(g/L)
32,6
26,1
30,4
50,1
45,8
48,3
81,2
73,2
79,6
29,7
23,4
27,1
49,3
41,3
45,9
77,8
70,2
74,3
24,6
21,8
22,4
43,5
36,1
38,9
75,8
64,3
67,2
74
DENSIDAD
(g/mL)
0,8077
0,8078
0,8099
0,8091
0,8110
0,8101
0,8111
0,8115
0,8117
0,8061
0,8071
0,8080
0,8080
0,8101
0,8079
0,8000
0,8040
0,8011
0,8022
0,8040
0,8021
0,7999
0,8045
0,8067
0,7970
0,7979
0,7998
%
ETANOL
95,39
95,36
95,16
95,03
94,53
94,77
94,51
94,4
94,35
95,79
95,54
95,31
95,31
94,77
95,19
96,26
96,31
97,01
96,74
96,31
96,77
97,29
96,19
95,64
97,95
97,75
97,31
T
0.5
0
0
0.5
1
0
0.5
0
1
0.5
1
1
0.5
1
0
0.5
1
0.5
0.5
0
0.5
0
1
0
0
1
1
pH
1
1
0.5
0
0
0.5
0
1
0
0.5
1
0.5
0
1
0
0.5
0.5
1
0.5
0.5
1
0
0.5
1
0
0
1
C GLUCOSA
0
1
1
0
0
0
1
0
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
1
0.5
0
1
0.5
1
0.5
1
1
0
0.5
0
1
0
75
% RENDIMIENTO
45,075
30,05
39,42
51,69
59,015
42,295
51,965
34,39
62,785
59,065
52,560
70,220
52,665
53,050
39,450
57,31
61,805
46,465
54,055
40,895
44,220
35,010
62,270
29,945
37,48
57,84
52,505
76
Parmetro
CONSTANTE
C
T
pH
C * pH
T2
PH2
C2
C2 * pH
T * pH2
C * T * pH2
Valor
Calculado
36,4548
10,4844
37,8877
27,0975
-9,25069
-14,6347
-30,7068
-11,4836
4,76281
-4,56115
6,80748
Error
Standard
0,718312
2,16639
1,99315
2,15726
2,05842
1,8528
1,97668
1,9587
0,363163
1,64151
2,26053
Valor - P
50,7506
4,83955
19,0089
12,5611
-4,49408
-7,8987
-15,5345
-5,86287
13,1148
-2,77864
3,01146
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0001
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0081
0,0043
Fuente
Modelo
Residual
Total
10
43
53
596,235
2,54056
234,69
Valor F
Ecuacin 3
F (99.9%)
3,64
F (experimental)
234,69
Error
98,2007
1,59
77
En este caso el
% RENDIMIENTO EXPERIMENTAL
77
67
57
47
37
27
27
37
47
57
67
77
% RENDIMIENTO CALCULADO
78
RESIDUALES
Y exp - Y cal
4.4
2.4
0.4
-1.6
-3.6
29
39
49
59
69
79
% RENDIMIENTO CALCULADO
pH
0,5
0,5
1
1
0.5
1,20711
0
-0,207107
0.5
0
CONC GLUCOSA
(g/L)
-0,207107
0.5
0
1
1,20711
0.5
1
0,5
0,5
0
79
%
RENDIMIENTO
49,2
27,475
87,165
57,135
61,07
66,98
55,33
70,74
27,475
16,445
Con este modelo emprico, se obtuvieron las graficas 11, 12, 13 y 14 que
corresponden al % rendimiento calculado vs. % rendimiento obtenido, la de
residuales, la grfica de la superficie de respuesta y las curvas de nivel
respectivamente.
% RENDIMIENTO =16.445 + 11.9334*pH + 93.3225*C 336.395*pH*C
54.4375*C2 + 283.343*C2*pH + 58.7866*pH2 + 111.795*pH2*C
127.657*pH*C2
(ECUACIN 6)
Las tablas 31, 32 y 33 muestran el anlisis de regresin mltiple, el anlisis
de varianza y los coeficientes estadsticos para el modelo descrito por la
ecuacin 6 respectivamente.
Tabla 31. Anlisis de regresin mltiple para la etapa de Fermentacin
Parmetro
Error
Standard
1,00291
4,25499
4,25499
Valor - P
CONSTANTE
pH
C
Valor
Calculado
16,445
119,9334
93,3225
16,3973
2,80456
21,9585
0,0000
0,0171
0,0000
PH*C
-336,395
14,0407
-23,9585
0,0000
C2
C2*pH
pH2
pH2*C
pH2*C2
-54,4375
283,343
58,7866
111,795
-127,657
4,01164
12,6859
4,01164
12,6859
11,3466
-13,5699
22,3353
14,654
8,8125
-11,2507
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
0,0000
Fuente
Modelo
Residual
Total
8
11
80
1101,68
2,01166
547,65
Ecuacin 3
Valor F
Valor F de Tablas (8/11)
F (95%)
F (99,9%)
F (experimental)
Error
2,90
8,35
547,65
99,74
1,41
% RENDIMIENTO EXPERIMENTAL
100
80
60
40
20
0
0
20
40
60
80
% RENDIMIENTO CALCULADO
81
100
RESIDUALES
Y exp - Y cal
5.9
3.9
1.9
-0.1
-2.1
-4.1
0
20
40
60
80
100
% RENDIMIENTO CALCULADO
% Rendimiento Etanol
170
130
90
50
10
-30
-0.2
0.1
0.4
0.7
pH
82
1
0.7
0.4
0.1
1.3 -0.2
1.3
Concentracin de
glucosa
1.4
1.1
0.8
0.5
0.2
-0.1
-0.4
-0.7
-1
-1
-0.7
-0.4 -0.1
0.2
0.5
0.8
1.1
1.4
pH
Function
-30.0
-10.0
10.0
30.0
50.0
70.0
90.0
110.0
100
130.0
150.0
170.0
190.0
Condiciones
% Conversin
Error
pH
Conc. Glucosa
Experimental
Calculado
4,53
170,34
91,4
99,71
5,3
5,89
141,37
93,8
99,04
5,2
4,49
196,55
94,2
98,71
4,5
5,75
135,17
95,6
98,49
2,9
83
Por inspeccin directa de las lneas de nivel de la grfica 14, se observa que
para tener altos porcentajes de rendimiento (>95%) para el proceso de
fermentacin, se necesitan condiciones de pH en los intervalos desde 4,50
hasta 4,55 y desde 5,75 hasta 5,9 y de concentracin de glucosa en los
intervalos desde 135 g/L hasta 141g/L y desde 170 g/L hasta 197 g/L.
84
CONCLUSIONES
85
86
RECOMENDACIONES
87
BIBLIOGRAFIA
Aspergillus niger.
2002
88
2da ed.
Editorial ACRIBIA,
Mxico: Limusa
Ed. Acribia:
T.,
ESSER,
Saccharomyces,
K.
Ethanol
production
advantages an disadvantages.
Zymomonas and
by
Journal of Applied
89
almidn
de
papa
usando
simultneamente
Aspergillus nger y
Microbiologa industrial.
Los microorganismos de
Maracay,
90
NAKAMURA, Shoichiro.
MATLAB.
Traduccin
GARCIA,
Roberto
E.
Prentice
may
1995
p.79,80,81,82,83
SAMSON, R., HOPKSTRA, E.
Microbiologa.
Barcelona:
El cultivo de la Yuca.
91
Politcnico Colombiano.
92
ANEXO A
% conversion =
[ Glucosa ]
[ Alm] * 1.11
* 100
Donde:
[Glucosa] = Concentracin de glucosa en gramos por litro de solucin
[Alm] = Concentracin de almidn de yuca en gramos por litro de solucin
1.11= Factor de correlacin requerido para cuantificar el incremento de
slidos totales durante la hidrlisis.
93
.
ANEXO B
DETERMINACIN DE LOS AZCARES REDUCTORES
Los azcares reductores fueron determinados por duplicado en muestras de
los hidrolizados del almidn, utilizando el cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS).
Cada mezcla de reaccin consisti en 1.0 mL del hidrolizado del almidn y 1.0
mL de DNS. Se utiliz un espectrofotmetro de haz simple Spectroquant
NOVA 400. La cantidad de azcar reductor en cada hidrolizado se estim a
partir de su absorbancia en 540 nm y una curva estndar de glucosa.
Preparacin del reactivo DNS.
En un
94
Inmediatamente se ley su
GLUCOSA (ppm)
0,065
100
0,103
200
0,144
300
0,189
400
0,24
500
0,302
600
0,356
700
0,423
800
95
ABSORBANCIA A 540 nm
900
800
700
600
500
400
y = 1938,6x + 8,4754
R2 = 0,9915
300
200
100
0
0
0,1
0,2
0,3
GLUCOSA (ppm)
96
0,4
0,5
ANEXO C
DETERMINACIN DE GLUCOSA
REACTIVO
BLANCO
MUESTRA
ESTANDAR
Kit
Patrn (mL)
Muestra (mL)
Agua Destilada
2,0
2,0
2,0
0,02
0,02
0,02
97
ANEXO D
DETERMINACIN DEL ALMIDN EN EL MEDIO
La determinacin de almidn se hizo utilizando un espectrofotmetro de haz
simple Spectroquant NOVA 400 por el mtodo colorimtrico de Antrona
cido Sulfrico. Las absorbancias del complejo coloreado se ley a 630 nm
(HART, 1991).
Preparacin de las soluciones patrn de glucosa para la curva de
calibracin
Estas soluciones fueron preparadas de la misma manera que las utilizadas
para la determinacin de azucares reductores con el reactivo DNS. (ANEXO B)
Obtencin de los datos de la curva de calibracin de glucosa para el
mtodo colorimtrico de Antrona Acido sulfrico
Inicialmente para la extraccin de grasas y azcares presentes en la muestra,
se pesaron 2 g de muestra en un tubo de centrfuga, luego se aadieron 25
mL de una mezcla de ter etlico ter de petrleo (1:3). Seguidamente se
taparon y se agitaron enrgicamente, posteriormente se
descarto el sobrenadante.
centrifug y se
a la muestra desengrasada se le
98
5mL de solucin
% Glucosa = C * B * FD
A * P * 10
% Almidn = % Glucosa * 1.06
Donde:
A = Absorbancia de la solucin patrn
B = Absorbancia de la muestra
C = Concentracin patrn 0,125 mg/ 5 mL
P = Peso de la muestra (g)
FD = Factor de dilucin 800
1,06 = Factor estequiomtrico de la relacin glucosa - almidn
99
GLUCOSA [ppm]
0,033
0,064
10
0,133
20
0,197
30
0,355
50
0,4
0,35
ABSORBANCIA
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
y = 0,0071x - 0,0048
R2 = 0,9978
0,05
0
-0,05
10
20
30
40
CONCENTRACION [ppm]
100
50
60
ANEXO E
TUBO
(mL)
(mL)
0,1
9,9
3 X 108
0,2
9,8
6 X 108
0,3
9,7
9 X 108
0,4
9,6
12 X 108
0,5
9,5
15 X 108
0,6
9,4
18 X 108
0,7
9,3
21 X 108
0,8
9,2
24 X 108
0,9
9,1
27 X 108
10
1,0
9,0
30 X 108
101
ANEXO F
% DE RENDIMIENTO DEL ETANOL
X g de glucosa
100 mL de sln
184 g de alcohol
360 g de glucosa
500
0.79
Y mL de alcohol
Donde:
% Rendimiento =
102
X 100