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Revista Cubana de Ciencia Agrcola, Tomo 49, Nmero 1, 2015.

Crecimiento de Pichia guilliermondii cepa Levica 27 en diferentes


fuentes de energa y nitrgeno
Yoandra Marrero1, C. A. Montoya3, O.Ruiz2, A. Elas1 y N. Madera3

Instituto de Ciencia Animal, Apartado Postal 24, San Jos de las Lajas, Mayabeque, Cuba
Universidad Autnoma de Chihuahua, Av. Universidad s/n, Arboledas, 31110 Chihuahua, Chih.,Mxico
3
Prolongacin Josefa Ortiz de Domnguez S/N, Ciudad Universitaria, 80040 Culiacn Rosales, Sin., Mxico
Correo electrnico: ymarrero@ica.co.cu
1

Se estudi el crecimiento de la levadura Pichia guilliermondii cepa Levica 27 para su utilizacin como aditivo microbiano en animales
rumiantes. Para ello se compar el crecimiento de la levadura en los caldos NRF y extracto de malta. Luego, se evalu su desarrollo al variar
los carbohidratos y fuentes de nitrgeno presentes en la fomulacin del caldo NRF. En los azcares se sustituy la glucosa por sacarosa y
lactosa y en el caso del nitrgeno se sustituy la triptona por sulfato de amonio, casena y urea. No hubo interaccin entre los tratamientos
y el tiempo de estudio para el conteo de clulas de Levica 27 en los caldos extracto de malta y NRF, y no hubo diferencias entre ambos
medios. En el medio NRF, los mejores crecimientos se lograron cuando se utiliz glucosa y sacarosa a las 72 h, y esta ltima disminuy el
pH del medio (P 0.001). La casena y la urea provocaron mayor crecimiento (P 0.001) a partir de las 48 h, pero la urea provoc aumento
del pH. Se concluye que el crecimiento de la cepa Levica 27 fue superior ante glucosa o sacarosa, casena o urea. Se recomiendan estudios
para disear un medio de cultivo econmico con fuentes nacionales, que permita la obtencin de un preparado con Levica 27 con efecto
aditivo en rumiantes.
Palabras clave: Pichia guilliermondii, carbohidratos, nitrgeno

La adicin de levaduras a la dieta de animales rumiantes


ejerce efectos favorables en la poblacin microbiana
y en los indicadores fermentativos del rumen y como
consecuencia, mejora la salud y la productividad de los
animales (Bruno et al. 2009 y Al Ibrahim et al. 2012). El
Instituto de Ciencia Animal (ICA) de la Repblica de Cuba
posee una coleccin de levaduras aisladas del ecosistema
ruminal, no pertenecientes al gnero Saccharomyces que
demostraron buen potencial para su empleo como aditivo
ruminal (Marrero et al. 2013). Se demostr que la cepa de
dicha coleccin denominada Levica 27, que pertenece a
la especie Pichia guilliermondii, estimul mayormente la
produccin de gas in vitro de sustratos fibrosos, comparado
con el resto de las cepas de la coleccin y con S. cerevisiae
(Marrero et al. 2014).
Estos resultados justifican la bsqueda de un medio
de cultivo adecuado, econmicamente factible, para la
obtencin de un producto aditivo a escala piloto, que
permita demostrar el efecto activador de la cepa en
animales en produccin.
Se conoce que el diseo del medio de cultivo es una
de las tareas ms importantes dentro de la tecnologa
biolgica. Segn Winkler (1988), en el costo total de los
productos biotecnolgicos, las materias primas pueden
representar entre 30 y 80 %. Adems, la composicin
del medio de cultivo tiene que satisfacer todos los
requerimientos nutricionales del microorganismo. En
este sentido, las levaduras son capaces de sobrevivir
en las condiciones adversas, comportndose de hecho
como anaerobios facultativos. Adems, son fciles de
cultivar tanto en el laboratorio como a escala industrial,
utilizando para ello un medio de cultivo que contenga

azcares, sales minerales y una pequea cantidad de


fuente de nitrgeno (lvarez 1995).
El objetivo de este estudio fue evaluar el crecimiento
de Pichia guilliermondii cepa Levica 27 ante diferentes
fuentes de energa y nitrgeno, para el posterior diseo
de un medio de cultivo.
Materiales y Mtodos
Material biolgico y medios de cultivo. Se utiliz
la cepa Levica 27, perteneciente a la especie Pichia
guilliermondii, ubicada en el Gen Bank, con nmero
JF894143. Esta cepa pertenece a la coleccin de
levaduras del ICA (RYCASI), con nmero de registro
980 en el World Data Centre for Microorganisms
(WDCM).
Se estudiaron los medios de cultivo caldo extracto
de malta y caldo NRF, de Caldwell y Bryant (1966),
modificados por Elas (1971), ya que aunque el primero
se emplea especficamente para el cultivo de hongos
y levaduras, no cuenta en su formulacin con las
soluciones minerales del segundo que pudieran favorecer
el desarrollo de la levadura.
El medio NRF se emplea para el cultivo de bacterias
ruminales, por ello se elimin de su composicin la
celobiosa, almidn soluble, lactato de sodio, hemina, cidos
grasos voltiles, HCl -cistena, Na2S.9H2O y Na2 HCO3. La
tabla 1 muestra la composicin del medio que se emple
La solucin mineral A contiene, por 1000 mL,
K2HPO4, 3.0 g. La solucin mineral B contiene, por
1000 mL: KH2PO4, 3.0 g; SO4(NH4)2, 6.0 g; NaCl,
6.0 g; MgSO47H2O, 0.6 g y CaCl2, 0.6 g.
Preparacin del inculo de levadura. Se utiliz

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Tabla 1. Composicin del medio NRF, modificado para


determinar los requerimientos de la cepa Levica 27
Ingredientes
Solucin mineral A
Solucin mineral B
Glucosa
Tryptona
Extracto de levadura
Cu SO4 5 H2O [0.15%, P.V-1,
en solucin]
Mn Cl2 4 H2O [0.1 %, P.V-1,
en solucin]
Co Cl2 [0.1 %, P.V-1, en solucin]
Fe SO47H2O [0.34% P.V-1
en solucin]
Agua destilada

Cantidad para volumen


final de 100 mL
15.0 mL
15.0 mL
0.4 g
0.2 g
0.25 g
1.0 mL
1.0 mL
0.1 mL
1.0 mL
67.0 mL

un cultivo de la levadura obtenido a las 24 h, del que


se tom una asada que se diluy en 10 mL del caldo
extracto de malta. Se incub a 30 C durante 24 h para
su reactivacin. Luego, de este cultivo se inocul 0.5 mL
en erlenmeyer de 100 mL de capacidad con 50 mL del
mismo medio y se incub en iguales condiciones. Este
constituy el inculo para los estudios y present una
concentracin de celulas vivas de 57.1 x 10-7 celmL-1.
Procedimiento experimental. Se compar primero el
crecimiento de la cepa de levadura en el caldo extracto
de malta y el caldo NRF modificado. El primer medio
se utiliz, especficamente, para el cultivo de hongos
y levaduras, pero no cuenta en su formulacin con las
soluciones minerales del segundo. Para esto, se adicion
0.1 mL del inculo antes descrito en tubos de ensayo que
contenian 10 mL de ambos caldos. Se utilizaron cuatro
tubos por tratamiento para cada hora en estudio. Los
tubos consituyeron la unidad experimental. A las 0, 4, 8,
12, 24, 36 y 48 h se determin el pH y la densidad ptica
(D.O). Adems, se efectuaron conteos de clulas en
cmara de Neubauer. Para ello las levaduras se tiieron
segn mtodo de Painting y Kirsop (1990).
Posteriormente se estudi el crecimiento de la cepa
en caldo NRF al cambiar las fuentes de azcares y
de nitrgeno, segn el estudio. En el primer caso, se
sustituy la glucosa por sacarosa y lactosa y para las
fuentes de nitrgeno, se retir el sulfato de amonio
presente en la solucin mineral B para incluir triptona
(144 mg), casena (144 mg) y urea (24.4 mg). Para esto,
al igual que en el estudio de las curvas, se adicion
0.1 mL del inculo en tubos de ensayo que contenian
10 mL de ambos caldos. Se utilizaron cuatro tubos
por tratamiento para cada hora en estudio. Los tubos
constituyeron la unidad experimental. Se determin el
pH y la D.O a las 0, 48 y 72 h.
El pH se midi con un potencimetro porttil, marca
HANNATM modelo HI 9017, con precisin de 0.1

unidades. La D.O se midi en un espectrofotmetro


marca HACH, modelo DR 5000, a una longitud de onda
de 530 nm.
Anlisis estadsticos. Se emple un diseo
completamente aleatorizado, con cuatro repeticiones
por tratamiento en cada hora de estudio. Los resultados
experimentales se analizaron con el paquete estadstico
InfoStat, versin 1.0 (Balzarini et al. 2001). En los
conteos de microorganismos, los datos se transformaron
segn LN, para garantizar la normalidad de varianza. La
dcima de comparacin de Duncan (1955) se aplic, en
los casos necesarios para discriminar diferencias entre
las medias.
Resultados y Discusin
Para el anlisis de crecimiento, las levaduras tienen
mayores similitudes con bacterias heterotrficas que
con los ascomicetos filamentosos y basidiomicetos con
los cuales se relacionan taxonmicamente. Por tanto, si
se excluyen algunos gneros de levaduras semejantes a
hongos filamentosos, se puede decir que su crecimiento
tiene una aproximacin excelente a una poblacin
homognea de organismos heterotrficos unicelulares
(Casadesus et al. 1985).
Al analizar las curvas que gener el conteo de clulas
de Levica 27 en los caldos extracto de malta y NRF
(figura 1) se comprob la similitud entre ellas. El anlisis
estadstico indic que no hubo interaccin entre los
tratamientos y el tiempo de estudio. No hubo diferencias
en el nmero de clulas que crecieron en ambos medios
(tabla 2), lo que indica que el medio NRF es adecuado
para el cultivo de la cepa en estudio y la evaluacin de
su crecimiento ante diferentes carbohidratos y fuentes
de nitrgeno. Sin embargo, la tabla 3 muestra las
diferencias significativas (P 0.001) que se encontraron
en el tiempo, lo que es lgico por el aumento del
nmero de clulas que presentan los microorganismos,
debido a su reproduccin, cuando se encuentran en un
medio de cultivo con los nutrientes necesarios para este
proceso.
Los resultados anteriores, en ambos medios de
cultivo, constataron la existencia de dos de las cuatro
fases descritas por Mateos (2005) para los crecimientos
de microorganismos en general: fase de latencia y fase
exponencial o logartmica. No se constat la existencia
de las fases estacionaria y de declinacin o muerte, ya
que hubo aumento de los conteos de clulas hasta la hora
48. Al parecer, la cantidad de nutrientes presentes en
el medio fue suficiente para lograr un crecimiento de la
levadura hasta este horario.
La fase Lag de crecimiento de Levica 27 se
extendi hasta la hora 8. En los perodos de adaptacin
y recuperacin en que se divide esta fase, primero
las clulas se adaptan a las nuevas condiciones del
medio, y puede ocurrir disminucin en el porcentaje de
clulas viables. Posteriormente comienza a aumentar la
velocidad de la divisin celular.

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LN del conteo de clulas/mL

Caldo NRF

Caldo Extracto de malta

17
16.5
16
15.5
15
14.5
14
0

12

24

36

48

Horas
Figura 1. Curva de crecimiento de la cepa Levica 27 en caldo extracto de malta y NRF modificado.
Tabla 2. Efecto del tratamiento en los conteos de clulas de Levica 27
(x 10-7 celmL-1)
Tratamientos
EE
Caldo extracto de malta
Caldo NRF
15.71
15.72
0.04
Clulas de levaduras
Tabla 3. Efecto del tiempo en los conteos de clulas de Levica 27 (x 10-7 celmL-1)
Tiempo (h)
0
4
8
12
24
36
a
a
ab
ab
b
Clulas de levaduras
15.23
15.32
15.41
15.47
15.64
16.22c
abcd
Letras distintas indican diferencias significativas (P 0.05)
***P 0.001

La fase de crecimiento exponencial se presenta


desde la hora 8 hasta la 48. Al respecto, Mateos (2005)
seal que, en este perodo, los nutrientes se utilizan
rpidamente y se incrementa el nmero de clulas.
Como consecuencia, se acumulan metabolitos finales
que pueden traer cambios en el pH. Esta afirmacin
se corrobora en la tabla 4, que muestra el pH y la DO
del cultivo de Levica 27 en los medios en estudio. En
ambos indicadores, hubo interaccin entre el tiempo y los
tratamientos. Se observ disminucin del pH, mientras
que aumenta la DO.
Se debe destacar que la levadura creci a pH superior
en el caldo NRF (de 6.0 a 6.41) con respecto al caldo
malta (de 4.22 a 4.54). Al respecto, Carrillo (2003)
plante que las levaduras toleran un rango de pH entre
3 y 10, pero prefieren un medio ligeramente cido, con
pH de 4.5 a 6.5, lo que se corresponde con los valores
obtenidos en ambos cultivos.
El crecimiento de un microorganismo se puede
constatar por mtodo directo de conteo de clulas, y

EE
48
16.71d

0.08***

por mtodos indirectos, como la medicin de la turbidez


a travs de la D.O (Pandey et al. 2001). Por ello, se
realizaron estudios de regresin lineal de la D.O ajustada
al conteo de clulas para los medios en estudio y se
establecieron las ecuaciones correspondientes:
Caldo extracto de malta
Conteo de clulas = 3.21 x 106 + 67.32 x 106 (D.O)
Caldo NRF
Conteo de clulas = 2.84 x 106 + 110.07 x 106 (D.O)
Los resultados mostraron coeficientes de regresin
altos de R2= 0.90 en el caldo extracto de malta y
R2= 0.60 en el caldo NRF, con P 0.001 en ambos
casos. Esto indica la posibilidad de utilizar la D.O como
indicador del crecimiento de Levica 27 en estos caldos
de cultivo.
La dinmica de crecimiento de los microorganismos
depende de mltiples factores. Adems del gnero, la
especie y la cepa en especfico, se observa variabilidad
cuando se utilizan diferentes condiciones, medios de
cultivo y dosis de inculo. Esta afirmacin se demuestra

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Tabla 4. Comportamiento del pH y D.O de la cepa Levica 27 en los caldos extracto


de malta y NRF
Tiempo (h)

pH

D.O

Caldo NRF
Caldo malta
Caldo NRF
Caldo malta
6.41g
4.54c
0.015a
0.013a
g
c
a
6.40
4.52
0.015
0.010a
6.23f
4.49c
0.017ab
0.023ab
6.18f
4.48c
0.025ab
0.037b
6.00d
4.38b
0.057c
0.073c
e
b
d
6.10
4.32
0.104
0.126e
6.08e
4.22a
0.102d
0.182f
0.0061***
0.0017***
abcdefg
Letras distintas indican diferencias significativas (P 0.05)
***P 0.001
0
4
8
12
24
36
48
EE

con los trabajos de Tai Shin et al. (2002), Castillo (2009)


y Angulo et al. (2013), en los que se presentan resultados
heterogneos en la dinmica de crecimiento de Candida
norvegensis, debido a la utilizacin de medios de cultivo
y dosis de inculo diferentes. Todo parece indicar que las
dosis de inclusin de los inculos fueron determinantes
en las diferencias entre los tres estudios, pues los dos
primeros incluyeron 20 y 5 % respectivamente y el
tercero, 0.1 %.
Aunque este estudio se realiz con una cepa de la
especie P. guilliermondii, la dosis del inculo fue la
misma que la utilizada por Angulo (2012). Es probable
que la cantidad de inculo fuera muy baja, lo que
provoc que la fase Lag del crecimiento se extendiera
hasta la hora 8.
Los resultados expuestos demostraron la posibilidad
de estudiar el crecimiento de Pichia guilliermondii,
cepa Levica 27, en caldo NRF con diferentes fuentes
de energa y nitrgeno. La figura 2 muestra los valores
de DO del cultivo de la cepa en caldo NRF para los tres
carbohidratos que se emplearon como fuentes de energa.
Todos los azcares se utilizaron por la levadura, pero
los mejores crecimientos se logran a partir de las 48 h

cuando se emplea glucosa y sacarosa, aunque con la


sacarosa a las 48 h se logran iguales valores de D.O que
con la glucosa a las 72 h, lo que se debe tener en cuenta
por el menor tiempo que emplea la cepa en crecer con
este carbohidrato.
Estudios similares, en los que se utiliz el medio
NRF para determinar los requerimientos de una cepa del
mismo gnero, demostraron que esta utiliz mayormente
glucosa como fuente de energa, cuando se compar
con sacarosa y lactosa (Angulo 2012). Esto demuestra
la especificidad que existe en las especies de levaduras,
en cuanto a la utilizacin de fuentes de carbohidratos.
Lo anterior ha sido corroborado por Kurtzman y Fell
(1998), quienes describen la capacidad de las levaduras
para utilizar una amplia gama de compuestos, entre ellos
carbohidratos que les confieren un valor significativo
para ser utilizados en la industria y la agricultura.
En los medios que contenan glucosa y sacarosa hubo
disminucin del pH (tabla 5) a las 48 h, que se extendi
a las 72 h en medio con sacarosa. Sin embargo, este se
mantuvo en el rango ptimo descrito para el crecimiento
de las levaduras (Carrillo, 2003) y corrobora el resultado
descrito en la tabla 4.

EE0.0033

Figura 2. Efecto de diferentes carbohidratos en el crecimiento del cultivo de Levica 27

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Tabla 5. Efecto de diferentes carbohidratos en el pH del cultivo de


Levica 27
Tiempo (h)
EE
0
48
72
Glucosa
6.40b
6.12d
6.12d
Sacarosa
6.42ab
5.91e
5.72f
0.118*
ab
a
c
Lactosa
6.43
6.47
6.25
abcd
Letras distintas indican diferencias significativas (P 0.05). *P 0.05
Carbohidratos

Snchez et al. (2007), al estudiar la influencia del


pH en el crecimiento de una cepa de P. guilliermondii,
determinaron que no existan diferencias en el crecimiento
de esta levadura en el intervalo de pH entre 5 y 7, en
el que se alcanzaron las mayores producciones de
biomasa. Constataron adems, que tambin se puede
trabajar con pH de 4 a 4.5, sin una afectacin marcada
en el crecimiento. Sin embargo, a pH 3, hubo afectacin
drstica del crecimiento, debido a la gran acidez del
medio.
A diferencia de trabajos anteriores, con levaduras
del mismo gnero, pero de la especie, I. orientalis, se
mantuvo 92 % de sobrevivencia a pH 3 (Tai Shin et al.
2002). De ah, la importancia de los estudios especficos
en cada cepa, cuando se desea utilizar levaduras en la
alimentacin de animales rumiantes. Las resistentes
a pH bajos pudieran ser ms efectivas en dietas con
concentrados, en las que la presencia de carbohidratos
de fcil fermentacin disminuye el pH del rumen.
Caldern et al. (2005) sugirieron que las levaduras
pueden captar nitrgeno para sintetizar protena
unicelular y las fuentes comunes son amonio, urea y
aminocidos. Esto se evidenci en este estudio, con el
crecimiento de Levica 27, en presencia de diferentes
fuentes de nitrgeno (figura 3). Se puede constatar que
los valores de D.O, cuando se utiliza casena, urea y
triptona, duplican los que se obtienen en presencia del
sulfato de amonio. Al respecto, Villamil y Zapata (1999)
mencionan que todas las levaduras pueden utilizar

nitrgeno en forma de in amonio, ya sea en cloruros,


nitratos, sulfatos, fosfatos de amonio, y pueden usar el
azufre del sulfato de amonio para la sntesis de algunos
aminocidos (Sarmiento y Herrera 2003).
Si se analizan los resultados de las figuras 2 y 3 se
podra recomendar diferentes combinaciones de fuentes
de carbohidratos y nitrgeno teniendo en cuenta sus
precios en el mercado.
La presencia de todas las fuentes de nitrgeno
provoc descenso gradual del pH, a las 48 y 72 h (tabla
6), y la urea mantuvo los valores por encima del ptimo
para levaduras. Aunque el crecimiento no se afect, este
aspecto se debe tener en cuenta si se elige la urea como
fuente en un medio de cultivo para la cepa en estudio.
No obstante, Snchez et al. (2007) disearon un medio
de cultivo simple para P. guilliermondii, sin extracto de
levadura, que contena miel como fuente de carbono y
urea como fuente de nitrgeno. Estos autores obtuvieron
elevados niveles de biomasa en cultivos sumergidos
como en fermentacin en estado slido.
Se concluye que el crecimiento de Pichia
guilliermondii cepa Levica 27 fue superior en presencia
de glucosa o sacarosa y de casena o urea, cuando
se compar con otras fuentes de energa y nitrgeno,
respectivamente. Se recomienda realizar estudios para
disear un medio de cultivo econmico con fuentes
nacionales de energa y nitrgeno, que permitan la
obtencin de un preparado con Levica 27 para efectuar
estudios in vivo y comprobar el efecto aditivo de la cepa.

EE0.0074

Figura 3. Efecto de diferentes fuentes de nitrgeno en la Densidad ptica del cultivo de


Levica 27

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Tabla 6. Efecto de diferentes fuentes de nitrgeno en el pH del cultivo de Levica 27


Tiempo (h)
0
48
72
Sulfato de amonio
8.61ab
8.51bc
8.50c
Triptona
8.65a
7.90e
7.68f
Casena
8.46c
7.64f
7.60f
Urea
8.52bc
8.20d
8.10d
abcdf
Letras distintas indican diferencias significativas (P < =0.05) *P<0.05
Fuente de nitrgeno

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Recibido: 7 de noviembre de 2014