UNIVERSIDAD NACIONAL DE MAR DEL PLATA FACULTAD DE

CIENCIAS AGRARIAS
BIOQUMICA DE LOS ALIMENTOS
Trabajo Prctico de Laboratorio N2:
Extraccin, purificacin y caracterizacin de protenas de tejido
animal
PRIMERA PARTE: Extraccin, purificacin y cuantificacin de
protenas
INTRODUCCIN
Es conocido que hasta cerca de los aos 80 ha sido excepcional la
extraccin y purificacin de protenas para uso alimentario a excepcin de
aquellas molculas que poseen actividades enzimticas, hormonales o
farmacolgicas. Numerosos productos de uso comn en la alimentacin estn
disponibles en estado puro o casi puro (sacarosa, NaCl), o bien en mezclas de
compuestos de propiedades comunes (aceites, margarinas, etc.). Sin
embargo, existe bastante reticencia an al consumo de preparaciones de
protenas purificadas.
La purificacin de protenas es realizada para:
Estudiar la estructura, las funciones y sus interrelaciones, en estos
casos una pequea cantidad de protenas es suficiente y su pureza
debe ser la mxima posible.
Uso industrial y particularmente tecnologa alimentaria. En este caso la
pureza no juega un rol fundamental sino la disponibilidad de las
fuentes proteicas, los costos de produccin y las necesidades.
Por lo tanto, los objetivos de la extraccin de protenas pueden
ser:Funcionales, nutricionales o econmicas.
La eleccin de la fuente de protena a extraer y purificar depende
entonces de estos fines posteriores. Por ejemplo, para las protenas de
1

actividad enzimtica, las fuentes elegidas sern aquellas donde esa protena
es ms abundante y estable.
En este caso es fundamental el estado nativo para que la preparacin
presente una actividad tecnolgica (propiedad funcional deseada) o una
actividad especfica lo ms elevada posible.
La estructura nativa de una protena de origen animal o vegetal es
alterada generalmente durante el proceso de extraccin por las condiciones
adoptadas (T, tratamientos mecnicos o qumicos, etc.) y tambin por el
contacto con proteasas naturales presentes, que pueden ser liberadas y
puestas en contacto con la protena durante el tratamiento de extraccin.
Esto puede ser mejorado disminuyendo la temperatura (T< a 10C reducen
la actividad de proteasas en general) o utilizando inhibidores de las mismas.
Tambin el control del pH es necesario para evitar la desnaturalizacin.
Para extraer las protenas intracelulares es necesario romper por
mtodos fsicos o qumicos las membranas y paredes celulares impermeables
a esas macromolculas.
La extractabilidad de las protenas depende de su localizacin y
solubilidad en el medio acuoso, sensibilidad a la desnaturalizacin, tamao,
forma y polaridad, etc.
Dentro de las fuentes proteicas animales la ms importante la
constituye la carne, tanto de especies terrestres como marinas. El msculo
est constituido por 60-78% de agua, 15-22% de protenas, 1-15% de lpidos,
1-2% de glcidos y 1% de sales. Estas cifras indican que las protenas
representan entre el 50-90% de la materia orgnica de la carne. Esta es la
razn por la cual la mayor parte de los estudios sobre la calidad de las
propiedades de la carne se realizan sobre las protenas musculares (Xiong,
1994). Las mismas pueden clasificarse segn su localizacin y solubilidad en:
1) Protenas sarcoplasmticas (solubles en agua o bajas fuerzas
inicas)

2) Protenas miofibrilares (solubles en alta fuerza inica, 0,5-0,6m KCl

o NaCl2)
3) Protenas del estroma o del tejido conectivo (insolubles en las
condiciones anteriores)
En

peces

las

protenas

miofibrilares

son

las

ms

abundantes,

constituyendo aprox. un 75% del tejido muscular, siendo mnimo el contenido

de protenas del estroma. Las protenas miofibrilares adems de constituir el
sistema contrctil in vivo son las responsables de las propiedades
funcionales de la carne tales como capacidad ligante de agua, poder
emulsificante, capacidad de gelacin, etc.

OBJETIVO: Extraer, purificar y cuantificar miofibrillas de pescado

PROCEDIMIENTO:
a) Se utilizarn ejemplares de merluza (Merlucciushubbsi), los cuales
sern fileteados. Estos sern posteriormente picados para tomar una
muestra homognea de tejido y luego se pesarn los gramos indicados
en el esquema que se detalla a continuacin (punto b).
b) Extraccin y purificacin de miofibrillas de pescado.
Materiales:

Pescado (merluza)
Cuchilla y tabla de picar
Balanza
Homogenizador OMNIMIXER
Solucin buffer estndar: Tris-maleato 20mM pH 7; 0,1M KCl
Probetas
Agua destilada fra
Tubos de centrifuga de 250 ml de capacidad
Hielo
Centrifuga refrigerada

ESQUEMA DE EXTRACCIN Y PURIFICACIN DE MIOFIBRILLAS :

8 gr de msculo desmenuzado y
picado
Homogeneizar en 100ml de buffer estndar (Tris-maleato 20mM a pH 7; 0,1M KCl)
durante 3min. (3 pulsos de 50seg con intervalos de 10 seg) en un Homogeneizador
de tejidos OmniMixer 17 106(Sorvall)
Filtrar por
gasa

Centrifugar a 850 x g durante 15

min

SOBRENADANTE

PRECIPITADO

(descartar)

Resuspender en 50 ml de buffer std y repetir dos veces

la operacin

SOBRENADANTE

PRECIPITADO

(descartar)

Resuspender en 50 ml de
buffer
MIOFIBRILLA
S
PURIFICADAS
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Nota: Todos los procedimientos deben realizarse a 2-4C

a) Cuantificacin de las protenas: la cuantificacin de las protenas

se realizar utilizando el mtodo de Lowry y col. (1951), utilizando
albmina de suero bovino como estndar.
b) Con la concentracin de protena calculada se proceder a determinar
el rendimiento (gramos de miofibrillas por 100 gramos de tejido) y
tomar alcuotas para la caracterizacin de las mismas (Parte 2).

SEGUNDA PARTE: Caracterizacin de miofibrillas de pescado

INTRODUCCIN
Las miofibrillas pueden ser caracterizadas a travs de medidas de sus
propiedades

bioqumicas

fisicoqumicas.

Dentro

de

los

indicadores

bioqumicos se determinan las actividades Mg 2+ y Mg2+ (EGTA)-ATP asas que

estn

relacionadas

con

la

interaccin

actina-miosina

del

complejo

actomiosina en presencia y/o ausencia de calcio endgeno. Durante esta

interaccin la cabeza energizada de miosina conteniendo ADP y fosfato
inorgnico, hace contacto con actina por activacin de la troponina por el
calcio. Mientras la determinacin de la enzima Ca 2+-ATPasa indica la
funcionalidad de la miosina en el complejo actomiosina. Por otra parte la
electroforesis

en

geles

de

SDS-poliacrilamida,

permite

monitorear

la

existencia de las bandas polipeptdicas que constituyen el complejo proteico

y determinar el porcentaje relativo de cada componente a travs del anlisis
densitomtrico de los mismos.
OBJETIVOS:

Caracterizacin

de

miofibrillas

de

merluza

travs

de

la

determinacin de la actividadMg2+ Ca2+- ATPasay Mg2+ (EGTA)ATPasa y electroforesis en geles SDS-PAGE.

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MATERIALES Y METODOS
Muestras:
-Suspensin de miofibrillas de filetes de merluza fresca

Reactivos:
-Cl2Mg 20mM
- Cl2Ca 3mM
-EGTA 10mM
-ClK 1M
-Buffer Tris-maleato 45 mM pH7
-ATP 6 mM
-Acido Tricloroactico (TCA) 40% (m/v)
-Heptamolibdato de amonio 2,5% (m/v)
-Acido ascrbico 10% (m/v)
-Acido sulfrico 6N
-Solucin estndar de fosfato monopotsico 2 g/ml
-Agua destilada
Equipo instrumental:
-Bao termostatizado
-Centrifuga
-Espectrofotmetro

PROCEDIMIENTO:
a) Determinacin de la actividad enzimtica:
La capacidad de hidrolizar ATP por las miofibrillas se determinar a 37C en
buffer tris-maleato 30mM (pH 7), las condiciones especficas para cada
enzima son las mostradas en la Tabla 1.
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Tabla 1: Condiciones especficas para las enzimas Mg2+ Ca2+- ATPasa

y Mg2+ (EGTA)-ATPasa.

Mg2+Ca2+ATPasa
Mg2+
(EGTA)ATPasa

mg/ml

ATP(
mM)

KCl(m
M)

Cl2Mg(
mM)

Cl2Ca(
mM)

EGTA(
mM)

Tiempo
(min)

0,12

0,75

60

0,1

---

0,25

0,75

60

---

0,5

En ambos casos el volumen final de incubacin ser 1,5 ml. Las

reacciones sern frenadas por adicin de 0,5 ml de una solucin fra de TCA
al 40%.
Las muestras sern mantenidas en hielo y luego centrifugadas a 3000
rpm por 5 minutos. Se tomarn alcuotas de los sobrenadantes y se
cuantificar el fsforo liberado por el mtodo colorimtrico de Chen y col.,
(1956).
b) Cuantificacin de fsforo:
Reactivo de color:
-2 volmenes de agua destilada
-1 volumen de cido sulfrico 6N
-1 volumen de molibdato de amonio 2,5%
-1 volumen de cido ascrbico 10%
-Solucin estndar de fosfato monopotsico de 2 g/ml
Protocolo:
Tubo
Blanc
o
1

Estndar de fsforo

Agua destilada

Muestra

Reactivo de color

---

2,0 ml

---

2 ml

0,5 ml (1g Pi)

1,5 ml

---

2 ml

1,0 ml (2g Pi)

1,0 ml

---

2 ml

1,5 ml (3g Pi)

0,5 ml

---

2 ml

2,0 ml (4g Pi)

---

---

2 ml

---

1,7 ml

0,3 ml

2 ml

Se agita vigorosamente al agregar el reactivo de color. Se deja en bao a

37C por 1h 30 min., se enfra y se lee en espectrofotmetro a 820nm. Hacer
la curva de calibracin con el estndar y calcular los microgramos de fsforo
liberado en cada muestra.

c) Electroforesis en geles SDS Poliacrilamida (SDS-PAGE 10%)

A cada tiempo sern tomadas alcuotas de las suspensiones para
electroforesis

en

geles

SDS-

poliacrilamida

10%.

Las

mismas

sern

desnaturalizadas por calentamiento a 100C durante 5minutos en buffer

desnaturalizante

(Tris-HCl

pH

6,8,

SDS

10%,

glicerol,

beta-

mercaptoetanol, agua destilada). Se usar una relacin 1:1 muestra: buffer

desnaturalizante.La electroforesis se llevar a cabo en geles 10% de acuerdo
al procedimiento de Laemmli (1970) usando un equipo microslab (SIGMA) o
BIORAD en el rango de 6500 a 205000 Da.