FUNDAMENTO

PRUEBAS DE
IDENTIFICACIN
BACTERIANA
PRUEBAS PRIMARIAS

Prueba de Gram
Es una tincin diferencial para la visualizacin de bacterias, desarrollada
por Christian Gram.

Cristal violeta: es un colorante catinico que penetra en todas

las clulas bacterianas a travs de la pared bacteriana.

Lugol: compuesto formado por yodo (I 2), en equilibrio con yoduro

de potasio y siulterio. Este compuesto acta como mordiente,

permitiendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la
pared, ya que el cristal violeta entra a la clula y forma un
complejo insoluble con el cristal violeta.
Alcohol: este compuesto permite la decoloracin, ya que los

compuestos antes mencionados si son solubles en esta solucin,

por lo que las bacterias Gram (-) se destien, puesto que la pared
celular de 3 capas impide que el complejo penetre
completamente, adems de la presencia de lpidos que se
disuelven en alcohol, en cambio en bacterias Gram (+) el complejo
queda fuertemente unido debido a la gran capa de peptidoglicn
que presenta.
Safranina: se utiliza como un colorante de contraste para las
bacterias Gram (-).

Prueba de la oxidasa
Se utilizan papeles empapados con el reactivo N,N,N tetrametil
parafenil endiamina 1%. Esta prueba se utiliza para saber si la
bacteria es capaz de producir citocromos C oxidasa. Cuando el
resultado es positivo, el papel se torna de color azul al entrar en
contacto con las colonias, mientras que si el papel queda de color
transparente es oxidasa negativo. Generalmente presente en
organismos aerbicos.

Oxidasa positiva: significa que la bacteria posee citocromos c

oxidasa, por lo que puede usar oxgeno en la produccin de

energa con una cadena transportadora de electrones. Ejemplo:
Neisserias y Moraxella catarrhalis.
Oxidasa negativo: que no posean oxidasa no significa que no
puedan utilizar el oxgeno, sino que aplican una enzima diferente.
Ejemplo: Enterobacterias.

Prueba de la catalasa
La catalasa es una enzima que descompone el perxido de hidrgeno en
agua y oxgeno.

Catalasa

catalasa, al depositarla en una solucin de perxido al 3%, se

produce una efervescencia. Ejemplos: Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Neisseria spp y Moraxella catarrhalis.
Catalasa negativo: no existe ninguna reaccin al depositar la

positivo:

cuando la colonia presenta la enzima

colonia en la solucin de perxido al 3%.

PRUEBAS SECUNDARIAS

Prueba de la coagulasa
Esta prueba se utiliza, en la clnica, para diferenciar Staphylococcus
aureus de otros Staphylococcus. Se dice que en la clnica, puesto que
tambin existen Staphylococcus coagulasa positivo pero que solo se
presentan en animales.
Existen dos tipos de coagulasa:

Coagulasa libre: esta prueba se realiza en un tubo con plasma, y

la reaccin positiva es la formacin de un cogulo.

Coagulasa ligada o clumping factor: esta prueba se realiza en
un portaobjetos, siempre con un control para observar que no se
produzca auto-aglutinacin. Se usa generalmente con plasma de
conejo, y debe verse aglutinacin en la prueba y no en el control
para que se considere positivo. Si la prueba fuera negativa,
necesita de confirmacin mediante la prueba de la coagulasa libre
en tubo.

Positivos:
Staphylococcus
Staphylococcus coagulans.

intermedius,

Staphylococcus

Negativos: Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus

Staphylococcus warneri, Staphylococcus lugdunensis, etc.

hyicus,
cohnii,

Consideraciones: siempre utilizar plasma con EDTA y no citrado, ya que

organismos como Enterococcus pueden metabolizar el citrato y dar
falsos positivos.

Prueba de la novobiocina
Se basa en la sensibilidad que presentan algunas bacterias frente al
antibitico novobiocina. Dentro de la clnica se utiliza luego de coagulasa
negativa. Dentro del cepario del laboratorio, los Staphylococcus
coagulasa negativo resistente a novobiocina son: S. sciuri, S.
saprophyticus y S. xylosus. La diferencia radica en que S. sciuri
nunca es hemoltico.

Los otros dos resistentes se diferencian por medio del Test de la xilosa.

Prueba PYR
El sustrato que se utiliza es pirrilidonil-beta-naftilamda y la prueba
consiste en determinar la presencia de la enzima l-pirrolidonil
arilamidasa. Los MO que contienen esta enzima pueden hidrolizar el
sustrato presente con liberacin de grupo pirrlico, que reacciona con el
reactivo revelador N-N dimetilamino cinamaldehdo.
Dentro de las cepas que se utilizan en el laboratorio, sirve para
diferenciacin de Staphylococcus lugdunensis, que es PYR (+).
As como tambin Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecalis,
Enterococcus faecium y Citrobacter spp.
En el laboratorio esto se realiza con un kit depositando la colonia en el
disco de papel, luego se humedece con el buffer que viene en el kit, se
mantiene a temperatura ambiente por 5 minutos y luego se le adiciona
una gota de solucin reveladora. Si el color resultante es fucsia, significa
que es una prueba positiva. Si queda del color de la colonia, es una
bacteria PYR negativa.

Prueba de la xilosa
Esta prueba se realiza con el fin de determinar si la bacteria es capaz de
utilizar el azcar xilosa. Esto se realiza en un tubo que contiene agar CTA
ms el azcar a analizar, en este caso xilosa, y el indicador de pH rojo
fenol. Este tubo vira desde un color rosa, hacia un color amarillo por la
produccin de cido realizada por la fermentacin del azcar.
Cuando la prueba es positiva, se debe realizar un Gram directo, para
identificar si la fermentacin fue producida por el miroorganismo en
anlisis o por una contaminacin ambiental.

En el laboratorio esta prueba sirve para diferenciar a dos bacterias

resistentes a novobiocina, Staphylococcus saprophyticus y
Staphylococcus xilosus.

Prueba de la urea
Esta prueba se utiliza para determinar la presencia de la enzima ureasa.
Dentro del laboratorio se utiliza para identificar a Staphylococcus
epidermidis.
Este medio se realiza a partir de un agar base urea de Christensen,
adems contiene rojo metil y urea en polvo.
Este tubo se encuentra en forma amarilla, es decir cido. Se evidencia la
presencia de ureasa cuando este vira desde el amarillo hacia fucsia, ya
que se produce una hidrlisis de la urea y liberacin de amoniaco, es
decir, un lcali. Esto aumente el pH del medio y se produce una
coloracin fucsia indicando positivo. El resultado est disponible a las 24
horas.

Prueba de la DNasa
Esta es una prueba de identificacin para bacterias productoras de
DNasa estable. Para esto se necesita un agar DNA en donde se inocular
una estra de la bacteria en anlisis, se dejar incubar por 18-24H. Para
revelar los resultados se necesita HCl 1N por 5 minutos sobre el agar.
Un resultado positivo ser revelado por presencia de un halo alrededor
de la estra, lo que indica que el DNA ha sido despolimerizado e
hidrolizado y el agar ha sido limpiado con HCl. Ejemplos:
Staphylococcus aureus, Moraxella catarrhalis.
Un resultado negativo es cuando no hay presencia de halo en el agar.

Prueba de bacitracina
Prueba basada en la sensibilidad que presentan algunas bacterias frente
a este antibitico.
La realizacin de este test se debe realizar bajo sospecha de un
Streptococcus pyogenes. Para ellos se debe primeramente identificar
la colonia a analizar y realizar un inculo en un caldo BHI, el cual debe
incubar por a lo menos 12 horas para que la bacteria se adapte al medio
y pueda crecer. Una confirmacin de que la bacteria ha crecido es la
turbidez que presentar el tubo inoculado. Luego, este tubo turbio se
siembra en csped en un agar sangre y se posiciona un sensidisco de
bacitracina 0,04 unidades. Y luego debe permanecer de 18-24 horas en
la estufa.

Positivo: este test mide sensibilidad o resistencia, no existe

trmino medio. En caso de ser sensible, se podr observar un halo

de inhibicin, adems debajo del sensidisco se podr observar un

color rojo ms oscuro, puesto que las bacterias no son capaces de
crecer y provocar hemlisis en ese sector. Ejemplo:
Streptococcus pyogenes.
Negativo: el test es resistente cuando la colonia no forma halo de
inhibicin alrededor del disco.
agalactiae, Enterococcus spp.

Ejemplo:

Streptococcus

Test de CAMP
Los Streptococcus grupo B (en laboratorio S. agalactiae), producen
factor CAMP, que al interactuar con la hemolisina presente en
staphylococcus aureus
(ATCC25923), se produce un sinergismo
hemoltico.
Para ello se debe tener un agar sangre de cordero, y se debe realizar
una estra al medio con Staphylococcus aureus, luego de esto, se realiza
una estra perpendicular a la anterior con la colonia sospechosa, siempre
desde dentro hacia afuera y nunca tocando la estra anterior, puesto que
se puede arrastrar de la colonia aureus, invalidando la prueba. Se debe
incubar a 35C en aeorbiosis.
En el laboratorio, la nica bacteria que da positivo para esta prueba es
Streptococcus agalactiae.

Test de bilis esculina

El agar bilis esculina es un medio selectivo diferencial utilizado para
Enterococcus y Streptococcus del grupo D (en el caso del
laboratorio Streptococcus bovis). Las sales biliares (4%) son el
ingrediente selectivo, mientras que la esculina es el ingrediente
diferencial.
Los enterococcus hidrolizan la esculina en glucosa y esculetina por
medio de la enzima beta glucosidasa, la esculetina es soluble en el

medio y forma un complejo con Fe +3, de color negro. Debe ser incubado
a lo menos 24 H. Debe tener al menos 40% de bilis.

Positivo: este test da resultados positivos para: Enterococcus

spp, y Streptococcus bovis (en el caso del laboratorio).

Agar manitol salino

Este medio contiene manitol 1%, rojo fenol, peptonas y cloruro de sodio
7,5%.
Si crece la bacteria, y adems vira desde el fucsia a amarillo, significa
que es Staphylococcus aureus. Si slo crece, sin viraje, se trata de
Staphylococcus epidermidis.
La sal permite la inhibicin de otros microorganismos, sin embargo los
Enterococcus spp. Tambin pueden crecer, por lo que este es un agar de
identificacin, no de aislamiento.

Test de optoqun
Se basa en la misma premisa que el test de bacitracina y novobiocina,
es decir, en la sensibilidad que presentan algunas bacterias a ciertos
antibiticos.

En este caso, este test se realiza cuando se sospecha de la presencia de

Streptococcus pneumoniae.
Esto quiere decir, que se realiza cuando en la placa de agar sangre, que
se incub en condiciones de capnofilia y humedad, la colonia que creci
presenta alfa hemlisis.
Si el test resulta sensible, es S. pneumoniae. Si es resistente, se trata
de otro microorganismo.

Test NaCl 6,5%

Permite evaluar la tolerancia de los microorganismos frente a un medio
salino. Adems este medio contiene glucosa y prpura de bromocresol.
Cuando el medio est en condiciones normales, es de color prpura
claro, es un medio lquido. Cuando la colonia crece y utiliza la glucosa
este se torna amarillo por accin de la acidificacin por fermentacin de
la glucosa.

Telurito de potasio
Este test se basa en la capacidad de ENTEROCOCCUS FAECIUM. Este se realiza en
un agar, en donde se realiza una estra con el microorganismo a analizar. Un
resultado positivo se evidencia mediante el crecimiento de las colonias de color
negro. Esto se basa en la capacidad de E. faecium de reducir el telurito de potasio.