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1 (2009) p 23-30
ISSN: 0253-9268. Review.
1 Introduccin
Los liposomas fueron descubiertos en 1961 por Alec D.
Bangham mientras estudiaba un tipo de biomolculas (los
fosfolpidos, PL) y su relacin con la coagulacin sangunea1. Desde entonces, se han convertido en herramientas
verstiles en Biologa, Bioqumica y Medicina.
terminal hidrosoluble en tanto el otro es hidrofbico, es decir se trata de molculas anfiflicas2. En numerosos artculos de revisin y captulos de libros se analiza el empleo de
los liposomas en la liberacin de frmacos, la terapia gnica y como inmunoadyuvantes. El uso de los liposomas
como carriers de frmacos se ha dirigido a reducir los
efectos txicos colaterales de las drogas en rganos sensibles, tales como corazn y riones, y a lograr una direccionalizacin a tejidos especficos tales como los tumorales. Por otra parte, la inclusin de lpidos catinicos en la
composicin liposomal ha potenciado su capacidad para
mediar la transfeccin en la terapia gnica. La racionalidad
que existe en el empleo de los liposomas en inmunizaciones y en el diseo de vacunas se basa en su capacidad para
liberar la molcula antignica en clulas especficas del sistema inmunolgico y estimular una respuesta inmune3.
Los liposomas estn constituidos por molculas anfiflicas derivadas o basadas en la estructura de los lpidos
de las membranas biolgicas4,5,6,7. Estos lpidos se forman, generalmente, a partir del enlace ster de dos cadenas hidrocarbonadas con la molcula del glicerol (glicerolpidos), o tambin pueden estar constituidos por la
unidad hidrofbica ceramida (esfingolpidos). Esta
parte hidrofbica se une a una cabeza polar hidroflica
que puede contener grupo fosfato (fosfolpidos) o algunas unidades azcares (glicolpidos). Las cabezas
polares de los lpidos biolgicamente relevantes pueden
ser zwitterinicas: fosfatidil colina (PC), fosfatidil etanolamina (PE), esfingomielina (SM); cargadas negativamente: cido fosfatdico (PA), fosfatidil glicerol (PG),
fosfatidil serina (PS), fosfatidil inositol (PI), cardiolipina
(CL) y glicolpidos cargados negativamente o no. Las
cadenas acilas saturadas con frecuencia varan en longitud entre 10 y 18 carbonos; las de longitud mayor de 18
carbonos son usualmente insaturadas con uno, dos o tres
dobles enlaces en configuracin cis. Los lpidos cargados positivamente son molculas sintticas las cuales son
diseadas para propiciar la condensacin del ADN e interactuar con las membranas biolgicas con carga neta
opuesta 3.
Los lpidos anfiflicos son muy poco solubles en agua
como monmeros, con una baja concentracin crtica
micelar (CCM), oscilando entre 10 8 y 1012 M, magnitud que depende de la longitud de las cadenas hidrocarbonadas presentes en sus estructuras. Los anfifilos con
una sola cadena hidrocarbonada (lisolpidos, cadenas de
cidos grados insaturadas, detergentes, etc.) espontneamente forman agregados en estructuras micelares.
Sin embargo, la mayora de los lpidos derivados de las
membranas biolgicas tienden a formar bicapas en fase
acuosa. Las estructuras lamelares que resultan se sellan
en vesculas denominadas liposomas. Atendiendo a las
caractersticas estructurales, en particular al nmero de
bicapas y al tamao, los liposomas se pueden clasificar
en vesculas multilamelares (del ingls multilamellar
vesicles MLV, 0.110 m) o unilamelares, estas ltimas
pueden ser de dimetro pequeo (del ingls small unilamellar vesicles SUV, <100 nm), de dimetro grande
(del ingls large unilamellar vesicles LUV, 100500
2 Procedimientos ms usados en la
preparacin de liposomas
Las vesculas MLV se obtienen por hidratacin, mediante agitacin, de una pelcula lipdica previamente
formada por evaporacin de una solucin de los lpidos
disueltos en un solvente orgnico, generalmente cloroformo. Esta hidratacin debe realizarse por encima de la
temperatura de transicin de fase de los lpidos. La distribucin del tamao y la lamelaridad de las vesculas
MLV es muy heterognea pero, debido al desarrollo de
la tecnologa liposomal, se dispone de procedimientos
sofisticados que rinden vesculas con un tamao ms
homogneo (Figura 1)7,8.
La sonicacin de una suspensin de MLV provoca la
ruptura de estas vesculas produciendo SUV con un radio de 3060 nm, aproximadamente. Los liposomas
SUV tienden a experimentar procesos de agregacin y
fusin debido a la presencia de defectos en sus bicapas1.
Extrusiones repetidas de una suspensin de MLV a travs de membranas de policarbonato, con poros de tamao bien definido, producen LUV con un dimetro que
puede oscilar entre 80400 nm, en dependencia de la
membrana utilizada en el proceso de extrusin7. Otro
procedimiento muy rpido para la preparacin de liposomas consiste en la disolucin de una mezcla lipdica
en etanol o ter, la cual es inyectada en una solucin
tampn apropiada originndose una mezcla heterognea
de SUV, LUV o MLV, en dependencia de la concentracin lipdica. El uso de este procedimiento en ocasiones
es limitado debido a la baja solubilidad de determinados
lpidos en estos solventes7. El mtodo de evaporacininversin de fase (REV, del ingls reverse phase evaporation method), basado en la rpida inyeccin de una solucin acuosa en una fase orgnica que contiene los lpidos, rinde vesculas en la suspensin acuosa con 0.1 a
1.0 m de dimetro y una capacidad de encapsular de
hasta un 50%. Los pasos fundamentales de este mtodo
son: la sonicacin, que resulta en una emulsin aguaen-aceite, seguida por un secado parcial a un gel semislido que es finalmente, convertido en una suspensin
concentrada de vesculas mediante agitacin vigorosa7.
La encapsulacin de biomolculas lbiles tales como
protenas y ADN en liposomas requiere de mtodos
reproducibles y que no incluyan etapas drsticas. El
procedimiento basado en la deshidratacin y rehidratacin de vesculas (DRV) desarrollado por Kirby y Gregoriadis9 es simple, emplea condiciones suaves y produce vesculas con una elevada eficiencia de encapsulacin para una amplia variedad de molculas. Las
vesculas DRV pueden ser producidas a gran escala
mezclando una solucin acuosa del compuesto a encap-
de las preparaciones.
La calorimetra diferencial de barrido (DSC) se
emplea para determinar la temperatura de inicio de la
fusin de las cadenas lipdicas y otras transiciones de
fase7, y el rea bajo la curva (es decir, la entalpa, H) es
representativa de la cooperatividad del proceso. Dado
que la temperatura de transicin es sensible a la
presencia de aditivos en la bicapa, este es un parmetro
recomendado para monitorear interacciones drogalpidos y para detectar impurezas y productos de
hidrlisis.
40
35
Liberacin de CF (%)
30
25
20
15
10
5
0
10
15
20
25
Tiempo (horas)
son herramientas potentes para examinar las caractersticas estructurales y de movimientos locales en las bicapas
lipdicas. Estos mtodos brindan informacin no slo de
la morfologa de los lpidos, sino tambin de los detalles
de la arquitectura local3. La seal de RMN-31P (estado
slido) permite identificar la presencia de fases lamelares, hexagonales y micelares/cbicas. El orden y movilidad local de segmentos moleculares individuales pueden
ser estudiados con la incorporacin selectiva de deuterio
para el anlisis por RMN-2H o con el marcaje con el radical nitrxido mediante EPR. Las caractersticas de los
espectros de RMN-2H de las cadenas acilas de los lpidos son tiles para distinguir las fases gel y fluida y el
estado lquido-ordenado. Por otra parte, el anlisis de las
cabezas polares lipdicas deuteradas ha mostrado que el
alineamiento de sus momentos dipolares refleja con elevada sensibilidad la asociacin de molculas cargadas y
de agua con la superficie de la membrana. De manera
similar, la penetracin y localizacin de molculas hidrofbicas, as como tambin la conformacin, orientacin
y perturbacin local de un pptido anfiflico y una protena transmembrana pueden describirse en detalles mediante RMN del estado slido3.
Figura 4. Inhibicin de la interaccin entre el EGFhr y su receptor por el suero de los animales inmunizados con EGFhrP64k encapsulado en DRV o adsorbido en Al(OH)3. La ordenada representa el porcentaje de inhibicin de la interaccin
EGFhr/ R-EGF, derivado de los anticuerpos anti-EGFhr presentes en el suero de los animales inmunizados. Como fuente
de receptores se utilizaron membranas de placenta humana. Ratones NMRI se inmunizaron a los 0 y 28 das por va intramuscular, con 10 g de EGFhr conjugado a P64k encapsulado en
DRV o adsorbido en Al(OH)3. Para el ensayo se extrajo el suero de los animales (n = 7) a los 90 das (dilucin 1:5). Como
control y para el clculo del porcentaje de inhibicin se utilizaron sueros de animales no inmunizados y un exceso de EGFhr
no radiactivo (control de mximo bloqueo o inhibicin de la interaccin EGFhrI125/R-EGF). Letras desiguales indican diferencias significativas, segn la prueba de Rangos Mltiples de
Duncan (p < 0.05)10,30.
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