PRACTICA Nº05

TOMA DE MUESTRA CLÍNICAS Y AISLAMIENTO E

IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS PATÓGENAS
(ENTEROBACTERIAS)

INTRODUCCIÓN

La identificación de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando

diferentes combinaciones de características y diferentes criterios en la
evaluación de similitudes.
Los ensayos bioquímicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas
bioquímicas convencionales, generalmente determinan la actividad de una vía
metabólica (conjunto de reacciones químicas) a partir de un sustrato que se
incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no.
Existen diferentes sistemas que facilitan la realización de tales ensayos, porque
proponen el mejor conjunto de pruebas bioquímicas para la identificación de un
grupo bacteriano, porque simplifican la interpretación de un resultado utilizando
un valor numérico, porque proveen los reactivos listos para su uso o porque
son totalmente automatizables.
Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se han
desarrollado para demostrar en forma clara una determinada característica
bioquímica como presencia o ausencia de una determinada actividad
enzimática, grupo de enzimas o determinada vía metabólica, crecimiento a una
determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No
significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano.
Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio
de cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente aún para el mismo
ensayo si se trata de diferentes microorganismos. Por ejemplo se debe suplir
con factores de crecimiento el medio de cultivo para estudiar la fermentación de
distintos azúcares cuando se sabe que el microorganismo en estudio es
exigente. A la determinación de la especie se puede llegar según diversos
sistemas (manuales de identificación, comerciales, etc.).

OBJETIVOS
○ Utilizar técnicas de siembra y medios de cultivo adecuados para
aislar bacterias patógenas.
○ Conocer las características de crecimiento de algunas bacterias
patógenas.
 ○ Identificar una bacteria a través de pruebas bioquímicas con medios
de cultivo sólido y líquido.
○ Reconocer los requerimientos nutricionales de la bacteria aislada.

PROCEDIMIENTO
➢ Coger un ansa del cultivo y sembrar por puntura en cada una de las
pruebas bioquímicas: TSI, LIA Y CITRATO.

Después de coger con el ansa una gota del cultivo se le introduce a las P.B dejando etrias.
➢ Después de eso coger un ansa y sembrar en el tubo con caldo
pectonado para realizar la prueba de indol. Y luego incubar a 37ºC por
24 horas.
 RESULTADO DEL DIA SIGUIENTE DE LAS PRUEBAS BIOQUIMICAS

Medios de cultivo:
Agar TSI se mantuvo alcalino (k/k)
Mancha negra (-)
Separación (-) triple azúcar son: lactosa, sacarosa y la glucosa.
Contiene

Agar LIA (+) hubo descarboxilación

Significa que la bacteria que se ha sembrado radica en CO

a para ver si la bacteria que se siembra consume fuente carbónico. Si es negativo es del mismo colo

Agar CITRATO (-)

Caldo pectonado ( indol) Es (+)

Anillo lita
 Resultados (fundamentación):

TSI
Medio universalmente empleado para la diferenciación
de enterobacterias, en base a la fermentación de
glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de ácido
sulfhídrico.
El Agar-hierro-triple azúcar es un medio de cultivo.
Gracias a su composición es uno de los medios de cultivo
más empleados para la diferenciación de enterobacterias
según:
1. Fermenten o no glucosa.
2. Fermenten o no lactosa o sacarosa.
3. Produzcan o no ácido sulfhídrico.
4. Produzcan o no gas.
Correspondientemente las reacciones sobre agar TSI son:
1. Si la bacteria problema fermenta la glucosa, acidificará
el medio haciendo virar a amarillo el indicador en el
fondo del tubo, mientras que si no es fermentadora de
glucosa, el medio permanecerá de color rojo.
2. Si la bacteria problema fermenta lactosa o sacarosa,
acidificará el medio en su superficie volviéndolo de
color amarillo, mientras que si no lo es, la superficie
del medio continuará de color rojo.
3. Si produce ácido sulfhídrico (debido a la reducción de
las sales de hierro), se presentará un ennegrecimiento
del tubo. La producción de sulfhídrico y el consiguiente
ennegrecimiento pueden impedir ver la fermentación
de la glucosa (fondo amarillo), pero este hecho implica
directamente que la bacteria es fermentadora de
glucosa.
4. Si aparece rotura o desplazamiento del medio,
significa que la bacteria es productora de gas.
Fundamento
 En el medio de cultivo, el extracto de carne y la
pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el
desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son
los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de
sodio es el sustrato necesario para la producción de
ácido sulfhídrico, el sulfato de hierro y amonio, es la
fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el
ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color
negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro
de sodio mantiene el balance osmótico. Por
fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se
detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual
vira al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de
sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona
luego con una sal de hierro proporcionando el típico
sulfuro de hierro de color negro
Prueba del indol
Es un compuesto orgánico heterocíclico, con estructura
bicíclica que consiste en un anillo de seis miembros
(benceno) unido a otro de cinco miembros (pirrol). La
participación de un par aislado de electrones de nitrógeno
en anillo aromático refiere a que el indol no es una base y
no representa una amina simple.
Es sólido a temperatura ambiente, y puede producirse
mediante bacterias como producto de la degradación del
aminoácido triptófano. Esto ocurre en forma natural en las
heces humanas, presentando el indol un intenso olor fecal.
Sin embargo, a muy bajas concentraciones, su aroma es
floral[] y constituye varias esencias florales y perfumes.
También está presente en el alquitrán de hulla
La estructura del indol puede hallarse en muchos
compuestos orgánicos, como el triptófano y las proteínas
que lo contienen, en los alcaloides y los pigmentos

Es una prueba bioquímica realizada en especies

bacterianas para determinar la habilidad del organismo de
romper el indol del aminoácido triptófano. Esta división
molecular es lograda por una serie de enzimas
intracelulares diferentes, un sistema que en conjunto se le
llama con frecuencia triptofanasa.
Se genera el indol por una desanimación deductiva del
triptófano vía la molécula intermediaria ácido indolpirúvico.
Las triptofanasas catalizan la reacción de desanimación,
durante el cual se remueve el grupo amino (NH2) de la
molécula de triptófano. Los productos finales de la reacción
son el indol, ácido pirúbico, amoniaco (NH3) y energía.
Como coenzima de la reacción se requiere al fosfato de
piridoxal
Mediante esta prueba se detecta la liberación de indol en
un cultivo bacteriano. Dicha liberación se debe a la
degradación del aminoácido triptófano mediante el enzima
triptofanasa.
Prueba de citrato
Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz
de utilizar citrato como única fuente de carbono y
compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno
en su metabolismo, provocando una alcalinización del
medio. Entre las enterobacterias estas características se
dan en los siguientes géneros: Enterobacter, Klebsiella,
Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin
embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y
Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos
nutrientes.
Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons.
Este medio contiene citrato de sodio y fosfato de amonio
como fuentes de carbono y de nitrógeno respectivamente y
azul de bromotimol como indicador de pH. Sólo las
bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán
multiplicarse en este medio y liberarán iones amonio lo
que, junto con la eliminación del citrato (ácido), generará
una fuerte basificación del medio que será aparente por un
cambio de color del indicador de pH, de verde a azul.
Fundamento

En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única

fuente de nitrógeno y el citrato de sodio es la única fuente
de carbono. Ambos componentes son necesarios para el
desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un
sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimático. El
cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el azul de
bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en
medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a
que los microorganismos capaces de utilizar citrato como
única fuente de carbono, usan sales de amonio como única
fuente de nitrógeno, con la consiguiente producción de
alcalinidad. El metabolismo del citrato se realiza, en
aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a
través del ciclo del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento
del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este
último, en presencia de un medio alcalino, da origen a
ácidos orgánicos que, al ser utilizados como fuente de
carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El
medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la
producción de citrato permeasa.
Siembra
A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar en
superficie un inóculo ligero, usando una ansa sin arrastrar
el agar.
Resultados
-Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad
-Negativo: el medio permanece de color verde debido a
que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color