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5-40 (2008)
RESUMEN
Se ha propuesto un mtodo nuevo, simple, rpido y automtico basado en
la extraccin cida asistida con energa de ultrasonidos para la determinacin
de metales en algas. Los metales se determinaron en lnea por espectrometra
de absorcin atmica con llama utilizando un sistema de anlisis por
inyeccin en flujo. Se estudi la influencia de varias variables en la eficacia
del proceso de extraccin utilizando diseos experimentales. Adems, las
metodologas propuestas fueron evaluadas calculando el lmite de deteccin,
lmite de cuantificacin y precisin. La validacin se efectu analizando un
material de referencia certificado (NIES-9, Sargasso, National Institute
for Environmental Studies, Japan) y mediante estudios de recuperacin.
Finalmente, la metodologa propuesta se ha utilizado para la determinacin
de Zn, Cu, Fe, Mn, Ca y Mg en algas marinas destinadas a la alimentacin
humana producidas y procesadas en Galicia.
Palabras clave: metales, extraccin cida continua, ultrasonidos, anlisis
por inyeccin en flujo, algas.
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Premio de Investigacin Real Academia Galega de Ciencias-Fundacin Caixa Galicia,
convocatoria 2007.
ABSTRACT
A new, simple, fast and automated method based on continuous
ultrasound-assisted acid extraction has been developed for the determination
of metals (Zn, Cu, Fe, Mn, Ca and Mg). The target metals have been on-line
monitoring by flame atomic absorption spectrometry by using a flow injection
analysis manifold. The influence of several extraction parameters on the
efficiency of metal leaching has been evaluated by using experimental designs.
Limits of detection and quantification and precision of the over all procedure
have been assessed. Method validation was performed analysing a seaweed
reference material (NIES-9, Sargasso, National Institute for Environmental
Studies, Japan) and by recovery studies. Finally, the developed continuous
extraction methodology has been applied to the determination of Zn, Cu, Fe,
Mn, Ca and Mg in edible seaweeds produced and processed in Galicia.
Key words: metals, continuous acid extraction, ultrasounds, flow injection
analysis, edible seaweeds.
INTRODUCCIN
Las algas se definen como plantas talofitas, unicelulares o pluricelulares
que viven de preferencia en el agua, tanto dulce como marina, y que, en
general, estn provistas de clorofila acompaada a veces de otros pigmentos
de colores variados que la enmascaran. El talo de las pluricelulares tiene
forma de filamento, de cinta o de lmina y puede ser ramificado. Aunque hay
muchas algas de agua dulce, la mayora vive en el mar. Dentro de stas, se
encuentran las algas unicelulares, microalgas o fitoplancton, las cuales son
microscpicas y representan el primer eslabn de la cadena alimenticia de
los animales acuticos. Adems, existen algas pluricelulares o macroalgas,
visibles al ojo humano y que normalmente se conocen como algas marinas
(Prez-Cirera Lpez-Nio, 2005). Entre las algas marinas macroscpicas se
pueden diferenciar cuatro grupos principales: Cyanophyta o algas azules,
Chlorophyta o algas verdes, Rhodophyta o algas rojas y Phaeophyceae o algas
pardas. Estos grupos se caracterizan no slo por los pigmentos que poseen,
sino tambin por la complejidad de su talo y sus mecanismos reproductivos
(Otero Schmitt et al., 2002). Sin embargo, tienen la caracterstica comn
de vivir sin raiz, y extraen su alimento y los nutrientes esenciales para su
crecimiento del agua del mar que les rodea. Desde hace mucho tiempo, el
hombre ha usado las algas con distintos fines para el medio ambiente y el ser
humano. Estas aplicaciones son:
- agropecuarias. Mejoran la produccin vegetal utilizadas como abono y
fertilizante, como corrector del pH de la tierra, e incluso como alimento para
el ganado.
- alimenticias. Las algas se han incorporado desde hace muchos siglos en
la dieta alimenticia, sobre todo en las culturas orientales y especialmente en
Japn, Corea y China, y en la poliacuicultura ecolgica, las algas sirven de
complemento diettico para peces o moluscos de granjas de cultivo.
- cosmticas. Los extractos de algas se emplean en productos para el
tratamiento de uas rotas, acn, arrugas, seborrea, e incluso para la cada del
cabello, el rejuvenecimiento de la piel, la obesidad o la celulitis. Asimismo,
su capacidad fotoprotectora se est utilizando para el desarrollo de cremas
solares.
- farmacolgicas. Las algas son muy utilizadas en la medicina tradicional
oriental.
- industriales. Para la optencin de ficocoloides: agarfitos (E-406),
alginatos (E-401 al E-405), y fundamentalmente carrageninas (E-407). El
agar se emplea en la elaboracin de medio de cultivo en laboratorio por
tener un gran poder gelificante. El agar tambin se aade como aditivo
gelificante y espesante (E-406) en gran cantidad de alimentos. Asimismo se
emplea en la industria fotogrfica y en la industria biotecnolgica (agarosa
para separaciones cromatogrficas y electroforticas). Las carrageninas son
polisacridos sulfatados muy apreciados por diversos tipos de industrias por
sus numerosas aplicaciones, normalmente alimentarias.
- medioambientales y energticas. Como restauradoras de zonas
contaminadas, depuradoras de efluentes o como bioindicadores para conocer
el estado de un determinado medio (Chaudhuri et al., 2007; Morrison et al.,
2007; Kamala-Kannan et al., 2008). Asimismo, su uso como combustible,
para generar biogs (metano), hidrgeno o biodiesel es otra lnea fructfera de
investigacin (Castell Orvay, 1993).
El consumo directo de algas en la alimentacin humana est muy
extendido en los pases orientales (China, Corea, Japn). Sin embargo, en las
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lnea que las muestras. La disolucin blanco es cido ntrico 3 M para el Ca,
y 0,5 M para el Mg.
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RESULTADOS Y DISCUSIN
Determinacin de cinc, cobre, hierro y manganeso
Para realizar la optimizacin de los parmetros que afectan a la extraccin
de Zn, Cu, Fe y Mn de las muestras de algas, se ha utilizado un diseo factorial
debido a que el nmero de variables implicadas es elevado (6 variables). As,
es necesario aplicar un diseo factorial de screening, para reducir de modo
significativo el nmero de experimentos a realizar en la optimizacin. Uno de
los diseos de screening ms utilizados es el diseo de Plackett-Burman. ste
permite fraccionar un diseo factorial completo proporcionando nmeros de
combinaciones de factores que son un mltiplo de cuatro. Por ejemplo, si se
aplicara un diseo factorial completo a 2 niveles para 6 variables implicara
la realizacin de 64 experimentos. Sin embargo, aplicando el diseo de
Plackett-Burman con un punto central, el nmero de experimentos a realizar
es de trece. As, las variables a optimizar para el dispositivo FIA 1 son las
siguientes: concentracin de HNO3 (disolucin extractante), concentracin de
HCl (disolucin extractante), tiempo de extraccin,
Tabla 2. Determinacin de Zn, Cu, Fe y Mn. Concentracin certificada y cantidad
de muestra analizada del material de referencia Sargasso, NIES-9, National Institute for
Environmental Studies, Japan.
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considerado un punto central en el que las variables toman un valor medio entre
el lmite superior e inferior. Una vez obtenida la matriz del diseo, se realizaron
los experimentos fijados por la misma. Para realizar estos experimentos se
utiliz un material de referencia certificado (NIES-9,Sargasso, National
Institute for Environmental Studies, Japan). La concentracin certificada para
Zn, Cu, Fe y Mn, y la cantidad de material de referencia utilizada (fijada
en funcin de la concentracin) para optimizar el proceso se muestran
en la Tabla 2.
La variable respuesta considerada ha sido el % eficacia en la extraccin
(% EF), calculado segn la siguiente ecuacin:
La matriz del diseo de Plackett-Burman con los valores que toma cada
variable en cada experimento y el % eficacia en la extraccin
Tabla 3. Matriz del diseo de Plackett-Burman con los valores de % EF para cada
variable en cada experimento para la determinacin de Zn, Cu, Fe y Mn. A, [HNO3]; B,
[HCl]; C, Tiempo de extraccin; D, Temperatura de extraccin; E, Caudal de extraccin; F,
Volumen de disolucin extractante.
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Figura 5. Optimizacin del tiempo de extraccin para Zn, Cu, Fe y Mn para caudales
de extraccin de 3,5 y 6 mL/min. [HNO3]=3 M; [HCl]=3 M; Temperatura de extraccin= 20
C; Volumen de disolucin extractante= 1 mL.
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las algas, se compar para cada uno de los casos la pendiente de la recta de
calibrado con la obtenida para la recta de adicin. Los resultados obtenidos
aparecen en la Figura 10. Como se puede observar en esta Figura, en todos
los casos la recta de calibrado y la recta de adicin son paralelas. Dicho
paralelismo se corrobor mediante la aplicacin de un test estadstico t para
un nivel de significacin del 95%. Por todo ello, se puede decir que no existe
efecto matriz para la determinacin de Zn, Cu, Fe y Mn en las muestras de
algas por el mtodo propuesto. Lo que se traduce en que se puede utilizar
nicamente la recta de calibrado correspondiente para relacionar la seal de
la muestra con la concentracin existente de cada metal.
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Tabla 8. LOD, LOQ e intervalo lineal para la determinacin de Zn, Cu, Fe y Zn en algas
para distintas cantidades de muestra.
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6 y 21,2 1,0 g/g, para Zn, Cu, Fe y Mn, respectivamente. Los resultados
obtenidos para el anlisis de estos metales por el mtodo propuesto fueron
los siguientes (media desviacin estndar, n=3): 15,0 0,2; 5,1 0,1; 183,7
1,1 y 20,9 0,2 g/g, para Zn, Cu, Fe y Mn, respectivamente. Con todos
estos datos se puede decir que el procedimiento utilizado para realizar la
determinacin de Zn, Cu, Fe y Mn en algas marinas mediante la metodologa
automtica propuesta es exacto.
La precisin se estudi en base al clculo de la repetibilidad de la
metodologa propuesta. Para ello, se aplic el mtodo propuesto a once
muestras de una misma alga. Los resultados obtenidos expresados como
coeficiente de variacin fueron los siguientes: 1,3; 2,0; 0,6 y 1,0%, para Zn,
Cu, Fe y Mn, respectivamente.
Se calcul la frecuencia de muestreo del mtodo propuesto considerando
la duracin de la etapa de extraccin y la duracin de la etapa de medida (20
s). De esta manera, las frecuencias de muestreo para los distintos metales
fueron las siguientes: 60, 36, 36 y 60 muestras/h, para Zn, Cu, Fe y Mn,
respectivamente.
Caractersticas analticas de los mtodos propuestos para la determinacin
de Ca y Mg en muestras de algas
Como se puede observar en la Figura 11, la recta de calibrado y la recta
de adicin son paralelas. Este paralelismo se comprob mediante la aplicacin
de un test estadstico t para un nivel de significacin del 95%. Por todo ello,
es posible concluir que no existe efecto matriz para la determinacin de Ca y
Mg en las muestras de algas por el mtodo propuesto.
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(media desviacin estndar, n=3) fueron 1,33 0,02 y 0,66 0,01%, para Ca
y Mg, respectivamente.
La precisin se estudi en base al clculo de la repetibilidad de la
metodologa propuesta. Para ello, se aplic el mtodo propuesto a once
muestras de una misma alga. Los resultados obtenidos para el estudio de la
precisin expresados como coeficiente de variacin estaban en el intervalo
0,9-1,4%, demostrndose la precisin de la metodologa analtica propuesta.
Se calcul la frecuencia de muestreo del mtodo propuesto considerando
la duracin de la etapa de extraccin (0,5 min) y la duracin de la etapa de
medida (25 s). As, la frecuencia de muestreo para Ca y Mg result ser de 55
muestras/h.
APLICACIN
DE
LAS
METODOLOGAS
ANALTICAS
DESARROLLADAS. DETERMINACIN DE Zn, Cu, Fe, Mn, Ca y
Mg EN ALGAS MARINAS DESTINADAS A LA ALIMENTACIN
HUMANA PRODUCIDAS Y PROCESADAS EN GALICIA
Los mtodos propuestos fueron aplicados para la determinacin de de Zn,
Cu, Fe, Mn, Ca y Mg en algas marinas destinadas a la alimentacin humana
producidas y procesadas en Galicia. Las muestras analizadas se adquirieron
en supermercados y tiendas de alimentacin. Estas algas son las siguientes:
Algas rojas: Agar-agar Atlntica (Gelidium sesquipedale), Dulse
(Palmaria palmata), Musgo de Irlanda (Chondrus crispus) y Nori (Porphyra
umbilicalis).
Algas pardas: Wakame (Undaria pinnatifida), Espagueti de Mar
(Himanthalia elongata), Kombu (Laminaria ochroleuca) y Kombu de azcar
(Laminaria saccharina).
Algas verdes: Lechuga de mar (Ulva rigida).
Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 10.
CONCLUSIONES
Las ventajas que presenta la metodologa automtica propuesta frente a los
mtodos analticos utilizados hasta el momento para realizar la determinacin
de metales en muestras de algas son las siguientes:
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Tabla 10. Resultados obtenidos para las muestras de algas analizadas: concentraciones
de Zn, Cu, Fe, Mn, Ca y Mg. Media desviacin estndar (n= 3 determinaciones).
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