Informe Enzimas

2016 - I
FACTORES QUE AFECTAN LA

ACTIVIDAD ENZIMTICA
Universidad Privada San Juan Bautista

onal de Medicina Humana
UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA
INFORME DE INVESTIGACIN
FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD

ENZIMTICA
ELABORADO POR:
DONAYRE ARAUJO CLAUDIA SUSANA
ICA PER
2016
Medicina Humana III Ciclo

2

INTRODUCCIN
El trmino cintica enzimtica implica el estudio de la velocidad de una

reaccin catalizada por una enzima y los efectos que pueden tener factores
como los inhibidores. Uno de los principales estudios que se realizan en una
enzima es medir el efecto en la velocidad de la reaccin cuando se modifican
las concentraciones del sustrato y se mantienen constantes la concentracin de
enzima, el pH, la fuerza inica del medio, la temperatura, entre otros.
Se evala la influencia de estos factores en la reaccin catalizada por enzimas

con la finalidad de determinar los intermediarios en una reaccin y el papel que
juegan en la reaccin enzimtica, es decir, para predecir mecanismos de
reaccin. Es esencial entender estos mecanismos para desarrollar nuevas
herramientas moleculares, por ejemplo, para combatir enfermedades en las
que se conoce a la enzima que la produce. Tambin es usual medir la actividad
enzimtica con diferentes sustratos para entender su especificidad o bien,
medir la actividad de la enzima de diferentes tejidos u organismos para
entender cmo las diferencias en actividad estn relacionadas con la funcin
y/o la fisiologa del organismo del que proceden.

3

I.
OBJETIVOS
1. Estudiar algunos factores que afectan la actividad enzimtica, como la
temperatura, el pH, la concentracin del sustrato y de la enzima y la
presencia de inhibidores.
2. Confrontar los conocimientos tericos adquiridos en clases con las
actividades experimentales en el laboratorio
II.
MARCO TEORICO
Para definir la actividad de una preparacin enzimtica se utiliza
en la prctica distintas expresiones. La cantidad de enzima se indica
habitualmente en unidad de actividad enzimtica (U). Se define la unidad
de actividad enzimtica como la cantidad de enzima que cataliza la
transformacin de un micromol de sustrato por minuto ( mol/min), bajo
condiciones ptimas de temperatura y pH. Normalmente, las unidades
de actividad que contiene una solucin se suele expresar en funcin del
volumen de la misma, en U/mL de solucin o referida a la cantidad de
protena presente en la solucin, expresada en U/mg de protena. En
este ltimo caso, la actividad enzimtica se denomina Actividad
especfica.
Recientemente, el Sistema Internacional de unidades (SI) ha

definido la unidad de actividad enzimtica como la cantidad de enzima
que transforma 1 mol de sustrato por segundo. Esta unidad se llama
katal (kat). Como 1 mol son 1x106 moles y 1 minuto son 60 segundos,
resulta que 1 katal equivale a 60x106 U. Esta unidad es muy grande, de
forma que se utilizan frecuentemente los submltiplos como el microkatal
(kat, 10-6 kat) o el nanokatal (nkat, 10-9 kat).
La actividad de una enzima puede determinarse midiendo la

cantidad de producto formando (o de sustrato consumido) por unidad de
tiempo. De esta manera existen distintos factores que pueden modificar
4

la actividad enzimtica. Los factores que modifican la actividad
enzimtica, entre otros, son:
1.- Concentracin de enzima

2.- Concentracin de sustrato
3.- Temperatura
4.- pH
5.- Inhibidores
A continuacin se detalla el efecto de cada uno de los factores

mencionados anteriormente.
1.
Concentracin de enzima
Cuando se determina la velocidad inicial de una reaccin

catalizada por una enzima a distintas concentraciones de sta, en
presencia
de
manteniendo
concentraciones
constante
los
saturantes
otros
de
factores
sustrato
ambientales
(temperatura y pH) se puede establecer la relacin entre cantidad

de enzima y actividad.
Cuanto mayor cantidad de enzima este presente, mayor
ser la velocidad que se alcanzar, debido a que necesito ms
cantidad de sustrato para alcanzar la saturacin.
La velocidad de la reaccin es directamente proporcional a

la concentracin de la enzima a cualquier concentracin de
sustrato. Por ejemplo, si la concentracin de enzima es
5

disminuida a la mitad, la velocidad inicial de la reaccin es
reducida tambin a la mitad de la original.
2.
Concentracin de sustrato

6

A medida que aumenta la cantidad de sustrato la velocidad
aumenta en forma lineal (zona proporcional), luego si bien la
velocidad contina aumentando ya no lo hace en forma lineal

(zona mixta) hasta que finalmente la reaccin alcanza una
velocidad mxima que es constante, se vuelve independiente de
la cantidad de sustrato (zona de saturacin). Esto ocurre debido a
que los sitios activos de las enzimas se encuentran todos
interactuando con las molculas de sustrato, por lo tanto hasta
que no finalice la reaccin la enzima no puede unirse a otro
sustrato.
La cintica enzimtica comienza a inicios del 1900 con la

derivacin de la Ecuacin de Michaelis-Menten, la que describe la
relacin entre la velocidad de la reaccin y la concentracin de
sustrato:

7

Se asume que la constante de velocidad de la reaccin
inversa para k3 es insignificante y
que lo importante son los
valores de velocidad inicial. Cuando estamos en velocidad inicial,

la cantidad de P es despreciable y, por lo tanto, la reaccin
inversa, E + P ES, es tambin despreciable. Las constantes de
velocidad se combinan dando la siguiente constante:
k +k
Km = 2
Donde k1, k2 y k3 son

constantes de velocidad
k1
La velocidad de la reaccin queda definida por la siguiente

ecuacin:
Donde
V= [S] V max
[S] + Km
V = velocidad de la reaccin Vmax = velocidad mxima

[S] = concentracin de sustrato
Km= constante de Michaelis-Menten

8

Km es un parmetro cintico muy importante al momento
de determinar la actividad de una enzima, ya que indica el grado
de afinidad de la enzima por un sustrato. El valor de Km es
inversamente proporcional a la fuerza de unin entre la enzima y
el sustrato. Un valor alto de Km, indica baja afinidad de la enzima
por el sustrato y un valor bajo, una alta afinidad.
Grfico de Velocidad de Reaccin versus Concentracin de

sustrato (V / [S])
La magnitud de Km es un valor caracterstico para la

combinacin de cada enzima con su sustrato. Al graficar V / [S] se
tendr:
V max
V max ----------2
Km
[S]
De este grfico se desprende que la Km corresponde a la

concentracin de sustrato a la que se obtiene la mitad de la
velocidad mxima.

9

Adems se pueden distinguir dos fases en la reaccin.
Una primera fase, en que la velocidad de la reaccin es

directamente
proporcional
la
concentracin
de
sustrato, es decir, es de orden uno. Esto ocurre a bajas

concentraciones de sustrato, por lo que la enzima no
est
saturada
de
sustrato,
de
manera
que
si
aumentamos la concentracin de sustrato, la velocidad

aumenta.
En la segunda fase, la velocidad de la reaccin se

vuelve independiente de la concentracin de sustrato,
es decir, es de orden cero. Esto ocurre cuando la
enzima es saturada por el sustrato, de manera que
aunque aumentemos la concentracin de sustrato, la
velocidad se mantiene constante.
Al tipo de curva obtenido por este grfico se le

llama
hiprbola
rectangular.
Como
no
es
una
representacin lineal, es difcil trabajar con ella y

obtener algunos datos. Lineaweaver-Burk, proponen un
tipo de grfico que considera los inversos de la
velocidad (1/V) y de la concentracin de sustrato (1/[S]),
obtenindose el siguiente tipo de grfico:
1
V
1
V max

10

1
Km
1
S
A este grfico, tambin se le conoce como de Dobles

Recprocos.
3.
Temperatura
Un aumento en la temperatura provoca un aumento

de la velocidad de reaccin hasta cierta temperatura, la
temperatura ptima. Por encima de esta temperatura, el
aumento de velocidad de la reaccin debido a la
temperatura es contrarrestado por la prdida de actividad
cataltica debida a la desnaturalizacin trmica, y la
actividad enzimtica decrece rpidamente hasta anularse.
Las enzimas de muchos mamferos tienen una temperatura
ptima de 37C, por encima de esa temperatura comienzan
a inactivarse y se destruyen. Sin embargo existen especies
de bacterias y algas que habitan en fuentes de aguas
termales y en el otro extremo ciertas bacterias rticas
tienen temperaturas ptimas cercanas a 0C.

11

4.
Ph
Las grficas muestran que a pH extremos las

protenas se desnaturalizan, por lo tanto la actividad
biolgica decae. Algunas enzimas no varan su actividad
con el pH sino que esta se mantiene constante en un
amplio rango. Otra
tendr el pH ptimo cido o bsico
teniendo en cuenta el medio en donde actan.
5.
Inhibidores

12

Muchos tipos diferentes de molculas inhiben las
enzimas, y actan de diversas formas.
Estos inhibidores pueden provocar una inhibicin

irreversible o una inhibicin reversible.
Inhibidores irreversibles: estos inhibidores se enlazan

con fuerza a la enzima, se unen COVALENTEMENTE a
algn aminocido del sitio activo. Producen cambios
permanentes en la molcula de enzima, con deterioro
definitivo de su capacidad cataltica. (Ejemplos, son los
compuestos
organofosforados
utilizados
como
insecticidas, el alopurinol un inhibidor utilizado en el

tratamiento de la Gota, etc).
Inhibidores
reversibles:
Los
diversos
modos
de
inhibicin reversible implican todos ellos la unin NO

COVALENTE de un inhibidor a la enzima, pero difieren
en los mecanismos por medio de los cuales reducen la
actividad enzimtica y en la forma en que afectan la
cintica
de
encontramos
la
reaccin.
los
Dentro
inhibidores
de
este
grupo
competitivos,
no
competitivos y incompetitivos. Sin embargo, los tipos de

inhibicin ms frecuentes son la competitiva y la no
competitiva.
Los
inhibidores
competitivos
compiten
con
el
sustrato por el sitio activo de la enzima, y si

aumentamos la cantidad de sustrato, el efecto

13

inhibidor se revierte alcanzndose la velocidad
mxima.
Los inhibidores no competitivos se enlazan a un sitio

distinto del sitio activo, de manera que el inhibidor se
puede unir a la enzima libre o bien al complejo
enzima sustrato, pero en ninguno de los casos
obtendremos
productos.
El
efecto
de
estos
inhibidores no se revierte por el agregado de mayor

cantidad de sustrato, de manera que se llega a una
velocidad mxima menor que si no tuviera el
inhibidor.

14

Los inhibidor incompetitivo se fijan a un sitio distinto

al del sustrato, con la diferencia que solamente se
fija al complejo enzima-sustrato.

15

No es raro observar algunos inhibidores a los cuales

no se les puede comprobar el mecanismo exacto de
inhibicin, siendo en algunos casos un tipo de inhibicin
mixta.
III.
MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS:
Espectrofotmetro
Tubos de ensayo

16

Pipetas de 10 ml graduadas 1/10 (3 por cada mesa).
Agua destilada.
Solucin almidon 1%
Solucin salina (NaCl 1%)
Buffer fosfato ph 6.6

Solucin amilasa
HCl 0.5 N

17

Solucin yodada
Papel milimetrado cuadriculado.
IV.
PARTE EXPERIMENTAL:
EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE LA ENZIMA, DE LA

TEMPERATURA Y DEL ION CLORO SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA
AMILASA SALIVAL
1. Prepararamos los siguientes tubos:
Tubos No.
Solucin almidn 1%
Buffer fosfato pH 6.6
Solucin salina (NaCl 1%)
Agua destilada
I
1 ml
5 ml
2.8 ml
---
II
1 ml
5 ml
2.6 ml
---
III
1 ml
5 ml
2.4 ml
---
IV
1 ml
5 ml
2.2 ml
---
V
VI
1 ml
1 ml
5 ml
5 ml
--2.2 ml
2.2 ml
---
2. Colocamos los tubos I al V en un bao de agua a 37 C, durante 5

minutos. El tubo VI nos sirvi de comparacin para ver el efecto de la
temperatura sobre la accin enzimtica por lo que se dej a
temperatura ambiente.
3. Luego, agregamos la solucin de enzima:
Tubos No.

18
II
III
IV
VI

Solucin amilasa
0.4 ml
0.8 ml
1.2 ml 1.6 ml 1.6 ml 1.6 ml
4. Despus, colocamos nuevamente los tubos I al V en bao de agua a

37C durante 20 minutos, el tubo VI se mantiene a temperatura
ambiente.
5. A continuacin hicimos el control final de la reaccin con el reactivo
de yodo, de la siguiente manera:
Tubos No.
HCl 0.05 N
de los tubos de reaccin
correspondientes agregar
Solucin yodada
I
5 ml
0.5 ml
II
5 ml
0.5 ml
III
5 ml
0.5 ml
IV
V
VI
5 ml
5 ml
5 ml
0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
6. Mezclamos y dejamos en reposo por 10 minutos.

7. Leemos las absorbancias al espectrofotmetro a 650 nm. La
diferencia de las absorbancias entre los tubos nos indic la actividad
enzimtica para cada tubo.
TUBOS
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
Tubo 5
Tubo 6
Tubo 7
ABSORBANCIA
0.019
0.018
0.017
0.016
0.015
0.015
0.040
8. Finalmente, graficamos en papel milimetrado: Actividad enzimtica en

el eje Y vs concentracin de la enzima [E] en el eje X.

19

V.
CUESTIONARIO:
1. Cul es la importancia del Km?
La Km es una constante para cada enzima, y su importancia radica
en que es un ndice muy aproximado (aunque no totalmente exacto)
de la afinidad de la enzima respecto a su sustrato. En efecto, si la Km
es muy pequea, quiere decir que a baja [S] se alcanzar la
velocidad mxima. En otras palabras, la Km suele ser inversamente
proporcional a la afinidad de la enzima por el sustrato.
Adems, la Km nos da una idea la afinidad que tiene el enzima por
su sustrato, cuanto mayor es Km menor es la afinidad (predominan
las formas E y S libres), cuanto menor es Km mayor es la afinidad
(predomina la forma ES).

20

2. Qu efectos produce las altas temperaturas sobre las enzimas?
Aunque el aumento de las temperaturas puede hacer que las
enzimas funcionan ms rpidamente, si la temperatura sube
demasiado la enzima deja de funcionar. Las enzimas se basan en
que tiene una estructura tridimensional muy especfico para trabajar
derecha. Si la temperatura alrededor de una enzima se pone
demasiado alta, la enzima pierde su forma, que se conoce como la
desnaturalizacin, y deja de trabajar. La mayora de las enzimas se
convertirn desnaturalizado a temperaturas muy altas.
Como sabemos las enzimas son siempre protenas, entonces stas
soportan temperaturas relativamente altas. Pero superada esa
temperatura, las protenas se desnaturalizan y por tanto tambin las
enzimas.
Se estima que la temperatura aproximada de desnaturalizacin in
vitro en de 45 C. In vivo pueden soportar temperaturas ambientales
ms altas pero es porque el cuerpo utiliza todos sus sistemas de
refrigeracin. Se puede vivir a temperaturas de hasta unos 50 C
Este fenmeno tiene la aplicacin industrial de sobrecalentar
sustancias, sobre todo alimenticias, que contengan enzimas que
puedan estropearlas. Por ejemplo, cortar una fermentacin vnica
para que no se convierta en actica.
3. Cmo se clasifican las enzimas?
Tipo de enzimas
Actividad
Catalizan
reacciones
de hidrlisis.
Rompen
las
biomolculas con molculas de agua. A este tipo

Hidrolasas
pertenecen las enzimas digestivas.

A-B + H2O

21
AH + B-OH

Un ejemplo es la lactasa, que cataliza la reaccin:
lactosa + agua
glucosa + galactosa
Catalizan las reacciones en las cuales un ismero se

transforma
en
otro, es
decir,
reacciones
de
isomerizacin.
A
Son ejemplos la fosfotriosa isomerasa y la fosfoglucosa

isomerasa, que catalizan las reacciones representadas
en la tabla inferior:
fosfotriosa isomerasa
Isomerasas
gliceraldehdo-3-fosfato
dihidroxiacetona-fosfato
fosfoglucosa isomerasa
glucosa-6-fosfato
fructosa-6-fosfato
Catalizan la unin de molculas.
A + B + XTP
Ligasas
A-B + XDP + Pi
Un ejemplo es la piruvato carboxilasa, que cataliza la

reaccin:
P Piruvato + CO2 + ATP
Liasas
oxaloacetato + ADP + Pi
Catalizan las reacciones de adicin de enlaces o

22

eliminacin, para producir dobles enlaces.
A-B
A+ B
Un ejemplo es la acetacetato descarboxilasa, que

cataliza la reaccin:
cido acetactico
Catalizan
reacciones
CO2 + acetona
de
xido-reduccin.
Facilitan
latransferencia de electrones de una molcula a

otra. Ejemplo; la glucosa, oxidasa cataliza la oxidacin
de glucosa a cido glucnico.
Oxidorreductasas
AH2 + B
Ared + Box
A + BH2
Aox + Bred
Catalizan la transferencia de un grupo de una sustancia

a otra. Ejemplo: la transmetilasa es una enzima que
Tansferasas
cataliza la transferencia de un grupo metilo de una

molcula a otra.
A-B + C
A + C-B
4. A qu se llaman zimgenos e isoenzimas?

23

Un zimgeno o proenzima es un precursor enzimtico inactivo,
es decir, no cataliza ninguna reaccin como hacen las
enzimas. Para activarse, necesita de un cambio bioqumico en
su estructura que le lleve a conformar un centro activo donde
pueda realizar la catlisis. En ese momento, el zimgeno pasa
a ser una enzima activa.
Las isoenzimas o isozimas son enzimas que difieren en la
secuencia de aminocidos, pero que catalizan la misma
reaccin qumica. Estas enzimas suelen mostrar diferentes
parmetros cinticos (i.e. diferentes valores de KM), o
propiedades de regulacin diferentes. La existencia de las
isoenzimas permite el ajuste del metabolismo para satisfacer
las necesidades particulares de un determinado tejido o etapa
del desarrollo.
5. Que son cofactores? Mencione ejemplos.

Un cofactor es un componente no proteico, termoestable y de baja
masa molecular, necesario para la accin de una enzima. El cofactor
se une a una estructura proteica, denominada apoenzima, y el
complejo apoenzima-cofactor recibe el nombre de holoenzima.
Aquellos
cofactores
que
estn
covalentemente
unidos
la
apoenzima son denominados grupos prostticos, ya sean orgnicos

(coenzimas) o inorgnicos.
Los cofactores se pueden clasificar atendiendo a diferentes criterios,
uno de los ms comunes es segn su naturaleza orgnica o
inorgnica:
Cofactores inorgnicos: iones metlicos (Mg2+, Cu+, Mn2+) y
los centros hierro-azufre.

Cofactores orgnicos: las coenzimas, por ejemplo la flavina, y
los grupos prostticos, por ejemplo el grupo hemo. Como
veremos a continuacin, la diferenciacin entre coenzima y

24

grupo prosttico es algo difusa y hay autores que proponen el
uso de slo uno de los dos trminos y abandonar el otro.
VI.
CONCLUSIONES
Como producto del anlisis de los resultados del experimento realizado
en el laboratorio, se pueden extraer las siguientes conclusiones:
La temperatura es un factor determinante en las reacciones

enzimticas porque acelera o retarda la accin de las enzimas, lo
que se evidencia con la produccin de burbujas.

Para que la catalasa funcione correctamente debe tener un ph
neutro y temperatura ambiente.

25

VII.
BIBLIOGRAFA
1. DOcon MC, Garca MJ, Vicente JC (1998). Estudio del equilibrio
cido-base. En DOcon MC, Garca MJ, Vicente JC (eds):
Fundamentos y Tcnicas de Anlisis Bioqumico, 1 ed. Editorial
Paraninfo (Madrid, Espaa), pp. 27 38.
2. GUIRRE
OBANDO,
O.A.;
MORALES
LVAREZ,
E.D.:
Reconocimiento de carbohidratos. Visitar Web: Universidad de

Quindio, Facultad de Educacin. Consulta 27 de julio de 2010.
(1988): Fehling (Germn). Enciclopedia Universal
3. ANNIMO
Ilustrada Europeo-Americana, 23, 560. Madrid, Espasa-Calpe.

26

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DONAYRE ARAUJO CLAUDIA SUSANA

Medicina Humana III Ciclo

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El trmino cintica enzimtica implica el estudio de la velocidad de una

Se evala la influencia de estos factores en la reaccin catalizada por enzimas

Medicina Humana III Ciclo

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Recientemente, el Sistema Internacional de unidades (SI) ha

La actividad de una enzima puede determinarse midiendo la

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1.- Concentracin de enzima

A continuacin se detalla el efecto de cada uno de los factores

Cuando se determina la velocidad inicial de una reaccin

(temperatura y pH) se puede establecer la relacin entre cantidad

La velocidad de la reaccin es directamente proporcional a

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velocidad contina aumentando ya no lo hace en forma lineal

La cintica enzimtica comienza a inicios del 1900 con la

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que lo importante son los

valores de velocidad inicial. Cuando estamos en velocidad inicial,

Donde k1, k2 y k3 son

La velocidad de la reaccin queda definida por la siguiente

V = velocidad de la reaccin Vmax = velocidad mxima

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Grfico de Velocidad de Reaccin versus Concentracin de

La magnitud de Km es un valor caracterstico para la

De este grfico se desprende que la Km corresponde a la

Medicina Humana III Ciclo

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Una primera fase, en que la velocidad de la reaccin es

sustrato, es decir, es de orden uno. Esto ocurre a bajas

aumentamos la concentracin de sustrato, la velocidad

En la segunda fase, la velocidad de la reaccin se

Al tipo de curva obtenido por este grfico se le

representacin lineal, es difcil trabajar con ella y

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A este grfico, tambin se le conoce como de Dobles

Un aumento en la temperatura provoca un aumento

Medicina Humana III Ciclo

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Las grficas muestran que a pH extremos las

tendr el pH ptimo cido o bsico

teniendo en cuenta el medio en donde actan.

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Estos inhibidores pueden provocar una inhibicin

Inhibidores irreversibles: estos inhibidores se enlazan

insecticidas, el alopurinol un inhibidor utilizado en el

inhibicin reversible implican todos ellos la unin NO

competitivos y incompetitivos. Sin embargo, los tipos de

sustrato por el sitio activo de la enzima, y si

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