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Dissertao de Mestrado
Aplicao de
Tecnologia Enzimtica
na Obteno de
-Caroteno a partir de
leo de Buriti
(Mauritia vinifera)
Bernardo Dias Ribeiro
RIO DE JANEIRO
FEVEREIRO/2008
DISSERTAO DE MESTRADO APRESENTADA AO CORPO DOCENTE DO CURSO DE PSGRADUAO EM TECNOLOGIA DE PROCESSOS QUMICOS E BIOQUMICOS DA ESCOLA
DE QUMICA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIIRO, COMO PARTE DOS
REQUISITOS NECESSRIOS OBTENO DO GRAU DE MESTRE EM CINCIAS (M.Sc.).
Orientadores:
Prof. Daniel Weingart Barreto, D. Sc.
Prof. Maria Alice Zarur Coelho, D. Sc.
RIO DE JANEIRO
FEVEREIRO/2008
ii
T
18
R484a Ribeiro, Bernardo Dias
Aplicao de tecnologia enzimtica na obteno de caroteno a partir de leo de buriti (Mauritia vinifera)/
Bernardo Dias Ribeiro. Rio de Janeiro, 2008.
xvi, 103 f.: il.
Dissertao (Mestrado em Tecnologia de Processos
Qumicos e Bioqumicos) Universidade Federal do Rio
de Janeiro, Escola de Qumica, 2008.
Orientadores: Daniel Weingart Barreto e Maria Alice
Zarur Coelho
1. Hidrlise enzimtica. 2. leo de Buriti. 3. Caroteno 4. Lipases
I. Barreto, D. W. (Orient.)
II. Coelho, M. A. Z. (Orient.)
III. UFRJ. Escola de Qumica. IV. Ttulo
CDD: 665.3
iii
iv
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, agradeo a Deus por ter me dado fora e autoconfiana para conseguir
superar todas as dificuldades que enfrentei durante esta dissertao;
minha me Sonia, que sempre lutou muito para me dar estudo, comida, conforto, e
tudo mais o que ela pode fazer, apesar de todas as dificuldades que a vida lhe proporcionou.
Sempre darei o meu melhor para poder corresponder o seu esforo, me;
minha av Maria, meu av Afranio e meu tio Afranio Jos por me apoiarem sempre
quando precisei, apesar de no conseguir ser mais presente como era em alguns anos atrs,
mas tenham certeza que amo muito todos vocs;
minha noiva Aline, porque alm de me fazer muito feliz, me deu algumas sugestes
interessantes durante a conduo desta dissertao;
A todos os meus amigos e familiares, por no terem me esquecido apesar de toda
minha ausncia neste perodo;
Ao meu orientador prof. Daniel Barreto, grande mestre e pai cientfico, por ter me
ensinado como pensar mais concretamente sobre produtos naturais e tambm na minha vida, a
ter mais foco nas pesquisas devido a minha avidez de querer saber sobre tudo e achar tudo
interessante. Grandes conversas na hora do almoo que giravam em torno de praticamente
qualquer assunto. Acima de tudo, mestre, obrigado por sua amizade e considerao;
minha orientadora prof Maria Alice, por ter me acolhido carinhosamente no seu
laboratrio desde 2003, e que considero como minha madrinha cientfica. Quem conhece
sabe que voc tem um corao imenso, teacher, e s tenho a agradecer por mim e por todos do
laboratrio por tudo o que voc faz pensando em ns;
Roberta, Etel, Priscilla, Gizele, Ana Iraidy, Ariana, Andr, Mariana, Kelly, Tatiana
e todos os outros que freqentaram o laboratrio de Enzimologia Industrial, pela amizade e
pelo ambiente agradvel de trabalho;
estagiria Lvia, por ter me ajudado em algumas anlises em um ponto crtico da
dissertao, e tambm ao pessoal do Departamento de Processos Orgnicos (rika, Elizandra,
Karine e Lourdes) pela convivncia pacifica e divertida;
prof Suely Freitas, por te me emprestado alguns solventes para realizao de
experimentos;
prof Eliana Flvia, e ao tcnico Paulinho, por terem permitido o uso do shaker no
laboratrio E-107;
A prof Magali Cammarota, por ter permitido o uso dos seus equipamentos, enquanto
nosso laboratrio estava em obras;
A prof Andra Salgado e a ps-doutoranda Ninoska, por ter permitido o uso de seu
shaker no Laboratrio de Engenharia Qumica;
Ao prof Alexandre Torres (IQ-UFRJ), por ter me tirado vrias dvidas de HPLC, e de
anlise de insaponificveis;
prof Claudia Rezende (IQ-UFRJ), e as alunas Carolina, Silvia e Michelle, por terem
feito e me explicado um pouco mais sobre anlise da composio de cidos graxos em
cromatografia em fase gasosa;
vi
RESUMO
RIBEIRO, Bernardo Dias. Aplicao de tecnologia enzimtica para obteno de caroteno a partir de leo de buriti (Mauritia vinifera). Rio de Janeiro, 2008. Dissertao
(Mestrado em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos) Escola de Qumica,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2008.
O -caroteno utilizado como corante alimentcio ou como complemento nutricional, por ser
a principal fonte de pr-vitamina A. Estima-se que o mercado mundial de carotenides, que
em 2005 foi de 887 milhes de dlares, ir crescer 3% ao ano, quebrando a barreira de 1
bilho de dlares em 2009, sendo o -caroteno responsvel por quase 30% deste mercado. A
maior parte do -caroteno vendido no mundo obtida por sntese qumica a partir da ionona, mas uma pequena parte produzida por processos biotecnolgicos, utilizando
diferentes microorganismos, tais como fungos filamentosos (Blaskelea trispora e Phycomyces
blaskeleeanus), leveduras (Rhodotorula glutinis), bactrias (Flavobacterium multivorum) e
microalgas (Dunaliella salina e D. bardawil). Alguns frutos oleaginosos como o dend
(Elaeis guineensis) e o buriti (Mauritia vinifera) apresentam um alto teor de carotenides,
principalmente de -caroteno. O buriti uma palmcea que cresce em diversas reas do
Brasil, e apresenta diversos usos tradicionais, como na preparao de refrescos e doces da
regio Amaznica. O recente interesse em novas fontes naturais de -caroteno tm estimulado
o desenvolvimento de processos para a extrao do leo rico em carotenides do buriti. A
maior parte desses processos, entretando, ainda baseada em tecnologias convencionais que
incluem a secagem e a prensagem do leo da polpa. O presente trabalho trata da
caracterizao inicial do leo bruto e refinado de buriti, incluindo a determinao dos
insaponificveis, e posteriormente a hidrlise enzimtica de ambos os leos, para a posterior
extrao e concentrao de -caroteno. Na etapa de hidrlise foi avaliado o desempenho de
duas lipases comerciais, Lipozyme TL IM e CALB L, e tambm de uma lipase produzida em
laboratrio originada de Yarrowia lipolytica. Os parmetros avaliados no processo de
extrao foram: temperatura, quantidade de enzima (atividade enzimtica) e relao substrato
(leo de buriti) / gua. As condies experimentais foram estabelecidas atravs de um
planejamento estatstico de experimentos, de forma a se otimizar seus valores em funo do
maior rendimento de cidos graxos livres e a perda mnima de carotenides durante o
processo. Os resultados foram analisados em relao ao teor de cidos graxos livres por
titulao; carotenides totais por espectrofotmetro e composio de carotenides totais por
HPLC, utilizando coluna YMC ODS-A com fase mvel de acetonitrila/metanol/THF
(50/45/5). Na caracterizao do leo bruto, os resultados foram similares aos j encontrados
na literatura, mas o leo refinado apresentou apocarotenides, que so formados durante o
processo de refino de leos vegetais. As condies timas de hidrlise enzimtica foram
diferentes para cada leo, onde a lipase Lipozyme TL IM apresentou uma atividade lipoltica
superior s demais. Aps a hidrlise do leo, foram testados alguns mtodos para separar os
cidos graxos formados dos carotenides, e assim aumentar a concentrao de -caroteno no
produto final.
viii
ABSTRACT
RIBEIRO, Bernardo Dias. Aplicao de tecnologia enzimtica para obteno de caroteno a partir de leo de buriti (Mauritia vinifera). Rio de Janeiro, 2008. Dissertao
(Mestrado em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos) Escola de Qumica,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2008.
-carotene is the main source of provitamin A, and is widely used as a food colorant and
nutritional supplier. The global market for carotenoids, which was of US$ 887 millions in
2005 and has been growing at an yearly rate of 3% , is estimated to surpass US$ 1 billion in
2009., -carotene being responsible for almost 30% of this market. Most of the -carotene
sold in the world is produced by chemical synthesis from -ionone, but a small amount is
manufactured using biotechnological processes, based on different microorganisms, such as
fungi (Blaskelea trispora and Phycomyces blaskeleeanus), yeasts (Rhodotorula glutinis),
bacteria (Flavobacterium multivorum) e microalgae (Dunaliella salina and D. bardawil).
Some oleaginous fruits such as palm (Elaeis guineensis) and buriti (Mauritia vinifera) present
high concentrations of carotenoids, specially -carotene. Buriti is a palm tree that grows wild
in different areas of Brazil, and has been traditionally used for the preparation of beverages
and candies in the Amazon area. The recent interest about other natural sources of -carotene
stimulated the development of processes to extract the carotenoid-rich oil of the buriti fruit.
Most processes, however, are still based on the conventional technologies for pulps, including
drying and pressing the oil off the pulp. The present work involves the initial characterization
of crude and refined buriti oil. The characterization includes the determination of
unsaponifiable matter, followed by enzymatic hydrolysis, for further extraction and
concentration of -carotene from the buriti oil. In the hydrolysis process, the performance of
two commercial lipases Lipozyme TL IM and CALB L, and also a lipase originated from
Yarrowia lipolytica produced in our laboratory was evaluated. The analysed parameters in the
hydrolysis process were temperature, enzyme quantity (enzymatic activity) and ratio substrate
buriti oil/ water. The experimental conditions were established based on an experimental
design in order to set the more favourable conditions for the process. The results were
analysed for the free fatty acids contents using titration; total carotenoids using
spectrophotometry and its composition by HPLC, using a YMC ODS-A column with a
mobile phase of acetonitrile/methanol/THF (50/45/5). In the characterization of crude oil, the
results were similar with those described in the literature, but the refined oil presented
apocarotenoids, which were formed during the refining of the oils. The optimized conditions
of the enzymatic hydrolysis were different for each oil, where the Lipozyme TL IM had a
higher lipolytic activity. After the hydrolysis of the oil, some methods were tested to separate
the fatty acids formed from the carotenoids, increasing the -carotene concentration in the
final product.
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Exemplares de soja, canola e palma ..........................................................................1
Figura 2 - Traumatina .................................................................................................................1
Figura 3 - Principais carotenos ...................................................................................................5
Figura 4 - Principais xantofilas...................................................................................................6
Figura 5 - Biossntese resumida dos insaponificveis (Simes et al, 2003)...............................8
Figura 6 - Esquema geral de biossntese de terpenides (Dewick, 2002) ..................................8
Figura 7 - Biossntese de licopeno. (Dey & Harborne, 1997; Bouvier et al, 2005). ..................9
Figura 8 - Biossntese de carotenides a partir do licopeno. (Dey & Harborne, 1997; Bouvier
et al, 2005)................................................................................................................................10
Figura 9 - Principais ismeros cis do -caroteno .....................................................................11
Figura 10 - Epoxicarotenides derivados do -caroteno..........................................................11
Figura 11 - Apocarotenides derivados do -caroteno ............................................................12
Figura 12 - Formulao de -caroteno dispersvel em gua (http://www.corporate.basf.com/,
2007).........................................................................................................................................15
Figura 13 Alimentos biofortificados. A) Tomate laranja e normal; B) Arroz dourado e
branco .......................................................................................................................................16
Figura 14 - Vias sintticas para obteno de -ionona.............................................................18
Figura 15 - Sntese de -caroteno por condensao enol-ter..................................................19
Figura 16 Sntese de -caroteno por condensao de Wittig ................................................19
Figura 17 Dunaliella salina e seu cultivo em tanques abertos ..............................................20
Figura 18 Phycomyces blakesleeanus e um zigosporo de Blakeslea trispora.......................22
Figura 19 - Rhodotorula glutinis e Sporobolomyces roseus ....................................................22
Figura 20 - Halomonas elongata e Escherichia coli ................................................................23
Figura 21 Palmeiras e frutos do buriti ...................................................................................25
Figura 22 Algumas reaes catalisadas por lipases...............................................................30
Figura 23 Esquema geral do stio ativo de uma lipase ..........................................................32
Figura 24 Mecanismo de reao em lipases ..........................................................................33
Figura 25 Perfil de carotenides dos leos de buriti .............................................................55
Figura 26 Avaliao do tempo reacional de hidrlise dos leos bruto (a) e refinado (b) de
buriti .........................................................................................................................................56
Figura 27 Avaliao da quantidade de cidos graxos produzida pelo custo de lipase durante
a hidrlise de leo bruto (a) e refinado (b) de buriti.................................................................56
Figura 28 Avaliao da temperatura na reduo da concentrao de -caroteno durante a
hidrlise de leo bruto (a) e refinado (b) de buriti ...................................................................57
Figura 29 Avaliao da relao leo/gua na hidrlise dos leos bruto (a) e refinado (b) de
buriti .........................................................................................................................................58
Figura 30 Avaliao da quantidade de enzima sobre a hidrlise dos leos bruto (a) e
refinado (b) de buriti.................................................................................................................58
Figura 31 Avaliao da quantidade de enzima sobre a concentrao de carotenides .........58
Figura 32 Avaliao de emulsificantes sobre a hidrlise enzimtica dos leos bruto (a) e
refinado (b) de buriti.................................................................................................................59
Figura 33 - Avaliao da adio de clcio sobre a hidrlise dos leos bruto (a) e refinado (b)
de buriti.....................................................................................................................................60
Figura 34 Avaliao de adio de adsorventes sobre a hidrlise dos leos bruto (a) e
refinado (b) de buriti.................................................................................................................61
Figura 35 - Avaliao da quantidade de alumina sobre a hidrlise dos leos bruto (a) e
refinado (b) de buriti.................................................................................................................62
x
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Insaponificveis de alguns leos vegetais ................................................................2
Tabela 2 Potenciais fontes vegetais produtoras de -caroteno..............................................24
Tabela 3 Composio centesimal da polpa do fruto de buriti ...............................................26
Tabela 4 Perfil de cidos graxos de frutos oleaginosos.........................................................27
Tabela 5 Perfil de carotenides de alguns leo vegetais .......................................................27
Tabela 6 Faixas timas de atuao de algumas lipases .........................................................31
Tabela 7 - Comparao entre processos convencionais de hidrlise de leos e gorduras........35
Tabela 8 Faixa de valores utilizada para otimizao dos parmetros da hidrlise enzimtica
..................................................................................................................................................50
Tabela 9 Planejamento Composto Central em 3 nveis com 3 pontos centrais.....................51
Tabela 10 Comparao da composio de cidos graxos dos leos de buriti .......................52
Tabela 11 Comparao dos ndices fsico-qumicos dos leos de buriti...............................53
Tabela 12 Comparao da composio de carotenides dos leos de buriti.........................54
Tabela 13 Comparao dos resultados (cidos graxos livres e carotenides) da hidrlise
enzimtica do leo bruto de buriti utilizando planejamento composto central ........................63
Tabela 14 Comparao dos resultados (cidos graxos livres e carotenides) da hidrlise
enzimtica do leo refinado de buriti utilizando planejamento composto central ...................70
Tabela 15 Comparao das condies timas para hidrlise enzimtica do leo bruto de
buriti .........................................................................................................................................77
Tabela 16 Comparao das condies timas para hidrlise enzimtica do leo refinado de
buriti .........................................................................................................................................77
xii
xiii
SUMRIO
CAPTULO 1 INTRODUO _____________________________________________ 1
CAPTULO 2 REVISO BIBLIOGRFICA _________________________________ 5
2.1) CAROTENIDES ___________________________________________________ 5
2.1.1) Caractersticas Gerais ______________________________________________ 5
2.1.2) Biossntese _______________________________________________________ 7
2.1.3) Propriedades e modificaes ________________________________________ 10
2.1.4) Aes benficas sade____________________________________________ 12
2.1.5) -Caroteno ______________________________________________________ 14
2.1.5.1) Formas de comercializao ______________________________________ 14
2.1.5.1.1) Matrizes lipoflicas_________________________________________ 14
2.1.5.1.2) Matrizes hidroflicas________________________________________ 15
2.1.5.1.3) Alimentos biofortificados____________________________________ 16
2.1.5.2) Mercado_____________________________________________________ 17
2.1.5.3) Fontes Comerciais_____________________________________________ 17
2.1.5.3.1) -caroteno Sinttico ________________________________________ 17
2.1.5.3.2) -caroteno Natural _________________________________________ 20
A Processos Biotecnolgicos ___________________________________ 20
A.1 Microalgas ______________________________________________ 20
A.2 Fungos Filamentosos______________________________________ 21
A.3 Leveduras _______________________________________________ 22
A.4 Bactrias ________________________________________________ 23
B Extrao de Fontes Vegetais _________________________________ 24
2.2) BURITI____________________________________________________________
2.2.1) Caractersticas Gerais _____________________________________________
2.2.2) leo de Buriti ____________________________________________________
2.2.3) Outras Tecnologias _______________________________________________
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81
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CAPTULO 1 INTRODUO
Os leos vegetais so a maior fonte de lipdeos comestveis, contabilizando mais de
75% do total de gorduras consumidas no mundo, com uma produo anual de cerca de 150
milhes de toneladas. Entre estes, quase 75% extrada do endosperma de sementes de
oleaginosas, como a soja e a canola, enquanto os demais so extrados do pericarpo de frutos,
como oliva e palma (Figura 1) (Salas et al, 2000; FAO, 2007).
Figura 2 - Traumatina
-Tocoferol Carotenides
(ppm)
(ppm)
leos
Insaponificveis
(%)
Fitoesteris
(ppm)
Coco
0,8 1,5
500 1100
Milho
1,3 2,8
7900 22100
112 134
1,2 3,6
Algodo
1,5 2,0
2700 5900
389
900 2900
130
Amendoim
0,4 1,0
Palma
1,2
400 500
130 260
500 700
Palmiste
0,1 0,8
800 1400
62
4,3 11,8
Oliva
0,5 1,5
1200 2700
119
1 20
Canola
1,2 2,0
4800 11300
210
130
Soja
0,5 1,6
1800 4100
75 - 117
Girassol
1,5
2400 4500
487 608
1,0 1,5
Arroz
35
1800
800
2.1.2) Biossntese
Os precursores dos metablitos especiais presentes nos leos vegetais, e o prprio leo
so intermedirios no metabolismo primrio, que se inicia a partir da fotossntese, onde a
glicose gerada para depois ser consumida na respirao e produzir gua e CO2, sendo que
esta ocorre em 3 etapas: gliclise, ciclo do cido ctrico e fosforilao oxidativa. De uma
forma resumida, a Figura 5 mostra a formao destes metablitos visando principalmente nos
insaponificveis (Berg et al, 2004).
FPP
IPP
IPP
GGPP
PD
PD
ZD
CRTISO
ZD
Figura 7 - Biossntese de licopeno. PD: fitoeno desaturase; ZD, -caroteno desaturase; CRTISO, carotenide
isomerase (Dey & Harborne, 1997; Bouvier et al, 2005).
LCE
LCB
LCB
LCB
CHB1, CHB2
CHB1, CHB2
CHE
CHB1, CHB2
Figura 8 - Biossntese de carotenides a partir do licopeno. LCE, licopeno -ciclase; LCB, licopeno -ciclase;
CHB1, carotenide -hidroxilase non-heme-di-ferro monooxigenase; CHB2, carotenide -hidroxilase ligada ao
ncleo heme do citocromo P450; CHE, carotenide -hidroxilase ligada ao ncleo heme do citocromo P450
(Dey & Harborne, 1997; Bouvier et al, 2005).
10
11
12
2.1.5) -Caroteno
O caroteno foi isolado pela primeira vez por Wackenroder em 1831 na forma de
cristais de cor vermelho-rubi extrado a partir da cenoura. Mas somente em 1907, Willstder
identificou a frmula molecular correta para o caroteno, C40H56, apesar de ainda ser uma
mistura de -caroteno e -caroteno. Em 1930, Karrer e Kuhn, obtiveram a formulao correta
do licopeno, -caroteno, -caroteno, zeaxanatina e lutena (Isler,1971; Britton et al,1995).
2.1.5.1) Formas de comercializao
O -caroteno utilizado como corante alimentcio, variando de amarelo a laranja, em
concentraes entre 2 a 50 ppm, ou como complemento nutricional, por ser a principal fonte
de pr-vitamina A, j que 100% pode ser convertido a vitamina A (Britton et al,1995).
Os carotenides sintticos so purificados por cristalizao com o objetivo de formar
grandes cristais, os quais podem ser facilmente separados por filtrao e lavados dos ismeros
cis e dos subprodutos remanescentes na soluo. Para serem comercializados, os carotenides
precisam ser formulados para aplicao em matrizes hidroflicas (sucos e bebidas) ou
lipoflicas (manteigas, margarinas e queijos), e para isso preciso tambm diminuir o
tamanho dos cristais.
15
16
17
Este intermedirio era originalmente obtido de fontes naturais como o leo de capimlimo (Cymbopogon citratus) ou a terebentina do pinho (Pinus caribea), mas atualmente a ionona obtida a partir da acetona, ou atravs do butadieno, como mostrado na Figura 14
(Isler,1971; Britton et al, 1996).
18
19
utilizado
como
suplemento
nutricional
(Dufoss
et
al,
2005;
http://www.cotecportugal.pt/, 2006).
A Processos Biotecnolgicos
A.1 Microalgas
O gnero Dunaliella pertence ao grupo das microalgas unicelulares halotolerantes que
acumulam uma grande quantidade de -caroteno em seu cloroplasto devido a alta intensidade
luminosa, obtendo em mdia, sob condies ideais em tanques abertos (Figura 17), 400 mg caroteno por rea (m) de cultivo ao dia, i. e. 10 a 14 % em peso seco no caso de Dunaliella
salina e D. bardawil (Dufoss et al, 2005; Gobbi, 2006; Spolaore et al, 2006). GarcaGonzlez et al (2005) tambm testaram a produo de -caroteno por cultivo em
fotobiorreatores tubulares, gerando 100 mg/m ao dia.
.
Figura 17 Dunaliella salina e seu cultivo em tanques abertos
20
21
22
A produo por F. multivorum foi de 2,9 mg/g de carotenides totais, sendo 82% de caroteno, 7% -criptoxantina e 11% zeaxantina em 2 dias de fermentao (Bhosale &
Bernstein, 2004).
23
Fontes Vegetais
Carotenides
(g/g)
-caroteno
(%)
Referncias
85 -174
49 - 65
Rodriguez-Amaya, 2001
470-700
54,4
Rodriguez-Amaya, 2001
160-226
92-95
Rodriguez-Amaya, 1996
513,9
72,5
Buriti (leo)
1150-3380
8,8 - 18,8
69,8-90,6
Tucum
(Astrocaryum aculeatum)
62,6 - 96,6
75,6-89,3
38
61,1
80,9
76,9
22,7
76,2
17,8
92,1
21
85,4
102,9
78,9
59,6
92,3
Rodriguez-Amaya, 1996
Rodriguez-Amaya, 2001
24
2.2) BURITI
2.2.1) Caractersticas Gerais
Na Tabela 2, verifica-se que o buriti uma das fontes vegetais de maior potencial para
extrao de -caroteno, com seu leo podendo alcanar at 3380 g de carotenides totais por
g de leo, sendo mais de 70% de -caroteno.
O buriti uma planta da famlia Arecaceae, antigamente conhecida como Palmae,
sendo nativa da Amrica Latina, principalmente Brasil, Peru, Bolvia, Equador, Colmbia,
Venezuela e Guiana. H duas espcies de buriti, sendo a Mauritia flexuosa nativa do Peru, e
conhecida como aguaje, e a Mauritia vinifera nativa do Brasil, conhecida tambm como
miriti. Podem chegar entre 35 a 40 m de altura, com ramos de 10 a 20 folhas, cada uma com 5
a 6 m de comprimento, gerando 3 a 4 cachos com 800 a 1000 frutos cada, sendo estes
variando entre 5 a 7 cm de dimetro, e 40 a 85 g cada (Figura 21). A polpa destes frutos de
buriti consumida pela populao local em doces e sucos (Silveira, 2004; Santos, 2005;
http://www.fao.org/, 2008).
Em 1996, a produo brasileira chegou a quase 5000 toneladas de frutos, sendo o Piau
responsvel por cerca de 70% deste valor, alcanando prximo de 5 toneladas de leo por
hectare (http://www.sidra.ibge.gov.br/, 2008).
25
Componentes
Mariath et
al (1989)
Tavares et Santos
al (2003) (2005)
Manhes
(2007)
gua
64,2
67,2
49,77
62,93
Protenas
1,8
1,5
2,82
2,1
Lipdios
8,1
3,8
19,8
13,85
Carboidratos
25,2
26,1
26,76
20,18
Cinzas
0,7
1,4
0,85
0,94
26
cidos graxos
Buriti
Tucum
Oliva
Abacate
Dend
12:0
lurico
----------
----------
----------
----------
0,1 1,0
14:0
mirstico
0,1
----------
0,67
0,02 - 0,13
0,9 1,5
16:0
palmtico
17,3 - 19,3
13,86
10 - 11,7
18:0
esterico
1,86 2,0
9,80
2,15
0,5 1,0
4,2 5,1
20:0
araqudico
----------
0,82
0,48
----------
0,2 0,7
16:1
palmitolico
----------
0,17
1,45
3,9 5,6
0,1 0,3
18:1
olico
73,3 78,7
46,81
73,8 -78
60 - 71
37,3 40,8
18:2
linolico
2,4 3,9
26,13
7 - 9,8
7,1 15,3
9,1 11
18:3
linolnico
2,17 2,2
0,93
----------
0,37 1,03
0 0,6
Referncias
Santos,
2005
Bora et al,
2001
Gunstone &
Padley, 1997
Danieli,
2006
Choo,
1994
Tucum
Dend
Buriti
-Caroteno
75,6-89,3
54,4 56,7
72,3 75,2
-Caroteno
2,68
25,2 37,6
3,9 - 15,9
-Caroteno
3,29
1,16 - 3,3
5,3 - 7,2
-Caroteno
0,22
0,7 2,3
0,9 2,5
-Caroteno
0,83
0,2 2,0
0 0,7
-zeacaroteno
3,27
0,6 1,0
1,1 2,41
Outros
carotenos
1,63
3,15 12,6
0,95
xantofilas
8,58
0 - 0,4
1,7 13,6
Algumas modificaes foram propostas por Chuang & Brunner (2006) neste processo
de extrao com fluido supercrtico para contornar sua baixa seletividade. Os autores
utilizaram a transesterificao do leo de palma e em seguida a extrao em trs etapas
obtendo um produto 200 vezes mais concentrado em carotenides, praticamente ausente de
steres, cidos graxos e triglicerdeos. Todavia, na temperatura utilizada (60C) e dada a
presena de O2 no CO2 supercrtico, condies que auxiliam a degradao dos carotenides,
necessria a adio de antioxidantes (BHT) ao processo (Cocero et al, 2000).
A transesterificao tambm utilizada como pr-etapa no processo de destilao
molecular, onde os carotenides so o resduo do processo, alcanando at 24000 ppm de
carotenides, com perdas de at 14%, a 210C em destilador centrfugo com tempo de
residncia em torno de 50s (Batistella & Maciel, 1998), ou ento em um destilador em filme
descendente em duas etapas, obtendo 80000 ppm de carotenides, com perdas de 25%, mas
sem alterao significativa no seu perfil (Ooi et al, 1994).
O processo de separao por membranas, que inicialmente era realizado para
degomagem de leos vegetais, foi testado tambm para recuperao de carotenides
utilizando-se membranas densas polimricas, mas na realidade este processo bastante
efetivo na separao das xantofilas e clorofila, alm dos fosfolpideos, com reteno entre 80
e 100%, produzindo um leo rico em carotenos (Subramanian et al, 2001; Arora et al, 2006).
Este processo, apesar de positivo na concentrao unicamente de carotenos, apresenta a
necessidade de uma etapa adicional de hidrlise ou transesterificao.
A hidrlise enzimtica tambm foi testada como pr-tratamento para facilitar a
recuperao de carotenide podendo substituir com xito a hidrlise alcalina, sem perdas por
degradao e isomerizao dos mesmos.
28
Lietz & Henry (1997) testaram a hidrlise do leo de palma utilizando a lipase de
Candida rugosa em uma concentrao de 10% p/v leo solubilizado em tampo fosfato
0,08M, mantendo a relao de leo e soluo aquosa em 1/175, e agitao em atmosfera de
N2, a 35C, durante 4 horas. Os autores obtiveram um rendimento de 96% em cidos graxos,
mantendo inalterada a concentrao de carotenides. Resultado similar foi alcanado por
Fernandez et al (2000), que apenas modificaram a relao de leo e soluo aquosa para
1/350, mostrando que tambm nessas condies a quantidade de carotenides se manteve
praticamente constante e igual a 330 ppm, enquanto que a saponficao alcalina promoveu a
reduo em 15% no teor de carotenides. Segundo os autores, a reduo era ainda maior
quando o sabo formado era removido por filtrao.
You et al (2002) utilizaram tambm leo de palma e lipase de Candida rugosa, mas
em condies diferentes. Neste trabalho, a quantidade de enzima empregada foi de 1% p/v,
substituindo o tampo fosfato por gua, alterando a relao leo/gua para 1/1, e aumentando
a temperatura para 50C e o tempo reacional para 24 h. Os autores obtiveram um rendimento
de 94% em cidos graxos e uma reduo no teor de carotenides da ordem de 15%,
provavelmente devido temperatura empregada.
2.3) LIPASES
As lipases so enzimas classificadas como hidrolases (glicerol ster hidrolases, E.C.
3.1.1.3) e atuam sobre a ligao ster de vrios compostos, tendo os acilgliceris como os
melhores substratos, podendo catalisar reaes de hidrlise, sntese, transesterificao e
interesterificao (Figura 22). As lipases so distintas de outras esterases, pois atuam de forma
nica em substratos insolveis em gua, atuando na interface leo-gua de solues
emulsionadas. Alm disso, caractersticas como estabilidade na presena de solventes
orgnicos, ausncia da necessidade de cofatores e alta enantiosseletividade, permitem que as
lipases tenham grande interesse tecnolgico (Sharma et al, 2001; Castro et al, 2004).
29
Fontes
pH
T (C)
Referncia
Candida rugosa
5-8
35 - 50
Candida antarctica A
6 - 10
35 - 70
Thermomyces lanuginosus
69
30 - 50
Aspergillus niger
68
40 - 55
5,5 7,5
35 - 45
Bacillus subtilis
8 10
30 - 40
Geotrichum candidum
6,5 - 8
32 - 42
Streptomyces rimosus
8,5 - 10
45 - 60
Yarrowia lipolytica
4-7
30 - 45
Rhizopus niveus
5-7
30 - 45
Uhlig, 1998
6,5 7,5
30 - 40
6-9
40 - 55
4 - 4,5
30 - 35
Pseudomonas aeruginosa
Rhizomucor miehei
Pncreas suno
Mamona (Ricinus communis)
Como visto na Figura 23, o stio composto de uma folha central consistindo de 8
diferentes fitas (1-8) conectadas com seis -hlices (A-F) (Jaeger et al, 1999; Martins,
2001; Castro et al, 2004).
32
2.3.3) Especificidade
Para aplicaes industriais, a especificidade da lipase um fator crucial. A enzima
pode ser especfica com relao a estrutura cida ou alcolica do substrato, e tambm em
relao aos seus ismeros. As lipases podem ser subdivididas em 3 grupos baseados em sua
especificidade.
33
aureus,
Chromobacterium
viscosum,
Thermomyces
lanuginosus
Processos
Convencionais
Autoclave
(mdia presso)
Twitchell
Colgate Emery
Temperatura (C)
149 177
100 - 104
252
Presso (atm)
5,1 10,2
40,8 47,6
Tempo (h)
5 - 10
12 - 48
2-3
Rendimento (%)
85 -98
85 -98
97 - 99
xidos de zinco,
clcio ou magnsio
cidos sulfnicos
em H2SO4
Catalisador
A hidrlise enzimtica de leos e gorduras pode ser conduzida de vrias formas. Neste
processo necessria a formao de uma interface lipdeo/gua e a absoro da lipase nesta
interface, e para isso podem-se empregar enzimas livres ou imobilizadas em sistemas
emulsionados, apenas agitados ou na presena de solventes orgnicos (Queiroz, 1996; Sharma
et al, 2001; Castro et al, 2004; Brigida, 2006).
Muitos trabalhos tm sido realizados utilizando sistemas emulsionados para hidrlise
enzimtica. Yao et al (2005) mostraram que a conduo de sistemas microemulsionados de
AOT (sulfosuccinato de bis(2-etill hexil) sdio) em isooctano para hidrlise de azeite de oliva
35
utilizando lipase de Candida rugosa em tampo fosfato 0,05M a 30C e 150 rpm, apresentou
um rendimento em cidos graxos de apenas 30% em 72 h de reao, sendo o baixo
rendimento atribudo a inativao que este sistema causa lipase.
Padilha & Augusto-Ruiz (2007) apresentaram resultados um pouco melhores
utilizando um sistema com acetato de polivinila e detergente aninico como emulsionantes
para hidrlise de leo de pescado com uma soluo tamponada de lipase pancretica, a 38C
por 1 h resultando em 44% de cidos graxos livres como resultado.
Noor et al (2003) testaram a hidrlise de leo de palma utilizando a lipase SP398 em
tampo emulsionado com goma arbica agitado a 1000 rpm, a 40C por 90 min, obtendo
hidrlise total do leo. Outras alternativas para se produzir emulses com maior rea
interfacial vm sendo testadas como a emulsificao por ultrassom, que aumenta em 67 vezes
a rea de contato do que o sistema conduzido por agitao a 1000 rpm, apesar de manter a
emulso estvel apenas por 2 h (Ramachandran et al, 2006).
Mas a hidrlise enzimtica no necessita exclusivamente de emulsionantes. Esta pode
ocorrer apenas com a agitao mecnica, apresentando taxas de hidrlise similares, conforme
verificado por Wang et al (1988).
Com o sistema apenas agitado, Gutierrez-Ayesta et al (2007) testaram vrias lipases
com diferentes estruturas conformacionais em tampo para hidrlise de leo de girassol
solubilizado em heptano, mantendo uma relao fase orgnica/fase aquosa de 1/1, e uma
quantidade de lipase de 5% em peso em relao ao leo, durante 6 h, a 60C. As lipases de
Thermomyces lanuginosus e Pseudomonas cepacia forneceram os melhores resultados,
correspondendo respectivamente a 85,3 e 69% de cidos graxos livres. A lipase tipo B de
Candida antarctica, tanto livre como imobilizada, por outro lado, forneceu as piores taxas de
hidrlise, em torno de 5%.
36
Considerando que inmeras variveis podem estar envolvidas nesse tipo de processo,
observa-se uma tendncia pelo emprego da metodologia de planejamento estatstico, que
possibilita verificar a influncia das variveis e suas interaes no rendimento de um
determinado processo com grande economia de tempo, material e recursos. Como exemplo,
cita-se o trabalho desenvolvido por Oliveira et al (1999) no qual foi analisada a influncia da
concentrao de lipase e do tempo de reao no desempenho da hidrlise da gordura de
babau por lipase comercial empregando a metodologia de superfcie de resposta, sendo
obtidos rendimentos entre 6,52 e 41,44% de cidos graxos livres. O ponto timo do processo
(maior porcentagem de hidrlise no menor tempo possvel), entretanto, no foi alcanado,
pois o planejamento fatorial proposto no cobriu a faixa correspondente a maiores tempos de
reao.
38
3.2) EQUIPAMENTOS
Os equipamentos utilizados no presente trabalho esto relacionados a seguir:
Centrfuga Fanem modelo 204-NR;
Transmissor de pH (pHmetro) Actron pH-2000;
Espectrofotmetro Hach DR/4000 UV;
Incubador com agitao e controle de temperatura (Shaker) Certomat BS-1;
Cromatgrafo lquido de alta eficncia (HPLC), equipado com uma bomba binria Waters
1525, de um detector UV-Visvel Waters 2487, alm de injetor e aquecedor de coluna.
Para processamento e anlise de dados foi utilizado o software Breeze v. 3.30. A coluna
analtica empregada foi a YMC-Pack ODS-A (100 x 4,6 mm), com tamanho de poro de
120
39
3.3.2) ndices
3.3.2.1) Saponificao (IS)
O ndice de saponificao uma medida dos cidos graxos livres e combinados que
existem no leo e diretamente proporcional massa molar mdia (MMM). Quanto menor
esta MMM, maior ser o IS.
40
IS =
(b a) * 0,5 * 56,1
(mg KOH/g leo)
2
(a b) * 0,1 *1000
meq O2/kg
1
41
Quanto maior o nmero de duplas ligaes por unidade de leo, maior o II.
O ndice de iodo foi calculado a partir da composio em cidos graxos de acordo com
o mtodo oficial Cd-1c-85 (Firestone, 1997), de acordo com a seguinte equao, sendo AOD,
cido octadecenico; AODD, cido octadecadienico e AODT, cido octadecatrienico.
Vol(mLNaOH)
28,2
Amostra(g)
3.3.3) Densidade
Um balo volumtrico vazio (m1) foi pesado, sendo depois preenchido com gua
destilada, que tenha sido antes fervida e resfriada, e depois pesado novamente (m2). E
finalmente, o balo foi rinsado com amostra, e em seguida preenchido com esta e pesado
(m3), obtendo a densidade relativa, de acordo com frmula abaixo (Matissek et al, 1998):
d 20 =
20
m3 m1
m2 m1
3.3.4) Umidade
O mtodo utilizado foi o oficial Bc-2-49 (Firestone, 1997), que consiste em se retirar
uma alquota de 2 mL de amostra, adicionando-a ao cadinho (m2), previamente seco e pesado
(m1), e seca em uma estufa a 103C, durante 24 horas (m3). O teor de umidade na amostra foi
determinado pela frmula:
42
m m1
100
% Umidade = 1 3
m 2 m 1
m2 m1
100
0,1
43
3.3.5.2) Carotenides
Reativo de Trabalho
Reativo Padro
Amostra
Branco
2,0 mL
-
Padro
2,0 mL
20 L
-
Amostra
2,0 mL
20 L
Abs.( Amostra )
200
Abs.( Padro)
(Abs ) * D * f *1000
(t ) * V
onde:
A = atividade da enzima (U.L-1), onde 1 Unidade enzimtica (1U) a quantidade de enzima
capaz de produzir 1mol de p-nitrofenol por minuto nas condies de ensaio;
47
48
49
Fatores
Temperatura (C)
Atividade Enzimtica (U)
Relao leo/gua
-1,68
25
1
1/1 (1)
-1
29
10,7
7/5 (1,4)
0
35
25
2/1 (2)
+1
41
39,9
13/5 (2,6)
+1,68
45
50
3/1 (3)
Ensaios
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15 (C)
16 (C)
17 (C)
Com as condies timas obtidas neste planejamento, foram realizados testes variando
alguns parmetros em intervalos menores, como a quantidade de enzima (5, 15, 25, 35, 45, 55
e 65 U), agitao (200, 300 e 400 rpm) e tempo reacional (0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 6 e 8 h) para se
alcanar maiores rendimentos em cidos graxos livres.
51
cidos graxos
Miristico (14:0)
Palmtico (16:0)
Esterico (18:0)
Oleico (18:1)
Linolico (18:2)
Linolnico (18:3)
Araquidico (20:1)
% Bruto
19,58
2,62
74,74
1,83
1,23
% Refinado
11,68
73,16
15,16
-
52
Anlises
ndice de Iodo (g I2/100g)
ndice de Saponificao (mg KOH/g)
ndice de Perxido (meq O2/1000g)
cidos Graxos Livres (%)
Densidade, a 20C (g/cm)
Umidade (%)
Teor de Insaponificveis (%)
Tocoferis Totais (ppm)
Esteris Totais (ppm)
Carotenides Totais (ppm)
leo
Bruto
67,45 1,0
186,53 6,0
3,79 0,4
10,0 1,0
0,844 0,03
0,73 0,1
1,99 0,2
777 20
1600 50
1817 30
Referncias
115 - 150
180 - 250
mx. 10
mx. 5
0,86 0,98
700
800 - 1000
1150 - 3380
leo
Refinado
89,17 1,0
174,8 6,0
1,19 0,2
4,37 0,4
0,812 0,02
1,90 0,2
1,23 0,1
159 20
1083 50
864 7
Referncias
80 150
150 210
mx. 7
mx. 1
0,8 0,98
-
53
Carotenides
-caroteno
-caroteno
-caroteno
Apocarotenides
Outros
% Bruto
76,8 0,4
8,8 0,1
4,5 0,1
0,45 0,07
9,4 0,4
% Refinado
45,0 0,3
2,5 0,1
1,9 0,1
45,0 1,2
6,0 0,2
54
leo bruto
Beta-caroteno
Alfa-caroteno
Gamacaroteno
Apocarotenides
leo refinado
Gamacaroteno
Alfa-caroteno
Beta-caroteno
(a)
60
CalB
435
60
TL
Yarrowia
50
40
30
20
CalB
435
TL
Yarrowia
40
% AGL
% AGL
50
(b)
30
20
10
10
10
15
tempo (h)
20
25
10
15
tempo (h)
20
25
(a)
CalB
435
TL
Yarrowia
200
150
100
50
0
Ampliando
400
350
300
250
200
150
100
50
0
400
350
300
250
(b)
10
15
tempo (h)
CalB
435
TL
Yarrowia
20
Ampliando
10
15
tempo (h)
20
7
6
5
4
3
2
1
0
25
Figura 26 Avaliao do tempo reacional de hidrlise dos leos bruto (a) e refinado (b) de buriti
25
10
15
tempo (h)
20
25
20
25
5
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
10
15
tempo (h)
Figura 27 Avaliao da quantidade de cidos graxos produzida pelo custo de lipase durante a hidrlise
de leo bruto (a) e refinado (b) de buriti
Quanto ao tempo reacional, apesar de em 24 horas haver maior hidrlise, foi escolhido
o tempo de 4 horas uma vez que a cintica j tende a estabilidade na formao de cidos
graxos.
Os carotenides tambm foram avaliados nesta etapa, mas no apresentaram
alteraes muito significativas nos perfis, concentrando em mais de 10% do seu valor total em
24 horas de hidrlise, provavelmente pela precipitao dos cidos graxos, diminuindo um
pouco o volume total de fase orgnica.
56
ppm
ppm
(a)
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
beta-caroteno
Apocarotenides
20
30
40
50
T (C)
60
70
80
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
beta-caroteno
Apocarotenides
20
30
40
50
T (C)
60
70
80
57
(a)
% AGL
% AGL
80
70
60
50
40
30
20
10
0
7\1
3\1
1\1
1\3
80
70
60
50
(b)
40
30
20
10
0
1\7
7\1
3\1
1\1
1\3
1\7
Figura 29 Avaliao da relao leo/gua na hidrlise dos leos bruto (a) e refinado (b) de buriti
80
70
60
50
(a)
%AGL
%AGL
40
30
20
10
0
1U
10U
50U
100U
80
70
60
50
40
30
20
10
0
(b)
1U
250U
10U
50U
100U
250U
Figura 30 Avaliao da quantidade de enzima sobre a hidrlise dos leos bruto (a) e refinado (b) de
buriti
Carotenides (ppm)
2500
Oleo Bruto
Oleo Refinado
2000
1500
1000
500
0
1U
10 U
50 U
100 U
250 U
58
(a)
30
Yarrowia
TL
CalB
Yarrowia
25
20
TL
CalB
20
% AGL
% AGL
25
30
15
15
10
10
5
Branco
Goma
arabica
Tween
Span
Branco
Goma
arabica
Tween
Span
Figura 32 Avaliao de emulsificantes sobre a hidrlise enzimtica dos leos bruto (a) e refinado (b) de
buriti
4.2.3.2) Clcio
A adio de ons clcio a esse sistema reacional poderia: na forma solvel, estabilizar
a lipase, dependendo da estrutura tridimensional da enzima, alm de possibiltar a formao de
sabo (interao entre ons clcio e os cidos graxos gerados); ou ainda na forma insolvel,
atuando como adsorvente dos cidos graxos formados, deslocando o equilbrio da reao no
sentido da hidrlise.
Na Figura 33 apresentado o rendimento em cidos graxos quando o clcio
adicionado substituindo a gua por uma soluo aquosa de CaCl2 a 0,01 e 0,05M ou na forma
de CaCO3 em concentraes de 5% em peso pelo volume de leo presente.
59
Para uma melhor comparao, foi feito um experimento sem adio de clcio (branco).
A adio de CaCO3 gerou um aumento (2 vezes) no rendimento em cidos graxos com todas
as lipases avaliadas, mas ao mesmo tempo, este reduziu a concentrao de carotenides em
20%, alm de necessitar de um maior nmero de centrifugaes para sua separao da fase
orgnica.
A adio de soluo de CaCl2 apresentou um pequeno aumento no rendimento em
cidos graxos quando foram utilizadas enzimas livres, no sendo este aumento porm muito
siginificativo. No caso da Lipozyme TL, a adio de CaCl2 teve efeito negativo na hidrlise
dos leos de buriti, principalmente no leo refinado. Isso pode ter ocorrido pela formao de
sabo e possvel ocluso dos poros do suporte.
(a)
60
60
Yarrowia
CalB
(b)
Yarrowia
50
TL
CalB
40
40
% AGL
% AGL
50
TL
30
30
20
20
10
10
Branco
CaCl2
0,05M
CaCl2
0,01M
CaCO3 5%
Branco
CaCl2
0,05M
CaCl2
0,01M
CaCO3 5%
Figura 33 - Avaliao da adio de clcio sobre a hidrlise dos leos bruto (a) e refinado (b) de buriti
4.2.3.3) Adsorventes
Foram testados dois adsorventes nesta etapa, um inorgnico (alumina bsica, pH entre
9-10, para cromatografia em coluna, com dimetro de partcula de 0,05-0,15 mm e rea
superficial de 155 m/g) e um polimrico (amberlita XAD2, uma resina de poliestirenodivinilbenzeno, com dimetro de partcula de 0,25 0,80 mm e rea superficial de 300 m/g).
A alumina foi selecionada dada a sua grande interao com cidos carboxlicos (KasprzykHordern, 2004), inclusive com cidos graxos (Queiroz 1996). J a amberlita adsorve vrios
tipos de compostos hidrofbicos at massa molar de 20 kDa, o que possibilitaria a adsoro
de cidos graxos, deslocando o equilbrio da reao no sentido da reao de hidrlise.
60
(a)
60
Yarrow ia
50
TL
40
%AGL
% AGL
Yarrow ia
TL
CalB
CalB
40
30
30
20
20
10
10
0
Branco
(b)
Amberlita
Alumina
Branco
Amberlita
Alumina
Figura 34 Avaliao de adio de adsorventes sobre a hidrlise dos leos bruto (a) e refinado (b) de
buriti
Por isso, alumina foi escolhida para fazer os testes alterando sua concentrao no meio
reacional, como apresentado nas Figuras 35 e 36. O aumento da concentrao de alumina na
hidrlise enzimtica levou a uma maior adsoro dos carotenides, como no caso da
utilizao de 20% de alumina onde houve a reduo de 15% no leo bruto e de 35% no leo
refinado, sendo esta adsoro preferencial por apocarotenides. At a concentrao de 10% de
alumina, esta adsoro de carotenides menos evidenciada, e apresenta um alto rendimento
em cidos graxos (superior a 60%), sendo por isso a quantidade de alumina escolhida para ser
usada no planejamento experimental.
61
60
% AGL
50
(a)
(b)
70
Yarrowia
Yarrowia
TL
60
TL
50
CalB
% AGL
70
40
30
CalB
40
30
20
20
10
10
0
0
1
5
10
% Alumina no leo
20
1
5
10
% Alumina no leo
20
Figura 35 - Avaliao da quantidade de alumina sobre a hidrlise dos leos bruto (a) e refinado (b) de
buriti
2100
(a)
2100
Yarrowia
TL
Yarrowia
TL
CalB
1800
Carotenides (ppm)
1800
Carotenides (ppm)
(b)
CalB
1500
1200
900
600
1500
1200
900
600
300
300
0
0
5
% Alumina no leo
10
20
5
10
% Alumina no leo
20
40
Yarrowia
TL
CalB
30
25
25
20
15
10
10
0,05M
0,2M
Yarrowia
TL
CalB
20
15
Branco
(b)
35
30
%AGL
%AGL
35
(a)
Branco
0,05M
0,2M
Figura 37 - Avaliao da substituio da gua por tampo fosfato sobre a hidrlise dos leos bruto (a) e
refinado (b) de buriti
62
Ensaios
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15 (C)
16 (C)
17 (C)
Lipozyme TL IM
Lipozyme CALB L
Lipase de Y. lipolytica
%AGL
Carotenides (ppm)
%AGL
Carotenides (ppm)
%AGL
Carotenides (ppm)
62,89
56,58
73,61
73,04
62,53
52,83
76,46
61,20
60,11
66,06
18,78
72,00
64,24
67,86
66,06
62,61
68,87
1539
1810
1561
1732
1580
1692
1609
1609
1547
1570
1814
1602
1631
1596
1728
1746
1720
13,22
13,86
17,51
14,72
14,29
15,30
15,72
15,59
14,40
18,16
13,77
18,78
17,94
16,41
13,77
14,08
14,40
1879
1920
1903
1754
1725
1575
1857
1666
1749
1712
1758
1811
1665
1552
1700
1658
1730
15,36
15,30
34,30
32,04
15,72
11,84
34,30
25,98
32,56
25,67
9,08
35,06
31,29
33,65
28,80
30,05
31,43
1696
1799
1565
1648
1607
1693
1791
1773
1644
1754
1756
1754
1769
1868
1802
1792
1778
4.3.1.1) Lipozyme TL IM
Na Figura 38 so apresentados os diagramas de Pareto referentes aos cidos graxos
livres e aos carotenides, sendo estatisticamente significativo apenas o termo linear da
atividade enzimtica, no caso dos cidos graxos e o termo quadrtico da temperatura, no caso
dos carotenides. O coeficiente de correlao, R, para os cidos graxos livres foi igual a 0,75,
e para os carotenides foi de 0,74, tendo baixo ajuste ao modelo.
63
(a)
(b)
Figura 38 Diagrama de Pareto para avaliao da hidrlise do leo bruto de buriti por Lipozyme TL IM
sobre cidos graxos livres (a) e carotenides (b)
Na Figura 39, o intervalo timo (com maior desirability) foi determinado em 10 - 35U
de atividade enzimtica, 1,9 - 2,9 de relao leo/gua e 27 - 36C de temperatura. As
condies timas encontradas foram: temperatura de 31,2C, atividade enzimtica de 21,6U e
relao leo/gua de 2,33. Com estas condies foram calculadas as variveis de resposta
(cidos graxos livres e carotenides) atravs do modelo utilizando os coeficientes de
regresso resultando em 64,48% e 1749 ppm, respectivamente.
64
Figura 39 Curvas de nvel fixadas no ponto timo: efeitos de temperatura, atividade enzimtica e relao
leo/gua sobre a hidrlise de leo bruto de buriti por Lipozyme TL IM
65
(b)
Figura 40 Diagrama de Pareto para avaliao da hidrlise do leo bruto de buriti por Lipozyme CalB L
sobre cidos graxos livres (a) e carotenides (b)
Na Figura 41, o intervalo timo (com maior desirability) foi de 45 - 50U de atividade
enzimtica, 1,0 - 1,6 de relao leo/gua e 25 - 45C de temperatura. As condies timas
encontradas foram: temperatura de 45C, atividade enzimtica de 50U e relao leo/gua de
1,6. Com estas condies foram calculadas as variveis de resposta (cidos graxos livres e
carotenides) atravs do modelo utilizando os coeficientes de regresso resultando em
18,80% e 2067 ppm, respectivamente.
66
Figura 41 Curvas de nvel fixadas no ponto timo: efeitos de temperatura, atividade enzimtica e relao
leo/gua sobre a hidrlise de leo bruto de buriti por Lipozyme CalB L
67
(b)
Figura 42 Diagrama de Pareto para avaliao da hidrlise do leo bruto de buriti por lipase de Yarrowia
lipolytica sobre cidos graxos livres (a) e carotenides (b)
Na Figura 43, o intervalo timo (com maior desirability) foi de 45 - 50U de atividade
enzimtica, 1,0 - 1,3 de relao leo/gua e 40 - 45C de temperatura. As condies timas
encontradas foram: temperatura de 42,4C, atividade enzimtica de 47,6U e relao leo/gua
68
de 1,0. Com estas condies foram calculadas as variveis de resposta (cidos graxos livres e
carotenides) atravs do modelo utilizando os coeficientes de regresso resultando em
34,56% e 1861 ppm, respectivamente.
Figura 43 Curvas de nvel fixadas no ponto timo: efeitos de temperatura, atividade enzimtica e relao
leo/gua sobre a hidrlise de leo bruto de buriti por lipase de Yarrowia lipolytica
69
Ensaios
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15 (C)
16 (C)
17 (C)
Lipozyme TL IM
Lipozyme CALB L
Lipase de Y. lipolytica
%AGL
Carotenides (ppm)
%AGL
Carotenides (ppm)
%AGL
Carotenides (ppm)
68,42
51,07
66,56
68,80
61,35
39,66
74,37
71,20
62,88
63,20
14,66
68,74
59,04
46,02
65,81
67,07
63,85
760
844
863
804
812
690
878
641
829
849
697
673
693
642
813
778
796
8,55
8,11
28,63
8,71
11,15
8,71
16,36
12,92
11,73
7,82
6,84
14,99
14,76
8,68
11,08
11,73
11,08
788
632
686
789
690
675
780
762
759
761
686
807
654
592
720
709
706
8,92
7,81
30,49
27,04
8,18
6,91
7,44
6,01
22,15
5,21
4,56
9,77
12,15
8,68
9,42
9,12
8,67
820
755
864
939
867
773
814
864
834
708
806
865
898
919
889
876
873
4.3.2.1) Lipozyme TL IM
Na Figura 44 so apresentados os diagramas de Pareto referentes s variveis-resposta,
cidos graxos livres e carotenides, sendo estatisticamente significativo apenas o termo linear
da atividade enzimtica, no caso dos cidos graxos livres; e a interao entre a temperatura e a
relao leo/gua, no caso dos carotenides. O coeficiente de correlao R para os cidos
graxos livres foi de 0,80, e para os carotenides foi de 0,81.
70
(a)
(b)
Figura 44 Diagrama de Pareto para avaliao da hidrlise do leo refinado de buriti por Lipozyme TL
IM sobre cidos graxos livres (a) e carotenides (b)
Na Figura 45, o intervalo timo (com maior desirability) foi de 25 - 40U de atividade
enzimtica, 1,0 - 1,8 de relao leo/gua e 25 ou 45C de temperatura. As condies timas
encontradas foram: temperatura de 45C, atividade enzimtica de 31,2U e relao leo/gua
de 1,8. Com estas condies foram calculadas as variveis de resposta (cidos graxos livres e
carotenides) atravs do modelo utilizando os coeficientes de regresso resultando em
75,86% e 878 ppm, respectivamente.
71
Figura 45 Curvas de nvel fixadas no ponto timo: efeitos de temperatura, atividade enzimtica e relao
leo/gua sobre a hidrlise de leo refinado de buriti por Lipozyme TL IM
72
(b)
Figura 46 Diagrama de Pareto para avaliao da hidrlise do leo refinado de buriti por Lipozyme CalB
L sobre cidos graxos livres (a) e carotenides (b)
Na Figura 47, o intervalo timo (com maior desirability) foi obtido em 50U de
atividade enzimtica, 1,2 - 2,0 de relao leo/gua e 25 - 30C de temperatura. As condies
timas encontradas foram: temperatura de 25C, atividade enzimtica de 50U e relao
leo/gua de 1,667.
73
Com estas condies foram calculadas as variveis de resposta (cidos graxos livres e
carotenides) atravs do modelo utilizando os coeficientes de regresso resultando em
28,55% e 792 ppm, respectivamente.
Figura 47 Curvas de nvel fixadas no ponto timo: efeitos de temperatura, atividade enzimtica e relao
leo/gua sobre a hidrlise de leo refinado de buriti por Lipozyme CalB L
74
(b)
Figura 48 Diagrama de Pareto para avaliao da hidrlise do leo refinado de buriti por lipase de
Yarrowia lipolytica sobre cidos graxos livres (a) e carotenides (b)
Na Figura 49, o intervalo timo (com maior desirability) foi determinado no intervalo
de 40 - 50U de atividade enzimtica, 2,5 - 3,0 de relao leo/gua e 25 - 28C de
temperatura.
75
Figura 49 Curvas de nvel fixadas no ponto timo: efeitos de temperatura, atividade enzimtica e relao
leo/gua sobre a hidrlise de leo refinado de buriti por lipase de Yarrowia lipolytica
76
Enzimas
Lipozyme TL
Lipozyme CalB L
Lipase de Y. lipolytica
Condio tima
Rendimento
T (C)
Ativ (U)
leo/Agua
% AGL
Carotenides (ppm)
31,2
45
42,4
21,6
50
47,6
2,33
1,6
1,0
64,48
18,80
34,56
1749
2067
1861
Tabela 16 Comparao das condies timas para hidrlise enzimtica do leo refinado de buriti
Enzimas
Lipozyme TL
Lipozyme CalB L
Lipase de Y. lipolytica
Condio tima
Rendimento
T (C)
Ativ (U)
leo/Agua
% AGL
Carotenides (ppm)
45
25
29
31,2
50
50
1,8
1,67
3,0
75,86
28,55
30,80
878
792
708
77
4.3.4) Otimizao
Em ambas as hidrlises enzimticas, tanto do leo bruto como do leo refinado de
buriti, o maior rendimento em cidos graxos livres (at 75%) foi obtido quando utilizou-se a
Lipozyme TL IM com pequenas perdas de carotenides.
Em todos os diagramas de Pareto analisados foi verificado que a atividade enzimtica
foi estatisticamente significativa na hidrlise dos leos no que se refere produo de cidos
graxos livres. Porm, como a correlao dos dados experimentais com o modelo teve um
baixo ajuste na maioria das avaliaes, decidiu-se testar este parmetro isoladamente,
mantendo as outras condies timas previstas pelo modelo.
Ainda objetivando uma maior hidrlise do leo, foram testadas diferentes velocidades
de agitao do sistema, de forma a aumentar a rea interfacial, facilitando a atuao lipsica.
Tambm foi avaliada a cintica reacional de hidrlise da Lipozyme TL IM em intervalos de
tempo menores que os utilizados no item 3.4.2.1.
4.3.4.1) Quantidade de Enzima
Na Figura 50, pode-se determinar como condies timas de atividade enzimtica 25
U (0,47% p/v) e 35 U (0,66% p/v) de Lipozyme TL IM para o leo bruto e refinado,
respectivamente, sendo obtidos os maiores rendimentos em cidos graxos livres (prximo de
70%), sem perdas significativas de carotenides.
78
Carotenides (ppm)
%AGL
80
70
60
50
40
30
20
10
0
leo Bruto
leo Refinado
10
20
30
40
50
60
70
2000
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
leo Bruto
leo Refinado
10
20
30
40
50
60
70
4.3.4.2) Agitao
Mantendo as condies obtidas no item 4.3.3.1., a velocidade de agitao de 300 rpm
foi escolhida, pois gerou maiores incrementos nos rendimentos em cidos graxos livres,
alcanando perto de 75%, com perdas de carotenides ligeiramente inferiores aos obtidos a
400 rpm (Figura 51).
80
200 rpm
% AGL
75
300 rpm
400 rpm
70
65
60
Carotenides (ppm)
1800
1600
200 rpm
1400
1200
300 rpm
400 rpm
1000
800
600
400
200
0
leo Bruto
leo Refinado
leo Bruto
leo Refinado
Figura 51 Avaliao da velocidade de agitao sobre a hidrlise enzimtica dos leos de buriti
79
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Carotenides (ppm)
% AGL
leo Bruto
leo Refinado
3
4
5
tempo (h)
2000
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
leo Bruto
leo Refinado
tempo (h)
81
leo Bruto
leo Refinado
Carotenides (ppm)
% AGL
3500
80
70
60
50
40
30
20
10
0
3000
2500
leo Bruto
leo Refinado
2000
1500
1000
500
0
Figura 53 Avaliao de cidos graxos livres e carotenides durante o ps-processamento do leos bruto e
refinado de buriti, onde (1) representa a finalizao do processo enzimtico; (2), a separao das fases
orgnica e aquosa e (3), a desacidificao com etanol em 4 extraes sucessivas
4.4.2.2) Saponificao
A saponificao foi realizada com solues aquosas e alcolicas 0,5 M de NaOH. A
saponificao aquosa no obteve separao de fases em nenhum dos dois leos de buriti,
gerando apenas sabo. A saponificao alcolica s obteve separao de fases com o leo
refinado de buriti, j que o leo bruto se tornou uma fase homognea com a soda alcolica.
A saponificao alcolica foi realizada por 2 vezes sucessivas no leo refinado,
removendo mais de 90% dos cidos graxos livres, e tambm 35% dos carotenides presentes,
alm da diminuio de 63% do volume da fase rica em carotenides. Apesar desses fatores,
esta fase ainda manteve 1085 ppm de carotenides com uma grande alterao no seu perfil
(Figura 54), se aproximando muito do perfil de carotenides encontrado no leo bruto, com
69% de -caroteno e 5% de apocarotenides.
Figura 54 Perfil de carotenides do leo refinado aps desacidificao com soda alcolica
82
4.4.2.3) Winterizao
A winterizao foi realizada apenas no leo bruto, pois no leo refinado de buriti no
ocorreu a formao de nenhum precipitado ao se resfriar a fase orgnica.
Aps a winterizao do leo bruto, foram obtidas 2 fases: a primeira slida com 43%
de cidos graxos livres e 3186 ppm de carotenides, enquanto a outra lquida obtendo 26% de
cidos graxos livres e 3910 ppm de carotenides.
83
CAPTULO 5 CONCLUSO
A caracterizao do leo bruto e refinado de buriti se mostrou coerente com os dados
referenciados na literatura. A presena de apocarotenides em quantidades elevadas no
leo refinado de buriti confirma que o processo de refino promove a degradao de
carotenides e a diminuio do seu valor nutricional.
A pr-avaliao do processo enzimtico determinou os intervalos de alguns parmetros
para o planejamento experimental, como temperatura (25 a 45C), relao leo/gua (1/1 a
3/1) e atividade enzimtica (1 a 50U) em um volume de mistura reacional de 8 mL. Alm
disso, determinaram-se o tempo reacional (4 h), as lipases a serem utilizadas (lipase de
Yarrowia lipolytica, Lipozyme TL IM e CALB L) e o uso da alumina em concentrao de
10% p/v como aditivo para aumentar a hidrlise enzimtica dos leos bruto e refinado de
buriti.
O planejamento experimental composto central determinou que tanto para hidrlise do
leo bruto como do leo refinado de buriti a Lipozyme TL IM foi a enzima que gerou
melhor rendimento em cidos graxos livres, com pequenas perdas em carotenides. Mas
como os modelos obtidos neste planejamento obtiveram baixo ajuste aos dados
experimentais, e tambm devido atividade enzimtica se demonstrar estatisticamente
significativa, foram realizadas etapas adicionais de otimizao para avaliao da influncia
de outras quantidades de Lipozyme TL IM, tempo reacional e agitao sobre a hidrlise.
Com isso, concluiu-se que as condies timas para a hidrlise enzimtica dos leo de
buriti so: bruto - 25U de atividade enzimtica, 2,33 de relao leo/gua e 31,2C de
temperatura e refinado - 35U de atividade enzimtica, 1,8 de relao leo/gua e 45C de
temperatura, mantendo o tempo reacional em 4 horas e alterando a velocidade de agitao
para 300 rpm.
84
85
CAPTULO 6 SUGESTES
No caso do leo refinado de buriti, poder-se-ia testar a remoo dos apocarotenides por
processos com membranas, antes mesmo de se realizar a hidrlise enzimtica.
O leo de palma tambm poderia ser utilizado como matria-prima para obteno de caroteno atravs de hidrlise enzimtica.
A adio de leo vegetal em matrizes vegetais ricas em -caroteno, como a cenoura e a
batata-doce; em licopeno, como o tomate e a melancia, ou ainda em xantofilas de interesse
comercial, caso de lutena e zeaxantina para a extrao dos carotenides, seguida de uma
posterior hidrlise enzimtica do leo vegetal poderia ser uma alternativa interessante, a
ser investigada.
Novas opes de processo, como: a combinao de duas lipases distintas, sendo que uma
delas com maior atuao em faixa mais cida de pH; outros emulsificantes; outros
adsorventes; maiores velocidades de agitao; e outras lipases, sendo estas originadas de
microrganismos diferentes deveriam ser testadas visando o aumento no rendimento da
hidrlise.
Outros mtodos de desacidificao poderiam ser testados como a extrao supercrtica, a
extrao por solventes utilizando outros lcoois de cadeia curta (metanol, propanol e
butanol) puros, ou com concentraes variadas de gua.
Diferentes concentraes de NaOH poderiam ser testadas para verificar a quantidade
mnima de base para a remoo de cidos graxos livres e apocarotenides.
A possibilidade de integrar os mtodos de winterizao e extrao com etanol para
aumentar a eficincia do processo na remoo dos cidos graxos livres e na concentrao
de -caroteno do leo bruto de buriti tambm poderia ser verificada.
86
87
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
ABBAS, H.; HIOL, A.; DEYRIS, V.; COMEAU, L.; Isolation and characterization of an
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100
GLOSSRIO
Cloroplasto: uma organela presente nas clulas das plantas e algas, rico em clorofila,
responsvel pela sua cor verde, e onde a fotossntese realizada.
Cromoplasto: uma organela presente nas clulas das plantas e algas, onde ocorre a
biossntese de pigmentos.
Distribuio t de Student: uma distribuio de probabilidades referente a inferncias de
mdias de populaes normalmente distribudas, sendo a base
para o popular teste t de Student onde se avalia a significncia
estatstica da diferena entre 2 mdias amostrais, e tambm os
intervalos de confiana da diferena entre 2 mdias
populacionais (Morettin & Bussab, 2002).
Endosperma: um tecido vegetal, que se encontra nas sementes de muitas angiospermas e
acumula reservas nutritivas, como amido, protenas e leo, utilizadas pelo
embrio durante seu desenvolvimento.
Fitoesteris: alcois cristalinos, neutros e de alto ponto de fuso, sendo que os principais so
-sitosterol, campesterol e estigmasterol (figura 55, Moreau et al, 2002).
Figura 55 Fitoesteris
Log P: logaritmo do coeficiente de partio da substncia de um sistema padro bifsico 1octanol/gua. Quanto maior o log P, mais apolar o solvente ou a mistura (Mojaat et
al, 2007).
Mecanismo Ping-Pong Bi Bi: mecanismo cintico de reaes com mltiplos produtos e
substratos catalisadas por lipases, onde E enzima; Es,
ster; Al, lcool; Ac, cido; W, gua; F, enzima em outro
estado conformacional (Cunha, 2007)
Pericarpo: o tecido do fruto que envolve e protege a semente nas angiospermas, incluindo
trs camadas: epicarpo (mais externa), mesocarpo (intermediria) e endocarpo
(mais interna).
Retinides: derivados de sntese de vitamina A, dentre eles retinal (figura 56), retinol e
tretinona (Rucker et al, 2001).
101
Figura 56 Retinal
R1 = CH3, R2 = CH3
R1 = H, R2 = CH3
R1 = CH3, R2 = H
R1 = H, R2 = H
102
APNDICE
Cintica de hidrlise enzimtica do leo bruto de buriti utilizando Lipozyme TL IM, onde os
tubos esto na seguinte seqncia temporal: 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 6 e 8h
Cintica de hidrlise enzimtica do leo refinado de buriti utilizando Lipozyme TL IM, onde
os tubos esto na seguinte seqncia temporal: 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 6 e 8h
(a)
(b)
103