PRCTICA 2B

LECTINAS

OBJETIVOS

Adquirir los conocimientos terico-prcticos para la obtencin de

compuestos proteicos con la actividad hemoaglutinante a partir de extractos
vegetales.
Determinar la actividad hemoaglutinante de los extractos obtenidos
Investigar el mtodo de conservacin no destructivo para las lectinas
obtenidas (LIOFILIZACIN)
Confirmar las caractersticas reportadas en las referencias para los
compuestos obtenidos, tales como pesos moleculares.

INTRODUCCIN

Las molculas que tienen la capacidad de descifrar la informacin contenida en

los carbohidratos son las lectinas. Las lectinas (del latn legere = seleccionar o
escoger) son protenas que unen a mono- y oligosacridos especficamente y
de manera reversible, no son enzimas y en contraste con anticuerpos, no son
producto de una respuesta inmune. Las lectinas tpicamente contienen uno o
ms sitios de combinacin de carbohidratos por molculas, esto es, son
divalentes o polivalentes. Por lo tanto, la unin de una lectina a carbohidratos
en la superficie celular, por ejemplo eritrocitos, puede causar una unin
cruzada de las clulas y su subsiguiente precipitacin, fenmeno que se refiere
como aglutinacin celular. La aglutinacin de eritrocitos o hemaglutinacin, es
una caracterstica principal de estas protenas y sirve para su deteccin y
caracterizacin rutinaria. De hecho, gracias a esta actividad fue que se
detectaron por primera vez, a principios del siglo XIX en extractos de plantas.
Por lo que se les denomin por mucho tiempo, fitohemaglutininas (Sharon y
Lis,1989 1997, 2001).
Se sabe que las lectinas se encuentran presentes en todos los organismos
incluyendo virus, bacterias, plantas hongos y animales, aunque el
descubrimiento de lectinas en animales se realiz con el descubrimiento de las
selectinas, a finales de los 1980s .
La gran importancia de las lectinas radica en el reconocimiento y comunicacin
celular, como se ilustra en la figura.
Interacciones entre lecitinas de superficie y carbohidratos.
Las lectinas son el medio de fijacin de diferentes tipos de clulas, bacterias,
virus o toxinas. En algunos casos las lectinas de superficie de las clulas se
unen a glicoprotenas, mientras que en otros casos los carbohidratos en la
superficie de las clulas que se pueden encontrar solos o acoplados a

protenas (glicoprotenas) o lpidos (glicolpidos), funcionan como sitios de

unin a lectinas. Las interacciones de estas lectinas con clulas pueden ser
inhibidas en muchos casos por carbohidratos, lo que ha proporcionado tiles
marcadores celulares que son empleados en tcnicas histoqumicas y en la
microscopa electrnica para estudiar la estructura y funcin de la membrana
plasmtica (Sharon y Lis, 2004).
Como se muestra en la figura, los microorganismos van a utilizar este
mecanismo para realizar los procesos de infeccin. El primer reporte, realizado
en la dcada de los 1950s, fue con el virus de la influenza, donde demostraron
que los virus reconocen carbohidratos especficos en las clulas hospederas.
Este mismo mecanismo es empleado por bacterias, hongos y protozoarios. En
plantas, las lectinas participan en la proteccin contra insectos y
microorganismos dainos, controlan la germinacin, transporte y
almacenamiento de azcares y en la simbiosis.

Fundamento De La Electroforesis.

La electroforesis se define como el movimiento de partculas cargadas en un

campo elctrico. La movilidad de las partculas est determinada de forma
proporcional al voltaje aplicado y la carga neta de la molcula y de forma
inversamente proporcional a la friccin de la molcula; esta ltima depende de la
forma y el tamao de la misma.
Durante una electroforesis el voltaje se mantiene constante por lo que la movilidad
de la molcula depender de su carga, forma y tamao: a mayor carga neta, la
molcula migrar ms rpido; a su vez, a mayor friccin, la movilidad ser menor.
Adems, la electroforesis permite la determinacin experimental de propiedades
como el punto isoelctrico y el peso molecular (PM) de una protena. La
electroforesis de protenas se realiza generalmente sobre matrices tipo gel, la ms
comn es la poliacrilamida.
Los geles de poliacrilamida poseen propiedades tales como transparencia,
elasticidad, porosidad controlable y compatibilidad con una gran variedad de
compuestos qumicos que los hace un excelente medio de soporte para
separaciones electroforticas.
Los geles de poliacrilamida son el resultado de la polimerizacin del monmero
acrilamida y la bis-acrilamida (N N-metil bisacrilamida) en presencia de
persulfato de amonio y la tetrametiletilndiamina (TEMED). El persulfato de
amonio activa al TEMED, el cual a su vez activa al monmero de acrilamida para
que polimerice. Las cadenas de poliacrilamida son entrecruzadas al azar por la
bis-acrilamida, formndose as una red de porosidad uniforme. Varias
modificaciones pueden realizarse para obtener geles con caractersticas
especficas segn sea necesario. Si se requieren geles con poros grandes, se
puede disminuir la cantidad de acrilamida y/o bis-acrilamida en la reaccin de
polimerizacin y viceversa. El tamao del poro de la matriz de poliacrilamida a
utilizar depender de las diferencias en tamao de los componentes proteicos que
se desean separar.
PAGE por sus siglas del ingls, (Polyacrylamide gel electrophoresis) ms
comnmente utilizado para la determinacin de pureza de una muestra o del PM
de una protena es el PAGE en presencia del detergente aninico duodecilsulfato
de sodio (SDS) o SDS-PAGE.
Por lo tanto, durante la corrida electrofortica las protenas con mayor PM
migrarn ms lento que las protenas con un menor PM. Cuando se compara la
movilidad electrofortica de una protena en particular con la movilidad
electrofortica de protenas de PM conocido (marcadores de PM), se puede
estimar el PM de la protena en cuestin. Una vez finalizada la corrida
electrofortica, las protenas son visualizadas mediante la adicin de un colorante
como el azul de Coomassie, (C47H48N3O7S2Na) el cual se une a las protenas pero
no al gel.

 Equipo.
Se utilizar como modelo para la prctica el equipo MiniProtean para la
realizacin de la electroforesis de protenas. (ver figura 3.)

Figura 1. Modelo Cmara electrofortica MiniProtean.

Tabla 1. Reactivos y soluciones para la preparacin del gel.

Gel
separador
Monmeros
Buffer pH 8.0
H2O
Persulfato de
Amonio 10%
TEMED
TOTAL

Gel separador
SDS-PAGE
10%
2.65 mL
1.00 mL
3.84 mL

Gel
concentrador
SDS-PAGE 4%
0.67 mL
1.30 mL
3.00 mL

80 L

40 L

8 L
8.0 mL

5 L
5 mL

Buffer pH 6.8

Geles de Corrida y Apilamiento

La tcnica de separacin comnmente utilizada se denomina electroforesis
discontinua. En la electroforesis discontinua se preparan 2 geles, el gel separador,
donde se separan las protenas, y el gel de apilamiento o gel concentrador
(stacking) que como su nombre lo indica, concentra la mezcla.
El gel de separador SDS-PAGE que separar las muestras debe tener una mayor
concentracin (10%) y pH ms bsico (8.0) de manera que ofrezca mayor
resistencia en la corrida a los polipptidos.
El gel de concentrador posee baja concentracin (4%) de forma que ofrezca poca
resistencia a la mezcla de protenas sometidas a electroforesis por tanto lo
atraviesan con relativa rapidez.
Una vez preparado y polimerizado el gel separador, se prepara, en la parte
superior de ste el gel concentrador. Bajo la accin del campo elctrico, la mezcla
proteica, colocada sobre el gel separador, comienza a migrar hacia el polo
positivo.
Cuando las protenas atraviesan el gel concentrador, se encuentran con la
resistencia ejercida por el gel de manera que aquellas protenas retardadas
puedan alcanzar al resto y todas inicien la separacin desde el mismo punto,
mejorando as la calidad de la corrida.

Preparacin Del Gel De Corrida

1. Ensamblar, segn instrucciones de la casa comercial, el cassette que

consta de soportes, vidrios y separadores.
2. Preparar el gel de corrida. El volumen del gel de corrida deber calcularse
dependiendo del grosor del gel.
3. Verter cuidadosamente la solucin de gel separador SDS-PAGE en el
contenedor representado por 2 vidrios sujetos al cassette y distanciados por
unos separadores segn se muestra a continuacin:

Figura 2. Introduccin de la solucin de gel separador SDS-PAGE 10%

entre los vidrios.
4. Dejar aproximadamente 1,5 cms de distancia entre la solucin y el vidrio
frontal (figura 3):

Gel separador

Figura 3.Gel separador antes de polimerizar

5. Luego de aadido el gel separador, y previo a la polimerizacin, aadir
suavemente agua destilada para evitar que el borde del gel polimerice de
manera irregular.
6. Esperar unos 15 min para una polimerizacin total del gel.

PREPARACIN DEL GEL CONCENTRADOR SDS-PAGE 4%

1. Luego de polimerizado el gel separador, descartar el agua de la superficie
del mismo y preparar el gel concentrador.
2. Verter suavemente el contenido del gel concentrador sobre el gel separado
polimerizado y colocar el peine cuidadosamente para que no se formen
burbujas (figura 4).

Gel concentrador

Figura 4.Colocacin del gel concentrador y del peine.

3. Esperar unos 10 min hasta que polimerice el gel concentrador.

Fundamento Azul Brillante de Coomassie: Este mtodo constituye una forma

rpida y confiable para la determinacin de protenas. Se basa en la cuantificacin
de la unin del colorante Azul Brillante de Coomassie a una protena desconocida
y la comparacin de esta unin con la de diferentes cantidades de una protena
estandard. El complejo colorante - protena presenta un mximo de absorcin a
595 nm.
Fundamento

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Escoger
Escoger una
una
especie
especie de
de
leguminosa
leguminosa que
que
sea produtora de
lectinas.
lectinas.

En
En nuestro
nuestro caso
caso
FRIJOL
FRIJOL PERUANO
PERUANO

Pesar
50 g,
g, de
de
Pesar 50
frijol lo
lo mas
mas fresco
fresco
frijol
posible,
posible, lavarlo,
lavarlo,
poner a remojar en
sol.
sol. isotnica
isotnica

Y mantenerla
durante toda
durante
toda la
la
noche
noche en
en un
un
volumen
volumen 1:1
1:1 v/m
v/m

Las
Las cascarillas
cascarillas se
se
dejan reposar 1 h.

Las
Las cascarillas
cascarillas se
se
colocan en
colocan
en un
un tubo
tubo
falcon de 50 mL y
se
se cubren
cubren con
con PBS.
PBS.

Colocar
Colocar el
el
endospermo en
en la
la
endospermo
licuadora con 50 100
100 ml
ml PBS
PBS

Descascarillar
Descascarillar 50
50 g
g
de frijol remojado.

Aadir
Aadir el
el molido
molido
del endospermo
en
en un
un embudo
embudo de
de
separacin,
separacin,

el
el cual
cual se
se mezcla
mezcla
con 100 mL de
acetona
acetona fra
fra en
en
proporcin
proporcin 2:1
2:1 ..

Esto
g de
Esto es
es 50
50 g
de
frijol
en 100
de
frijol en
100 mL
mL de
acetona.
acetona.

Mezclar
Mezclar
suavemente
suavemente
durante 5 min.
CUIDANDO
CUIDANDO liberar
liberar
los
los gases
gases en
en
c/mezclado.
c/mezclado.

Al
Al tener
tener las
las fases
fases
separadas en
nuestro
embudo
nuestro embudo
recuperar
recuperar las
las
lectinas
lectinas

Dejar
Dejar reposar
reposar las
las
fases 15 min. y
recuperar
la
recuperar la
acetona.
acetona.

NOTA:
la funcin
funcin
NOTA: la
de la acetona es
arrastrar
los
arrastrar los
lpidos.
lpidos.

Abriendo la llave
del
del embudo
embudo o
o
quitando
quitando la
la tapa.
tapa.

que
que se
se encuentrar
encuentrar
en la parte inferior
del
del embudo
embudo de
de
separacin.

Se vacian en un 2
tubos
tubos falcon
falcon de
de 15
15
mL
mL

Los
se van
van
Los cuales
cuales se
a centrifugar
durante
durante 5
5 minutos
minutos
a 3500 rpm.

Este proceso se
repite
repite de
de 2
2a
a3
3
veces.
veces.

se
se utiliza
utiliza para
para la
la
electroforesis
electroforesis SDSSDSPAGE dentro 15
das.

El otro tubo que

contiene
contiene las
las
lectinas
endosperma
endosperma SIN
SIN
SOL.
SOL. SALINA
SALINA

Uno de los tubos

se
se DILUYE
DILUYE CON
CON
10 mL DE SOL.
SALINA
SALINA 0.85%
0.85%

Buffer
Buffer PBS.
PBS.

Ambos tubos se
dejan
dejan abiertos
abiertos
para que se
evapore
evapore la
la
acetona.
acetona.

La
La cascarilla
cascarilla del
del
frijol
frijol que
que se
se dejo
dejo
remojando se licua
y se filtra.

donde
donde se
se obtiene
obtiene
el
el epitelio
epitelio del
del frijol
frijol
el cual se deja a 4
C

Hemoaglutinacin
se toma
1 gota
gota de
se
toma 1
de
sangre
gota
sangre +
+1
1 gota
lectina
endospermo
diluido
diluido

1 gota sangre + 1
gota de lectina
epitelio
epitelio filtrado.
filtrado.

Observar
Observar si
si hay
hay
presencia de
aglutinacin.
aglutinacin.

 CUESTIONARIO
1. Que son las lectinas y cul es su funcin.
Las lectinas son protenas o glicoprotenas de origen no inmune, fijadoras de carbohidratos con
capacidad para aglutinar clulas y precipitar glicoconjugados.5
Cualquier definicin deber tener en cuenta los siguientes aspectos:
Las lectinas son glicoprotenas.
No son de origen inmunolgico.
La relacin de las lectinas con varias glicoprotenas que contienen sitios de combinacin.
http://glosario_crohn.espacioblog.com/post/2006/12/17/lectina
2. Donde estn presentes las lectinas.
Las lectinas estn presentes en casi todo lo vivo, pues se han encontrado en el reino vegetal, animal
y en microorganismos.
En las plantas se han detectado, principalmente en los cotiledones y endospermos de las semillas y
constituyen del 2 al 10 % del total de las protenas de stas. En el reino animal se han encontrado en
invertebrados, tales como cangrejos, camarones, caracoles, lombrices y moluscos.
Estn presentes fundamentalmente en la hemolinfa y rganos sexuales.
3. Como actan las lectinas.
Las lectinas tpicamente contiene uno o ms sitios de combinacin de carbohidratos por molculas
esta es son divalentes o polivalentes.
Las lectinas constituyen un interesante grupo de protenas de origen no inmune que comparten en
comn la propiedad de enlazarse de forma especfica y reversible a carbohidratos, ya sean libres o
que formen parte de estructuras ms complejas.
Contienen al menos 2 sitios de unin, de ah que puedan enlazarse en primer lugar a un azcar
especfico y en forma secundaria a una molcula glicosilada. Poseen interesantes propiedades que
convierten a esta clase de protenas en herramientas invalorables en los laboratorios biolgicos, por
lo que se utilizan en numerosas investigaciones que incluyen: estudio de la estructura de las
membranas, deteccin de transformaciones malignas, purificacin de glicoconjugados, estudios
citogenticos, as como tambin en ensayos histoqumicos, enzimticos y en el tipaje de grupos
sanguneos.

4. A que se refiere el efecto micrognico.

5. Como se emplean las lectinas y que utilidad tienen como reactivo de diagnostico.
Las lectinas se consideran armas valiosas en el campo de la Gentica, la Biomedicina y la
Inmunologa. Su utilidad est basada en la propiedad que tienen de combinarse con varios tipos de
glicoconjugados presentes en las superficies celulares y fluidos corporales.
Sus propiedades mitognicas permiten que se utilicen en estudios que tienen como base la
proliferacin de linfocitos en cultivos, como son:
- La evaluacin de la produccin de citoquinas (interfern e interleuquinas) y la expresin de sus
receptores en sobrenadantes de cultivos de linfocitos provenientes de pacientes con enfermedades
de alto impacto social como el sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), la tuberculosis y la
leishmaniasis, entre otras.
- La caracterizacin de algunos aspectos relacionados con la respuesta inmune y fenmenos
asociados con ellas como la inmunosupresin.
- La interaccin entre virus, como por ejemplo entre el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y el
virus de la hepatitis B, as como la susceptibilidad y resistencia a stos.
- Evaluacin de la efectividad de terapias antirretrovirales de acuerdo con la respuesta de los
linfocitos a la estimulacin con las lectinas antes y despus de la terapia, como por ejemplo en
terapias contra el VHI.
- Anlisis de funciones linfoproliferativas y citotxicas en clulas mononucleares causadas por
algunas drogas.
- Estudios acerca de la influencia nutricional en la proliferacin de linfocitos y su cintica de
proliferacin.
- La induccin de genes en linfocitos.
- La deteccin de anormalidades cromosmicas.
Actualmente se han estudiado en detalle 9 lectinas con efecto mitognico sobre los linfocitos, entre
las que se destacan las provenientes de Phaseolus vulgaris (PHA), Canavalia ensiformis (Con A),
Pisum sativum (PSA) y Fitolaca americana (PWM). Estos mitgenos pueden activar de forma
diferente los linfocitos T y B, por ejemplo la PHA y Con A inducen mitogenicidad en clulas T,
mientras que el mitgeno de carmn (PWM) estimula ambos tipos de clulas. No se conoce lectina
alguna que estimule slo a los linfocitos B humanos.
Las lectinas forman parte de conjugados como lectina-lectina, lectina-enzimas y lectina-anticuerpos,
lo que ha permitido el desarrollo de tcnicas cromatogrficas como la cromatografa de afinidad para
la
purificacin de glicoprotenas. Ejemplo de ellas es la purificacin de IgG utilizando anti-IgG acoplada
a la Con A-Sepharose y la purificacin de IgM usando Con ASepharose, as como tambin la
purificacin de enzimas y de las propias lectinas.

Las interacciones de estas protenas con clulas pueden ser inhibidas en muchos casos por
azcares, por lo que se ha llegado a la conclusin de que ellas se enlazan a sacridos de la
superficie celular, lo que ha provisto a los cientficos de tiles marcadores para emplearlos en
tcnicas histoqumicas y en la microscopia electrnica para estudiar la estructura y funcin de la
membrana plasmtica. Generalmente se utilizan lectinas conjugadas con marcadores fluorescentes
como la biotina y las ms usadas para estos fines son la PHA-L, PHAE y las provenientes de Pisum
sativum (PSA), Triticum vulgare (WGA), Solanum tuberisum (STL), Arachis hypogae (PNA), Datura
strmonium (DSL), Lens culinaris (LCA) y de Griffonia simplicifolia (GSL).1
Dentro de los estudios de membrana se ha reportado en la literatura el uso de lectinas para estudiar
cambios estructurales en los glicoconjugados presentes en las superficies celulares25 y en
ocasiones de esta forma detectar cambios morfolgicos ocurridos, para analizar la distribucin
subcelular de epitopes y terminales glicoproteicos, adems para detectar alteraciones en la
expresin de molculas presentes en la superficie celular.
Otra rea importante en la cual se emplean las lectinas es la deteccin de transformaciones
malignas en clulas, a travs de la aglutinacin preferencial que muestran las lectinas con clulas
transformadas.
Adems se han realizado investigaciones para utilizar las lectinas y polmeros sintticos enlazados a
ellas como agentes anticancergenos in vivo e in vitro, ya que se ha visto que disminuyen el
crecimiento de las clulas tumorales. Se utilizan tambin para la inmunizacin contra virus
productores de inmunodeficiencia y algunos tumores y como medicamentos para prevenir
metstasis.35 Las propiedades citotxicas de algunas lectina como la Ricina y Abrina hacen tambin
que stas brinden inters como potenciales armas teraputicas en el tratamiento del cncer humano.
Las lectinas se emplean igualmente en la caracterizacin de grupos sanguneos humanos, as como
en la identificacin de nuevos grupos sanguneos.
Algunas de las lectinas son especficas en sus reacciones con los grupos sanguneos ABO, MN, A1
y A2 de humanos, por esto han sido utilizadas en la determinacin del tipo de sangre de los
individuos.
La mayora de las lectinas aglutinan los eritrocitos de todos los grupos sanguneos en humanos y
actan a similares concentraciones, stas son lectinas no especficas (no significa que no sea
especfica a los azcares); el resto son lectinas especficas.
http://bvs.sld.cu/revistas/hih/vol15_2_99/hih02299.pdf

RESULTADOS

Tabla 1. Reactivos utilizados para la elaboracin del Buffer PBS 1 X

Reactivo
NaCl
KCl
Na2HPO4
KH2PO4

Masa
(g)
8
0.2
1.44
0.24

Este se prepar en 800 mL de H 2O, se afor hasta llegar a 1 L

posteriormente se procedi ajustar el pH hasta llegar a un pH = 7.4
con una sol. de HCl

Tabla 2. Prueba de hemoaglutinacin.

Prueba de Hemoaglutinacin
1 gota de sangre + 1 gota de lectina endospermo
1 gota de sangre + 1 gota de lectina del epitelio
diluido
filtrado
Presencia de aglutinacin
Presencia de aglutinacin

Figura 1.

Figura 2.

HOJA DE CLCULO

Para preparar el Persulfato de Amonio al 10% se tomo como base el siguiente

clculo.
1000 l 100

x l 10
NH 4 2 S2 O8
x=100 l

1 g 1000 g

x g 100 g
NH 4 2 S2 O8
x=0.1 g
Por lo tanto preparamos:
NH 4 2 S2 O8+ 900 l de H 2 O
x=0 .1 g

para preparar el gel separador SDS-PAGE %

Nota: tanto el Persulfato de Amonio como el TEMED se deben preparar justo

antes de hacer el gel.

ANLISIS DE RESULTADOS

Figura 2. Tipos de frijol

Mediante esta prctica se analizaron las propiedades del frijol peruano (Phaseolus
Vulgaris), este contiene protenas como las lectinas las cuales constituyen un
interesante grupo de origen no inmune que comparten en comn la propiedad de
enlazarse de forma especfica y reversible a carbohidratos, ya sean libres o que
formen parte de estructuras ms complejas.
Contienen al menos 2 sitios de unin, de ah que puedan enlazarse en primer
lugar a un azcar especfico y en forma secundaria a una molcula glicosilada el
cual tiene la capacidad de producir una aglutinacin.
Como se observa en la Tabla 2. La cual revela que al interactuar las lectinas del
frijol y los eritrocitos de humano se produce la aglutinacin, esto nos quiere decir
que contiene gran concentracin de lectinas, para producir dicha a aglutinacin.
Es una leguminosa resistente a climas ridos y a enfermedades provocadas por
bacterias y virus, esto se debe a que las lectinas de origen vegetal, como las del
frijol peruano, son resultado de un proceso de evolucin en el sistema de defensa,
el cual les permite contrarrestar efectos nocivos provocados por hongos, bacterias
e insectos.

CONCLUSIONES

Poseen interesantes propiedades que convierten a esta clase de protenas

en herramientas invalorables en los laboratorios biolgicos, por lo que se
utilizan en numerosas investigaciones que incluyen: estudio de la estructura
de las membranas, deteccin de transformaciones malignas, purificacin de
glicoconjugados, estudios citogenticos, as como tambin en ensayos
histoqumicos, enzimticos y en el tipaje de grupos sanguneos.

BIBILOGRAFA
http://dieumsnh.qfb.umich.mx/glicobiologia.htm

http://bvs.sld.cu/revistas/hih/vol15_2_99/hih02299.pdf
http://glosario_crohn.espacioblog.com/post/2006/12/17/lectina
En la sesin anterior se dejaron en refrigeracin a 4C, 2 tubos falcn los cuales
contienen las lectinas endospermo y lectinas epitelio filtrado, estas se transfirieron
cada una por separado a un tubo ependorf se toman 100 L de muestra y esta se
transfieren a una membrana la cual tiene un dimetro de poro de 0.45 m, de este
filtrado se recuperan 10 L de muestra para correr el gel y as realizar la
electroforesis.
Para hacer el gel nos basamos en la siguiente tabla 3.
Hicimos un gel para correr protenas qu diferencias hay varias, los geles que
podemos utilizar son ms delgados es diferente el material para DNA el material
utilizado para hacer la electroforesis usamos la agarosa a un porcentaje de 0.11%
el porcentaje de agarosa poda ir variando dependiendo del tamao del poro que
queramos ya que si lo que bamos a correr era muy pesado entonces hacamos
una agarosa ms laxa, por eso nosotros al correr un DNA genmico usamos la
agarosa al 0.11% y si es ms pequeo se utiliza una agarosa ms concentrada
queda ms dura pero el poro es ms cerrado y por lo tanto no se va tan rpido la
muestra dependiendo de lo que queramos correr es como vamos a hacer al
porcentaje nuestros geles.
En este caso para correr las protenas vamos a utilizar dos tipos de geles uno que
se le conoce como Gel Separador SDS-PAGE 10% el cual va en la parte de abajo
del gel este se adiciona un poco mas abajo de donde llega el peine, despus
vamos a adicionar un Gel Concentrador SDS-PAGE 4%, el cual va a concentrar la
muestra este se adiciona justamente donde va el peine, en ambos se usa una
solucin de monmeros al 30% los cuales van a polimerizar, en este caso es la

acrilamida y la poliacrilamida estos dos ya vienen juntos por que son altamente
txicos cuando an no han polimerizado, y una vez que polimeriza el gel pierden
su toxicidad.
La profesora mandara los fundamentos de las soluciones utilizadas en el lab.
La solucin de monmeros se encuentra en forma lquida, y para que estos
polimericen se necesita de la presencia de un catalizador que en este caso va a
ser el Persulfato de Amonio y el TEMED el cual es un iniciador de la reaccin, de
igual manera el TEMED es altamente txico, al momento de poner el Persulfato de
Amonio y el TEMED en ese momento empieza la reaccin y empieza a
polimerizar.
Tambin se puso en nuestra mezcla un buffer el cual para el separador lleva un pH
de 8.0 lo cual produce un gel desnaturalizado esto quiere decir que la protena que
est en estructura terciaria la vamos a desnaturalizar para que quede laxa y pueda
correr a travs del gel las cuales se separan en base a su carga.
Esta se carga negativamente con el SDS para que corra las protenas ya que
tienen diferentes cargas esto es que tienen un punto isoelctrico el cual va a llegar
a una neutralidad dependiendo del buffer que pongamos, en este caso para el
separador a un pH = 8 y para el concentrador a un pH = 4

Para haces esto tenemos dos vidrios lo cuales lo vamos a empalmar por que por
que no esta parejo y por lo tanto nos permite adicionar la solucin no va a ser
como el gel de agarosa el cual se vaci la agarosa en el carrito
En este caso lo que se hace es el gel el cual tiene un grosor de los empaques que
contienen aproximadamente de 0.2 mm se pone el vidrio abajo se pon en los
empaques en los extremos del vidrio en ambos lados y se pegan con un aparato
el cual los deja derechos para evitar que se salga el gel