BACTERIOLOGIA DE

PEIXES
Identificao bacteriana com base em mtodos bioqumicos,
serolgicos e moleculares

Sub-culturas

Cultura pura

IDENTIFICAO
BACTERIANA
Existem vrios mtodos de identificao bacteriana:
Mtodos bioqumicos:
Mtodos clssicos;
Sistemas multiprova.
Mtodos serolgicos;
Mtodos moleculares.

IDENTIFICAO
BIOQUMICA TRADICIONAL

IDENTIFICAO
BACTERIANA
A utilizao de mtodos de identificao mais avanados, exige quase sempre uma
identificao bioqumica prvia;

A identificao bacteriana clssica inicia-se com:

Reaco de Gram, baseada na estrutura da parede celular;
Morfologia e mobilidade;
Oxidase;
Metabolismo oxidativo/fermentativo;
Descarboxilao de aminocidos;

IDENTIFICAO
BIOQUMICA
So vrios os testes bioqumicos utilizados na identificao bacteriana:
Catalase;
Produo de cido e/ou gs a partir de vrios acares;
Reduo de nitratos;
Hidrlise da ureia (produo da enzima urease);
Utilizao de citrato;
Hidrlise da gelatina;
Teste do Vermelho de metilo (MR);
Teste de Voges-Proskauer (VP);

IDENTIFICAO
BIOQUMICA
Testes bioqumicos:
Produo de indol;
Produo de sulfureto de hidrognio (H2S);
- Galactosidase (ONPG);
Crescimento a vrias concentraes de sal (NaCl);
Crescimento a vrias temperaturas;

Sensibilidade a antibiticos.

TESTES BIOQUMICOS

GRAM
Teste de Gram:
Primeiro teste a ser efectuado quando se pretende
identificar uma bactria;
Permite dividir as bactrias em 2 grandes grupos:
Gram positivas e Gram negativas;
Este teste baseia-se na constituio da parede
bacteriana.

COMPOSIO DA PAREDE
BACTERIANA
Constituio da parede de uma bactria Gram-positiva

Constituio da parede de uma bactria Gram-negativa

MTODOS

Pode ser realizado por dois mtodos distintos:

Colorao de Gram tradicional;
Mtodo de Ryu (1938), em que se utiliza uma
soluo de KOH a 3%.

COLORAO DE GRAM
Na colorao de Gram, realizam-se em 4 passos:
Cobrir o esfregao com uma soluo de violeta de cristal
durante 30 segundos;
Lavar com gua e aplicar uma soluo de lugol durante 30
segundos;
Lavar com gua e aplicar uma soluo de acetona;
Lavar com gua e aplicar uma soluo de safranina durante 30
segundos e voltar a lavar com gua.

COLORAO DE GRAM
Bactrias Gram positivas, possuem um peptidoglicano
espesso:
Coram de azul/violeta, j que retm o violeta de cristal;
Bactrias Gram negativas, possuem um peptidoglicano fino:
Coram de vermelho porque no so capazes de reter o
violeta de cristal durante o processo de descolorao,
corando com a safranina ;

Gram +

Gram -

FORMA

As bactrias tm 3 formas caractersticas:

Cocos;
Bacilos;
Espiroquetas - forma de saca-rolhas.

MOBILIDADE
Quanto mobilidade, as bactrias podem ser:
Mveis:
Devido aos flagelos, que so estruturas proteicas que se
estendem para fora da membrana celular de algumas
bactrias Gram positivas e negativas;
Imveis:
No confundir com os movimentos Brownianos.

CITOCROMO OXIDASE
As bactrias que contm o sistema citrocromo, produzem
uma enzima oxidativa que cataliza a oxidao do citocromo c;
Os organismos que possuem no seu sistema respiratrio o
citocromo c so oxidase positivos, dando uma cor azul/
purpura com o reagente N, N, N, N-tetrametil-pfenilenodiamina;
Os organismos que no possuem citocromo c, so oxidase
negativas e no vo oxidar o reagente mantendo a cor
original.

CATALASE
Durante a respirao aerbia, as bactrias produzem
perxido de hidrognio e em alguns casos io superxido:
Estes compostos so molculas altamente reactivas;
A sua acumulao vai resultar na morte das bactrias,
se estas no forem capazes de os degradar
enzimaticamente.
A enzima catalase a responsvel pela degradao destes
compostos;

CATALASE
A produo da enzima catalase pode ser determinada pela
adio de perxido de hidrognio a uma cultura bacteriana:
As bactrias capazes de produzirem esta enzima,
degradam rapidamente o perxido de hidrognio,
levando produo de gua e oxignio, o que
corresponde a uma reaco positiva;
A ausncia de bolhas de oxignio corresponde a uma
reaco negativa.

Reaco catalase positiva

METABOLISMO DA
GLUCOSE
As bactrias podem utilizar duas vias metablicas distintas
para obterem energia a partir da glucose:
Respirao: na presena de oxignio, as molculas de
glucose so completamente oxidadas em dixido de
carbono e gua;
Fermentao: se o oxignio no est presente, a glucose
convertida em cido pirvico e outros produtos terminais
como etanol, cido actico e butrico, levando a uma
acidificao do meio onde se encontram.

METABOLISMO DA
GLUCOSE
Metodologia:
O/F Basal Medium, segundo Hugh & Leifson, suplementado
com 1% de glucose;
Utilizam-se 2 tubos, um dos quais coberto com parafina
lquida estril;
Incubao at 7 dias;
A mudana da cor do meio para amarelo considerado um
resultado positivo.

METABOLISMO DA
GLUCOSE
Bactrias de gua salgada:
Suplementar o O/F Basal Medium com 1% de
NaCl;
Utilizar ZOF (Lemos et al., 1985).

O/F segundo Hugh & Leifson

ZOF

A - Meio no inoculado;
B - Reaco negativa;
C - Reaco positiva.

A - Meio no inoculado;
B - Reaco negativa;
C - Reaco positiva.

PROVA DE INDOL
Baseia-se na capacidade das bactrias desdobrarem a molcula de
triptofano levando produo de indol;
O triptofano um aminocido essencial;
A sua oxidao origina cido pirvico e amonaco:
As vrias enzimas que intervm neste processo recebem o
nome colectivo de triptofanase.
A capacidade de hidrolisar o triptofano, com a produo de
indol, no uma caracterstica de todas as bactrias.

PROVA DE INDOL
A triptofanase catalisa uma reaco de desaminao:
A hidrlise da molcula de triptofano ocorre apenas
na sua cadeia lateral;
O anel aromtico fica intacto sob a forma de indol.
A presena de indol detectada pela adio do
reagente de Kovacs, que constitudo por pdimetilamino-benzaldedo, butanol e cido clordrico;

PROVA DE INDOL

O indol presente no meio extrado para a camada

de reagente de Kovacs pelo butanol acidificado e
nesta, vai reagir com o p-dimetilamino-benzaldedo,
adquirindo uma cor vermelho cereja.

B
Depois da adio do reagente de Kovacs:
A - Camada amarela - bactria indol negativa;
B - Camada vermelho cereja - bactria indol positiva.

SULFURETO DE
HIDROGNIO (H2S)
Determinar se ocorre a libertao de sulfureto de
hidrognio a partir de aminocidos que possuem
enxofre na sua constituio;
Aminocidos que contm enxofre:
Metionina;
Cistena.

SULFURETO DE
HIDROGNIO (H2S)
Na presena de qualquer destes aminocidos, o enxofre reduzido por
hidrogenao, levando produo de sulfureto de hidrognio sob a
forma gasosa:
Gs incolor:
necessrio um indicador para a sua deteco;
So vrios os compostos que podem funcionar como indicadores:
Ferro, sulfato ferroso, sulfato de amnio ferroso ou frrico,
tiosulfato de sdio ou sulfito de bismuto.

SULFURETO DE
HIDROGNIO (H2S)
Meio SIM, possui como indicadores o sulfato de amnia ferroso e
o tiosulfato de sdio;
necessrio a presena dos dois indicadores, j que a deteco do
sulfureto de hidrognio s possvel ao fim de duas etapas:
A bactria vai reagir com o tiosulfato de sdio, dando origem a
sulfato ou sulfito de sdio e sulfureto de hidrognio;
O sulfureto de hidrognio vai reagir com o sulfato de amnia
ferroso, produzindo um precipitado negro insolvel, o sulfato
de ferro.

Reaco de sulfureto de hidrognio:

A - Reaco positiva;
B - Reaco negativa.

UTILIZAO DO CITRATO
Pretende-se determinar se uma bactria capaz de
utilizar o citrato como nica fonte de carbono;
O citrato um intermedirio do ciclo de Krebs;
As bactrias que possuem a enzima citrato-permease
vo transportar o citrato para o interior da clula e
transforma-lo em piruvato.

UTILIZAO DO CITRATO
O agar citrato de Simmons possui na sua constituio
citrato de sdio como nica fonte de carbono e
fosfato de amnia como nica fonte de azoto;
As bactrias capazes de utilizar o citrato como nica
fonte de carbono vo degradar o fosfato de amnia
em amonaco ou hidrxido de amnia, levando
alcalinizao do meio (passa a azul).

CITRATO DE
SIMMONS
A - Resultado negativo
B - Resultado positivo