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--Un microscopio simple es aquel que utiliza una sola lente de aumento. Es el microscopio ms
bsico. El ejemplo ms clsico es lalupa. El microscopio ptico estndar utiliza dos sistemas de
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lentes alineados.
--Se denomina microscopio compuesto a aquellos instrumentos que poseen ms de una lente de
objetivo. Estos se utilizan especialmente para analizar objetos transparentes o que se encuentran
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fluorocromos.
Los microscopios de luz polarizada son instrumentos que poseen dos polarizadores. Uno de ellos,
se ubica entre el condensador y la muestra mientras que el segundo se encuentra entre el
observador y la muestra. El material utilizado es el cuarzo ya que permite el paso de luz polarizada.
Estos microscopios se usan para identificar substancias cristalinas, amiloides, colgeno, asbesto,
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la geologa (en el anlisis de la composicin mineralgica y textural de las rocas) y, por supuesto, en el campo
de la biologa (en el estudio de estructuras microscpicas de la materia viva), por citar algunas disciplinas de
la ciencia.
Hasta ahora se da uso en el laboratorio de histologa y anatoma patolgica, donde la microscopa permite
determinadas aplicaciones diagnsticas, entre ellas el diagnstico de certeza del cncer, numerosas
estructuras cristalinas, pigmentos, lpidos, protenas, depsitos seos, depsitos de amiloide, etctera.
Parte mecnica del microscopio
Esquema de un microscopio ptico.
5 * Foco: dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
La parte mecnica del microscopio comprende el pie, el tubo, el revlver, el asa, la platina, el carro y el tornillo
micromtrico. Estos elementos sostienen la parte ptica y de
iluminacin; adems, permiten los desplazamientos necesarios para
el enfoque del objeto.
El tubo: tiene forma cilndrica. El tubo se encuentra en una carretera superior de la columna mediante
un sistema de cremalleras, las cuales permiten que el tubo se mueva mediante los tornillos. * Tubo: es la
cmara oscura que porta el ocular y los objetivos. Puede estar unida al brazo mediante una cremallera
para permitir el enfoque.
El tornillo macromtrico o macroscopico: girando este tornillo, asciende o desciende el tubo del
microscopio, deslizndose en sentido vertical gracias a un mecanismo de cremallera. Estos movimientos
largos permiten el enfoque rpido de la preparacin.
El tornillo micromtrico o microscopico: mediante el ajuste fino con movimiento casi imperceptible
que produce al deslizar el tubo o la platina, se logra el enfoque exacto y ntido de la preparacin. Lleva
acoplado un tambor graduado en divisiones de 0,001 mm, que se utiliza para precisar sus movimientos y
puede medir el espesor de los objetos.
Tornillos macro y micromtrico: Son tornillos de enfoque, mueven la platina o el tubo hacia arriba y
hacia abajo. El macromtrico lo hace de forma rpida y el micromtrico de forma lenta, para un enfoque
ms preciso. Pueden llevar incorporado un mando de bloqueo que fija la platina o el tubo a una
determinada altura.
La platina: es una pieza metlica plana en la que se coloca la preparacin u objeto que se va a
observar. Presenta un orificio, en el eje ptico del tubo, que permite el paso de los rayos luminosos a la
preparacin. La platina puede ser fija, en cuyo caso permanece inmvil; en otros casos puede ser
giratoria; es decir, mediante tornillos laterales puede centrarse o producir movimientos circulares.
Platina: Es una plataforma horizontal con un orificio central, sobre el que se coloca la preparacin, que
permite el paso de los rayos procedentes de la fuente de iluminacin situada por debajo. Dos pinzas
sirven para retener el portaobjetos sobre la platina y un sistema de cremallera guiado por dos tornillos de
desplazamiento permite mover la preparacin de adelante hacia atrs o de izquierda a derecha y
viceversa. Puede estar fija o unida al brazo por una cremallera para permitir el enfoque.
Las pinzas: son dos piezas metlicas que sirven para sujetar la preparacin. Se encuentran en la
platina.
El revlver: es una pieza giratoria provista de orificios en los que se enroscan los objetivos. Al girar
el revlver, los objetivos pasan por el eje del tubo y se colocan en posicin de trabajo, lo que se nota por
el ruido de un pin que lo fija. 7 * Revlver: Es el sistema que porta los objetivos de diferentes
aumentos, y que rota para poder utilizar uno u otro, alinendolos con el ocular.
Sistema ptico
El sistema ptico es el encargado de reproducir y aumentar las imgenes mediante el conjunto de lentes que
lo componen. Est formado por el ocular y los objetivos. El objetivo proyecta una imagen de la muestra que el
ocular luego ampla.
El ocular: se encuentra situado en la parte superior del tubo. Su nombre se debe a la cercana de la
pieza con el ojo del observador. Tiene como funcin aumentar la imagen formada por el objetivo. Los
oculares son intercambiables y sus poderes de aumento van desde 5X hasta 20X. Existen oculares
especiales de potencias mayores a 20X y otros que poseen una escalamicromtrica; estos ltimos tienen
la finalidad de medir el tamao del objeto observado. Ocular: lente situada cerca del ojo del observador.
Capta y ampla la imagen formada en los objetivos.
Los objetivos: se disponen en una pieza giratoria denominada revlver y producen el aumento de
las imgenes de los objetos y organismos, y, por tanto, se hallan cerca de la preparacin que se
examina. Los objetivos utilizados corrientemente son de dos tipos: objetivos secos y objetivos de
inmersin. 2 * Objetivo: lente situada en el revolver. Ampla la imagen, es un elemento vital que permite
ver a travs de los oculares
Los objetivos secos se utilizan sin necesidad de colocar sustancia alguna entre ellos y la
preparacin. En la cara externa llevan una serie de ndices que indican el aumento que producen, la
abertura numrica y otros datos. As, por ejemplo, si un objetivo tiene estos datos: plan 40/0,65 y
Sistema de iluminacin
Este sistema tiene como finalidad dirigir la luz natural o artificial de tal manera que ilumine la preparacin u
objeto que se va a observar en el microscopio de la manera adecuada. Comprende los siguientes elementos:
Fuente de iluminacin: se trata clsicamente de una lmpara incandescente de tungsteno sobrevoltada; en
versiones ms modernas con leds. Por delante de ella se sita un condensador (una lente convergente) e,
idealmente, un diafragma de campo, que permite controlar el dimetro de la parte de la preparacin que
queda iluminada, para evitar que exceda el campo de observacin produciendo luces parsitas.
Condensador: est formado por un sistema de lentes, cuya finalidad es concentrar los rayos
luminosos sobre el plano de la preparacin, formando un cono de luz con el mismo ngulo que el del
campo del objetivo. El condensador se sita debajo de la platina y su lente superior es generalmente
planoconvexa, quedando la cara superior plana en contacto con la preparacin cuando se usan objetivos
de gran abertura (los de mayor ampliacin); existen condensadores de inmersin, que piden que se llene
con aceite el espacio entre esa lente superior y la preparacin. La abertura numrica mxima del
condensador debe ser al menos igual que la del objetivo empleado, o no se lograr aprovechar todo su
poder separador. El condensador puede deslizarse verticalmente sobre un sistema de cremallera
mediante un tornillo, bajndose para su uso con objetivos de poca potencia. Condensador: lente que
concentra los rayos luminosos sobre la preparacin.
Diafragma: el condensador est provisto de un diafragma-iris, que regula su abertura para ajustarla
a la del objetivo. Puede emplearse, de manera irregular, para aumentar el contraste, lo que se hace
cerrndolo ms de lo que conviene si se quiere aprovechar la resolucin del sistema ptico. 4
* Diafragma: regula la cantidad de luz que llega al condensador
Tcnica histolgica
Se denomina tcnica histolgica al conjunto de
operaciones a que se somete una materia
organizada (tejido biolgico), a fin de que sea posible su estudio por medio del microscopio, posibilitando la
observacin de estructuras no visibles al ojo humano.
Pasos de la tcnica histolgica
Proceso de fijacin
Lavados
Deshidratacin
Aclaramiento
Infiltracin
Inclusin
Microtoma
Tincin
Observacin (Este ltimo no es considerado como un paso de la tcnica histologica por varios
autores)
Obtencin del material histolgico
Los tejidos se pueden obtener de diferentes formas:
Biopsia
Abiopsia
Fijacin
En este paso el tejido obtenido se coloca en una sustancia fijadora para evitar los cambios post-mortem. Unos
de los fijadores ms usado es el formol al 10% (formaldehido). En el caso de que utilicemos ms adelante el
microscopio electrnico, usaremosglutaraldehdo (para protenas) u osmio (para lpidos).
Lavados
Se debe lavar el tejido para quitar el exceso de fijador.
Deshidratacin
Suena incoherente que se deba lavar el tejido y despus deshidratarlo. El exceso de fijador al momento de la
infiltracin, incluso en la microtoma, podra afectar los cortes histolgicos, y por ello se debe lavar. La
deshidratacin se hace empleando diferentes soluciones de alcohol de concentracin creciente.
Aclaramiento
En este paso se sustituye el alcohol por un disolvente de parafina. El ms usado es el xilol (xileno) ya que
como la muestra est deshidratada, el xilol entrar hasta lo ms profundo del tejido. Tambin el tejido pierde
color y adquiere un tono acaramelado.
Infiltracin
En este paso la muestra se coloca en parafina lquida, cabe mencionar que se debe usar parafina histolgica.
Como se ha dicho en el paso anterior el tejido est completamente lleno de xilol, ahora debido a smosis sale
el xilol y entra la parafina.
La deshidratacin, aclaramiento e infiltracin pueden ser realizadas manualmente pero hoy en da se realizan
de modo automtico en mquinas especficas.
Inclusin
Aqu se forman bloques de parafina dentro de los cuales estn las muestras a estudiar. Tambin hay
maquinas especializadas para la inclusin en parafina de tejidos. Despus de su inclusin y posterior secado,
estos se deben poner a enfriar en un congelador para su posterior corte.
Microtoma
Se realizan cortes histolgicos muy delgados segn lo requerido o la costumbre del laboratorio donde se
realice la tcnica. Los cortes van desde 0,5 micras hasta 8 u 10 micras. Los cortes se echan al bao de
flotacin y se pescan con un portaobjetos, se marcan con la fecha, el tipo de tejido y la tincin con que se
van a procesar. El ngulo de corte entre el cuchillo del microtomo y el bloque ha de estar entre 10 y 15. Una
vez realizado el corte se da un bao de agua destilada, para que la parafina se estire. Un buen corte
histolgico debe tener un grosor aproximado de 3-5 micras para que sea fcilmente atravesado por la luz.
Tincin
Hay muchos tipos de tinciones para diferenciar en los tejidos las diferentes estructuras o sustancias.
La tincion ms usada o tambin llamada "de rutina" es la de hematoxilina y eosina (H&E). Se usa un colorante
llamado hematoxilina que tie las sustacias cidas o que las contengan, como el ncleo que contiene cido
desoxirriboncleico (ADN) La eosina amarillenta tie las estructuras bsicas como el citoplasma y dems
orgnulos eosinoflicos de la clula.
Otra tincin muy usada es la de Papanicolau Usa colorantes como:
OG6
EA50
Esta tincin es muy usada para teir excreciones corporales como saliva, orina, etc. (La sangre NO es una
excrecin sino un fluido corporal.)
Como se mencion anteriormente hay muchas tinciones Otros ejemplos son:
Masson
PASCHIFF
Perls
Plata metenamina
Warthin-Starry
Ziehl-Neelsen
Van Gieson
Azul alciano
Sudn III
Rojo Congo
Observacin
Como se menciono al principio algunos autores no consideran la observacin como un paso de la tcnica
histolgica sino el objetivo final de la misma. Como se puede deducir, se observa la laminilla al microscopio y
se busca lo que se necesite ver para llegar a un diagnostico.
La tcnica histolgica es muy empleada en laboratorios y hospitales. Permite hacer diagnsticos de distintas
enfermedades, como para saber si un tumor es maligno o beningno, etc.
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Pasamos a colocar la preparacin sobre la platina de forma que la muestra quede centrada en el
orificio por el que pasar la luz. El portaobjetos debe quedar firmemente sujeto por las pinzas metlicas
que en la platina.
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Ahora ya podemos comenzar con la observacin. Se empieza con el objetivo de menor poder de
aumento que hemos puesto en posicin en el primer paso. Este normalmente es el de 4x. Podemos
pasar directamente al objetivo de 10x en caso de preparaciones de bacterias o clulas de tamao
similar. Pasamos a realizar el enfoque.
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Tras enfocar la muestra utilizando un objetivo de pocos aumentos, pasamos al siguiente objetivo
de mayor aumento. La imagen puede desenfocarse un poco y tendremos que ajustar el enfoque con el
tornillo micromtrico. En algunas ocasiones puede ocurrir que al pasar a un objetivo de mayor aumento
se pierda por completo la imagen; en este caso ser mejor pasar de nuevo al objetivo anterior y volver a
realizar el enfoque. As vamos pasando a objetivos de mayores aumentos. A ms aumentos, el objetivo
enfoca de forma ms cercana a la preparacin. Por ello hay que tener cuidado de que el objetivo no
toque la muestra, pues se puede estropear tanto la lente del objetivo como la propia preparacin.
Tambin puede ocurrir que no se estropee pero que se manche de aceite de inmersin si se est
observando una preparacin que ya se haba observado con el objetivo de inmersin. En este ltimo
caso habr que limpiar la lente del objetivo de forma adecuada.
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Subimos el condensador todo lo que podamos para que se visualice de forma clara y
ntida el crculo que se ilumina en la muestra. En este crculo ser dnde pondremos una gota del
aceite de inmersin.
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Giramos el revlver dnde van los distintos objetivos del microscopio hasta que quede
en una posicin media entre el objetivo del inmersin y el anterior. As nos queda el espacio libre
para colocar el aceite sin ningn obstculo.
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Ponemos una gota de aceite de inmersin en el crculo de luz que se debe visualizar
ntidamente en la preparacin. Una gota es una gota, ni dos ni tres. Hay que poner la cantidad
mnima que podamos.
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Mirando desde fuera del microscopio, no a travs del ocular, acercamos la platina al
objetivo hasta que la lente frontal del objetivo entre en contacto con el aceite de inmersin. Este
acercamiento hay que realizarlo de forma lenta. En cuento el aceite y la lente entren en contacto,
paramos.
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Pasamos a mirar a travs del ocular y enfocamos con el tornillo micromtrico. Hay que
realizar el enfoque con cuidado, la distancia entre la preparacin y el objetivo es realmente corta!!!
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Tras poner el aceite de inmersin sobre la preparacin, hay que volver a realizar el
enfoque desde el principio si queremos volver a mirar con un objetivo diferente al objetivo de
inmersin. De lo contrario se corre el riesgo de manchar la lente de los objetivos.
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