La tcnica ms usada es la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC),
por su sensibilidad, fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas
exactas, su idoneidad para la separacin de especies no voltiles y su aplicacin a sustancias de primordial inters en la industria, como son los aminocidos, protenas, cidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, entre otros.
La HPLC se puede utilizar como tcnica preparativa y como tcnica analtica,
permitiendo la purificacin, identificacin y cuantificacin del analito deseado. La eleccin de la fase estacionaria y la fase mvil, del flujo al que se va a impulsar la fase mvil a travs de la fase estacionaria e incluso de la temperatura a la que se va a realizar la cromatografa, permitirn una correcta separacin del analito de otros compuestos. Cada componente de una solucin tiene unas caractersticas determinadas bajo ciertas condiciones cromatogrficas, y debe conseguirse que la migracin del componente y de los contaminantes a travs de la columna sea lo suficientemente distinta para que dicho compuesto sea separado de los dems del extracto, para permitir su posterior identificacin y cuantificacin. A este proceso se le denomina purificacin. Campos de Aplicacin de HPLC Frmacos: Antibiticos, sedantes esteroides, analgsicos Bioqumica: Aminocidos, protenas, carbohidratos, lpidos Productos de alimentacin: Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos Productos de la industria qumica: Aromticos condensados, tensoactivos, propulsores, colorantes
Qumica forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcticos
Medicina clnica: cidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina, estrgenos.
Algunas aplicaciones importantes de la HPLC preparativa
Separacin y purificacin de metabolitos
Separacin y purificacin de los metabolitos de las drogas procedentes de muestras de
orina
Purificacin y separacin de enantimeros
Purificacin de compuestos naturales
Purificacin y caracterizacin de enzimas y protenas
Esta tcnica esta indicada para la separacin de compuestos orgnicos
semivlatiles. Hidrocarburos Poliaromticos (PAHs), Aminocidos: OTA, cido Flico, Herbicidas, Vitaminas, Acido tenuazonico, Formaldehdoetc. Rango de trabajo para muestras lquidas: g L-1 - mg L-1 Rango de trabajo para muestras slidas: g Kg-1 - g g
Deteccin
La eficiencia de un detector cromatogrfico depende de la relacin entre la cantidad
fsica medida y la composicin del efluente, as como tambin de lascaractersticas de las seal de transferida. Los detectores en cromatografia de lquidos son de dos tipos bsicos. Los detectores basados en una propiedad de la disolucin responden a una propiedad de la fase mvil, tal como el ndice de refraccin, la constante dielctrica, o la densidad, que se modifica por la presencia de los analitos. Por contraste, los detectores basados en una propiedad del soluto responden a alguna de las propiedades del soluto, como la absorbancia UV, fluorescencia, o intensidad de difusin, que no son propias de la fase mvil. Detectores de absorbancia de infrarrojo Una de las mayores limitaciones al uso de los detectores de infrarrojo se debe a la baja transparencia de muchos de los disolventes que se utilizan. Por ejemplo, las bandas anchas de absorcin infrarroja del agua y de los alcoholes impiden prcticamente el uso de este detector para muchas aplicaciones. Detectores de fluorencia Una ventaja inherente a los mtodos de fluorescencia es su alta sensibilidad, que resulta ser ms de un orden de magnitud mayor que la de los sistemas de absorbancia. En cromatografa de lquidos se ha aprovechado esta ventaja para la separacin y determinacin de los componentes fluorescentes de las muestras. Detector ndice de refraccin Los detectores de ndice de refraccin tienen la ventaja de que responden a casi todos los solutos. Es decir, son detectores universales anlogos a los detectores de llama en cromatografia de gases. Adems, son fiables y no dependen del caudal. Sin embargo, son muy sensibles a los cambios de temperatura, y se han de mantener a una temperatura constante en unas pocas milsimas de grado centgrado. Detectores electroqumicos Los fabricantes de instrumentos proporcionan en la actualidad varios tipos de detectores electroqumicos. Estos dispositivos se basan en cuatro mtodos electroanalticos que incluyen la amperometra, la voltamperometra, la coulombimetra y la conductimetra. Una de las mayores ventajas de este tipo de detector es que su respuesta resulta ser aproximadamente la misma para todos los solutos no voltiles. Adems es notablemente ms sensible que el detector de ndice de refraccin En la cromatografa de lquidos no hay detectores tan aplicables universalmente ni tan fiables como los detectores de ionizacin de llama y de conductividad trmica. Uno de los mayores retos en el desarrollo de la cromatografa de lquidos ha sido el
perfeccionamiento de los detectores. Un detector ideal para cromatografa de
lquidos debera poseer todas las propiedades listadas en relacin con la cromatografa de gases, con la excepcin de que un detector para cromatografa de lquidos no es necesario que sea sensible en un intervalo tan grande de temperaturas. Adems, un detector de HPLC debe tener un volumen interno mnimo a fin de reducir el ensanchamiento de banda. Los detectores en cromatografia de lquidos son de dos tipos bsicos. Los detectores basados en una propiedad de la disolucin responden a una propiedad de la fase mvil, tal como el ndice de refraccin, la constante dielctrica, o la densidad, que se modifica por la presencia de los analitos. Por contraste, los detectores basados en una propiedad del soluto responden a alguna de las propiedades del soluto, como la absorbancia UV, fluorescencia, o intensidad de difusin, que no son propias de la fase mvil.