Tcnicas Avanzadas en Qumica

Ciencias Ambientales, curso 2005/06

Prctica 1
DETERMINACIN DE FOSFATOS
EN AGUAS POR ESPECTROFOTOMETRA
1. Objetivo
El objetivo de esta prctica es la determinacin del contenido de fosfatos solubles en
una muestra de agua mediante espectrofotometra ultravioleta-visible. Se aplicar el mtodo
de adiciones estndar para eliminar interferencias con otros compuestos.
Los abonos inorgnicos estn constituidos por diversas clases de fosfatos solubles, los
ms comunes de los cuales derivan de los aniones meta- (PO3), piro- (P2O74) y ortofosfato
(PO43). Debido a su elevada solubilidad, estos aniones son arrastrados fcilmente por las
aguas superficiales hacia ros, acuferos, etc. Otra fuente de fosfatos la constituyen los
vertidos urbanos que contienen detergentes: para aumentar su eficacia, algunos detergentes
utilizan fosfatos inorgnicos en su composicin como agentes alcalinizadores. Las aguas
naturales contienen normalmente cantidades de fosfatos por debajo de 1 mg/l. Cantidades
superiores de estos nutrientes favorecen el crecimiento de algas que consumen el oxgeno del
medio acutico y provocan la desaparicin de especies vegetales y animales.
2. Metodologa experimental
A. Fundamento
El mtodo propuesto para determinar fosfatos se basa en la formacin de un
heteropolicido con el reactivo vanado-molbdico (de color amarillo y soluble en agua) cuya
absorcin de luz se mide a 420 nm. Para el ortofosfato, la formacin de este complejo tiene
lugar segn la reaccin:

(PO4)3 + (VO3) + 11(MoO4)2 + 22 H+ P(VMo11O40)3 + 11 H2O

(1)

En esta identificacin interfieren concentraciones apreciables de Fe(III), silicato y

arseniato, entre otras especies. Es decir, estas especies absorben luz a la longitud de onda
utilizada (420 nm, absorcin del P(VMo11O40)3). Para eliminar dicha interferencia se
preparar un blanco (sin fosfato) cuya absorbancia se restar de la del resto de las muestras.
Adicionalmente, es posible que la absorbancia del complejo se vea afectada por
efectos de matriz. La matriz puede potenciar o atenuar la absorbancia de luz por el complejo,
lo cual puede conducir a resultados errneos. Para minimizar este efecto, aplicaremos el
mtodo de adiciones estndar, que consiste en la adicin de cantidades crecientes del analito
de inters (fosfato en nuestro caso) a una cantidad fija de muestra. ste procedimiento resulta
ms efectivo que un calibrado externo (recta de calibrado con disoluciones patrn) cuando la
matriz interfiere en la deteccin. En esta prctica estudiaremos la importancia de los efectos
de matriz, determinando la concentracin de fosfato mediante ambos mtodos y comparando
los resultados.

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B. Espectrofotometra
La espectrofotometra es una de las tcnicas experimentales ms utilizadas para la
deteccin especfica de molculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomolculas, etc) y
estado de agregacin (slido, lquido, gas). El fundamento fsico-qumico de la
espectrofotometra est relacionado con la capacidad de las molculas de absorber energa
luminosa y almacenarla en forma de energa interna. Esto permite que se inicien ciclos vitales
de muchos organismos, entre ellos el de la fotosntesis en plantas y bacterias.
La Mecnica Cuntica nos dice que la luz est compuesta de fotones cada uno de los
cules tiene una energa:

Efotn = h = hc/ ,

(2)

donde h = 6.6 10-34 Js es la constante de Planck, c es la velocidad de la luz, es su frecuencia

y su longitud de onda. Cuando decimos que una molcula absorbe luz de longitud de onda
, esto significa que la molcula absorbe un fotn de esa longitud de onda. En esta prctica
estudiaremos la absorcin de luz en el visible-ultravioleta cercano ( 325-700 nm). Cuando
una molcula absorbe un fotn en este intervalo espectral, se excita pasando un electrn de un
orbital del estado fundamental a un orbital excitado de energa superior. De esta manera la
molcula almacena la energa del fotn:

A + h A*

E(A*) E(A) = h

(3)

Como la energa se conserva, la diferencia de energa entre el estado excitado (A*) y el

fundamental de la molcula (A) debe ser exactamente igual a la energa del fotn. Cada
molcula tiene una serie de estados excitados discretos (o bandas) que dependen de su
estructura electrnica y que la distinguen del resto de molculas. Como consecuencia, el
espectro de absorcin, es decir, la luz absorbida en funcin de la longitud de onda,
constituye una verdadera sea de identidad de cada molcula. Dos molculas distintas
presentarn espectros de absorcin distintos, como se representa esquemticamente en la
figura 1.
Figura 1: Hipotticos espectros de absorcin de dos molculas distintas A y B
B*(2)

B*(2)

A*(2)
A*(1)

B*(1)

molcula A

Absorbancia

A*(2)

Espectros
de absorcin
de A y B
A*(1)
B*(1)

molcula B
4

Longitud de onda

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Un espectrofotmetro (figura 2) consta de una fuente de luz blanca caracterizada

por un espectro de emisin continuo en un intervalo amplio de longitudes de onda (en nuestro
caso 350nm-900 nm). Un monocromador acta como filtro ptico transmitiendo un haz de luz
de longitud de onda fija e intensidad I0 que penetra en la cubeta de anlisis donde se
encuentra la muestra. Un detector sensible a la luz mide la intensidad del haz a la salida If.
Figura 2: Esquema del espectrofotmetro

La intensidad del haz de luz se va atenuando a medida que atraviesa la cubeta con la
muestra debido a la absorcin de las molculas. El ritmo de absorcin depende de la
intensidad inicial de luz y de la concentracin de molculas. De esta manera, cuando un haz
de luz de intensidad I recorre una distancia dL en una muestra con una concentracin de
molculas [B], se produce una atenuacin de intensidad dI dada por:

d I = - k [B] I dL

(4)

El significado de la constante de proporcionalidad k se discute ms abajo. La expresin

anterior se puede integrar de la siguiente forma:

dI
= k [B] dL
I

I f dI
I0

= k [B]

L
0

dL

ln

If
= k [B] L
I0

(5)

lo cual da lugar a la ley de Lambert-Beer para la absorcin de luz en un medio, que relaciona
la intensidad a la salida de la muestra If, con la intensidad inicial I0, la concentracin de
molculas y la distancia recorrida por la luz en la muestra, L:

I f = I 0 10 [B ] L

( = k / ln 10 )

(6)

El espectrofotmetro, en lugar de la intensidad, mide la absorbancia A que se define por:

A log10

I0
= [B] L
If

(7)

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donde la constante es la denominada absortividad molar1 (o tambin coeficiente de

extincin), que en general depende de la longitud de onda de la luz incidente.
Como se puede observar, la absorbancia es directamente proporcional a la
concentracin de molculas en la muestra. Es decir la representacin de absorbancia frente
a concentracin sigue una recta de pendiente m = L. Esta ley de proporcionalidad se
cumple para luz monocromtica (de una longitud de onda dada) y disoluciones diluidas de las
molculas absorbentes (< 0.01M). Se encontrarn en general desviaciones cuando se realicen
experimentos sobre muestras concentradas de analitos.
C. Mtodos de calibrado: patrn externo y adiciones estndar
Una curva de calibrado representa la respuesta de un mtodo analtico (seal
detectada) sobre muestras patrn o estndar con concentraciones conocidas de analito. Se
prepara adems una disolucin blanco, que contienen nicamente la matriz, es decir todos
los reactivos y disolventes de la muestra salvo el analito de inters. En el intervalo de
respuesta lineal del mtodo analtico (dentro del cual la seal es proporcional a la
concentracin de analito), se obtiene una recta de calibrado a partir del procedimiento
siguiente (ver figura 3):
1) Se representa la seal detectada corregida de la seal del blanco frente a la concentracin
de cada disolucin patrn;
2) se realiza una regresin lineal de los puntos resultantes por el mtodo de mnimos
cuadrados (ver el apndice de este guin). . Se recomienda el uso de Excel para obtener la
recta de ajuste. La recta de calibrado y = a x + b (x: concentracin , y: seal) permite
obtener la concentracin de cualquier muestra problema a partir de la seal obtenida
experimentalmente
Figura 3: Recta de calibrado a partir de patrones externos

Ntese que la ley de Lambert-Beer se define en la ecuacin (6) con una potencia de 10, en lugar de una
exponencial (como correspondera a invertir la relacin ln(If/I0) de la ecuacin (5). Para corregir este hecho basta
recordar que ln x = (ln 10) log x. De ah la relacin para la absortividad =k/ln10.

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El mtodo alternativo de adiciones estndar consiste en aadir sobre la muestra

problema cantidades crecientes conocidas de analito. De esta manera, todas las medidas se
realizan sobre la misma matriz. Al representar la seal experimental frente a la concentracin
de analito aadida resulta una recta a partir de cuya pendiente y ordenada en el origen se
obtiene la concentracin de la muestra problema. El procedimiento se demuestra e ilustra en
la figura 4.
Figura 4: Recta de calibrado a partir de adiciones estndar

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3. Aparatos y material
Material
9 matraces aforados de 25 ml
Probeta de 250 ml
1 matraz aforado de 100 ml
Pipetas de 1, 5 y 10 ml
1 vaso de precipitado de 100 ml
5 vasos de precipitado de 50 ml
Matraces aforados de 100ml y 1000 ml por banco (3-4 parejas)
Reactivos
Heptamolibdato amnico
Metavanadato amnico

ortofosfato cido potsico

5. Procedimiento experimental
A. Preparacin de reactivos
1. Reactivo vanado-molbdico (nica para todos): En unos 400 ml de agua destilada,
disolver 20g de heptamolibdato amnico, Mo7O24(NH4)64H2O. Preparar una
segunda disolucin de 0.5 g de metavanadato amnico, NH4VO3, en 300 ml de
agua y aadir 100 ml de cido ntrico concentrado (con guantes y gafas de
proteccin, en la campana extractora). Mezclar ambas disoluciones en un matraz
aforado de un litro y enrasar con agua destilada.
2. Disolucin patrn de ortofosfato (PO4)3 (1 g/l en fosfatos) (nica para todos):.
Preparar 100 ml de disolucin patrn en matraz aforado disolviendo la cantidad
adecuada (calclela) de KH2PO4 en agua destilada.
3. Disolucin de trabajo de ortofosfato (0.1 g/l): Cada pareja prepara una disolucin
de trabajo pipeteando 10 ml de disolucin patrn y enrasando a 100 ml con agua
destilada en matraz aforado.
B. Calibrado externo
En matraces aforados de 25 ml se pipetean alcuotas de la disolucin de trabajo de
forma que la concentracin final de fosfato sea de 3, 5, 10, 15 y 20 mg/l. Se
agregan 10 ml de la disolucin vanado-molibdato amnico a cada una de ellas y se
enrasa con agua destilada. Agitar cada matraz para homogeneizar la disolucin y
dejar en reposo 10 minutos para que tenga lugar el desarrollo del color.
Preparar adems un blanco (disolucin con 10 ml de vanado-molibdato, sin
fosfato).
C. Preparacin de las muestras problema
Pipetear 5 ml de la disolucin problema y pasarlos a un matraz aforado de 25 ml.
Aadir 10 ml de la disolucin vanado-molibdato y enrasar con agua destilada.
Repetir este procedimiento otras 2 veces ms para tener 3 muestras problema.
Dejar reposar 10 minutos
D. Medidas de absorbancia
-

Ajustar el espectrofotmetro para medidas de absorbancia a 420 nm

Introducir el blanco en el aparato y ponerlo a cero.
Medir finalmente la absorbancia a 420 nm de los patrones y de las 3 muestras.
6

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Construir la recta de calibrado y determinar la concentracin de cada muestra

problema.
La concentracin de fosfatos en la muestra problema original ser el resultado
de promediar los resultados de las tres medidas y aplicar el factor de dilucin.
El error se obtiene a partir de la dispersin de los datos: = t(s/N), donde s es
la desviacin cuadrtica y N el nmero de medidas realizadas.

E. Determinacin de fosfato por el mtodo de adiciones estndar

Con el fin de minimizar efectos de matriz se aplica el mtodo de adiciones
estndar. Para ello se pasan 4 alcuotas del mismo volumen de muestra problema
en matraces de 25 ml. A 3 de esos matraces se les aade cantidades crecientes de la
disolucin de trabajo. A continuacin se agregarn 10 ml de la disolucin de
vanado-molibdato y se enrasar con agua destilada. Dejar reposar 10 minutos.
Calcular las alcuotas de la muestra problema y las adiciones de forma que la
concentracin estimada de fosfato no exceda de 20 mg/l.
Medidas de absorbancias:
Poner a cero el espectrofotmetro con el mismo blanco del apartado anterior y
medir la absorbancia a 420 nm de cada muestra.
Construir la recta de adiciones estndar y determinar la concentracin de fosfatos.
Aplicar el factor de dilucin correspondiente.
Para el clculo de errores en este apartado, pedir el resultado obtenido a 2 parejas
del mismo turno de prcticas y realizar los clculos de la desviacin estndar.
F. Presentacin de resultados
1. Incluir todas las medidas de absorbancia y concentraciones de las
disoluciones patrn de fosfato correspondientes en tablas.
2. Representar en grficas independientes los datos experimentales de los dos
calibrados realizados (patrn externo y adiciones estndar), as como cada
una de las rectas por mnimos cuadrados (se recomienda el uso de Excel)
3. Para cada uno de los mtodos utilizados (calibrado y adiciones estndar),
expresar la concentracin de fosfato resultante de la muestra problema
junto con los errores absoluto y relativo de la determinacin. Comparar
ambos mtodos y discutir los resultados.
6. Gestin de residuos:
Los reactivos de esta prctica no son peligrosos para el medioambiente en bajas
concentraciones y se pueden desechar en el fregadero.
7. Bibliografa
Daniel C. Harris, Anlisis Qumico Cuantitativo 2 ed., Ed. Reverte. Captulos 4, 5 y 19

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Apndice 1: Regresin lineal por mnimos cuadrados: Expresiones de clculo