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VOLUMEN I
TRABAJO DE AO SABTICO
2004
TABLA DE CONTENIDO
Pgina
VOLUMEN I
viii
NOMENCLATURA
INTRODUCCIN
ix
CARACTERSTICAS DE LA BIOTENOLOGA
Multidisciplinaria.
Emplea diferentes tcnicas.
ADN recombinante.
Hibridomas.
Fusin de protoplastos.
Fermentacin y escalado de procesos.
Tecnologa de enzimas.
Cultivo de tejidos vegetales.
Ingeniera de tejidos.
Conviven diferentes estados de desarrollo.
Multisectorial.
2
2
2
2
2
4
4
5
5
5
6
6
1.2
1.3
1.3.1
1.3.2
1.3.3
1.3.4
1.3.5
1.3.6
1.3.7
1.3.8
1.4
1.4.1
1.4.2
OPERACIONES BIOTECNOLGICAS
Eleccin del cultivo: seleccin, mejora, o en su caso creacin del
organismo o la poblacin celular ms adecuada.
Cultivos en masa.
ii
8
8
12
15
18
19
19
20
21
22
22
22
1.4.3
1.4.4
1.4.5
Respuestas celulares.
Operacin del proceso.
Recuperacin de los productos.
22
22
23
1.5
24
1.6
27
32
2.2
41
2.3
2.3.1
2.3.1.1
2.3.1.2
2.3.1.3
2.3.2
2.3.2.1
2.3.2.2
2.3.3
2.3.4
2.3.5
2.3.5.1
2.3.5.2
2.3.5.3
2.3.5.4
2.3.5.5
2.3.5.6
2.3.5.7
2.3.5.8
2.3.5.9
2.3.5.10
2.3.5.11
2.3.6
2.3.7
2.3.7.1
2.3.7.2
2.3.8
2.3.9
CARBOHIDRATOS
Clasificacin de los carbohidratos.
Monosacridos.
Oligosacridos.
Polisacridos.
Isomerismo.
Ismeros estructurales.
Esteroisomeros.
Estructura cclica de los carbohidratos.
Monosacridos y derivados importantes.
Propiedades de los monosacridos.
Mutarrotacin.
Enolizacin (transformacin de Lobry de Bruyn von Ekenstein).
Deshidratacin.
Oxidacin-reduccin (azcares reductores).
Reduccin de monosacridos.
Oxidacin de azcares.
Formacin de glucsidos.
Metilacin de monosacridos.
Acetilacin de monosacridos.
Formacin de N-glucosilaminas.
Formacin de osazonas.
Oligosacridos.
Polisacridos.
Polisacridos de reserva.
Polisacridos estructurales.
Paredes celulares de las plantas.
Paredes celulares bacterianas.
44
45
45
2.4
LPIDOS
2.4.1
Clasificacin de los lpidos.
2.4.1.1 Lpidos complejos.
45
45
45
46
48
52
57
57
58
59
59
60
61
62
63
63
63
64
64
67
67
69
73
73
75
75
75
iii
2.4.1.2
2.4.2
2.4.3
2.4.4
2.4.5
2.4.6
2.4.7
2.4.8
Lpidos sencillos.
cidos grasos.
Acil glicridos.
Ceras.
Fosfolpidos.
Esfingolpidos.
Glucolpidos.
Terpenoides y esteroles.
76
76
79
81
82
84
85
86
2.5
2.5.1
2.5.1.1
2.5.1.2
2.5.1.3
2.5.2
2.5.3
2.5.3.1
2.5.3.2
2.5.3.3
2.5.3.4
2.5.3.5
89
90
90
96
97
98
99
103
105
106
106
2.6
2.6.1
2.6.1.1
2.6.1.2
2.6.1.3
2.6.2
2.6.3
2.6.3.1
2.6.3.2
2.6.3.3
2.6.4
2.6.5
CIDOS NUCLEICOS
Estructura de los nucletidos.
Bases pirimidnicas y purnicas.
Nuclesidos.
Nucletidos.
cido desoxirribonucleico (ADN).
cido ribonucleico (ARN).
ARN mensajero (ARNm).
ARN de transferencia (ARNt).
ARN ribosmico (ARNr).
Propiedades de los cidos nucleicos.
Traduccin.
109
109
109
110
110
111
115
115
115
116
117
117
2.7
2.7.1
2.7.2
2.7.3
2.7.3.1
2.7.3.2
2.7.3.3
2.7.3.4
2.7.4
2.7.4.1
2.7.4.2
2.7.4.3
ENZIMAS
Caractersticas de las enzimas como catalizadores.
Clasificacin de las enzimas.
Aplicaciones de las enzimas.
Catalizadores en procesos industriales.
En anlisis.
En medicina.
Otras aplicaciones.
Propiedades de las enzimas.
Estabilidad.
Capacidad cataltica.
Especificidad.
iv
118
118
118
120
120
120
123
125
125
125
126
128
2.7.5
Actividad enzimtica y su medicin.
2.7.6
Produccin de enzimas.
2.7.6.1 Ventajas de los microorganismos como productores de enzimas.
2.7.6.2 Recuperacin de enzimas extracelulares e intracelulares.
2.7.6.2.1 Operaciones de separacin slido-lquido.
2.7.6.2.2 Operaciones de extraccin de enzimas intracelulares.
2.7.6.2.3 Concentracin del caldo de fermentacin.
2.7.6.2.4 Purificacin.
2.7.6.2.5 Formulacin de preparados enzimticos comerciales.
2.7.6.3 Enzimas inmovilizadas.
2.7.6.3.1 Matrices utilizadas como soporte de enzimas.
2.7.6.3.2 Seleccin de un soporte.
2.7.6.3.3 Tcnicas de inmovilizacin de enzimas.
2.7.6.3.4 Eleccin del mtodo de inmovilizacin.
2.7.6.4 Inmovilizacin de clulas.
2.7.7
Cintica enzimtica.
2.7.7.1 Cintica enzimtica en fase homognea.
2.7.7.2 Influencia del pH y la fuerza inica en la actividad enzimtica.
2.7.7.3 Influencia de la temperatura en la actividad enzimtica.
2.7.7.4 Inhibicin de las enzimas.
2.7.7.4.1 Inhibicin irreversible.
2.7.7.4.2 Inhibicin reversible.
129
130
130
131
132
133
134
137
139
140
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146
146
146
148
148
148
148
149
TAXONOMA
153
3.2
MTODOS EN MICROBIOLOGA
3.2.1
Microscopios y microscopa.
3.2.1.1 Microscopios pticos.
3.2.1.2 Microscopios electrnicos.
3.2.2
Preparaciones para el examen por microscopa ptica.
3.2.2.1 Tcnica del montaje en hmedo y de gota pendiente.
3.2.2.2 Tcnicas de tincin.
155
155
155
156
156
156
157
3.3
158
3.4
161
3.5
TCNICAS DE CARACTERIZACIN
161
3.6
3.6.1
BACTERIAS
Caractersticas morfolgicas.
163
163
3.7
3.8
CIANOBACTERIAS
HONGOS
168
169
v
3.9
VIRUS
172
3.10
NUTRICIN MICROBIANA
173
3.11
MEDIOS DE CULTIVO
178
3.12
CRECIMIENTO DE POBLACIONES
179
3.13
182
189
3.14
VOLUMEN II
200
200
204
206
207
208
209
4.2
4.2.1
4.2.2
4.2.3
4.2.4
209
210
212
212
213
4.3
214
4.4
4.4.1
4.4.2
4.4.3
220
221
223
224
4.5
226
4.6
4.6.1
BIOENERGTICA
Rendimiento energtico del metabolismo de los carbohidratos.
vi
230
233
4.6.2
234
4.7
236
ETANOL
Agentes de la fermentacin.
Medio de cultivo.
Bioqumica del etanol.
Proceso de produccin de etanol.
Utilizacin del etanol.
240
241
242
244
244
247
5.2
5.2.1
5.2.2
LA CERVEZA
Materias primas.
Fabricacin de la cerveza.
247
248
252
5.3
5.3.1
5.3.2
5.3.3
5.3.4
5.3.5
CIDO CTRICO
Agentes de la fermentacin.
Medio de cultivo.
Bioqumica del cido ctrico.
Proceso de produccin de cido ctrico.
Utilizacin del cido ctrico.
260
260
261
262
263
265
5.4
5.4.1
5.4.2
5.4.3
5.4.4
5.4.5
CIDO ACTICO.
Agentes de la fermentacin.
Medio de cultivo.
Bioqumica del cido actico.
Proceso de produccin del cido actico.
Utilizacin del cido actico.
266
266
268
269
270
274
5.5
5.5.1
5.5.2
5.5.3
5.5.4
5.5.5
CIDO LCTICO
Agentes de la fermentacin.
Medio de cultivo.
Bioqumica del cido lctico.
Proceso de produccin del cido lctico.
Utilizacin del cido lctico.
274
275
279
281
282
282
5.6
5.6.1
5.6.2
5.6.3
5.6.4
5.6.5
284
286
290
291
293
297
5.7
298
5.7.1
5.7.2
5.7.3
5.7.4
5.7.5
Agentes de la fermentacin.
Medio de cultivo.
Bioqumica del biogs.
Proceso de produccin de biogs.
Utilizacin del biogs.
298
299
301
302
308
5.8
5.8.1
5.8.2
5.8.3
5.8.4
308
309
310
311
311
BIBLIOGRAFA
316
viii
NOMENCLATURA
A:
ADN:
AN:
ARN:
ADP:
AMP:
ATP:
ATT:
C:
CTP:
CoQ:
dAMP:
dGTP:
dUTP:
5GMP:
G:
GDP:
GTP:
5IMP:
FDA:
FAD:
FADH2:
FMN:
LAB:
NAD:
NADH:
NADP:
NADPH:
PEP:
PUC:
T:
TPP:
SIDA:
U:
UTP:
Vmax:
VHB:
5XMP:
adenina
cido desoxirribonucleico.
cido nucleico.
cido ribonucleico.
adenina difosfato.
adenina monofosfato.
adenina trifosfato.
enzima -antitripsina.
citosina.
citosina trifosfato.
ubiquinona (benzoquinona).
desoxiadenina monofosfato.
desoxiguanosina trifosfato.
desoxiuridina trifosfato.
cido guanidlico.
guanina.
guanina difosfato.
guanosina trifosfato.
cido isocnico.
oficina de alimentacin y farmacia.
dinucletido de flavina y adenina (forma oxidada).
dinucletido de flavina y adenina (forma reducida).
mononucletido de flavina.
bacterias acido lcticas.
dinucletido de nicotinamida y adenina (forma oxidada).
dinucletido de nicotinamida y adenina reducido (forma reducida).
dinucletido fosfato de nicotidamina y adenina (forma oxidada)
dinucletido fosfato de nicotidamina y adenina reducido (forma reducida).
fosfoenol piruvato.
protena unicelular.
timina.
pirofosfato de tiamina.
sndrome de inmunodeficiencia adquirida.
uracilo.
uridina trifosfato.
velocidad mxima.
hepatitis B.
cido xantlico.
INTRODUCCIN
Figura 1.1. Insercin de un gen en un plasmidio de Eschirichia coli y clonacin de este gen
en las clulas del cobacilo (Montoya, 1990)
Figura 1.2. Ingeniera gentica vegetal con los plsmidos inductores de tumor de la
Agrobacterium tumefaciens (Perea, 1990)
3
Figura 1.3. La fusin de dos protoplastos genticamente diferentes puede dar lugar a
hbridos completos, hbridos parciales y cbridos
1.1.2.4 Fermentacin y escalado de procesos. Las fermentaciones son los procesos
ms conocidos y consisten en poner microorganismos, clulas animales o vegetales, en un
medio de cultivo adecuado, con condiciones controladas para que este organismo sintetice
un producto esperado.
Las fermentaciones representan el proceso biotecnolgico
industrial ms importante. Los principales productos determinados por esta va son: etanol,
protena unicelular, cidos orgnicos, aminocidos, jarabes fermentados, polisacridos de
origen microbiano y antibiticos, entre otros.
4
1929-1932
1941
1950
1953
1956-1957
1957
1960
1973
1975
1976
1981
1983
1988
1990
1994
1997
1990 - 2000
2000
2002
Acontecimientos
Obtencin de bebidas fermentadas de cereales (Babilonia y Egipto).
Pan valindose de procesos fermentativos (Egipto)
Vino, pan, fermentacin productos lcteos, fermentacin alcohlica.
Rotacin en los campos agrcolas.
Destilacin de los medios en que se cultivaba la levadura (China y/o
Medio Oeste).
Meischer descubri el ADN.
Produccin de vacunas.
Pasteur descubri los procesos microbianos de fermentacin en
cerveza y en otros productos fermentados.
cidos orgnicos.
Se invent el trmino gene en el estudio de la herencia. Se estableci
la primera gran planta de digestin anaerobia y se uso la
fermentacin para producir glicerina y acetona.
Trabajos preliminares de Fleming sobre la penicilina.
Produccin industrial de penicilina por Florey.
Antibiticos, vitaminas.
Modelo de doble hlice para el ADN.
Fabricacin de cido glutmico en el Japn.
Fabricacin de lisina en Estados Unidos.
Aminocidos, enzimas y vacunas.
Clonacin del primer gene por ingeniera gentica.
Primer anticuerpo monoclonal.
Creacin primera empresa de Biotecnologa.
Aprobacin del uso de anticuerpos monoclonales para diagnstico.
Insulina humana. Transformacin de vegetales por ingeniera
gentica.
Nueve productos de uso teraputico humano, doscientos sistemas de
diagnstico utilizando anticuerpos monoclonales. Pruebas de campo
con especies vegetales modificadas genticamente.
Se aprob la quimosina para la manufactura de quesos.
La FDA autoriz la comercializacin del primer alimento transgnico
Se clon el primer animal adulto (la oveja Dolly).
Cien nuevos productos de uso teraputico humano, semillas de
cultivos bsicos transformadas genticamente, nuevos agroqumicos,
nuevos materiales y productos qumicos.
Mapa del genoma humano.
Por lo menos 200 sustancias llegarn a la fase de ensayo clnico.
1.3
tarde en la dcada de los 60, esa estrategia ocupa un primer plano a la hora de idear
recursos para los pases subdesarrollados; se disearon procesos para desarrollar
cepas de Candida lipolytica, que obtenan el carbono y la energa para el crecimiento de
los alcanos (molculas de hidrocarburos de cadena lineal) del petrleo. Fue entonces
cuando se acuo el trmino protenas unicelulares para describir el nuevo campo de
alimentos y piensos microbianos (Rose, 1981), (Phaff, 1981), (Medina et al., 1996),
(Medina, 2003).
Enzimas. La aplicacin de enzimas en la industria de alimentos es muy variada. Para la
coagulacin enzimtica de la leche se usa el cuajo microbiolgico proveniente de los
mohos Endothia parastica, Mucor pusillus y Mucor miehie (Angarita, 1992). Con el uso
de enzimas pectolticas en la produccin de pulpas de fruta, se logra aumentar la
produccin de pulpa, disminuir la viscosidad, mejorar la estabilidad del nctar, aumentar la
eficiencia de evaporacin, etc. (Pinzn, 1991). Para la produccin de leche con lactosa
hidrolizada se usa la -galactosidasa (lactasa) que hidroliza la lactosa en galactosa y
glucosa. Adems, la hidrlisis de la lactosa disminuye los riesgos de recristalizacin de
sta en los productos lcteos y aumenta su poder endulzante (Angarita, 1992). Para la
produccin de glucosa a partir de almidn se usan las amilasas y amiloglucosidasas.
Tambin se ha utilizado la glucosa-isomerasa para la produccin de fructosa a partir de
glucosa (Crueger et al., 1993). La invertasa al hidrolizar la sacarosa forma jarabes ms
dulces, constituidos por monosacridos ms solubles que la sacarosa que no cristalizan al
ser concentrados. Las amilasas que existen naturalmente en la levadura y la harina de trigo
contribuyen principalmente a la produccin de dixido de carbono durante la fermentacin
y coccin, los dos procesos responsables del desarrollo del sabor y la subida de la masa
para obtener un pan suave y sabroso (Medina, 1995).
Aminocidos. Los aminocidos tienen amplias aplicaciones industriales (alimentos,
aditivos de piensos, medicina y cosmtica y como material de partida en la industria
qumica). En la industria de alimentos los aminocidos se utilizan solos o en combinacin
para aumentar el sabor. El glutamato sdico, el aspartato sdico y la D, L-alanina, se
aaden a los jugos de frutas para mejorar el sabor y la glicocola se adiciona a los alimentos
que contienen edulcorantes. La L-cistena mejora la calidad (textura) del pan durante el
proceso de coccin y acta como un antioxidante en los jugos de frutas. El L-triptfano,
combinado con L-histidina, acta tambin como antioxidante y se utiliza para evitar que la
leche en polvo se enrancie. El aspartame (L-aspartil-L-fenilalanina metil ster) se utiliza
como edulcorante de bajas caloras en las bebidas no alcohlicas. Las protenas de las
plantas son frecuentemente deficientes en aminocidos esenciales como la L-lisina, la Lmetionina, la L-treonina o el L-triptfano, por lo tanto, algunos de stos son adicionados a
los alimentos de humanos y de animales para aumentar su valor nutritivo (Crueger et al.,
1993), (Garca et al., 1993).
Potenciadores del sabor (nuclesidos, nucletidos y compuestos relacionados).
Todos los ribonuclesidos 5- monofosfatos de purinas incrementan el sabor. En orden
descendiente de efectividad es: cido guanidlico (5-GMP), cido isocnico (5- IMP) y
cido xantlico (5- XMP). Cantidades pequeas de estos nucletidos (0,005 0,01 %) se
usan para aumentar el sabor de las sopas y las salsas; adems, la adicin de stos ayuda a
10
Patgenos naturales contra plagas, entre los que se encuentran bacterias, virus y hongos, se
usan como agentes de control biolgico. Los hongos del gnero Trychoderma tienen un
gran potencial como agentes contra hongos patgenos del suelo. Actualmente hay inters
en el posible uso de las bacterias cido lcticas como agentes de biocontrol para garantizar
la seguridad de alimentos refrigerados mnimamente procesados, los cuales no son
acidificados, especialmente con frutas y vegetales (Quintero et al., 1993), (Breidt et al.,
1997).
Los mtodos usados con productos hortcolas estn basados en la manipulacin de la
informacin gentica de las enzimas que producen etileno, el cual es el agente responsable
de la sobremaduracin. Por medio de la transformacin gentica se producen plantas con
frutos que no producen etileno o lo producen muy poco. La aplicacin de etileno exgeno
restaura el patrn normal de maduracin. Esta estrategia es aplicable en potencia a
cualquier fruto (Gmez-Lim, 1996).
En el sector pecuario las aplicaciones iniciales se dirigieron principalmente a sistemas de
diagnstico, nuevas vacunas y drogas, fertilizacin de embriones in vitro, uso de hormonas
de crecimiento. La biotecnologa ha contribuido a la generacin de animales transgnicos
con un crecimiento ms acelerado, con incremento en el tamao (peces) o produccin de
leche (vacas) y en la calidad de la carne (cerdos). Esto se ha logrado a travs de la
utilizacin de hormonas del crecimiento o somatostatina. La biotecnologa ha permitido
que se generen productos de alto valor agregado, como la hormona de crecimiento, en la
leche de animales transgnicos. Recientemente, se ha reportado la produccin de
hemoglobina humana en cerdos transgnicos (Quintero et al.., 1993). Los animales
transgnicos como el ratn oncognico han sido muy tiles en trabajos de laboratorio para
estudios de enfermedades humanas.
El cultivo de clulas vegetales individuales o de grupo de ellas, en grandes fermentadores,
constituye una forma de obtener productos vegetales (frmacos, pesticidas, edulcorantes,
aromatizantes). Adems, las clulas vegetales individuales constituyen un medio muy
apropiado y eficiente para desarrollar nuevas variedades de plantas. Para la introduccin de
un ADN forneo en clulas vegetales, se puede aprovechar el proceso natural de infeccin
llevado a cabo por la bacteria Agrobacterium tumefaciems. Esta bacteria porta un plsmido
(fragmento de ADN separado del cromosoma bacteriano) que produce tumores (conocidos
como agalla del cuello o agalla en corona o cncer vegetal) en la mayora de las plantas
dicotiledneas. El mecanismo de la infeccin bacteriana se basa en la insercin de un gen
extrao en el plsmido inductor del tumor, que se utiliza para infectar plantas y producir
una agalla de corona. . Todas las clulas vegetales de la agalla contienen dicho plsmido
con su fragmento de ADN extrao. Se cultivan las clulas del callo en el laboratorio hasta
que originen plntulas, que al crecer se podrn plantar en el suelo. Puesto que cada planta
se produce de una sola clula portadora del gen extrao, todas las clulas de la nueva planta
adulta sern portadoras del gen. (Brill, 1981), (Perea, 1990), (Nieto, et al., 1999).
1.3.3 Farmacutico y salud. La biotecnologa y en particular los procesos fermentativos,
se han usado en la produccin de principios activos farmacuticos, distinguindose entre
ellos los antibiticos (penicilinas, cefalosporinas, bleomicinas, antraciclinas, tetraciclinas,
eritromicinas, estreptomicinas, rifamicina, bacitracina), los alcaloides, drogas
15
antitumorales, las vacunas bacterianas, las vacunas virales, las vitaminas, las enzimas y
algunos esteroides que son transformados biolgicamente durante su proceso de
produccin. Estos productos son de gran valor mdico y comercial en el mundo, pero
puede decirse que tanto los principios activos como los procesos de produccin se
desarrollaron antes de los aos 70 y por lo tanto, los esfuerzos actuales se dirigen hacia un
aumento de productividad y rendimiento con el objeto de disminuir costos de produccin.
A pesar de que los antibiticos poseen una amplia variedad de estructuras qumicas y muy
diversos lugares de accin, todos satisfacen el principio de toxicidad selectiva. Dicho
principio mantiene que un agente quimioteraputico eficaz no debe afectar a los tejidos
humanos y si ser txico para el agente infectante. Las penicilinas y cefalosporinas
obstruyen la formacin de la pared celular bacteriana; las bleomicinas y antraciclinas
interfieren la replicacin del ADN; las eritromicinas, tetraciclinas y estreptomicinas
inutilizan el complejo ribosmico y las rifamicinas interrumpen la transcripcin de ADN en
ARN mensajero (Aharonowitz et al., 1981).
Las nuevas tecnologas biolgicas, establecidas a partir de 1973, particularmente la
ingeniera gentica (o tecnologa de ADN recombinante) aun cuando existen otras tcnicas
de gran uso y potencialidad, han permitido que el hombre pueda producir protenas
humanas en otro tipo de seres como son las bacterias, levaduras y en algunos casos
animales superiores. Una vez entendido como los seres vivos procesan la informacin
gentica y como obtener de ella protena, slo falt que un grupo de investigadores y de
empresarios pudiese percibir el valor teraputico y econmico, para iniciar la generacin
de un grupo muy importante de nuevas protenas que hasta ese momento era muy difcil
conseguir y en otros casos era prcticamente imposible obtenerlas.
El conocimiento sobre el sistema inmunolgico humano ha permitido identificar un grupo
muy importante de protenas y establecer nuevos sistemas de produccin. Entre estas
protenas se encuentran los interferones, las interleukinas, los factores estimulantes de
crecimiento, el factor de necrosis tumoral, etc. Adems, se han podido generar nuevas y
mejores vacunas (viruela, poliomelitis, tifus, ttanos, sarampin, hepatitis A, hepatitis B,
rotavirus y malaria) (Daz-Betancourt, 1996), (Rappuoli et al., 1997), (Weiner et al., 1999),
(Langridge, 2000).
Las principales tendencias en la investigacin y aplicacin de la biotecnologa en el sector
salud, son:
Todos los seres vivos compartimos el mismo cdigo gentico, el lenguaje en el que se
especifican las instrucciones precisas para la sntesis de protenas. Esto significa que se
puede introducir material gentico forneo en una clula. Si se inserta el gen humano en el
material gentico de una bacteria, sta fabricar la protena correspondiente, siempre y
cuando la informacin fornea contenga tambin los elementos necesarios para la expresin
del gen. La eleccin de una clula productora viene determinado no slo por criterios
econmicos, sino tambin por las normas reguladoras de los pases. En la prctica slo son
tres los organismos o clulas ms utilizadas en la sntesis de protenas teraputicas:
Eschericchia coli, Saccharomyces cerevisiae y clulas de ovario de Hamster. Por
recombinacin gentica se produce: insulina humana, los interferones, el activador del
plasmingeno tisular, la albmina humana, la hormona del crecimiento o somatostatina, la
hormona eritropoyetina (Ahatonowitz et al., 1981), (Stiegler et al., 1997). La mayora de
los interferones se agrupan, de acuerdo con la secuencia aminocdica de sus estructuras
proteicas en tres clases: alfa, beta y gama. Los interferones actan en primera lnea de
defensa contra infecciones vricas y parasitarias. Hoy en da los interferones son el segundo
producto biotecnolgico ms vendido en el mundo (Johnson et al., 1994), (Gil et al., 2001).
Farmacia de granja. Una fuente alternativa de sntesis de protenas recombinantes con
finalidad teraputica la ofrecen los animales y plantas transgnicas. Se han introducido
genes humanos en embriones femeninos de cabras, cerdos, ovejas y vacas. Estos genes
llevan asociado un interruptor que faculta nicamente a las clulas de las mamas para
producir la molcula. El producto se recoge directamente de la leche del animal. De la
farmacia de granja han salido la enzima -antitripsina (AAT), extrada en leche de oveja.
Esta enzima facilita la respiracin en pacientes con enfisema pulmonar (Stiegler et al.,
1997), (Wilmut, 1999). La protena C humana, el factor VIII y factor IX, el activador
tisular del plasmingeno (Velander et al., 1997). La hormona de crecimiento humana a
partir de leche de vacas transgnicas clonadas para el tratamiento contra el enanismo
(BioPlanet-Breves, 2004).
Anticuerpos monoclonales. Se estn utilizando tanto en terapia para enfermedades
como para diagnstico. Las inmunoglobulinas son producidas en un hibridoma, producto
de la fusin de una clona de linfocito B y una lnea inmortal. Estas inmunoglobulinas
reconocen y unen con una alta afinidad, nicamente un determinado antgeno. Los
anticuerpos son macromolculas en forma de Y. Tienen por misin luchar contra los
invasores. Los anticuerpos monoclonales estn sintetizados por copias idnticas, o clones
de un mismo linfocito B, por cuya razn atacan una sola diana especfica.
Hay en el mercado una de decena de anticuerpos monoclonales. Cubren desde la
prevencin del rechazo de un rgano transplantado hasta la oncoterapia. Otros tres
monoclonales esperan la aprobacin de la Oficina de Alimentacin y Farmacia (FDA).
Aunque la produccin de anticuerpos monoclonales suele corresponder a los hibridomas,
unas clulas de mamferos, se est trabajando en su obtencin a partir de la leche de
animales sometidos a ingeniera gentica y a partir de plantas transgnicas (Ezell, 2001).
Probiticos. Estn definidos como microorganismos vivos que son ingredientes de los
17
alimentos y que tienen un efecto benfico en la salud humana. Muchas cepas probiticas
han sido identificadas, estudiadas y comercializadas: Lactobacillus acidofillus,
Lactobacillus casei, Lactobacillus fermentun, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus
rhamnosus, Lactobacillus lactis, Bifidobacterium lactis, longum, Bifidobacterium breve.
Los probiticos disminuyen los riesgos de cncer, mejora la funcin del tracto intestinal y
la inmune, moderan la respuesta alrgica, inhiben la infeccin por la Helicobacter pylori
(salud estomacal), inhiben infecciones del tracto urogenital en las mujeres, disminuyen el
nivel de colesterol y la hipertensin (Sanders, 1999), (Salminen, 1999).
Desarrollo y produccin de sistemas de diagnstico. Los nuevos sistemas de
diagnstico son aquellos que utilizan anticuerpos monoclonales y sondas de cidos
nucleicos, debido a la alta especificidad de los reactivos, as como a la simplicidad de las
pruebas. Otro sistema que tambin tiene importancia es el de los biosensores que se basa
en la utilizacin de enzimas o anticuerpos acoplados a dispositivos electrnicos. Ejemplos
de stos, son los electrodos enzimticos para analizar el colesterol, los aminocidos, el
cido rico, la penicilina, la urea, el etanol y la glucosa (Schultz, 1991), (Quintero et al.,
1993), (Illanes, 1994).
Desarrollo y produccin de vacunas. La manera ms efectiva de controlar la hepatitis
B (VHB) es mediante la vacunacin. En los ltimos aos se han desarrollado dos tipos de
vacunas contra la VHB: la plasmtica, mediante el aislamiento del virus del plasma de
portadores asintomticos y purificacin del antgeno de superficie (HbsAg) y la
recombinante, mediante el clonaje y expresin de este antgeno en una clula eucaritica.
El Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa, de la Habana, Cuba, se dio a la tarea de
desarrollar una vacuna contra la hepatitis B por va recombinante. Los primeros clones
obtenidos en S. cerevisiae llegaron a los fermentadores en 1986. En 1988 se probaron las
cepas de la levadura Hansenula polymorpha y Pichia pastori, logrndose muy buenos
resultados. A principios de 1990 comenz la produccin a escala piloto y un ao despus
se inaugur una nueva instalacin, con dos fermentadores de 3 000 L y se comenzaron los
trabajos de puesta en marcha y validacin. A principios de 1992 se comenz la produccin
a escala de 3000 L. En 1994 comenzaron las negociaciones para la transferencia de esta
tecnologa a otros pases, mientras que en Cuba se inauguraba una segunda planta de
produccin del principio activo, con una capacidad 1,5 veces superior a la primera (DazBetancourt, 1996).
Actualmente se esta trabajando en la creacin de vacunas comestibles mediante la bacteria
Agrobacterium tumefaciens, que permite introducir en las clulas vegetales los genes de
antgenos bacterianos o vricos. Entre los alimentos que se estn investigando como opcin
alternativa a las vacunas inyectables se tienen los pltanos, las papas, los tomates, la
lechuga, el arroz, el trigo, la soya y el maz (Langridge, 2000). Las vacunas con material
gentico, ya sea ADN o ARN, pueden que consigan prevenir el SIDA, el paludismo y la
hepatitis C, para las que no existen vacunas eficaces (Weiner, 1999).
1.3.4 Qumico. En la actualidad, la contribucin de los procesos biolgicos a la industria
qumica (excluyendo la industria farmacutica) est limitada a: modificacin de esteroides
por va enzimtica, produccin de cido itacnico. (termoplsticos), etanol (disolvente,
extractor, anticongelante, materia prima de otros compuestos orgnicos y combustible),
18
1996), (Basnakova et al., 1997), (Hu et al., 1997), (Macaskie et al., 1997), (Duong et al.,
1997).
El problema de la contaminacin ambiental es una de las principales preocupaciones del
hombre de cara al siglo XXI. En particular, el petrleo constituye una de las principales
fuentes de polucin del medio ambiente, ya que la mayor parte de sus componentes son
recalcitrantes a la biodegradacin. Sin embargo, existe un grupo numeroso de
microorganismos heterotrficos capaces de utilizar los hidrocarburos del petrleo como
fuente de carbono y energa para su crecimiento, produciendo dixido de carbono, agua,
biomasa y otros productos parcialmente oxidados que no son txicos (Eweis, et al., 1999),
(Daz, 1999). (Gonzlez et al., 2002). Existe el producto AquaBact para la
biorremediacin de suelos contaminados con petrleo, constituido por un cultivo mixto de
cepas de microorganismos que se presentan en forma natural en el medio ambiente,
reforzado con un suministro de nutrientes balanceados, que permiten acelerar la
biodegradacin de hidrocarburos del petrleo.
Tratamiento de gases. Existen dos tipos de procesos: aerobios y anaerobios. El
primero permite tratar corrientes de aire contaminadas, mientras que el segundo puede
aplicarse a sistemas tal como el gas natural o las corrientes de la digestin anaerobia.
Existen dos tipos de tecnologas para el tratamiento de gases: biolavadores, en donde los
contaminantes se extraen en un lquido, generalmente agua, los cuales a su vez son
sometidos a oxidacin por sistemas clsicos utilizados en el tratamiento de efluentes y
biofiltracin, donde se pasa la corriente gaseosa por un lecho hmedo, en el cual se
encuentran los microorganismos oxidantes (Zhil et al., 1993), (Crueger et al., 1993),
(Kennes et al., 1996).
1.3.8 Armas biolgicas. El arsenal biolgico ha despertado un inters creciente en los
estados y en las bandas terroristas; siendo necesarios controles ms estrictos sobre este tipo
de armamento para evitar su empleo. A diferencia de cualquier otro tipo de armamento, el
biolgico incrementa su peligrosidad con el tiempo. Unos agentes biolgicos incapacitan a
la victima; otros, la matan. El virus Ebola acaba con el 90 % de sus victimas, en poco ms
de una semana; no se conoce tratamiento alguno. La bacteria Yersinia pestis produce la
peste bubnica; existen las vacunas que proporcionan inmunidad y los antibiticos suelen
ser eficaces si se administran precozmente. La toxina botulnica, liberada por la bacteria
Clostridium botulinum, produce botulismo, que conlleva a menudo a la muerte; la
antitoxina detiene a veces el proceso. El Bacillus anthracis produce ntrax o carbunco, que
puede ser fatal; la vacuna y los antibiticos ofrecen proteccin suficiente, a menos que la
exposicin sea alta (Cole, 1997). La suelta intencionada de organismos que devoren las
cosechas del enemigo, es un arma desvastadora en tiempos de guerra o en manos terroristas
(Rogers et al., 1999).
Bilogos e ingenieros estn desarrolando detectores consistentes en chips de anticuerpos o
ADN que detectan patgenos. Trabajan tambin en la creacin de dispositivos que
detectan los olores emitidos por los microorganismos o aditivos introducidos para
convertirlos en armas (Casagrande, 2002).
21
El impulso de la biotecnologa en Amrica Latina tiene que superar los problemas comunes
en dichos pases, entre otros:
Por ello resulta imprescindible, para los pases en desarrollo, planificar una infraestructura
cientfica, que permita estudiar cambios y avances cientficos rpidos y evitar la
importacin indiscriminada de tecnologa.
Cuadro 1.2. Temas especficos de investigacin en desarrollo en pases
Latinoamericanos
Segn expertos, para los pases del Tercer Mundo la biotecnologa presenta buenas
oportunidades, especialmente a travs de:
Francia
USA
Dinamarca
USA
USA
USA
www.abcbiokits.com
www.abgenis.com
www.biotech.about.com
www.colciencias.gov.co/simbiosis/
directorios/empresasalimentos
www.acsmedioambiente.com
www.uni-leipzig.de/sept/facts/pdf/
biotech_chile_spanish.pdf
www.addavita.demon.co.uk/
www.biotech.about.com
www.advandcedcell.com
www.agastyamicrotek.com.
www.biotech.wisc.edu/Companies/
CompDir/
Costa Rica
www.agroceres.com
www.agrogene.com
www.agromod.com.mx
Francia
Mxico
Brasil
India
USA
Espaa
Mxico
Alemania
www.aibaonline.com/propects.htm
www.biotech.wisc.edu/Companies/
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www.amgen.com
www.amgen.es
www.aquaquim.com
www.astrazeneca-us.com
www.aventis.com
www.aventispasteur.com
Colombia
www.bayer.cl/noticias/temas/
tema01.asp
28
Bejozaden
Biobras
Biocen
Bio Gestion
Bioiberica
Biokit
Bilogos, Inc.
Bio Products Inc.
Biotecnologa Ambiental S.A.
Biotecol
Bios-Chile S.A.
Bio-Sidus
Brasil
Colombia
Espaa
USA
USA
Mxico
Colombia
Chile
Argentina
Biosigma S.A.
Bio Sonda S.A.
Chile
Biosource
Biotransplant
www.bejo.com
www.uni-leipzig.de/sept/facts/pdf/
biotech_chile_spanish.pdf
www.biocen.cu/estruct/producc.htm
www.biogestion.unal.edu.co
www.bioiberica.com
www.biokit.com
www.biotecnologa.com.mx/biotec.html
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Prensa100.htm
Biotek Instruments
Bthek
Biosource International
Calgene
Cambia
Canifarma
CellFor
Celltech
USA
Brasil
USA
USA
Australia
Mxico
Canada
Venezuela
Colombia
Mxico
Cergen
CIB (Corp. Invest. Biol.)
CIAT (Centro Int. ee Agric. Trop.)
CID (Centro Desarr. Intern.)
CIGB (Centro Ing. Gen.y Biotec.)
Cim
CIPAV
CORPOICA
Diagnotec S.A.
Argentina
Colombia
Colombia
USA
Cuba
Cuba
Colombia
Colombia
Chile
Chile
USA
29
www.bthek.com.br
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Eco-Pest
Eibol
Embrabio
Espaa
Brasil
Embrapa
Brasil
Embryo Genetics
Mxico
USA
Florigene
Florinsa
Frito-Lay, Inc.
Fundacin Ciencia para la vida
Gala Biotech
Genetech Inc.
Genetic Testing Institute, Inc.
Ecuador
Chile
USA
Genitope
Gentech
Geron
Gis Brocades
IBUN (Inst. Biotec. UNAL)
Industrias Agro Biolgicas S.A.
Inst Biotecnol.-UNAM
Inst. Inmun. Hosp.. Sn Juan Dios
Internac.Ag-Tcnico Americ. Ltda
John Innes Centre (JIC)
Kazusa DNA Research (KDRI)
Kirin Brewery
Laboratorios Mixin
Lesaffre
Levapan S.A.
Lexicon Genetics
Maxygen
Medares
Meristem Therapeutics
Mexama
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Dinamarca
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Pharmamar
Espaa
Pharmagen
Espaa
Pharmagenesis
USA
PIC international Group
Plant Genetyc Sistems
Polar
USA
Blgica
Venezuela
Probical S.A.
Chile
Protecdr
Protein Design Labs Inc.
Puleva Biotech
Pulsar
Mxico
USA
Espaa
Mxico
Quimir
Rhom and Haas
Ross Breeders
SemBioSys Genetics
Sistemas Genmicos
Sucromiles
Mxico
Alemania
USA
Canada
Espaa
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Tecnocolibri
Tepual S.A.
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Chile
Chile
Transgene
Tranxenogen
Valle
Francia
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Vecol S. A.
Vetrepharm
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31
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www.norbiotech.cl/norbiotech.html
www.northamericanbio.com
www.perfomanceplants.com
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www.protecdr.com
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www.pulevabiotech.com
www.uni-leipzig.de/sept/facts/pdf/
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www.quimir.com.mx
www.rossbreeders.com
www.sembiosys.ca
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www.uni-leipzig.de/sept/facts/pdf/
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CLULA
ORGNULOS
Ncleo
Mitocondria
Cloroplasto
Cuerpos de Golgi
ASOCIACIONES SUPRAMOLECULARES
Ribosomas
Complejos enzimticos
Sistemas contrctiles
Microtbulos
Membranas celulares
Cromatina
MACROMOLCULAS
cidos nucleicos
Protenas
Polisacridos
Lpidos
UNIDADES ESTRUCTURALES
Nucletidos
Aminocidos
Monosacridos
cidos grasos
Glicerina
INTERMEDIARIOS
Piruvato
Citrato
Malato
Gliceraldehdo 3-fosfato
PRECURSORES
Dixido de carbono
Agua
Amonaco
Nitrgeno
Agua
70
Protenas
15
3000
cidos nucleicos
-ADN
1
1
-ARN
6
1000
Hidratos de carbono
3
50
Lpidos
2
40
Molculas sillares
estructurales e intermediarios
2
500
Iones inorgnicos
1
12
_________________________________________________________________________
Los tipos principales de biomolculas ejercen idnticas funciones en todas las especies de
clulas. Los cidos nucleicos actan universalmente almacenando y transmitiendo la
informacin gentica. Las protenas son los productos directos y los efectores de la accin
de los genes. Las protenas son las ms verstiles de todas las biomolculas, debido a que
participan en la catlisis de reacciones bioqumicas, el transporte de molculas pequeas a
travs de las membranas celulares o desde un sitio del organismo a otro, la proteccin del
organismo contra agentes infecciosos, regulan la actividad cataltica, almacenan
aminocidos como elementos nutritivos, son elementos esenciales en los sistemas mviles y
contrctiles, actan como hormonas, toxinas y elementos estructurales. Los polisacridos
pueden servir como elementos estructurales extracelulares o como reserva de combustibles
que proporcionan energa para la actividad celular. Los lpidos, a su vez, tambin
desempean el mismo papel en todas las clulas, bien como componentes estructurales
principales de las membranas o como fuente de combustible rico en energa.
En la Escherichia coli las protenas estn constituidas solamente por 20 aminocidos
diferentes, los cuales estn ordenados en secuencias distintas, de modo que forman
diferentes tipos de protenas. Anlogamente, los cidos nucleicos estn constituidos a partir
de slo 5 mononucletidos diferentes. Adems, los 20 aminocidos distintos constituyentes
de las protenas y los cinco nucletidos diferentes que integran los cidos nucleicos son
idnticos en todas las especies vivientes. De manera semejante, los polisacridos estn
integrados solamente por unas pocas molculas de azcares simples. A medida que los
organismos vivos han evolucionado hacia formas ms complejas y altamente diferenciadas,
se han desarrollado nuevas biomolculas de mayor complejidad y variedad. Entre ellas se
encuentran pigmentos, aceites esenciales aromticos, hormonas, antibiticos, alcaloides,
lignina, entre otras. Sin embargo, las investigaciones sobre la biognesis de tales sustancias
complejas muestran, no obstante, que tambin derivan en ltimo trmino de alguna de las
biomolculas primordiales. Por ejemplo, los terpenos (vitaminas, aceites esenciales,
35
pigmentos vegetales, caucho), proceden en ltimo trmino, del cido actico, producto
principal de la degradacin de la glucosa y de los cidos grasos.
Los aminocidos no slo actan como sillares de construccin de las molculas proteicas,
sino tambin como precursores de las hormonas, los alcaloides, las porfirinas, los
pigmentos y otras muchas biomolculas. Los mononucletidos no slo constituyen las
unidades fundamentales de los cidos nucleicos, sino que actan como coenzimas y
molculas transportadoras de energa.
Las clulas se clasifican en dos grupos: los procariotas y los eucariotas; los trminos se
derivan del griego Karyon que significa nuez, semilla o ncleo, por lo que procariota
significa antes del ncleo y eucariota un ncleo bien formado. Los organismos
procariticos (unicelulares), aunque son los menos desarrollados, son los ms abundantes y
ampliamente distribuidos. Las clulas eucariticas estn representadas por organismos
unicelulares o multicelulares. La clase eucariote incluye a las plantas, animales, mohos,
protozoarios, levaduras y algunas algas; la cual debe su existencia a una transformacin en
virtud de la cual bacterias diminutas y elementales se convirtieron en clulas grandes y
dotadas de una organizacin compleja (Duve, 1996).
La clula procariota con un tamao entre 1 y 10 m de dimetro, se caracteriza por tener
(Pelczar, 1990):
Cpsula: algunas clulas procariticas poseen una cpsula o capa mucosa, que consiste
36
en una cubierta mucilaginosa o mucosa en torno a la pared celular rgida, constituida por
polisacridos.
Membrana celular: debajo de la pared celular se localiza la membrana plasmtica, que
delimita el compartimiento celular nico, el citoplasma. La membrana celular contiene
aproximadamente 45 % de lpidos y un 55 % de protenas; los lpidos forman una fase no
polar continua. La membrana es una zona selectivamente permeable que permite que la
atraviesen libremente el agua, ciertos nutrientes e iones metlicos y desechos. Las enzimas
responsables de la conversin de la energa de los alimentos en ATP, se hallan localizadas
en la membrana.
Pili: los pili que no se encuentran en todas las bacterias, son prolongaciones o
extensiones de la pared celular. Algunos de los pili son huecos y pueden servir para
transferir el ADN durante la conjugacin sexual.
Flagelos: son prolongaciones de la pared celular. Los flagelos bacterianos son
apndices largos y finos que se encuentran fijos a la clula por uno de sus extremos
(anclados a la membrana celular) y libres por el otro extremo. El filamento del flagelo
bacteriano est compuesto de subunidades de una protena denominada flagelina. Los
flagelos son responsables de la movilidad de algunas bacterias.
Mesosomas y discos ticaloides: repliegues o irregularidades de la membrana
citoplasmtica hacia el interior de la clula. En algunas especies de bacterias la membrana
plasmtica presenta dos tipos de invaginaciones, los discos tilacoides caractersticos de las
cianobacterias, que contienen molculas de clorofila en su interior y los mesosomas los
cuales pueden tener un rol en la replicacin del ADN.
Citoplasma: el interior de la clula o citoplasma es una suspensin heterognea de
biomolculas, de consistencia similar al gel, que incluye molculas pequeas, protenas y
enzimas solubles, nutrientes y sales inorgnicas, ribosomas y ADN enrollado en la regin
nucleoide. El citoplasma es la regin donde se efectan muchas reacciones metablicas.
Regin nucleoide: la regin nucleoide contiene cromatina, un complejo de ADN
cromosomal e histonas. El material gentico o genoma, es un cromosoma nico,
constituido por una molcula de ADN duplo helicoidal, con enrollamiento compacto. El
ADN es el portador de la informacin gentica. Durante la divisin cada hebra se replica
originando dos molculas hijas duplo-helicoidades. La mayora de estos organismos
contiene adems, una molcula de ADN mucho ms pequea en forma de asa cerrada,
llamada plsmido. Algunas bacterias poseen uno o varios plsmidos y stos pueden
permanecer independientes del genoma principal o recombinarse con l.
Ribosomas: complejo de ARN y protena. Son los sitios de sntesis de protenas. Cada
clula de Escherichia coli contiene cerca de 15 000 ribosomas; cada uno de ellos posee una
subunidad principal y otra menor. Cada subunidad contiene cerca del 65 % de ARN y un
35 % de protena.
37
40
Los virus
(Figura 2.4) son otro ejemplo de ensamblados supramoleculares.
Bioqumicamente, muchos virus consisten en una sola molcula de ADN o ARN enrollado
en un paquete de protenas. Los virus no pueden existir de manera independiente y por lo
general no se les considera como una forma de vida, sino como parsitos, porque no tienen
la capacidad de llevar a cabo el metabolismo o la reproduccin sin la ayuda de una clula
husped. Cuando los virus infectan una clula, toman el control de su maquinaria
metablica y la obligan a sintetizar cidos nucleicos y protenas para nuevas partculas
virales.
generada por las reacciones bioqumicas. El agua es una molcula dipolar, no lineal, puede
formar grandes redes de puentes de hidrgeno, sea consigo misma o con otras molculas
polares.
En teora, cada molcula de agua puede formar puentes de hidrgeno con cuatro molculas
de agua vecinas, que se alcanzan en los cristales de hielo; en estado lquido forma cuando
menos tres puentes de hidrgeno, disminuyendo este nmero con el aumento de la
temperatura. El trmino puente de hidrgeno se refiere a la interaccin de un tomo de
hidrgeno, unido en forma covalente a un tomo electronegativo con los electrones de un
segundo tomo electronegativo al que no est directamente unido en forma covalente. Los
puentes de hidrgeno originan la estructura abierta (huecos) del hielo, que permite una
densidad menor que la del agua lquida a 4 0C, razn por la que el hielo flota. La presencia
de los puentes de hidrgeno se hace evidente en las propiedades del agua lquida, como
altos puntos de fusin, de ebullicin y calor de vaporizacin en comparacin con otros
lquidos.
En los materiales biolgicos (protenas, cidos nucleicos), los dos tomos que ms
comnmente participan en los enlaces de hidrgeno son el nitrgeno y el oxgeno (O H
O, O - H N, N H O y N - H N). Los grupos funcionales que participan en la
formacin de puentes de hidrgeno son tan diversos, como: grupos hidroxilo de alcoholes,
cidos orgnicos y carbohidratos; grupos carbonilo de aldehdos, cetonas, cidos, amidas y
steres y grupos N-H de amidas y aminas. Los puentes de hidrgeno se forman y se
rompen mucho ms rpidamente en los sistemas acuosos que la mayor parte de enlaces
covalentes. El puente de hidrgeno en agua lquida tiene una energa de enlace de slo
casi 20 kJ/mol, la cual es muy pequea en comparacin con la del enlace covalente de O-H
de 460 kJ/mol. (Hicks, 2001).
El agua disuelve muchos tipos de biomolculas, incluidas las que son inicas, polares o
neutras (no tienen carga). Las propiedades disolventes del agua derivan de su polaridad y
de los enlaces hidrgeno. Muchas biomolculas sin carga se disuelven fcilmente en agua
porque tienen grupos funcionales polares que forman interacciones dipolo-dipolo
favorables (alcoholes, aminas, amidas, steres). En soluciones acuosas, las sustancias
inicas y polares se rodean de molculas de agua y, por consecuencia, se atena el poder
electrosttico de las primeras, al interaccionar con los puentes de hidrgeno y el tomo de
oxgeno del agua. Se pueden formar extensas redes de puentes de hidrgeno cuando los
tomos de grupos funcionales polares se combinan con molculas idnticas, semejantes y/o
agua. (Boyer, 2000).
Las molculas inicas y polares son hidroflicas y forman interacciones favorables con el
agua. Los compuestos no polares son en esencia insolubles en agua; sin embargo, las
molculas anfipticas, poseen un extremo hidroflico (polar) y uno hidrfobo (no polar),
pueden formar micelas y bicapas (agregados moleculares), en los que su extremo polar se
orienta hacia el agua; y el no polar hacia los extremos de similar caracterstica, dirigindose
hacia el interior de la estructura conformada. Las asociaciones de regiones no polares de las
molculas se conocen como interacciones hidrofbicas. Muchas biomolculas son
anfipticas, como las protenas, ciertas vitaminas, pigmentos esteroles y fosfolpidos.
42
El agua tiende tambin a oponerse a la atraccin electrosttica entre los iones positivos y
negativos. Por su constante dielctrica tan alta, el agua es el solvente ideal para mantener
separados diversos iones en solucin. (Hicks, 2001).
De todas las propiedades fisicoqumicas del agua, la tendencia ionizarse es de crucial
importancia en la estructura y funcin de las biomolculas; por esto, se revisa el tpico de
ionizacin en trminos de constante de equilibrio y pH. Un cido de Brnsted es una
sustancia que puede donar protones y una base, aceptarlos. Al donar el cido un protn se
considera como una base conjugada. El agua puede reaccionar como un cido cuando
dona un protn para formar un oxidrilo (OH-), o como una base al aceptar un protn para
generar un hidronio (H3O+, que se abrevia con H+). La potencia de un cido se indica por
la magnitud de su constante de disociacin, K. La fuerza de un cido se define por su pK
(pK = -log K). Los cidos dbiles tienen una constante de disociacin menor que el
hidronio y se encuentran parcialmente disociados en solucin acuosa. La relacin entre pH,
pK y las concentraciones de los miembros de sus cidos conjugados con su base
correspondiente se expresa mediante la ecuacin de Henderson-Hasselbalch:
pH = pK + log [A-]/[HA]
El pK de un cido equivale al pH cuando son iguales las concentraciones del cido y de su
base conjugada. Los valores de pK de los cidos se pueden determinar de manera
experimental siguiendo un procedimiento de titulacin. La proporcin de las
concentraciones de base conjugada y cido vara con el pH. Por ejemplo, una solucin de
cido lctico a 25 0C (K = 1,38 x 10-4) y un pH de 5,0 contiene un 93 % de lactato y un 7 %
de cido lctico; por el contrario, una solucin de cido lctico a la misma temperatura y un
pH de 4,03 consta de 60 % de lactato y 40 % de cido lctico (Boyer, 2000), (Hicks, 2001).
Muchos cidos y bases de importancia biolgica tienen dos o ms grupos ionizables
(politrpicos) y consecuentemente, las curvas de titulacin son ms complejas que las de
los cidos que solo tienen un grupo ionizable (monotrpicos). En la curva de titulacin del
cido fosfrico (H3PO4), presente en los fluidos celulares de todos los organismos, se
diferencian tres regiones (Figura 2.5), las cuales corresponden a las disociaciones de las
especies: H3PO4, H2PO4- y HPO4-2, cuyos valores de pK a 25 0C son 2,12, 7,21 y 12,67,
respectivamente. Por clculos con la ecuacin de Henderson-Hasselbalch se puede
demostrar que a pH 7,0, la especie de fosfato mayoritaria es la H2PO4- (Hicks, 2001).
Un amortiguador cido-bsico es la mezcla de un cido dbil y su base conjugada en una
solucin con un pH cercano al pK de este cido. Los amortiguadores son eficaces slo en
el pH dentro del intervalo pK 1; siendo mxima cuando el pH es igual al pK. Fuera de
este intervalo, el pH de la solucin cambia rpidamente por la adicin de cidos o bases
fuertes. Las reacciones metablicas generan altas concentraciones de cidos orgnicos que
podran cambiar el pH de muchos fluidos sino existieran los agentes amortiguadores. La
capacidad de una disolucin para minimizar los cambios de pH producidos por la adicin
de un cido o de una base se llama capacidad de amortiguacin. Los fluidos
intracelulares y extracelulares poseen esta capacidad y permiten mantener el pH constante;
mediante sistemas amortiguadores naturales. Ejemplos de sistemas amortiguadores
importantes son el cido carbnico-bicarbonato, H2CO3 HCO3-, (pH 5,4 7,4) y
43
Figura 2.5. Titulacin de una disolucin de cido fosfrico 0,1 M con hidrxido potsico
0,1 M a 25 0C
2.3 CARBOHIDRATOS
Los carbohidratos pueden definirse como polihidroxialdehdos o polihidroxicetonas y sus
derivados. Actualmente se conoce, que algunos carbohidratos contienen nitrgeno y
azufre; adems, de carbono, hidrgeno y oxgeno. Los carbohidratos desempean diversas
funciones biolgicas:
Los carbohidratos constituyen las tres cuartas partes del mundo biolgico y alrededor del
80 % del aporte calrico de la humanidad. Son los principales componentes de casi todas
las plantas, comprenden del 60 - 90 % de su peso seco. Tambin se encuentran en los
tejidos de los animales. Los vegetales sintetizan sus propios carbohidratos a partir del
dixido de carbono y del agua por la fotosntesis. Los vegetales utilizan los carbohidratos
como fuente de energa, as como tejido de sostn. La mayora de los microorganismos
utilizan los carbohidratos como fuente de carbono y de energa.
44
Ismeros de cadena.
carbono.
H H H H
HCCCCH
H H H H
n-butano
45
H H
H
HCC C H
H CH3 H
iso-butano
Ismeros de posicin. Tienen la misma cadena pero difieren en la posicin del grupo
sustituyente.
H H H
H H
H
H C C C Cl
HCC C H
H H H
H Cl
H
n-cloruro de propilo
cloruro de isopropilo
Ismeros de grupo funcional. Los compuestos tienen diferentes grupos funcionales.
H3C - CH2 - CH2OH
n-propanol
Cl
Cl
C = C
H
H
cis-1,2-dicloroeteno
C = C
H
Cl
trans-1,2- dicloroeteno
Ismeros pticos. Hacen girar el plano de la luz polarizada cuando sta incide sobre
las molculas en solucin (actividad ptica). Este es el tipo de isomerismo que se encuentra
comnmente en los carbohidratos; se observa por lo general, cuando una molcula contiene
uno o ms tomos de carbono quirales (del griego kheir = mano) o asimtricos. Se tiene un
centro quiral (o un tomo de carbono quiral) cuando cuatro grupos distintos estn unidos al
carbono. Estos grupos pueden disponerse en el espacio de dos maneras diferentes, de modo
que se forman dos compuestos distintos.
Tal diferencia consiste en que no pueden
sobreponerse entre s.
Los ismeros pticos cuyas imgenes especulares no se superponen reciben el nombre de
enantimeros. Los enantimeros poseen propiedades fsicas y qumicas idnticas, hacen
girar la luz polarizada en un plano en un mismo nmero de grados, pero en direcciones
opuestas; en el sentido de las manecillas del reloj, dextrgiro y en sentido opuesto,
levgiro. Las dos formas del cido lctico existen en la naturaleza. Una forma aislada del
tejido muscular, es idntica en todos los aspectos a la otra forma que se asla de la levadura,
46
H C OH
HO C H
H C OH
HO C H
HO C H
H C OH
H C OH
HO C H
COOH
COOH
COOH
COOH
I
II
III
IV
Las estructuras I y II , III y IV representan pares de enantimeros, puestos que sus
imgenes especulares no se superponen. Esto no resulta vlido para las estructuras I y III,
II y III o II y IV. Todos se consideran ismeros pticos (ismeros porque tienen la misma
frmula molecular, pticos porque hacen girar el plano de la luz polarizada), pero no son
imgenes especulares. Estos pares de ismeros pticos son diaestereoismeros. Los
diaestereoismeros son ismeros pticos cuyas imgenes especulares no se corresponden
entre s. Los diaestereoismeros no poseen propiedades fsicas idnticas ni hacen girar la
luz polarizada en un plano en la misma magnitud. Pueden exhibir el mismo tipo de
propiedades qumicas, pero la velocidad con que reaccionen puede ser distinta. Se ha
convenido en que si dos ismeros pticos no son enantimeros, son diastereoismeros.
Cualquier par de azcares que difieran slo en la configuracin alrededor de un slo tomo
de carbono asimtrico, se denominan epmeros. Las estructuras I y III, I y IV, II y III, II y
IV son ejemplos de epmeros. Una mezcla que contenga cantidades iguales de los ismeros
dextrgiro y levgiro ser pticamente inactiva, ya que la rotacin que causen las
molculas de una forma ser cancelada por la rotacin que origina las molculas de la otra
forma. Una mezcla que contenga cantidades iguales de un par de enantimeros recibe el
nombre de mezcla racmica o racemato, se simboliza mediante la notacin (dl) o ().
El monosacrido ms sencillo que posee un tomo de carbono asimtrico, la triosa
glicerosa o gliceraldehdo, se ha seleccionado como compuesto de referencia o patrn.
Como presenta un centro quiral puede existir en dos formas pticamente activas. El D y L,
47
se debe a que el grupo hidroxilo del carbono quiral aparece a la derecha o a la izquierda,
respectivamente (cuando se escribe de manera que el grupo aldehdo quede en la parte
superior). El (+) y el (-), significa que el enantimero es dextrgiro o levgiro,
respectivamente.
CHO
H C OH
CH2OH
CHO
HO C H
CH2OH
D-(+)-gliceraldehdo
L(-)-gliceraldehdo
ROH
Alcohol
OH
R C OR
H
Hemiacetal
Esta reaccin qumica se aplica a una D-ribosa de cadena lineal como se muestra en la
Figura 2.8 (a), de la cual resulta una estructura hemiacetal cclica. El anillo de cinco
miembros se denomina furanosa, porque se asemeja al anillo heterocclico furano (Figura
8 (b). La misma reaccin aplicada a la D-glucosa forma un anillo de seis miembros
denominado piranosa por que es semejante al pirano (Figura 2.9). Las aldohexosas pueden
existir en forma de aldofuranosas; sin embargo, puesto que el anillo de aldopiranosa es ms
estable que el anillo de furanosa, aquel predomina en las disoluciones de aldohexosas.
48
Figura 2.6.
Familia de las D-aldosas con tres a seis tomos de carbono, vistas con sus
frmulas estructurales de cadena abierta.
49
Figura 2.7. Familia de las D-cetosas con tres a seis carbonos, vistas con sus formas
estructurales de cadena abierta
50
Figura 2.8. Ciclacin de la cadena abierta de la D-ribosa para formar una mezcla de dos
hemiacetales cclicos, la -D-ribofuranosa y la -D-ribofuranosa.
Las cetosas con un nmero de carbonos mayor de cuatro pueden reaccionar en forma
similar:
O
OH
R C R
+ ROH
R C OR
OR
Acetona
Alcohol
Hemicetal
Cuando se cierra el anillo para cada monosacrido, el carbono del carbonilo precedente
(aldehdo o cetona) se convierte en un centro quiral; por consiguiente, son posibles dos
molculas estereoismeras.. Estos ismeros son diastereoismeros, ms bien que
enantimeros, puesto que slo difieren en la configuracin alrededor del carbono
hemiacetlico o hemicetlico (C1 en las aldosas y C2 en las cetosas). Ms especficamente,
estas formas se conocen con el nombre de anmeros, porque nicamente exhiben la
mencionada diferenciacin. Se sugiri denominar anmero al que tiene el hidroxilo
51
Figura 2.9. Ciclacin de la cadena abierta de la D-glucosa para formar una mezcla de dos
hemiacetales cclicos, la -D-glucopiranosa y la -D-glucopiranosa
anomrico representado debajo del plano del anillo y anmero al que tiene el hidroxilo
anomrico por arriba del plano del anillo (Figura 2.10).
2.3.4 Monosacridos y derivados
derivados importantes, estn:
Figura 2.10. Ciclacin de la cadena abierta de D-fructosa para formar una mezcla de dos
hemiacetales cclicos, la -Dfructofuranosa y -D-fructofuranosa
CHO
H C OH
CH2OH
CH2OH
C=O
CH2OH
D-gliceraldehdo
Dihidroxiacetona
53
H C OH
H C OH
CH2OH
D-eritrosa
H C OH
HCH
H C OH
H C OH
H C OH
H C OH
CH2OH
CH2OH
D(-)-ribosa D(-)-2-desoxirribosa
D(-)-ribosa
D(-)-2-desoxirribosa
C=O
HO C H
H C OH
CH2OH
CH2OH
C=O
H C OH
H C OH
CH2OH
D-xilulosa
D-ribulosa
54
H C OH
H C OH
HO C H
HO C H
CH3
L-ramnosa
CHO
HO C H
H C OH
H C OH
HO C H
CH3
L fucosa
55
CHO
H C NH2
HO C H
H C OH
H C OH
CH2OH
D-glucosamina
CHO
H C NH2
HO C H
HO C H
H C OH
CH2OH
D-galactosamina
56
C=O
HO C H
H C OH
H C OH
H C OH
CH2OH
D-sedoheptulosa
promedio de las rotaciones de la y -glucosas. En lugar de una mezcla 50-50 de las dos
formas, la condicin de equilibrio debe ser tal que predomine uno de los dos ismeros.
Los porcentajes de y -glucosa en una mezcla en equilibrio puede calcularse mediante
ecuaciones simultneas:
18,7 x + 112,2 y = 52,7
x+ y=1
Mezcla en equilibrio
_________________________________________________________________________
D-glucosa
+112,2
+18,7
+52,7
D-fructosa
-21
-133
-92
D-galactosa
+151
-53
+84
D-manosa
+30
-17
+14
D-lactosa
+90
+35
+55
D-maltosa
+168
+112
+136
_________________________________________________________________________
cetnicas de los
H C OH
HO C H
H C OH
H C OH
HO C H
HO C H
HO C H
CH2OH
H C OH
H C OH
H C OH
H C OH
H C OH
CH2OH
CH2OH
CH2OH
D-sorbitol
D-manitol
D-xilitol
Glicerina
El D-sorbitol se encuentra en las bayas de muchas plantas superiores, especialmente
Rosaceae. Es un slido cristalino a temperatura ambiente, pero de bajo punto de fusin.
El D-manitol existe en las algas y en los hongos. Ambos compuestos son solubles en agua
y tienen un sabor dulce. Los polialcoholes o azcares-alcoholes son utilizados como
agentes endulzantes por su poder edulcorante, reduccin calrica y/o no cariogenicidad. La
glicerina es un importante componente de algunos lpidos. El mio-inositol es un derivado
del inositol, es importante porque se encuentra en el lpido fosfatidil-inositol sino tambin
en el cido ftico. La sal de calcio y de magnesio del cido ftico se conoce como fitina y
abunda en el material extracelular de sostn en los tejidos de las plantas superiores.
Tabla 2.4. Poder edulcorante de algunos polialcoholes comparados con l de la
Sacarosa*
_________________________________________________________________________
Polialcohol
Poder edulcorante
_________________________________________________________________________
Xilitol
90
Sorbitol
63
Galactitol
58
Maltitol
90
Isomaltitol
90
Manitol
50
Lactitol
35
Sacarosa
100
_________________________________________________________________________
*(Garca et al., 1993).
2.3.5.6 Oxidacin de azcares. El grupo aldehdico de las aldohexosas se oxida con
61
que se produce se conoce con el nombre de cido aldnico (es decir, cido glucnico a
partir de la glucosa). En presencia de un agente oxidante poderoso, del tipo del HNO3, se
oxidan tanto el grupo aldehdico como la funcin alcohlica primaria, hasta constituir el
cido dicarboxlico, o aldrico, correspondiente (es decir, cido glucrico). Uno de los
productos de oxidacin ms importantes de los monosacridos es el cido monocarboxlico,
el cual se obtiene de la oxidacin exclusiva de la funcin alcohlica primaria. Esta
reaccin por lo general se lleva a cabo por medio de enzimas especficas. El producto es
un cido urnico (es decir, cido glucurnico) Tales cidos son componentes de muchos
polisacridos y son importantes biolgicamente.
Los cidos aldnicos y urnicos presentan una gran tendencia a establecer un ster interno
y formar lactonas de cinco y seis miembros. El cido ascrbico (vitamina C) es una lactona (Hicks, 1999).
ROH + ROH
R-O-R (ter)
Cuando el grupo hidroxlico de una segunda molcula de azcar reacciona con el hidroxilo
hemiacetlico (o hemicetlico) de otro monosacrido, en un medio cido moderado,
anhidro, el glucsido resultante es un disacrido. El enlace entre los dos azcares se
conoce como enlace glucosdico. Los polisacridos se forman por la unin de un gran
62
2.3.5.10 Formacin de N-glucosilaminas. Las aldosas y las cetosas reaccionan con las
aminas en un disolvente apropiado formando N-glucosilaminas. En los nucletidos y en los
cidos nucleicos, los tomos de nitrgeno de las bases purnicas y pirimidnicas forman
enlaces N-glucosilamina con el C1 de la D-ribosa o de la 2-desoxi-D-ribosa.
63
Fenilosazona de la D-glucosa
65
Xilanos y arabinanos.
Hemicelulosa. Polisacrido de las pentosas, sobre todo D-xilanos, los cuales son
polmeros de la D-xilosa con enlaces -1,4, que poseen cadenas laterales de arabinosa y
otros azcares (manosa, galactosa). Esta presente en las clulas vegetales.
Pectina. Es otro componente polisacrido importante de las paredes de las clulas
vegetales. Constituido por cido D-galacturnico, arabinosa y galactosa. Se emplea para
gelatinizar las mermeladas y jaleas.
71
Pptidoglucano (Muropptido). Es un heteropolimero lineal de cido N-acetilmurmico (NAMA) y N-acetil-D-glucosamina (NAG) alternados. Las unidades
monomricas estn ligadas en un esqueleto extendido por medio de enlaces glucosdico
-1,4. La resistencia y rigidez de las paredes celulares bacterianas se debe a una red de
pptidos entrecruzados entre las hebras de los polisacridos lineales. La composicin y
secuencia de aminocidos de los pptidos enlazantes vara entre cada tipo de bacteria. El
cido N-acetil-murmico tiene su grupo hidrxilico del C3 asociado por una unin ter a la
funcin -hidroxlica del cido lctico. A su vez, el grupo carboxlico del cido lctico se
encuentra enlazado a cadenas laterales tetrapeptdicas, cada una de las cuales contiene Lalanina, D-alanina, cido D-glutmico o D-glutamina, meso-diaminopimlico, L-lisina, Lhidroxilisina u ornitina, segn la especie bacteriana que se trate. La estructura del
peptidoglucano de la pared celular bacteriana, es resistente a la accin de las enzimas que
hidrolizan los pptidos, las cuales no atacan a los pptidos que contienen D-aminocidos.
Sin embargo, la enzima lisozima provoca la lisis de muchas bacterias, al hidrolizar los
enlaces glucosdicos -1,4.
Figura 2.12. Segmentos de un cido teicoico que contiene restos alternativos de D-alanina
y de N-acetilglucosamina
74
En un tipo de cido teicoico los grupos hidroxilo libres alternativos del esqueleto de fosfato
de glicerilo se hallan ocupados por D-alanina y por restos de D-glucosa o N-acetil-Dglucosamina. Los polisacridos accesorios contienen ramnosa, glucosa, galactosa o
manosa (o sus aminas). Segn las especies pueden ser mucilaginosos o bien formar
cpsulas resistentes y duras.
Las paredes de las clulas Gram-negativas son mucho ms complejas que las de las clulas
Gram-positivas, sus componentes accesorios estn constituidos por polipptidos,
lipoprotenas y un lipopolisacrido. Este ltimo est constituido por un esqueleto
trisacrido, unidad que se repite y que esta constituida por dos heptosas y cido
octulosnico (azcar-cido de ocho carbonos). A este esqueleto se hallan unidas cadenas
laterales oligosacardicas y el cido graso -hidroximiristico.
2.4 LPIDOS
Los lpidos se caracterizan por su escasa solubilidad en el agua y considerable solubilidad
en disolventes orgnicos no polares (cloroformo, tetracloruro de carbono, ter, benceno),
propiedades fsicas que reflejan la naturaleza hidrfoba de sus estructuras. Los lpidos
desempean diversas funciones biolgicas importantes, actuando como:
2.4.1.2 Lpidos sencillos: no contienen cidos grasos y por lo tanto, no son saponificables.
Se forman a partir de una unidad simple que se repite: la unidad isoprenoide. Esta unidad
por condensaciones, crece hasta formar compuestos tales como el hule, los carotenoides,
los esteroides y muchos terpenos ms simples.
2.4.2 cidos grasos. Los cidos grasos se encuentran en cantidades muy grandes como
componentes fundamentales de los lpidos saponificables, en las clulas y en los tejidos; en
estado libre aparecen solamente en trazas. Todos ellos contienen un grupo funcional
carboxilo (COOH, polar, corresponde al C1) enlazado con una cadena aliftica lineal (no
polar). El nmero de tomos de carbono en los cidos grasos puede ir desde 4
(mantequilla) hasta 36 (los que se encuentran en el cerebro), aunque la mayora de los
cidos grasos que se encuentran en la naturaleza contienen entre 12 y 24 tomos de
carbono, predominan los que contienen 16 y 18. Como los cidos grasos son sintetizados
por la combinacin de unidades de dos tomos de carbono del cido actico (CH3COOH),
casi todos tienen un nmero par de tomos de carbono. Los cidos grasos con un nmero
impar aparecen slo en cantidades mnimas en los animales terrestres, pero en muchos
organismos marinos se presentan en cantidades importantes (Lehninger, 1995).
La cadena hidrocarbonada, que por lo general carece de ramificaciones, puede estar unida
exclusivamente por enlaces sencillos carbonocarbono (saturados) o tener uno o ms
dobles enlaces carbono-carbono (insaturados).
En los cidos monoinsaturados
(monoenoicos), el doble enlace se presenta casi siempre entre los carbonos 9 y 10. En la
mayora de los cidos grasos poliinsaturados (polienoicos), los dobles enlaces adicionales al
que se encuentra entre los carbonos 9 y 10, estn situados, generalmente, entre el doble
enlace 9 y 10 y el extremo metilo (terminal de la cadena). En la mayor parte de cidos
poliinsaturados los dobles enlaces mltiples no estn conjugados (-CH2-CH=CH-CH=CHCH=CH-CH2-) sino que estn separados por un grupo metileno (-CH2-CH=CH-CH2CH=CH-CH2-). El sistema de enlaces conjugados es mucho ms reactivo. Los cidos
grasos que presentan dobles enlaces conjugados experimentan una gran polimerizacin
(pinturas). Tanto el retinol como los carotenos, son ejemplos de sistemas conjugados
importantes en las biomolculas (Conn et al., 1996).
Los cidos grasos insaturados predominan sobre los saturados, especialmente en las plantas
superiores y en los animales que viven a temperaturas bajas. Los cidos grasos de origen
animal tienen una estructura bastante simple, es decir, estas molculas son de cadena recta
(principalmente de 16 a 22 carbonos) y pueden tener de 0 a 6 dobles enlaces. Los cidos
grasos bacterianos, un poco ms variados,
pueden ser saturados (C12-C18),
monoinsaturados (C16-C18), de cadena ramificada o pueden tener incluso un anillo de
ciclopropano (en el cido lactobaclico). Los cidos grasos de origen vegetal son
considerablemente ms variados y tienen enlaces acetilnicos, grupos epoxi, hidroxi y ceto
o bien anillos de ciclopropeno y ciclopenteno (Conn et al., 1996), (Hicks, 2001).
Los mamferos pueden sintetizar cidos grasos saturados y monoinsaturados a partir de
otros precursores pero son incapaces de fabricar cido linoleico y -linolnico (cidos
grasos esenciales). Estos cidos grasos tienen que obtenerse de fuentes vegetales, donde
son muy abundantes. El cido linoleico es un precursor necesario en los mamferos, para la
biosntesis del cido araquidnico, que no se encuentra en las plantas.
76
Las propiedades fsicas de los cidos grasos y de los compuestos que los contienen
dependen de la longitud y grado de instauracin de la cadena de hidrocarburos:
Los cidos grasos son solubles en solventes orgnicos como alcoholes, hexano y ter
dietlico.
La solubilidad en agua disminuye con el incremento de la cadena. A una cadena larga
y pocos enlaces dobles corresponde una baja solubilidad en agua.
El punto de fusin baja con la introduccin de dobles enlaces. Los cidos grasos
saturados poseen puntos de fusin ms altos que los insaturados de igual longitud de
cadena. Todos los cidos grasos saturados de menos de diez carbonos son lquidos
oleosos a temperatura ambiente. A 25 0C, los cidos grasos saturados de 12:0 a 24:0 tienen
una consistencia cerosa; mientras que los insaturados con una longitud de cadena similar
son aceites lquidos. Cuanto mayor sea el grado de insaturacin de un cido graso, menor
ser su punto de fusin
Los cidos grasos saturados tienen una gran capacidad de rotacin entre cada enlace
carbono-carbono, lo cual confiere a estas molculas una gran flexibilidad. Estas molculas
pueden empaquetarse juntas, con estrechez, casi como un arreglo cristalino, con los tomos
a todo lo largo de la cadena estableciendo un contacto de van der Waals con las molculas
vecinas.
En los cidos grasos insaturados, los dobles enlaces en la posicin cis, obligan a que la
cadena de hidrocarburos no mantenga la estructura totalmente extendida y se doble en cada
enlace insaturado que posea. Estos cidos no pueden empacarse de manera similar a los
saturados.
Los cidos grasos son molculas anfipticas, debido a que estn formadas por un
componente hidrfobo (cadena hidrocarbonada) y un componente hidroflico (grupo
carboxlico). En ellos el componente hidrfobo interacciona uno con otro y el componente
hidrfilo interacciona con el ambiente acuoso circundante. Una consecuencia de esta
propiedad de los cidos grasos, es la de asociarse en una forma definida, formando
micelas.
77
CH3(CH2)5CH - CH(CH2)9COOH
CH3(CH2)4CH - CHCH2CH=CH(CH2)7COOH
O
A. trans-hexadecenoico CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7COOH
cido eladico
CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH
OH
28
16:1(9 t)
18:1(9 t)
Cerebrnico
CH3(CH2)21CHCOOH
*(Lehninger, 1995), (Conn et al., 1996),(Boyer, 2000), (Hicks, 2001)
Cuando un doble enlace est en la cadena hidrocarbonada de un cido graso, ocurre
isomerismo geomtrico. La mayora de los cidos grasos insaturados se encuentran en
forma de ismeros cis menos estables, en lugar de ismeros trans ms estables.
78
cido larico
CH3(CH2)10COO-Na+ + H2O
Laurato de sodio
(jabn)
En condiciones fisiolgicas, los cidos grasos libres existen como sales carboxilato
(iones) debido a que sus valores de pKa estn entre 4 y 5; por consiguiente, los nombres de
los cidos grasos terminan con el sufijo ato (laurato, eleato, etc.)
La reactividad qumica de las cadenas hidrocarbonadas de los cidos grasos depende de
la instauracin. Las cadenas saturadas son relativamente no reactivas. Mientras las
insaturadas exhiben la reactividad caracterstica de los dobles enlaces carbono = carbono;
por ejemplo, pueden incorporar tomos de halgeno o de hidrgeno o ser atacados por el
oxgeno (autooxidacin) (Boyer, 2000).
2.4.3 Acil glicridos. El acil glicerol ms abundante es el triacilglicerol, llamado tambin
triglicrido o lpido neutro, el cual se compone de tres cidos grasos unidos al glicerol. Los
diacil gliceroles y los monoacilgliceroles no existen en cantidades apreciables en la
naturaleza, pero son intermediarios importantes en varias reacciones biosintticas.
CH2OCOR1
CH2OCOR1
R2COOCH
R2COOCH
CH2OH
CH2OCOR3
Triacilglicerol
CH2OCOR1
HOCH
CH2OH
1,2 - diacilglicerol
1- monoacilglicerol
CH2OH
RCOOCH
CH2OH
2- monoacilglicerol
Los grupos hidroxilo polares del glicerol y el grupo carboxilo polar de cada cido graso
estn ligados a travs de enlaces ster neutros, de ah que los triacilgliceroles sean
molculas hidrfobas, no polares, insolubles en agua pero solubles en solventes no polares.
Pueden existir en estado slido o lquido, segn la naturaleza de los cidos grasos
constitutivos. La mayora de los triacilgliceroles vegetales tienen puntos de fusin bajos y
son lquidos a la temperatura ambiente, debido a que contienen una gran proporcin de
cidos insaturados, del tipo de los cidos oleico, linoleico y linolnico. En contraste, los
triacilgliceroles animales contienen una mayor proporcin de cidos grasos saturados, tales
como los cidos palmtico y esterico, lo que se traduce en puntos de fusin ms elevados,
dando lugar a que presenten carcter semislido o slido a la temperatura ambiente. Si los
tres grupos hidroxilo del glicerol estn esterificados con el mismo cido, el ster resultante
se llama triacilglicerol simple (trimiristina del aceite de nuez moscada), que raras veces se
encuentran en la naturaleza. Todos los triacilgliceroles que se obtienen de grasas y aceites
79
naturales contienen dos o tres cidos grasos distintos y, por tanto, se les denomina
triacilgliceroles mixtos.
La funcin principal de los triacilgliceroles en los animales es servir de reservorio de
energa ya que no son componentes de las membranas. Como combustible de reserva, los
triacilgliceroles tienen dos ventajas significativas sobre los polisacridos (glucgeno,
almidn):
Los tomos de carbono de los cidos grasos estn ms reducidos que los de los
carbohidratos.
La oxidacin de los triacilgliceroles proporciona ms del doble de energa por gramo
que la de los carbohidratos
Tabla 2.6. Composicin de cidos grasos de algunas grasas de origen animal y vegetal
_________________________________________________________________________
Saturados (%)
Grasas animales
Pescado
Pollo
Cerdo
Res
Mantequilla
Monoinsaturados (%)
28
40
40
54
59
29
38
46
44
37
Poliinsaturados (%)
43
22
14
2
4
Aceites vegetales
Azafrn
11
11
78
Girasol
12
18
70
Maz
14
26
60
Sesamo
14
43
43
Soja (soya)
15
27
58
Cacahuata
20
45
35
Algodn
29
19
52
Coco
86
12
2
_________________________________________________________________________
Los lpidos pueden ser lquidos o slidos, no cristalinos a la temperatura ambiente. Las
grasas y aceites puros son incoloros, inodoros e inspidos. Son ms ligeros que el agua
(densidad = 0,8 g/cm3). Casi no conducen el calor y la electricidad y por tanto sirven como
aislantes para el cuerpo.
La hidrlisis de los triacilgliceroles puede efectuarse por varios procedimientos, los ms
comunes utilizan cidos, lcalis o enzimas (lipasas). La hidrlisis cida es reversible
mientras que la alcalina es irreversible. La hidrlisis alcalina recibe el nombre de
saponificacin, debido a que uno de sus productos es un jabn (sales de sodio o de potasio
80
de los cidos grasos). Esta reaccin proporciona un mtodo analtico til para la
determinacin de una constante, ndice de saponificacin, el cual es caracterstico de los
lpidos complejos:
triacilglicerol + base
jabn + glicerol
O
CH2 O C R1
2
R C O C H
O
CH2 O P OX
OLos glicerofosfolpidos son molculas anfipticas con una regin no polar aliftica (cola) y
otra polar, constituida por el grupo fosfato y un sustituyente en X (cabeza). Son los lpidos
de mayor polaridad. Los cidos grasos saturados que con mayor frecuencia se esterifican
en el C1 son palmtico y esterico y la posicin C2 es ocupada comnmente por un cido
graso insaturado de 16 a 20 carbonos, como el oleico, linoleico y araquidnico. El ms
simple glicerofosfolpido, en el que el sustutuyente X es un H, se llama cido fosfatdico,
que se halla slo en pequeas cantidades en las membranas pero es un intermediario
importante en la biosntesis de los fosfoglicridos. En los glicerofosfolpidos, que por lo
general constituyen las membranas biolgicas, la regin polar o cabeza se forma por
alcoholes polares (colina, etanolamina, serina, glicerol, fosfatidilglicerol, mioinositol).
Los fosfoglicridos puros son slidos blancos de consistencia crea, pero por exposicin al
aire se oscurecen y experimentan cambios complejos a causa de la tendencia de sus cidos
grasos insaturados a peroxidarse por la accin del oxgeno atmosfrico. Son solubles en
muchos solventes no polares que contengan cierta cantidad de agua y son extrados
adecuadamente de las clulas y los tejidos mediante mezclas de cloroformo-metanol. No se
disuelven fcilmente en acetona anhidra. Cuando los fosfolpidos se adicionan al agua se
disuelven; sin embargo, solamente forman disolucin verdadera en cantidades muy
pequeas, la mayor parte del lpido disuelto se halla en forma de micelas dispersas en el
sistema acuoso.
Se encuentran ampliamente distribuidos en bacterias y tejidos animales y vegetales, y sus
estructuras generalizadas, sin importar su origen son bastantes similares. Son los
componentes ms abundantes de las membranas biolgicas. Actan como agente
emulsionante en las superficie de las membranas celulares. Desempean funciones
importantes en la cadena respiratoria, el metabolismo de las grasas, procesos de secrecin y
en el transporte de iones a travs de las membranas celulares.
Una hidrlisis alcalina suave de los fosfoglicridos produce cidos grasos en forma de
jabones, pero deja inalterado el esqueleto de la molcula, constituido por la glicerina-cido
fosfrico-alcohol. En lcali concentrado origina la liberacin de ambos cidos grasos, del
alcohol y del fosfato de glicerilo. Este ltimo puede escindirse mediante hidrlisis cida.
82
83
O
CH2 O C R1
R2 C O CH
CH2 X
X : - (galactosa)1 o 2
- (glucosa)1 o 2
- (manosa)1 o 2
- (glucosa)(galactosa)
Los galactolpidos y los sulfolpidos se han encontrado principalmente en los tejidos con
funciones fotosintticas (membrana de los cloroplastos). El galactosildiacilglicrido se ha
hallado tambin en el tejido neural de los vertebrados y el dimanosildiacilglicrido en las
bacterias.
2.4.8 Terpenoides y esteroles. Los terpenos estn constituidos por unidades mltiples
del hidrocarburo de cinco tomos de carbono, isopreno (2-metil-1,3 butadieno).
CH3
CH2 = C CH = CH2
Los terpenos que contienen una unidad de isopreno se llaman hemiterpenos, los que
contienen dos unidades se denominan monoterpenos, los que contienen tres unidades se
denominan sesquiterpenos y los que contienen cuatro, seis, ocho y diez unidades, reciben
el nombre de diterpenos, triterpenos, tetraterpenos y politerpenos, respectivamente.
Los terpenos pueden ser molculas lineales o cclicas y algunos de ellos contienen
estructuras de ambos tipos. Los enlaces dobles en los segmentos lineales de muchos
terpenos se hallan en la configuracin estable trans.
86
En los vegetales se han identificado un nmero muy grande de terpenos, muchos de los
cuales poseen sabores y olores caractersticos, y son componentes principales de los aceites
esenciales obtenidos de tales plantas. As, los monoterpenos geraniol, limoneno, mentol,
pineno y alcanfor, son los componentes principales del aceite de geranio, de limn, de
menta, de trementina y de alcanfor, respectivamente. El farnesol constituye un ejemplo de
sesquiterpeno. Entre los diterpenos se halla el fitol, que es un alcohol terpenoide lineal
componente de la clorofila, un pigmento fotosinttico. Entre los triterpenos figura el
escualeno, precursor importante en la biosntesis del colesterol. Entre otros terpenos
superiores se incluyen los carotenoides, que son una clase de hidrocarburos
tetraterpnicos, y sus derivados oxigenados. Un carotenoide importante es el -caroteno,
fuente del color anaranjado y precursor de la vitamina A. Otro carotenoide importante es el
licopeno, pigmento rojo de la piel del tomate. El cido giberlico es un terpeno no lineal
que se encuentra en las plantas, como una hormona de crecimiento de stas. El caucho
natural es un politerpeno, constituido por largas cadenas hidrocarbonadas que contienen
centenares de unidades de isopreno en orden lineal regular.
Entre los terpenos ms importantes hay tres miembros del grupo de las vitaminas
liposolubles: vitamina A, E y K. Otro compuesto terpenoides que acta como coenzima es
la ubiquinona o coenzima Q.
Los esteroides se originan a partir del escualeno, triterpeno lineal que se cicla con
facilidad. El primer producto esteroide importante de esta ciclacin es el lanosterol, que
es el precursor del colesterol en los tejidos de animales. El colesterol y el lanosterol son
miembros de un gran subgrupo de esteroides llamados esteroles. El colesterol aparece muy
raramente en las plantas superiores las cuales contienen otros tipos de esteroles conocidos
colectivamente como fitosteroles. Entre estos se halla el estigmasterol y el -sitosterol.
Los mohos y las levaduras contienen adems otros tipos de esteroles, los micosteroles,
figura entre ellos el ergosterol, que se convierte en vitamina D por irradiacin de la luz
solar. Los esteroles no se encuentran en las bacterias.
87
Sin embargo, en las protenas existen unas veinte unidades monmeras de diferente
estructura, y stas son los aminocidos.
2.5.1 Aminocidos. Un aminocido es cualquier molcula orgnica que posea un grupo
carboxilo (un cido orgnico) y un grupo amino (una base orgnica). Segn esta definicin
general, existen cientos de aminocidos distintos. Los aminocidos que forman las
protenas se caracterizan por tener un carbono central (carbono alfa) rodeado de un
hidrgeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y una cadena lateral R.
2.5.1.1 Clasificacin de los aminocidos. La cadena lateral R hace que cada aminocido
sea qumica y biolgicamente distinto. Los grupos R varan en tamao, polaridad, carga y
reactividad qumica. Cada aminocido posee propiedades nicas debido a la variacin en la
estructura de los grupos R. Segn la reactividad se clasifican en (Figura 2.14):
Grupo I: aminocidos con cadenas laterales no polares. Esta familia contiene
cinco aminocidos con grupos R que son hidrocarburos alifticos (alanina, leucina,
isoleucina, valina y prolina), dos con anillos aromticos (fenilalanina y triptfano) y uno
que contiene azufre (metionina); por consiguiente, son hidrofbicos. Estos aminocidos
son menos solubles en el agua que los aminocidos con grupo R polares; el menos
hidrfobo en esta clase es la alanina.
Grupo II: aminocidos con cadenas laterales polares, sin carga elctrica en el pH
fisiolgico. En las cadenas laterales de los aminocidos de este grupo se encuentran grupos
polares neutros (sin carga), con un par de electrones disponibles para formar puentes de
hidrgeno con el agua o con otras molculas. La polaridad de la serina, treonina y
tirosina se debe a sus grupos hidroxilo; la de la asparagina y glutamina a sus grupos
amdicos y la de la cistena a la presencia del grupo sulfidrilo (-SH). La glicocola, se
clasifica a veces como no polar, pero su grupo R, que es un tomo de hidrgeno, es
demasiado pequeo para que pueda influir en la elevada polaridad de los grupos -amino y
-carboxilo. La cistena y la tirosina poseen las funciones ms polares de esta clase de
aminocidos, a saber, los grupos tiol e hidroxilo fenlico, respectivamente. La cistena se
encuentra con frecuencia en las protenas en su forma oxidada, la cistina.
Grupo III: aminocidos con cadenas laterales cidas. Estos aminocidos (cido
asprtico y glutmico) tienen un grupo carboxlico en la cadena lateral que les confiere sus
propiedades cidas. En el pH fisiolgico (6 a 7), los tres grupos funcionales de estos
aminocidos se encuentran ionizados en una especie de carga neta de 1.
Grupo IV: aminocidos con cadenas laterales bsicas. Este grupo est constituido
por la lisina, que contiene un segundo grupo amino en la posicin de la cadena aliftica;
la arginina, que tiene un grupo guanidinio cargado positivamente y la histidina, que
contiene la funcin imidazolio, dbilmente bsica.
Adems, de estos 20 aminocidos, que son las unidades bsicas de todas las protenas,
existen otros que se encuentran en contadas protenas: 4-hidroxiprolina, derivado de la
prolina que se encuentra con cierta abundancia en la protena fibrosa colgeno y en algunas
90
Figura 2.14. Estructuras completas para los 20 aminocidos presentes en las protenas, al
pH fisiolgico. Clasificacin de los aminocidos en cuatro grupos, basados
en la reactividad qumica y en la polaridad de la cadena lateral R.
91
Figura 2.15. Algunos aminocidos poco frecuentes hallados en las protenas fibrosas
Existen ms de 150 aminocidos en la naturaleza (particularmente en el reino vegetal) pero
no forman parte de las protenas. Entre estos estn: la -alanina, precursor de la vitamina
cido pantotnico; la homocistena y la homoserina son intermediarios en el metabolismo
de los aminocidos; la citrulina y la ornitina son intermediarios en la sntesis de la
arginina. Otros aminocidos no proteicos actan como agentes qumicos para la
transmisin de los impulsos nerviosos, tal como ocurre con el cido -aminobutrico.
Algunos aminocidos no proteicos poseen la configuracin D, por ejemplo, el cido
D-glutmico, hallado en cantidades sustanciales en las paredes celulares de muchas
bacterias (peptidoglucano), la D-alanina hallada en las larvas o pupas de algunos insectos
la D-serina, que se encuentra en los gusanos de tierra. Los hongos y las plantas superiores
contienen una variedad de aminocidos no proteicos. En las plantas se encuentran algunos
como la canavanina, el cido dyenclico y la -cianoalanina, que son txicos para otras
formas de vida (Figura 2.16).
2.5.1.2 Propiedades generales de los aminocidos.
R C COOH
NH2
R C COO
NH3
+
Forma no disociada
Forma dipolar o
de ion hbrido
El carbono alfa tetradrico de cada aminocido con excepcin de la glicina, lleva unido
93
H C OH
H
-L-serina
COO
+
H C NH3
HO C H
H
-D-serina
Todos los -L-aminocidos tienen como mnimo dos grupos qumicos que pueden
ceder o aceptar protones (H+), es decir, que poseen dos grupos ionizables: el -amino y el
-carboxilo. Los valores de pK para la disociacin de los grupos ionizables de los 20
aminocidos se dan en la Tabla 2.7. Los aminocidos, por ser dipolares, son sustancias
anfotricas; son capaces de comportarse como cidos o bases. Cuando se disuelve en el
agua un in hbrido cristalizado, como la alanina, puede actuar como cido (dador de
protones) o como base (aceptor de protones). El grado de ionizacin y la carga de los
aminocidos dependen del pH de la solucin. La curva de titulacin de la alanina se
muestra en la Figura 2.17. En ella se observan dos puntos de inflexin, indicativos de dos
valores de pK, uno de ellos define la disociacin del protn del grupo carboxilo (pK1 = 2,3)
y el otro, la disociacin del protn del grupo amino (pK2 = 9,7). Los cambios qumicos se
muestran en las reacciones:
+
H3NCH(CH3)COOH + OH+
H3NCH(CH3)COO- + OH-
H3NCH(CH3)COO- + H2O
H2NCH(CH3)COO- + H2O
pK1
pK2
pK3
Glicina
2,4
9,8
Alanina
2,3
7,9
Valina
2,3
9,6
Leucina
2,4
9,6
Isoleucina
2,4
9,7
Metionina
2,3
9,2
Fenilalanina
1,8
9,1
Prolina
2,0
10,6
Serina
2,1
9,2
Treonina
2,6
10,4
Cistena
1,8
10,8
8,3
Asparagina
2,0
8,8
Glutamina
2,2
9,1
Tirosina
2,2
9,1
10,9
Triptfano
2,4
9,4
cido asprtico
2,0
10,0
3,9
cido glutmico
2,2
9,7
4,3
Histidina
1,8
9,2
6,0
Lisina
2,2
9,2
10,8
Arginina
1,8
9,0
12,5
_________________________________________________________________________
Cuando el pH de la solucin es de 2,3, 50 % de la alanina estn en la forma A y 50 % en la
forma B. A medida que se aade ms base, la forma B disocia otro protn (NH3+) para
95
97
nanopptidos que puede asumir una estructura cclica formando puentes disulfuro entre la
cistena amino terminal y una cistena del interior del pptido. Siete de los nueve
aminocidos son idnticos. Sin embargo, los efectos fisiolgicos son bastante distintos: la
vasopesina aumenta la presin sangunea al constreir los vasos sanguneos perifricos;
mientras la oxitocina causa la contraccin del msculo liso.
Tirocidina y penicilina G: son antibiticos. La penicilina G posee los residuos de
aminocidos valina y cistena, pero stos no estn unidos por enlaces peptdicos; en su
lugar se encuentra un anillo de azufre y una estructura anular tensa de cuatro miembros.
Aspartame (L-aspartil-L-fenil-metil-ster): es un pptido sinttico que muestra
actividad biolgica. Es aproximadamente, 200 veces ms dulce que la sacarosa y se
considera que carece del sabor desagradable asociado con otros edulcorantes artificiales.
Tiene menos kilocaloras que la sacarosa (1/16). Se utiliza en las bebidas gaseosas
dietticas y en los productos alimenticio de bajas caloras.
Insulina: es una hormona que regula el metabolismo de los carbohidratos, contiene 51
aminocidos.
2.5.3
Protenas. Las protenas son biopolmeros de tamao muy variado, compuestas
de 20 -aminocidos distintos. Su peso molecular vara desde aproximadamente 5000 hasta
varios millones de daltons. A pesar de esta complejidad, se ha determinado la secuencia
aminocida de cierto nmero de protenas, mediante mtodos que se explican Lehninger,
(1995) y Boyer, (2000). Las protenas que constan de una sola cadena polipeptdica se
denominan monomricas y las que tienen dos o ms cadenas polipeptdicas se denominan
oligomricas. (Tabla 2.9)
Tabla 2.9. Propiedades moleculares de algunas protenas
_________________________________________________________________________
Protena
Peso molecular Nmero de residuos de Nmero de
aminocidos
cadenas
Insulina (bovina)
5 733
51
2
Citocromo c (humano)
13 000
104
1
Ribonucleasa A (pncreas bovino)
13 700
124
1
Lisozima (clara de huevo)
13 930
129
1
Mioglobina (corazn equino)
16 890
153
1
Quimotripsina (pncreas bovino)
21 600
241
3
Hemoglobina (humana)
64 500
574
4
Albmina srica (humana)
68 500
550
1
Inmunoglobulina G (humana)
145 000
1 320
4
ARN polimerasa (E. coli)
450 000
4 100
5
Ferritina (bazo equino)
450 000
4 100
24
Glutamato deshidrogenasa (hgado
bovino)
1 000 000
8 300
40
Virus mosaico del tabaco
40 000 000
2 130
_________________________________________________________________________
98
estructura es hlice o lmina plegada (Figura 2.18) Las protenas fibrosas son los
elementos bsicos estructurales en el tejido conjuntivo de los animales superiores, tales
como el colgeno de los tendones y la matriz de los huesos; la -queratina (ricas en restos
de cistina) del cabello, cuernos, cuero, uas y plumas; la -queratina (rica en restos de
glicocola, alanina y serina) de las fibras hiladas por las araas y los gusanos de seda,
escamas, garras y picos de reptiles y pjaros y la elastina del tejido conjuntivo elstico.
Las globulares estn plegadas en formas esfricas o globulares compactas y con las
cadenas polipeptdicas enrolladas. Ciertas regiones no son hlice o lmina plegada.
Solubles en agua o en las disoluciones acuosas salinas. Generalmente desempean una
funcin mvil o dinmica en la clula. Estas protenas se disuelven en los fluidos
biolgicos como la sangre y el citoplasma, de modo que se espera que tengan un contenido
relativamente alto de residuos de aminocidos con grupos polares y grupos R con carga.
De las 2000 enzimas conocidas casi todas son globulares, como tambin lo son los
anticuerpos, algunas hormonas y muchas protenas que desempean una funcin de
transporte, tales como las seroalbmina y la hemoglobina.
Algunas protenas se hallan situadas entre los dos tipos, fibroso y globular, debido a sus
largas estructuras cilndricas y a su solubilidad en soluciones acuosas salinas. Se
encuentran entre ellas la miosina, elemento estructural importante del msculo y el
fibringeno, precursor de la fibrina, elemento estructural de los cogulos sanguneos.
100
Figura 2.18. Relacin entre los cuatro niveles de la estructura proteica: (a) estructura
primaria o covalente, (b) estructura secundaria, (c) estructura terciaria,
(d) estructura cuaternaria
104
Figura 2.19. Esquemas de las estructuras de algunas protenas. (a) mioglobina, (b)
hemoglobina, (c) virus de la poliomielitis, (d) virus del mosaico del tabaco
2.5.3.3 Propiedades de las protenas.
Son sustancias anfteras. Se comportan como cidos y como bases.
El pHI (q = 0) es caracterstico de una protena dada (Tabla 2.10). Depende del nmero,
tipo y distribucin de los grupos cidos y bsicos de la molcula. Cuando una protena
tiene una proporcin mayor de aminocidos bsicos presenta pHI alto; cuando la tiene
menor, su pHI es bajo.
La solubilidad de las protenas depende del pH. Son menos solubles a su pHI a este pH
tienden a aglutinarse (coagularse) y precipitan de la solucin.
Tabla 2.10. pHI de algunas protenas
______________________________
Protena
pHI
______________________________
Pepsina
< 1,1
Pepsingeno
3,7
Casena
4,6
Albmina de huevo
4,7
Albmina de suero
4,8
Ureasa
5,0
Insulina
5,3
Fibringeno
5,5
Catalasa
5,6
Hemoglobina
6,8
Ribonucleasa
9,5
Citocromo c
10,0
Lisozima
11,0
________________________________
105
2.5.3.4 Desnaturalizacin de las protenas. Se define como todo cambio que altere la
configuracin tridimensional nica de una molcula de protena, sin causar una ruptura
simultnea de los enlaces peptdicos. Junto con la destruccin de la estructura cuaternaria
(si existe), terciaria y secundaria, tienen lugar cambios drsticos en la naturaleza fsica y
bioqumica de la molcula. Entre las causas de la desnaturalizacin estn factores fsicos
(calor, congelacin y radiacin ultravioleta); qumicos (oxidacin, reduccin, disolventes
orgnicos, iones metlicos, fuerza inica y pH) o biolgicos (protelisis, modificacin y
degradacin enzimtica). Entre los disolventes orgnicos y los iones metlicos pesados que
causan la desnaturalizacin de las protenas, estn el etanol e isopropanol y el Hg+2, Ag+ y
Pb+2, respectivamente. Los reactivos para alcaloides (cido pcrico y tnico), causan
tambin la desnaturalizaci. Algunos de los efectos de la desnaturalizacin son: el
descenso de la solubilidad, modificacin de la capacidad de fijacin de agua, prdidas de
actividad biolgica (enzimtica, inmunolgica), incremento de la susceptibilidad al ataque
por las proteasas a causa del desenmascaramiento de los enlaces peptdicos, incremento de
la viscosidad (Medina, 1995), (Plou et al., 1999), (Viguera, 2003).
2.5.3.5 Biomembranas. Todas las clulas biolgicas se hallan rodeadas de una capa
limtrofe denominada membrana plasmtica. Los organelos de las clulas eucariticas,
como el ncleo las mitocondrias y los cloroplastos tienen su propio sistemas de membranas
con estructura y funcin semejante a las de las membranas plasmticas.
Papel biolgico de las membranas. Como barrera fsica, la membrana proporciona
integridad estructural a la clula, dndole su aspecto y forma, empaquetando literalmente
los componentes celulares. Su estructura es la responsable de la organizacin y separacin
en compartimientos de las actividades bioqumicas que suceden dentro de los tejidos y las
clulas. Sin embargo, como una clula no puede vivir en un estado totalmente aislado, la
membrana tambin debe actuar como un filtro de selectividad dejando entrar a los
nutrientes necesarios para su crecimiento y desarrollo, y permitiendo que salgan los
productos de desecho. La clula tambin debe comunicarse con el medio que la rodea.
Insertadas en el lado externo de las membranas plasmticas estn las protenas receptoras
que unen hormonas como la adrenalina y la insulina, donde transmiten una seal qumica
que regula los procesos metablicos del interior de la clula. En esta forma, los estmulos
qumicos del lado externo de la clula pueden influir en la bioqumica intracelular.
Por ltimo, algunas membranas especializadas contienen ensamblados proteicos que actan
como sistemas de transduccin de energa. Las membranas mitocondriales contienen
enzimas y otras protenas que convierten la energa liberada por la oxidacin de grasas y
carbohidratos a la forma qumica de ATP. En los organismos fotosintticos, la energa
luminosa es atrapada por pigmentos y transformada en energa qumica por protenas de las
membranas de los cloroplastos.
Componentes y estructura de la membrana. Las biomembranas son ensamblados
supramoleculares de lpidos, protenas y carbohidratos.
La proporcin de estos
componentes vara segn la fuente de la membrana. Cada tipo de clula y organelo tienen
funciones particulares que dependen de las propiedades de las membranas. La diversidad
en la composicin de la membrana puede dar lugar a que sta desempee funciones muy
106
Lpidos (%)
Protenas (%)
Mielina
80
18
Hgado de ratn
52
45
Extracto humano (plasma)
43
49
Hojas de maz
45
47
Mitocondria (externa)
48
52
Mitocondria (interna)
24
76
Excherichia coli
25
75
_________________________________________________________________________
La proporcin de protena a lpido puede ir desde 80:20 hasta 20:80. Las membranas
poseen muchas caractersticas comunes a pesar de su composicin tan variada. En ellas no
existen carbohidratos libres, estn unidos covalentemente con las molculas de lpidos y
protenas. El contenido de carbohidratos, normalmente es de 5 % o menos y esta
representado en los glucolpidos y las glucoprotenas. Entre los principales estn la
galactosa, manosa, L-fucosa, glucosa, glucosamina, galactosamina y cido silico. Las
colas de carbohidrato desempean funciones importantes como sitios de reconocimiento
celular.
La estructura general de la mayora de las membranas biolgicas consta de una bicapa
lipdica constituida por fosfolpidos; que se mantiene unida mediante interacciones
hidrofbicas, no covalentes. La parte hidrofbica del fosfolpido apunta hacia el interior,
mientras que las porciones hidroflicas son las expuestas a la fase acuosa. En esta bicapa
lipdica existen protenas parcial o totalmente embebidas. Las principales protenas poseen
una regin altamente hidrofbica que es la que interacciona con las zonas muy apolares de
las cadenas de cidos grasos. Algunas de estas atraviesan las membranas y ejercen dominio
tanto en el interior como en el exterior de esta estructura. La estructura global de la
membrana plasmtica se estabiliza mediante el establecimiento de puentes de hidrgeno y
de interacciones hidrofbicas. Adems, cationes como el Mg+2 y el Ca+2 tambin
contribuyen a la estabilizacin de la membrana a travs de las interacciones inicas con los
grupos polares de carga negativa presentes en los fosfolpidos (Lehninger, 1995).
Las propiedades dinmicas de la membrana celular, las llevan a cabo las protenas de la
membrana. Dichas protenas son de distintos tipos funcionales, incluidas las enzimas, las
protenas receptoras y las protenas de transporte. Las protenas de la membrana pueden
clasificarse en dos categoras: protenas extrnsecas o perifricas que se hallan unidas a
la superficie de la membrana; son relativamente polares y muy solubles en agua. Las
protenas intrnsecas o integrales, que constituyen el 70 % o ms de la protena total de la
membrana, estn unidas muy fuertemente a la porcin lipdica; siendo insolubles en
107
sistemas acuosos neutros. Estas solo pueden liberarse rompiendo la bicapa lipdica e
interfiriendo con las interacciones hidrfobas que existen entre protenas y lpidos.
Las protenas perifricas normalmente se encuentran normalmente unidas por interacciones
inicas, no covalentes y por puentes de hidrgeno entre sus residuos de aminocido y
residuos de aminocidos complementarios de las protenas integrales que estn expuestas
sobre la superficie de la membrana. La mayor parte de las protenas perifricas
probablemente funcionan como receptoras y enzimas. Las protenas integrales contienen
grandes porciones de residuos de aminocidos hidrfobos que les permiten ocultarse en la
regin no polar de la bicapa de lpido. Como estas protenas, por lo general, atraviesan la
membrana, funcionan principalmente como protenas de transporte, facilitando el paso de
molculas de soluto desde un lado de la membrana hacia otro. La membrana mitocondrial
interna es una de las ms complejas; contiene aproximadamente 100 clases diferentes de
cadenas polipeptdicas (Lehninger, 1995), (Cavarrubias et al., 2002).
Se han propuestos varios modelos de estructura de membrana. La evidencia dada por los
experimentos apoya el modelo de mosaico fluido, el cual afirma que los fosfolpidos de las
membranas se hallan ordenados en bicapas formando una matriz o nima fluida de cristales
lquidos, en la que penetran las protenas globulares parcial o completamente (Figura 2.20).
En esta bicapa, las molculas lipdicas individuales pueden moverse lateralmente, dotando
a la bicapa de fluidez, flexibilidad y adems de una resistencia elctrica elevada y de
relativa permeabilidad respecto a las molculas muy polares. El modelo de mosaico fluido
postula que las protenas de la membrana son globulares, para interpretar su alto contenido
en hlice . Algunas de las protenas incrustadas estn en la superficie (protenas
perifricas) y otras atravesando la bicapa completa (protenas integrales). Este modelo
propone que existe un contacto ntimo entre lpidos y protenas. Las protenas flotan con
cierta libertada dentro y sobre la bicapa, creando un patrn de mosaico fluido.
Figura 2.20. Modelo de mosaico fluido de las membranas biolgicas. Este modelo se
compone de una bicapa de lpido en la que estn insertadas protenas integrales
y perifricas. Los lpidos proporcionan el armazn estructural y las protenas
funcionan como enzimas o como protenas de transporte
108
Las propiedades dinmicas de transporte tambin pueden explicarse con este modelo. Las
molculas no polares, posiblemente difunden a travs de la membrana por la naturaleza
hidrfoba de la regin central. Las molculas polares, hidroflicas, deben ser transportadas
con ayuda de protenas especficas localizadas en la membrana.
109
6.1.3 Nucletidos. Son steres fosfato de los nuclesidos. Constituyen las subunidades
fundamentales de los cidos nucleicos. Los ribonucletidos y los desoxirribonucletidos
se encuentran libres en las clulas en cantidades significativas. Los nucletidos ms
abundantes contienen fosfato unido mediante enlace ster al grupo 5hidroxilo de la
110
pentosa. Los nucletidos son compuestos bastante cidos debido a los residuos de cido
fosfrico. En el pH fisiolgico, todos los protones estn disociados de los grupos fosfato,
generando compuestos con varias cargas negativas. Los nucletidos celulares estn
asociados con iones matlicos como Mg+2 y Mn+2 para neutralizar sus cargas. Todos los
rinonuclesidos y desoxirribonuclesidos corrientes aparecen en las clulas no solamente
en forma de 5-monofosfato, sino tambin en forma de 5-difosfatos y 5-trifosfatos
(Tabla 2.12).
Tabla 2.12. Abreviatura de los ribonuclesidos y desoxirribonuclesidos 5-fosfatos
Ribonuclesidos 5-fosfatos
Desoxirribonuclesidos 5-fosfatos
Base
MonoDiTriMonoDiTri_________________________________________________________________________
Adenina
AMP
ADP
ATP
dAMP
dADP
dATP
Guanina
GMP
GDP
GTP
dGMP
dGDP
dGTP
Citosina
CMP
CDP
CTP
dCMP
dCDP
dCTP
Timina
UMP
UDP
UTP
dUMP
dUDP
dUTP
_________________________________________________________________________
111
Los nucleotidos sirven como sillares de los cidos nucleicos, pero tambin desempean
otras funciones. El ATP es el principal transportador de energa qumica en la clula; la
interconversin de ADP y ATP esta ligada a la transferencia de energa en el metabolismo:
ATP + H2O ADP + Pi + energa
Pi = HPO4-2
La mayora del ADN celular se compone de dos hebras de polinucletido plegadas en una
doble hlice (doble filamento). La doble hlice es estabilizada por dos tipos de fuerzas:
puentes de hidrgeno entre bases complementarias de hebras opuestas e interacciones
hidrfobas y de van der Waals.
Figura 2.21. Estructura qumica parcial del ADN (a) y del ARN (b).
113
Los dos filamentos se encuentran orientados uno frente a otro en tal forma que las bases
nitrogenadas que se proyectan de cada uno quedan muy cercanas entre s y dirigidas hacia
el interior de la doble hlice para proporcionar un medio hidrfobo. Los nucletidos de
adenina y de timina pueden emparejarse estructuralmente, de manera que se establece un
nmero mximo de dos enlaces de hidrgeno entre estas dos bases. Los de citosina y
guanina pueden arreglarse espacialmente mediante la integracin de tres enlaces de
hidrgeno.
Estos enlaces hidrgeno intramoleculares explican la estructura secundaria del ADN y
constituyen la fuerza fundamental que mantiene unidos a los dos filamentos de la molcula.
Las porciones hidrfilas constituidas por la desoxirribosa y las cargas negativas de los
oxgenos de los grupos fosfatos se presentan en el exterior de la doble hlice, lo cual facilita
la interaccin con el agua.
La proporcin cuantitativa de las bases en una macromolcula se adapta en ocasiones a las
denominadas reglas de Chargaff, tales reglas se enuncian a continuacin (Hicks, 2001):
La composicin de las bases del ADN generalmente vara de una especie a otra.
Las muestras del ADN aisladas de los diferentes tejidos de una misma especie se
componen de las mismas bases.
La composicin de las bases del ADN en una especie no cambia con la edad, el estado
de nutricin o las modificaciones ambientales.
En todos los ADN de diferentes especies el nmero de los residuos de adenina es igual
al nmero de los residuos de timina (A = T) y el nmero de residuos de guanina es igual al
nmero de citosinas (G = C); por ende A + G = T + C
Las composiciones bsicas que se conocen varan notablemente de un organismo a otro.
Esto se expresa claramente mediante lo que se conoce como relacin disimtrica (A +
T)/(G + C). En otras palabras, la composicin bsica distinta entre los organismos se
refleja en la variacin de su relacin disimtrica. Los organismos ntimamente
relacionados suelen tener composiciones bsicas semejantes y, por tanto, los valores de sus
relaciones disimtricas son muy parecidos.
Watson y Crick postularon un modelo semiconservador de duplicacin de la molcula de
ADN. Pensaron que durante la duplicacin del ADN (que probablemente ocurre durante la
interfase de la mitosis), los dos filamentos se desenrollan y cada filamento acta como
molde para la formacin de un nuevo filamento complementario. Los trifosfatos de
desoxinuclesido, que probablemente existen en estado libre en el ncleo, de alguna
manera atraen (segn las reglas de apareamiento) al ADN de un solo filamento
desenrollado. En esta forma, se generan dos nuevos filamentos complementarios a los dos
filamentos maternos. Conforme comienza a formarse las nuevas molculas hijas, toma la
configuracin en espiral de la molcula progenitora (Mathews et al., 2002).
114
2.6.3 cido ribonucleico (ARN). Todos los tipos de ARN, sin importar su tamao o
funcin biolgica, son sintetizados como molculas de una sola hebra. Se distingue del
ADN por:
Ms que plegarse en un patrn peridico y uniforme como el ADN, las hebras nicas del
ARN se doblan sobre s mismas y adoptan conformaciones que tienen varios elementos
estructurales distintos, los cuales se encuentran dispersos a lo largo de toda la molcula de
ARN (vueltas en horquilla, doble hlice a la derecha, asas internas y las protuberancias).
Existen tres tipos de ARN, que difieren por su funcin bioqumica, masa molecular y
estructura secundaria.
2.6.3.1 ARN mensajero (ARNm). El ARNm lleva el mensaje gentico del ADN a los
ribosomas, sitios de sntesis proteica. Es complementario a un segmento del ADN. Al
parecer, todos los ARN son sintetizados in vivo mediante un mecanismo de molde, a partir
de una parte de la molcula de ADN. Cada molcula de ARNm, que acarrea el mensaje de
un gen, tiene un tamao definido pero por su inestabilidad existencia transitoria, se conoce
poco acerca de su estructura tridimensional (Boyer, 2000).
2.6.3.2 ARN de transferencia (ARNt). Son los tipos ms pequeos de ARN. Son los
transportadores de aminocidos especficos que van a usarse en la sntesis proteica. Todos
los ARNt contienen entre 74 y 93 nucletidos en una sola cadena. Todos los ARNt tienen
una estructura secundaria y terciaria comn, la tpica forma de hoja de trbol es el patrn
comn. Las caractersticas estructurales incluyen vueltas en horquilla, las regiones doble
helicoidales y las asas (Boyer, 2000).
115
Figura 2.22. La figura de la izquierda corresponde al apareamiento de las bases A-T y G-C
en la doble hlice del ADN. La figura de la derecha corresponde a las
caractersticas generales de las estructuras secundara y terciaria del ARN
2.7 ENZIMAS
Las enzimas son en su gran mayora molculas proteicas, sintetizadas por la clula viva,
que actan como catalizadores biolgicos al permitir que las reacciones qumicas del
metabolismo celular ocurran a una velocidad significativa, en condiciones ambientales
extremadamente suaves compatibles con el mantenimiento de la viabilidad celular (pH
cercano a la neutralidad y temperaturas moderadas). Se ha logrado disear nuevos
catalizadores biolgicos que incluso mejoran el comportamiento de una enzima natural,
como el citocromo P450 (Corma et al., 2003).
2.7.1 Caractersticas de las enzimas como catalizadores. La propiedad fundamental de
una enzima, como cualquier catalizador, es aumentar la velocidad de una reaccin. Sin
embargo, las enzimas se caracterizan por:
Ser los catalizadores ms eficientes. En cantidades micromoleculares aceleran las
reacciones celulares a velocidades extremadamente rpidas. Los catalizadores biolgicos
aceleran entre 106 a 1012 veces la velocidad de las reacciones qumicas, a temperaturas
suaves y presin atmosfrica (Plou et al., 1999).
Ser muy especficas. Catalizan solamente una reaccin o un grupo muy limitado de
ellas que estn muy relacionadas entre s.
Condiciones especficas de reaccin. Las enzimas catalizan sus reacciones a
temperaturas menores a 100 0C y a pHs cercanos a la neutralidad, mientras que los
catalizadores qumicos frecuentemente requieren altas temperaturas y presiones, as como
pHs extremos.
Tener un grupo de reacciones catalizadas extremadamente amplio. Pudindose
catalizar muchas ms reacciones que con los catalizadores qumicos.
Tener su actividad sujeta a regulacin natural. Los mecanismos de este proceso
regulador incluyen: control alostrico, modificacin covalente y variacin en la cantidad de
enzima sintetizada.
Cuando los mecanismos de control se alteran, por ejemplo, de las proteasas, stas se
producen en exceso, a destiempo o donde no procede, apareciendo la artritis, la
aterosclerosis, el cncer y otros procesos patolgicos de similar tenor. Las proteasas
promueven el crecimiento de los tumores y fomentan la formacin de metstasis (Lpez,
2000).
2.7.2 Clasificacin de las enzimas. El primer criterio de clasificacin se basa en el tipo
general de la reaccin qumica en la cual participa la enzima. Las enzimas tienen nombres
oficiales que reflejan las reacciones que catalizan. Cada enzima tiene un nombre oficial
internacional terminado en asa y un nmero de clasificacin que consta de cuatro dgitos,
cada dgito se refiere a una clase y subclase de reaccin. En la Tabla 2.13, se da la resea
parcial de la clasificacin sistemtica de las enzimas (Plou et al., 1999):
118
En funcin de su capacidad intrnseca para ser regulables o no, las enzimas pueden
dividirse en dos grandes grupos (Hicks, 2001):
Enzimas alostricas o regulables. Presentan, adems del sitio activo o isostrico, otros
sitios no catalticos o alostricos, capaces de aceptar molculas interaccionantes que
ejercen un efecto regulador sobre el sitio activo, al modificar las caractersticas
esteroisomricas de la protena y como consecuencia del sitio activo. La regulacin puede
119
120
Aplicacin
Carbohidrolasas
, amilasas
-amilasa
-amilasa
Glucoamilasa
Pectinasa
Celulasa
Lactasa
-galactosidasa
Invertasa
Cereales germinados
Hongo
Bacteria
Moho
Moho
Moho
Moho, levadura
Moho
Levadura
Proteasas
Papaina
Bromelina
Pepsina
Renina
Proteasa fngica
Proteasa alcalina
Vegetal
Vegetal
Animal
Animal, moho
Moho
Bacteria
Otras hidrolasas
Penicilina acilasa
Aminoacilasa
Lipasa
Pancreatinasa
Bacteria
Bacteria
Bacteria, moho
Animal
Farmacutica
Alimentos fortificados
Lctea, panificacin, farmacut.
Oxido-reductasas
Glucosa oxidasa
Catalasa
Moho
Bacteria
Isomerasas
Glucosa isomerasa
Bacteria
Edulcorantes
_________________________________________________________________________
1.
lactato
NAD+
LDH
piruvato
121
NADH2
1.
glucosa
NAD+
GDH
2.
NADH2
DP|ox.
gluconato +
NAD+
NADH2
DP|red.
Detector
Glucosa oxidasa-peroxidasa
Glucosa
Cromforo oxidado Espectrofotmetro
Hexoquinasa-glucosa 6 fosfato
deshidrogenasa
Glucosa
NADH
Espectrofotmetro
Lactato deshidrogenasa
c. lctico
NADH
Espectrofotmetro
Alcohol deshidrogenasa
Etanol
NADPH
Espectrofotmetro
Nitrato reductasa
Nitrato
Azocompuesto
Espectrofotmetro
Ureasa
Urea
CO2
Respirmetro
Luciferasa
ATP
Luz
Luminmetro
Luciferasa bacteriana
NADH
Luz
Luminmetro
_________________________________________________________________________
Inclusin de la enzima como parte integral del aparato analtico. Electrodo
enzimtico. Esta compuesto bsicamente de un sensor electroqumico y una enzima
inmovilizada en la proximidad de la superficie sensible del sensor. El sensor
electroqumico, que puede ser un electrodo convencional o de ion selectivo, tiene en su
parte inferior una membrana permeable a la sustancia a detectar por el elemento sensor;
bajo esta membrana se ubica la enzima inmovilizada, la cual esta a su vez contenida
mediante una segunda membrana que la separa del medio de anlisis. El sustrato a analizar
difunde a travs de la membrana exterior protectora hasta la enzima inmovilizada,
reacciona, y el producto a su vez difunde a travs de la membrana interior selectiva hasta el
elemento detector (Figura 2.23).
Los detectores basales empleados en la fabricacin de electrodos enzimticos pueden ser
amperomtricos (polarogrficos y galvnicos) o potenciomtricos.
Los electrodos
enzimticos permiten a partir de un electrodo convencional o de ion selectivo la
122
En la
Figura 2.23. Esquema de un electrodo enzimtico. (1) sensor electroqumico, (2) sello,
(3) membrana interior selectiva, (4) enzima inmovilizada, (5) membrana
exterior protectora.
Tabla 2.16.
Electrodos enzimticos
Enzima
Sustrato
analizado
Glucosa oxidasa
Alcohol oxidasa
Ureasa
Uricasa
Penicilinasa
Amino cido oxidasa
Colesterol oxidasa
Glucosa
Etanol
Urea
cido rico
Penicilina
Aminocidos
Colesterol
Compuesto
detectado
O2
H2O2
NH4+
CO2
H+
O2
O2
Tipo de electrodo
base
O2 disuelto, Pt-Ag
Pt-Ag
Ion selectivo
pCO2
pH
O2 disuelto, Pt-Ag
O2 disuelto, Pt-Ag
Pancreatina
Pepsina
Amilasa
Papaina
Celulasa
Lipasa
Tripsina
-quimotripsina
Bromelina
Peptidasa
Dextranasa
Estreptoquinasa
Uroquinasa
Colagenasa
Lisozima
Origen
Funcin
Pncreas porcino
Mucosa estomacal porcina
Aspergillus sp.
Carica papaya
Aspergillus sp.
Pncreas porcino
Pncreas bovino
Ayuda-digestiva
Ayuda-digestiva
Ayuda-digestiva
Ayuda-digestiva
Ayuda-digestiva
Ayuda-digestiva
Antinflamatorio
Antibronquitis
Ananas comosus
Antinflamatorio
Serratia sp.
Antinflamatorio
Penicillium funiculosum
Tratamiento caries
Estreptococcus sp.
Agente tromboltico
Orina
Agente tromboltico
Clostridium hystolyticum
Tratamiento quemaduras
Clara de huevo
Oftalmologa,
potenciador de antibiotic.
_________________________________________________________________________
Aplicaciones extracorpreas (ex-vivo) En este tipo de sistemas el torrente sanguneo
del paciente es derivado hacia un circuito externo a travs de un reactor enzimtico, en el
que se logra el efecto deseado. Este tipo de aplicacin es til para la remocin selectiva de
metabolitos txicos y de nutrientes de clulas malignas. Los casos ms estudiados son la
eliminacin de urea mediante ureasa inmovilizada (rin artificial enzimtico) y de
asparagina mediante asparaginasa inmovilizada. Otros casos de importancia se indican en
la Tabla 2.18.
Tabla 2.18. Aplicaciones de enzimas en forma extracorprea
Enzima
Enfermedad
Tipo de reactor enzimtico
_________________________________________________________________________
-galactosidasa
Arginasa
Bilirrubina oxidasa
Mal de Fabry
Hiperargininemia
Ictericia
124
Heparinasa
Remocin heparina
Empacado con sefarosa
Enzimas microsomales
Falla heptica
Empacado con agarosa
alanina amonio liasa
Fenilcetonuria
Fibra hueca
UDP glucuronil transferasa
Falla heptica
Empacado con agarosa
Aplicaciones intracrporeas (in vivo). Presenta problemas por la respuesta del
sistema inmunolgico del paciente y la accin de proteasas endgenas. La administracin
intracorprea
puede hacerse a nivel subcutneo, intramuscular, gastrointestinal,
intraperitoneal, intravenoso o intraarterial.
Se utilizan eritrocitos vaciados o liposomas como soporte. En ambos las enzimas son
encapsuladas e inyectadas al torrente sanguneo. En la Tabla 2.19 se indican algunos
ejemplos representativos de este tipo de aplicaciones.
Tabla 2.19. Aplicaciones de enzimas en forma intracorprea
_________________________________________________________________________
Enzima
Enfermedad
-glucosidasa
Arginasa
Asparaginasa
- glucuronidasa
Catalasa
Fibrinolisina
Proteasa bacteriana
alanina amonio liasa
Uricasa
Uroquinasa
Glicogenosis
Hiperargininema
Cncer
Mucopolisacaridosis
Acatalasemia
Trombosis
Cistitis
Fenilcetonuria
Gota
Trombosis
Soporte
Albumina
Polietilenglicol
Poliacrilamida, liposomas
Eritrocitos vaciados
Colodin
Sephadex
Aminoetilcelulosa
Polietilenglicol
Polietilenglicol
Agarosa
125
128
Ecuacin 1
v = -dCoE/dt = dCoE/dt
B
X
C
Y
v = dP/dt = dZ/dt
129
130
La enorme variedad de vas metablicas (y, por tanto, de enzimas) que existen, no
slo en el mundo de los microorganismos en general, sino incluso dentro de una sola
especie.
El acumular las plantas superiores productos de desecho en las vacuolas, los cuales
son frecuentemente inhibidores enzimticos y txicos.
131
Entre las propiedades a tener en cuenta en las operaciones de separacin estn: la densidad,
el tamao y la compresibilidad de las clulas; la naturaleza del caldo; el pH y la
temperatura. En muchos casos puede ser mejorada la separacin por: la adicin de
facilitadores de la filtracin y de agentes floculantes, variacin del pH, uso de coloides con
carga contraria, uso de enzimas clarificantes, eleccin de una cepa ms fcil de separar y
control de las condiciones de fermentacin. Los mtodos de separacin de slidos en
suspensin se clasifican de acuerdo con el tipo de fenmeno en que se basan:
Digestin enzimtica.
pero si se optimizan las condiciones de operacin sirve como tcnica de purificacin. Entre
los agentes de precipitacin estn:
Sales inorgnicas disociables. Debido a su gran solubilidad las sales que se usan son el
cloruro sdico, sulfato sdico, acetato clcico, cloruro de potasio y el sulfato amnico.
Siendo este ltimo el ms comn, en razn de su bajo costo, alta solubilidad, inocuidad
para la mayor parte de las enzimas y efecto estabilizante en ciertos casos.
El fenmeno de precipitacin por alta fuerza inica (salado), se ha explicado por efecto de
solvatacin de iones, que limitan el agua disponible, rebajando su concentracin por debajo
del lmite de solubilidad de la enzima. La precipitacin de una enzima se ve ayudada, si se
encuentra en su punto isoelctrico.
Por lo general las molculas de mayor peso molecular se precipitan primero, aunque esto
tambin depende de su carga electrosttica y del pH de la solucin. La cintica de
precipitacin por fuerza inica es rpida, alcanzndose el equilibrio a los pocos segundos
de contactar la solucin enzimtica con la sal. El tamao de partcula es muy pequeo lo
que obliga al uso de altas fuerzas centrfugas, para la recuperacin de precipitados.
Solventes orgnicos.
Cuando se van aadiendo cantidades crecientes de solventes
orgnicos (metanol, etanol, isopropanol, cetona, eter etlico), las molculas de protena
interaccionan ms con otras molculas de protena que con el agua. La formacin de
complejos entre molculas de protena de distinta carga, contina hasta que se alcanza el
punto en el que la protena precipita, debido al decrecimiento de la constante dieltrica y
por tanto al aumento de las fuerzas atractivas electrostticas entre las molculas de protena
de distinta carga. Se debe trabajar a temperaturas por debajo de 0 0C para evitar la
desnaturalizacin.
Polmeros cargados de alto peso molecular. Para el fraccionamiento de la protena
pueden utilizarse polmeros solubles en agua, entre los que se destaca el polietilenglicol,
por ser el ms usado, no ser txico, ni inflamable y que no desnaturaliza las protenas. A
diferencia de los solventes posee en efecto estabilizador, por lo que puede utilizarse a
temperatura ambiente. Es eficaz a concentraciones relativamente bajas (6-12 %). La
solubilidad de la protena, en presencia del polietilenglicol, se afecta por el pH, la fuerza
inica y la temperatura. Se usan adems, polmeros como el cetavin, el sulfato de
protamina, el DEAE-dextrano, entre otros.
Ultrafiltracin y smosis inversa. Aunque sea considerada como tcnica de
concentracin, constituye tambin un mtodo vlido de purificacin. Utiliza las diferencias
existentes entre los pesos moleculares (tamao) de las protenas deseadas y las no deseadas.
En la ultrafiltracin las molculas se fuerzan a pasar, mediante presin a travs de una
membrana de tamao pequeo (peso molecular entre 500 y 300 000). La smosis inversa
es un proceso de ultrafiltracin que utiliza membranas con poros suficientemente pequeos
(peso molecular lmite 250) para que permita el paso de las molculas de solvente.
Hay dos tipos de ultrafiltro, el ultrafiltro microporoso y el de difusin. El primero es
similar a un filtro convencional, esto es la membrana es rgida, con una serie de orificios al
136
azar extremadamente pequeos que la atraviesan, cuyo tamao medio oscila entre 500 y
5000 0A. Las molculas muy pequeas atraviesan la membrana, mientras que las grandes
quedan retenidas en la superficie del filtro. Las molculas de tamao intermedio quedan
retinadas en la estructura y terminan por obstruir los poros. Por esta razn los filtros
microporosos han sido desplazados por los filtros difusores.
El ultrafiltro de difusin es en esencia una membrana de gel hidrfila homognea a travs
de la cual los solventes y solutos son transportados por difusin molecular bajo la accin de
un gradiente de concentracin o de actividad. De esta manera el transporte de una molcula
a travs de una membrana requiere de energa cintica y transcurre ms fcilmente a
temperaturas ms elevadas. Una membrana fcilmente permeable se hidrata rpidamente y
debe estar constituida por un polmero que posea una afinidad especfica elevada por el
solvente. Por el contrario, una membrana rgida, relativamente poco hidratada, tiene una
baja permeabilidad, en particular en aquellas ocasiones en las que exista una baja afinidad
entre el polmero de la membrana y el disolvente.
La ultrafiltracin es un mtodo, especialmente til para el trabajo con enzimas, debido a
que:
Es una tcnica suave y no destructiva (aunque algunas molculas grandes pueden sufrir
roturas).
A temperatura de operacin baja se evitan las prdidas en la actividad y se minimiza la
autodigestin.
Es econmico.
operaciones secuenciales, el rendimiento global puede resultar bastante bajo. Por ello, la
tendencia actual es el desarrollo de operaciones de purificacin suficientemente poderosas
que permitan incrementos de pureza apreciables.
Particin bifsica. Es una tcnica desarrollada con base en el fenmeno de
incompatibilidad de polmeros, que consiste en que soluciones de dos polmeros(por
ejemplo, polietilenglicol y dextrano) o de un polmero y una sal (ejemplo de las sales,
fosfato de potasio, sulfato amnico) forman en determinados intervalos de concentraciones,
dos fases inmiscibles. Ambas fases son acuosas por lo que, al fraccionarse las protenas
entre ellas, no se produce desnaturalizacin, por el contrario los polmeros frecuentemente
ejercen un efecto protector sobre la enzima.
La fase en la que se localice una determinada protena depende de su propio peso
molecular, del peso molecular y concentracin de los polmeros, temperatura, pH y
fuerza inica. La particin es ms efectiva mientras mayor sea el peso molecular. La
distribucin de la protena entre ambas fases, est gobernada por su coeficiente
caracterstico de particin (K). La extraccin puede llevarse a cabo en una sola etapa, o en
mltiples etapas, con flujo en paralelo o en contracorriente. La separacin entre la enzima
y el polmero, se puede lograr por dilisis o ultrafiltracin, por precipitacin con sales, entre
otros.
Utilizacin de membranas. Se basa en la capacidad de algunas membranas
polimricas de discriminar entre molculas segn su tamao y/o composicin qumica. Es
necesario tener un gradiente que dirija el cambio molecular:
comerciales.
La etapa de
las condiciones.
Se logra una distribucin uniforme de la enzima por todo el reactor.
Se mejora el rendimiento y la calidad del producto.
El estado de oxidacin del material del soporte. Superficies redox pueden ser utilizadas
para estabilizar enzimas redox (soporte de titanio para la papana)
2.7.6.3.3 Tcnicas de inmovilizacin de enzimas. Cuando la enzima es sometida al
proceso de inmovilizacin, debe permanecer inalterada su secuencia de aminocidos en el
sitio activo y su estructura terciaria. Es necesario realizar el proceso bajo condiciones muy
controladas y moderadas. Deben evitarse las altas temperaturas, los tratamientos cidos y
alcalinos, las altas concentraciones de sal, entre otros.
La clasificacin de los mtodos de inmovilizacin se basa en el tipo de interaccin
responsable de la inmovilizacin y la naturaleza del soporte:
Atrapamiento. Se basa en la localizacin de una enzima dentro de la red espacial de
una matriz polimrica o dentro de una membrana de forma que se evite la liberacin de la
enzima, sin impedir la penetracin del sustrato. Se requiere que las molculas del sustrato
y del producto sean relativamente pequeas.
Puesto que la enzima no esta unida de ninguna forma al gel o a la membrana, este mtodo
puede aplicarse ms generalmente que cualquier otro para el atrapamiento de enzimas,
independiente de sus propiedades y con poca prdida de la actividad biolgica.
Atrapamiento en geles. Se basa en la localizacin de las enzimas dentro de los espacios
intersticiales de geles polimricas entrecruzadas, insolubles en agua. Para la formacin del
gel, se disuelve la enzima en la solucin del precursor del polmero y se activa la
polimerizacin; el gel resultante puede dispersarse mecnicamente en partculas del tamao
deseado.
Dos tipos de polmeros han sido preferentemente usados, por un lado geles como la
poliacrilamida y similares y por otro, los geles derivados de materiales naturales como
triacetato de celulosa, agar gelatina, carrageno o alginato, almidn, etc.
143
DEAE, TEAE y ECTEOLA, mientras que los cambiadores catinicos ms utilizados son
derivados de CM.
Quelacin o unin metlica. Implica el uso de metales de transicin como una forma de
activar la superficie del soporte, permitiendo el acoplamiento directo de la enzima, sin
previa transformacin qumica del soporte, a travs de la formacin de quelatos. El grado
de estabilidad operacional es elevado.
Se puede producir desorcin cuando el
almacenamiento se prolonga mucho.
Entre los soportes utilizados estn el vidrio, la quitina, la celita, el cido algnico, la
gelatina, la celulosa, entre otros. Tambin se pueden obtener hidrxidos u xidos
hidratados de los metales de transicin (titanio (III), titanio (IV) y zirconio (IV))
Enlace covalente. Se basa en la unin covalente de la enzima a la matriz insoluble en
agua. Implica una reaccin de preparacin del soporte y luego una reaccin de
acoplamiento entre el soporte y la enzima. Presenta unas condiciones de inmovilizacin
ms complicadas y menos suaves. Generalmente, no lixivian la enzima a la solucin, en
presencia de sustrato o de soluciones de alta concentracin inica. Los enlaces covalentes
deben implicar slo a grupos funcionales de la enzima, que no sean esenciales para la
accin cataltica.
Se puede emplear cualquier material polimrico. El polmero puede ser fabricado de forma
que lleve las cargas que se desean, tanto en cantidad como en signo. Se puede inmovilizar
prcticamente cualquier enzima. Las molculas de sustrato tienen fcil acceso a las
molculas de enzima. Es imposible obtener clulas inmovilizadas aunque s enzimas no
purificadas.
Entrecruzamiento. Consiste en unir las molculas entre s mediante enlaces
covalentes, por medio de reactivos bi-o multifuncionales, con la posibilidad de incluir una
protena inerte, formando agregados tridimensionales entrecruzados, totalmente insolubles
en agua, pero que no necesitan el uso de soportes adicionales.
Constituye realmente una prolongacin de la tcnica de enlace covalente, bsicamente con
las mismas ventajas e inconvenientes. El reactivo bifuncional ms comnmente empleado
es el glutaraldehido. Algunas enzimas inmovilizadas por esta tcnica son capaces de
resistir condiciones extremas de pH y temperatura. Se necesitan altas cantidades de
enzima.
Para poder utilizar una enzima en su estado soluble se han diseado mtodos fsicos de
confinamiento que usan membranas semipermeables, fibras huecas o membranas de
ultrafiltracin.
Inmovilizacin sin modificacin qumica de la enzima. Se utiliza una membrana
impermeable a las molculas de enzima y permeable al producto y en algunos casos a las
molculas de sustrato.
145
E + S
k1
k-1
dP/dt
ES
k3
= k3 [ES]
k-1 + k3
= _________
k1
Km
[E]
= [ET] - [ES]
[ET] [S]
[ES] = __________
Km + [S]
k3 [ET] [S]
v = ___________
Km + [S]
Si se considera el caso en que: [ET] = [ES]
vmax [S]
= __________
Km + [S]
vmax = k3 [ET]
vmax
_____
Km
1
____
Km
[P]t
____
t
ln
vmax,1
k3,2 [ET]
______ = ________
vmax,2
k3,1 [ET]
E
= ___
R
T1 - T2
( __________ )
T1 T2
de tal forma que la temperatura ptima de reaccin debe ser el resultado del compromiso
entre estos dos efectos. La mayor parte de las enzimas presentan su actividad ptima en el
intervalo de 30 40 0C y, por encima de 45 0C, comienzan a desnaturalizarse.
2.7.7.4 Inhibicin de las enzimas. Los inhibiores reducen la velocidad de una reaccin
enzimtica. En muchos casos el producto de una reaccin enzimtica es un inhibidor. La
inhibicin debe minimizarse para que la actividad de la enzima que cataliza la reaccin sea
mxima. Se conocen cuatro tipos de inhibicin:
2.7.7.4.1 Inhibicin irreversible. Tiene lugar cuando la molcula del inhibidor se
combina irreversiblemente con la de la enzima, modificando qumicamente su estructura
(formando un complejo estable) y anulando o reduciendo bastante su actividad. Un
compuesto que forme un enlace covalente con un grupo en el sitio activo, puede causar este
tipo de inhibicin. Por ejemplo, Pb y Hg que reaccionan con los grupos SH del centro
activo de la enzima.
k1
k-1
k4
ES
k3
EI
v = dP/dt = k3 [ES]
[ET] = [ES] + [EI] + [E]
Km =
vmax [S]
___________
Km + [S]
donde
149
E +
k1
k-1
ES
k3
+
I
k2
k-2
EI
Encontrndose que:
1
___
v
[I]
Km
1
= ( 1 + ____ ) ( _____ ) ____
Ki
vmax
[S]
1
+ _____
vmax
Ki = k-2 / k2
E + S
k1
k-1
ES
+
I
k3
+
I
k-2
k2
k4
EI
k-4
EIS
[I]
Km 1
= ( 1 + ___ ) ____ ___
Ki
vmax [S]
[I]
1
+ ( 1 + ___ ) ____
Ki
vmax
k1
k-1
ES
+
k3
E
151
I
k2
k-2
EIS
Encontrndose que:
1
___
v
[I]
1
( 1 + ____ ) ___
Ki
vmax
Km
____
vmax
1
____
[S]
152
3.1 TAXONOMA
La taxonoma es la ciencia de la clasificacin de los organismos y est constituida por dos
subdisciplinas principales, la identificacin y la nomenclatura.
El sistema de
clasificacin biolgica esta basado en una jerarqua taxonmica u ordenamiento en grupos
o categoras. En microbiologa la unidad taxonmica bsica es la especie; la cual esta
constituida por un grupo de organismos (microorganismos) estrechamente relacionados, en
los que los individuos del grupo son iguales en el mayor nmero de caractersticas. Los
grupos de especies se renen en gneros. Por analoga a las especies, un gnero puede
definirse como una coleccin de especies distintas que comparten las propiedades
principales que definen dicho gnero pero difieren entre s por la presencia o ausencia de
otros caracteres normalmente menos significativos. Aunque los gneros se agrupan en
familias, las familias en rdenes, los rdenes en divisiones, etc., hasta alcanzar el nivel
taxonmico ms alto, que es el dominio, la familia es el taxn superior que se emplea de
manera rutinaria en estudios taxonmicos de procariotas.
155
Figura 3.1 (A) Con un palillo se hace un anillo de vaselina en torno a la depresin que hay
en el portaobjetos. (B) Se pone un poco de suspensin microbiana en el centro
de un cubreobjetos. (C) Se invierte el cubreobjetos y se pone sobre la depresin
del portaobjetos.
3.2.2.2 Tcnicas de tincin. Con el objeto de incrementar el contraste y facilitar la
observacin de la muestra en microscopia de campo claro, se puede utilizar colorantes. Los
colorantes son compuestos orgnicos y cada tipo de colorante puede tener afinidad por
determinadas estructuras celulares. Muchos de los colorantes utilizados estn cargados
positivamente (catinicos) y se combinan fuertemente con componentes celulares cargados
negativamente, como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Entre los colorantes
catinicos se pueden citar el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina.
Se han desarrollado procedimientos de tincin para: observar mejor el aspecto morfolgico,
identificar partes estructurales y ayudar a identificar y/o diferenciar organismos similares.
Las tinciones ms simples se realizan sobre muestras presecadas. Se coloca un frotis o una
fina pelcula de la muestra sobre un portaobjeto de vidrio. La fijacin del frotis sobre el
portaobjetos se logra mediante calentamiento, el cual hace que los microorganismos se
peguen al portaobjetos. Sobre el portaobjetos con la suspensin seca de microorganismos se
derrama una pequea cantidad de una solucin diluida del colorante, y se mantiene el
contacto durante uno o dos minutos, se lava varias veces con agua y se seca. Este tipo de
preparacin suele observarse con un objetivo de inmersin.
La aplicacin de un solo colorante se conoce como tincin simple y la de una serie de
soluciones de colorantes o reactivos se denomina tincin diferencial. La tincin
diferencial no tie de manera homognea a todos los tipos de clulas. La ms importante
tincin diferencial utilizada en microbiologa se denomina tincin de Gram. Dependiendo
del resultado de esta tincin, las bacterias pueden dividirse en dos grandes grupos: Gram
positivas y Gram negativas. Adems, se tienen las tinciones diferenciales: cido
resistente, Giemsa, de esporas, de cpsulas, de flagelos, entre otras. En la tincin de Gram
se dan los siguientes pasos:
Tincin del frotis previamente fijado al calor con cristal violeta (CV) durante 1 minuto.
Todas las clulas se tien de color azul/prpura.
157
despus de su preparacin; casi siempre, mediante calentamiento. Adems, hay que tener
presente que los otros materiales que entren en contacto con el medio de cultivo deben a su
vez estar estriles. Los contaminantes areos constituyen el problema ms comn, ya que
el aire siempre contiene partculas de polvo que generalmente contienen comunidades de
microorganismos. Cuando los recipientes se abren, deben ser manejados de tal modo que el
aire cargado de contaminantes no entre en ellos, con la ayuda de mecheros de alcohol. La
transferencia asptica de un cultivo desde un tubo a otro, por ejemplo, se realiza
normalmente con un asa de cultivo o una aguja, que ha sido previamente esterilizada por
calentamiento a la llama. Los cultivos en los que ha habido crecimiento pueden tambin
ser transferidos a la superficie de placas de medio con agar, donde se forman colonias,
mediante el crecimiento y divisin de clulas aisladas.
Por ejemplo, en el aislamiento de cultivos puros de las bacterias de la boca, se siguen los
siguientes principales pasos:
159
Extensin en placa. Se coloca una gota de inculo en el centro de una placa de petri
con un medio del tipo del agar nutritivo y con un tubo de vidrio doblado se extiende el
inculo sobre la superficie del medio. En algunas placas aparecen colonias aisladas.
3.6 BACTERIAS
3.6.1 Caractersticas morfolgicas. Entre las caractersticas morfolgicas figuran el
tamao, la forma, la estructura y el tipo de agrupacin. Las bacterias ms frecuentemente
estudiadas en la microbiologa miden aproximadamente 0,5 a 1.0 por 2,0 a 5,0 m.
Aunque las bacterias son sumamente diminutas, es posible medir sus dimensiones con
relativa facilidad y precisin. Para este fin, el microscopio se equipa con un micrmetro
ocular, que es un disco que lleva grabadas lneas equidistantes y que permite ver la las
lneas de la regla puestas sobre los microorganismos.
Las clulas individuales son elipsoidales, esfricas, alargadas (cilndricas) o en espiral
(helicoidales). Las clulas bacterianas esfricas o elipsoidales se denominan cocos. Las
clulas cilndricas o alargadas se denominan bacilos. Existen considerables diferencias en
la longitud y la anchura de las varias especies de bacilos. Los extremos de algunos bacilos
son rectangulares, otros redondeados y otros estn afilados o puntiagudos. Las bacterias en
forma de espiral o espirilos se presentan predominantemente como clulas individuales sin
unir.
Ciertas especies de bacterias muestran patrones de ordenamiento de sus clulas tales como
parejas, racimos, cadenas o filamentos. Los cocos presentan varios ordenamientos
(Figura 3.3). Cada uno de estos ordenamientos es caracterstico de una especie en
particular. Existen ordenamientos de los cocos en: diplococos, en los cuales las clulas
permanecen unidas predominantemente en parejas; estreptococos, las clulas permanecen
unidas formando cadenas; tetracocos, las bacterias forman grupos de cuatro clulas;
estafilococos, las bacterias se unen formando racimos de cocos y sarcinas en las cuales se
presenta un ordenamiento cbico de las clulas.
Los bacilos no se ordenan segn una variedad de patrones como los caractersticos de los
cocos. Algunas especies, sin embargo, muestran tendencia a un ordenamiento de sus
clulas (Figura 3.4). El bacilo que causa la difteria tiende a producir agrupamientos de
clulas alineadas lateralmente, denominado ordenamiento en empalizada. Las clulas de
algunas especies acuticas se ordenan segn un modelo de roseta. Las clulas de otras
especies se encuentran en pares (diplobacilos) o en cadenas (estreptobacilos)
163
Figura 3.3. Modelo de ordenamiento de los cocos. (A) Diplococos. (B) Estreptococos.
(C) Tetracocos. (D) Estafilococos. (E) Sarcinas.
Figura 3.4
En las bacterias en espiral, los espirilos, predominan las clulas individuales aisladas. Las
formas espirilares de diferentes especies exhiben notables diferencias en cuanto a su
164
Figura 3.6. Ordenamiento de los flagelos en las bacterias: (A) montrico (B) lofotrico
(C) anfitrico (D) pertrico
puede difundir fcilmente quedando por ello en torno a la pared celular. El glicocliz
bacteriano proporcionan una cubierta protectora, sirven de reservorio de alimento
almacenado y fijan una cantidad considerable de agua (resistencia a la desecacin).
Algunas especies de bacterias, particularmente las de ambientes de aguas dulces (ricas en
materia orgnica) y marinas, estn encerradas dentro de una vaina o tbulo. Las vainas
estn formadas por compuestos metlicos insolubles, tales como xidos frricos y
magnsico precipitados en torno a la clula, como productos de su actividad metablica.
Ciertas bacterias se caracterizan por la formacin de un apndice semirrgido llamado
pednculo que se prolonga desde la clula. El pednculo tiene una sustancia adherente en
su extremo distal, que permite a la clula pegarse a superficies slidas. Las bacterias
pedunculadas se encuentran en aguas dulces o en ambientes marinos.
Debajo de las sustancias extracelulares tales como las cpsulas o las capas mucosas y
externas a la membrana citoplasmtica, que es un componente de todas las clulas vivas,
esta la pared celular, una estructura muy rgida que da forma a la clula. El espesor de la
pared celular de la mayora de las bacterias estudiadas oscila entre 10 y 35 nm, sin
embargo, algunas paredes celulares son mucho ms gruesa. La pared celular constituye
una porcin significativa del peso total de la clula. Dependiendo de la especie y de las
condiciones de cultivo, puede ser del 10 al 40 % del peso seco del organismo. Las paredes
celulares bacterianas son esenciales para el crecimiento y la divisin.
166
Las bacterias Gram-positivas tienen una pared celular gruesa (15-80 nm), con triple capa,
constituida principalmente por peptidoglucano, que corresponde al 50 % del peso seco de
algunas clulas bacterianas. Adems, contiene cidos teicoicos y lpidos en una baja
proporcin (1- 4 %). Estas bacterias son ms susceptibles a la penicilina. Su crecimiento es
retrasado por colorantes bsicos, como el cristal violeta. Sus requerimientos nutricionales
son relativamente complejos en muchas especies. Son las ms resistentes a la rotura
mecnica.
Las bacterias Gram-negativas tienen una pared celular delgada (10-15 nm), con triple capa,
una capa de peptidoglucano (capa interna), una capa de lipopolisacrido (capa externa) y
una capa de lipoprotena (capa media). El peptidoglucano, representa el 10 % del peso
seco de algunas clulas bacterianas. Adems, contiene lpidos en una alta proporcin (1122 %) y no presenta cidos teicoicos. Estas bacterias son menos susceptibles a la penicilina.
Su crecimiento no se retrasa significativamente por colorantes bsicos, como el cristal
violeta. Sus requerimientos nutricionales son relativamente sencillos. Son menos
resistentes que las Gram-positivas, a la rotura mecnica.
La membrana citoplasmtica o membrana protoplasmtica o membrana plasmtica
est localizada inmediatamente debajo de la pared celular. Su espesor es del orden de
7,5 nm. Controla el paso de sustancias qumicas en solucin hacia dentro y fuera de la
clula. Proporciona adems la maquinaria bioqumica para transportar iones inorgnicos,
azcares, aminocidos, electrones y otros metabolitos a travs de la membrana. Estas
sustancias en solucin pasan a travs de la membrana por difusin pasiva o bien por
transporte activo. La membrana citoplasmtica se repliega hacia el interior de la clula o se
invagina en el citoplasma, produciendo una estructura denominada mesosoma. Con
frecuencia se ve que se originan en el punto en donde la membrana inicia una invaginacin
previa a la divisin celular y quedan unidos a la regin nuclear. Se cree que los mesosomas
funcionan en la sntesis de la pared celular y en la divisin del material nuclear.
La estructura viable derivada de una clula vegetativa por la separacin de toda la pared
celular, se llama protoplasto. Los protoplastos son cuerpos redondos que toman la forma
esfrica desde el momento en que carecen de la pared celular, inmviles, no se dividen, no
forman nuevas paredes y por lo general no son susceptibles a la infeccin por ..... (fagos
patgenos).
La produccin experimental de protoplastos se logra mediante dos
procedimientos: separacin de la pared celular por tratamiento enzimtico (lisozima) o
cultivo de la bacteria en un medio con penicilina por ejemplo, que impide la sntesis de la
pared celular. En cualquiera de los dos mtodos es necesario ajustar la presin osmtica
del medio, para mantener la integridad estructural de la nueva clula desprovista de su
pared celular. Cuando se colocan en agua estos protoplastos estabilizados en una
determinada concentracin de sacarosa, se produce rpidamente la lisis, es decir, el agua
penetra en la clula, sta se hincha y estalla. Cuando el peptidoglucano se separa en las
bacterias Gram-negativas, otras capas de la pared permanecen adheridas a los cuerpos
redondos, a stas se les llama esferoplastos, porque no son protoplastos limpios.
El material celular contenido dentro de la membrana citoplasmtica se divide en el rea
citoplasmtica de aspecto granular y que es rica en ARN, el rea cromtica o rea nuclear
167
que es rica en ADN y la porcin fluida que contiene nutrientes disueltos y materia
particulada, denominada cuerpos de inclusin.
Densamente empaquetadas a travs del rea citoplasmtica existen partculas de protenaARN, llamadas ribosomas, que son el sitio de la biosntesis de protena. El material
nuclear o ADN, en una clula bacteriana ocupa una posicin cerca del centro de la clula y
esta unido al sistema mesosoma-membrana citoplasmtica. Este material es el aparato
gentico total o genoma de la bacteria y consta de un nico cromosoma, en el que van
todos los genes. El cromosoma procaritico es una molcula circular, aunque se conoce que
algunas bacterias poseen un ADN cromosmico lineal. Al material nuclear de la bacteria
se le designa cuerpo de cromatina, nucleoide o cromosoma bacteriano. Se ha
encontrado que en el genoma de la Escherichia coli existen 4,7 millones de pares de bases,
que al abrirse y linealizarse alcanza una longitud aproximada de 1 mm, aunque la clula de
E. coli mide slo 2-3 m de largo; por tanto, el ADN debe estar empaquetado. El
empaquetamiento de tanto ADN en la clula requiere el superenrrollamiento del ADN. El
ADN superenrrollado adopta una forma ms compacta que el circular. En el cromosoma de
la E. coli existen unos 50 dominios superenrrollados, que son estables debido a su
asociacin con protenas estructurales. Esta estructura permite el plegamiento y la torsin
de la larga molcula de ADN para adaptarse a la clula.
Dentro del citoplasma pueden acumularse diferentes clases de sustancias qumicas y formar
grnulos y glbulos denominados cuerpos de inclusin. Por ejemplo, algunas especies de
bacterias del azufre, acumulan grandes cantidades de azufre que aparecen como glbulos
dentro del citoplasma. Otros cuerpos de inclusin encontrados en las bacterias estn
compuestos de polifosfato, lpidos, glucgeno, almidn, cido poli--hidroxibutrico
(PHB), magnetita (Fe3O4).
Ciertas especies de bacterias producen esporas, ya sea externas a la clula (exosporas) o
bien dentro de la clula vegetativa (endosporas). Estos son cuerpos metablicamente
durmientes producidos en el ltimo estadio del crecimiento celular que, bajo condiciones
apropiadas, germinan y producen la clase original de clula en crecimiento o vegetativa.
Existen esporas elpticas localizadas centralmente, esfricas localizadas terminalmente y
ovaladas con localizacin subterminal. Las esporas son resistentes a muchos agentes
fsicos y qumicos.
3.7 CIANOBACTERIAS
Las cianobacterias son organismos procariticos fotosintticos. Es decir, que contienen
clorofila y otros pigmentos que les permiten realizar fotosntesis. Captan la energa
lumnica a travs de ficobilisomas, complejos proteicos exclusivos de estos procariotas y
algas rojas. En los ficobilisomas abunda la ficocianina, protena azulada que, junto con la
clorofila , verdosa, dan a las cianobacterias su coloracin verde-azulada. Las
cianobacterias tienen una estructura celular como la de las bacterias y son ligeramente
mayores que stas. Son unicelulares y se encuentran aisladas o en cadenas de clulas, que a
168
veces son ramificadas. La reproduccin es asexual, por fisin binaria simple, por fisin
mltiple o por produccin de esporas (Garbisu et al., 1999), (Brock, 2001).
Numerosos organismos procariticos, como las cianobacterias, producen vesculas de gas
que son las responsables de la flotabilidad de las clulas. Las vesculas de gas son
estructuras en forma de haz, huecas pero rgidas, con distinta longitud y dimetro. Se
hallan localizadas en el citoplasma en un nmero muy variable, desde unas pocas hasta
centenares por clula. La membrana de la vescula de gas se compone slo de protena,
tiene unos 2 nm de espesor y es impermeable al agua y a los solutos, pero permeable a la
mayora de los gases; por lo tanto, las vesculas de gas, aparecen como estructuras rellenas
de gas rodeadas por los constituyentes del citoplasma.
Algunas cianobacterias asimilan nitrgeno atmosfrico. Son las que disponen de
nitrogenasa, sistema enzimtico que cataliza la reduccin de N2 a iones amonio (NH4+). En
el laboratorio se cultivan sin mayor dificultad en medios lquidos o agar solidificado con
luz artificial o natural. Se ha creado una industria en torno a estas microalgas, sobre todo
en pases que gozan de abundante luz solar y climatologa adecuada. De entre las
explotaciones a gran escala destacan por su abundancia y productividad las de Spirulina
(ahora denominada Arthrospira). Antao, las cianobacterias se cultivaban en estanques
abiertos a la intemperie o en el interior de invernaderos. Hoy se emplean fotobiorreactores
construidos con tubos de plstico transparente o translcido, que se disponen
helicoidalmente (Garbisu et al., 1999).
3.8 HONGOS
El estudio de los hongos se denomina micologa. Aunque los hongos constituyen un grupo
grande y diverso, prcticamente hay tres grupos importantes: los hongos filamentosos
(mohos), las levaduras y las setas.
Los hongos son microorganismos eucariticos quimioorganotrficos. Cuando se comparan
con las bacterias, los hongos tienen en general, requerimientos nutricionales simples y sus
procesos biosintticos no son particularmente diferentes o inusuales. Cuando requieren
materia orgnica muerta para su nutricin se les conoce como saprfitos. Como saprfitos
destruyen plantas complejas y restos de animales degradndolos a formas qumicas simples
que pasan a formar parte del suelo y, finalmente, son absorbidas por otras generaciones de
plantas. El crecimiento saproftico de los hongos tambin puede ser daino y causar
cuantiosas prdidas si ocurre en maderas, alimentos y otros materiales. Los hongos
producen venenos (micotoxinas) muy txicos y en algunos casos carcinognicos
(productores de cncer).
Los hongos saprfitos son importantes en las fermentaciones industriales de cerveceras y
vinateras, en la produccin de antibiticos, vitaminas y cidos orgnicos. Tambin en las
panaderas y el curado de los quesos. Algunos hongos a pesar de ser saprfitos, pueden
invadir a los hospedadores vivos y prosperar como parsitos. Como parsitos los hongos
enferman a plantas, hombres y animales; aunque la mayor parte de esos males son menos
graves que los que les causan las bacterias y los virus.
169
por una membrana como en una clula tpica, habitualmente se hace referencia a un
compartimiento como si fuese una clula.
Septadas con clulas plurinucleadas. Los septos dividen a las hifas en clulas con
ms de un ncleo en cada compartimiento.
Figura 3.7. Tres tipos de hifas (A) no septada (cenoctica) (B) septada con clulas
mononucleadas (C) septada con clulas plurinucleadas
Los micelios pueden ser vegetativos o bien reproductores. Algunas hifas del micelio
vegetativo penetran en el medio, a fin de obtener nutrientes para el organismo. Los
micelios reproductores son responsables de la produccin de esporas y usualmente se
proyectan hacia el aire, a partir del micelio. El talo es todo el hongo filamentoso en forma
individual, incluidas las porciones vegetativas o no sexuales y todas las estructuras
especializadas.
La glucosa es una fuente de carbono muy aprovechada por muchos mohos. Otros azcares,
sobre todo la sacarosa y la maltosa, as como muchos compuestos ms complejos, como el
almidn y la celulosa, son utilizados por muchas especies. Algunas especies necesitan, y
todas pueden utilizar, sustratos con nitrgeno orgnico. Otras se sirven de nitrgeno
inorgnico (sales de amonio o nitratos). Para su desarrollo necesitan pequeas cantidades
de hierro, fsforo, potasio, zinc, cobre, manganeso y molibdeno. Algunas especies
requieren vitaminas. Un medio natural de amplio uso para el cultivo de los mohos, en el
laboratorio, es la infusin de papa con agar y glucosa.
3.9 VIRUS
Los virus no son clulas, su estructura y composicin son ms simples que las de la clula
procaritica. No viven libres, sino que son parsitos obligados, es decir requieren una
clula viva para su propagacin. Por lo tanto, no crecen en medios artificiales de
laboratorio. Constan de una cadena de cido nucleico, o bien ADN o bien ARN, envuelta
172
de una capa de protena. En comparacin con la mayora de los microorganismos los virus
son muy pequeos. Su tamao oscila entre los 20-25 nm y los 200-300 nm. Los virus no
pueden verse utilizando el microscopio ptico. Las partculas vricas pueden verse por
microscopia electrnica y muestran varias formas. Los virus tienen hospedadores
especficos, es decir, multiplican dentro de una clase particular de clula viva (vegetal,
animal o microbiana.
Bacteria
Levadura
Moho
Protena
55 (50-60)
40 (35-45)
32 (25-40)
Carbohidrato
9 (6-15)
38 (30-45)
49 (40-55)
Lpido
7 (5-10)
8 (5-10)
8 (5-10)
cido nucleico
23 (15-25)
8 (5-10)
5 (2-8)
Cenizas
6 (4-10)
6 (4-10)
6 (4-10)
______________________________________________________________________
El medio de cultivo debe proporcionar los nutrientes necesarios para la propagacin celular.
Debe considerarse el anlisis del microorganismo a desarrollar, para suministrar las
cantidades requeridas de cada elemento con relacin a la cantidad final de masa celular que
se desea obtener (Tabla 3.2 y 3.3) (Illanes, 1994), (Scragg, 1996).
Tabla 3.3. Composicin elemental de los microorganismos (% b.s.)
Componente
Bacterias
Levaduras
Hongos filamentosos
_________________________________________________________________________
Carbono
45 - 52
45 - 52
45 - 55
Nitrgeno
10 - 14
6-9
4-7
Hidrgeno
10
10
10
Oxgeno
20
20
20
Azufre
0,2 - 1
0,05 0,3
0,1 0,5
Fsforo
2-3
0,8 2,5
0,5 4,5
Magnesio
0,1 0,5
0,1 0,5
0,1 0,7
Potasio
1,0 4,5
1,0 4,0
0,2 2,5
Sodio
0,5 1,0
0,01 1,0
0,02 0,5
Calcio
0,01 1,1
0,1 0,3
0,1 1,4
Hierro
0,02 0,2
0,01 0,5
0,1 0,2
______________________________________________________________________
Rendimiento celular
Glucosa
0,5
Metanol
0,5
Etanol
0,75
Metano
0,62
n-alcanos
1,0
Celulosa
0,5
Almidn
0,5
_________________________________________________________________________
177
cuestin. En general, los procariotas crecen ms rpidamente que los eucariotas y los
eucariotas pequeos lo hacen ms rpidamente que los grandes.
Fase estacionaria. En un cultivo donde no se renueva el medio, el crecimiento
exponencial no puede ocurrir indefinidamente. Lo que habitualmente sucede es que, o bien
un nutriente esencial del cultivo se acaba, o algn producto de desecho se acumula en el
medio hasta alcanzar concentraciones inhibitorias del crecimiento exponencial; llegando la
poblacin a la fase estacionaria. Aunque en esta fase no tiene lugar crecimiento, todava
ocurren muchas funciones celulares, incluyendo el metabolismo energtico y algunos
procesos biosintticos. En algunos organismos puede incluso tener lugar crecimiento lento
durante la fase estacionaria, algunas clulas crecen y otras mueren, siendo el balance total
de ausencia de incremento en el nmero de clulas (crecimiento crptico).
Fase de muerte. Si la incubacin contina despus que la poblacin alcance la fase
estacionaria, las clulas deben permanecer vivas y metablicamente activas, pero tambin
deben morir. Si esto ltimo ocurre se dice que las clulas se encuentran en fase de muerte.
En algunos casos la muerte va acompaada de lisis celular, debido a que se inducen
enzimas autolticas en condiciones de inanicin. La fase de muerte de un ciclo de
crecimiento es tambin una funcin exponencial; sin embargo, en muchos casos, la
velocidad de muerte celular es mucho ms lenta que el crecimiento exponencial.
Hay dos tipos fundamentales de productos metablicos: primarios y secundarios. Un
metabolito primario microbiano es el que se forma durante la fase primaria del
crecimiento del microorganismo. Es necesario en el crecimiento de ste. Un metabolito
secundario, aparentemente no es esencial para el crecimiento, mantenimiento y la
reproduccin; se produce durante la fase estacionaria. En el metabolismo secundario, las
dos fases distintas del metabolismo se denominan trofofase e ideofase. La trofofase es la
fase de crecimiento, mientras que la fase de produccin de metabolitos es la ideofase. El
metabolito secundario se produce, generalmente, a partir de varios productos intermedios
que se acumulan, bien en el medio de cultivo o bien en las clulas, durante el metabolismo
primario. Una caracterstica de los metabolitos secundarios es que las enzimas implicadas
en su produccin estn reguladas separadamente de las enzimas del metabolismo primario.
En algunos casos se han identificado inductores especficos de la produccin metabolitos
secundarios. Con frecuencia es posible obtener una superproduccin de metabolitos
secundarios, en tanto que los metabolitos primarios, ligados como estn al metabolismo
primario, usualmente no se pueden producir en grandes cantidades. Ejemplos de
metabolitos secundarios son los antibiticos, alcaloides, pigmentos y toxinas (Brock, 2001).
ln (X/X0) = t
umax [S]
= ____________________
(KS + [S]) ( 1 + [S]/Ki)
max [S]
= ____________________
(KS + [S]) (1 + [P]/KP)
Temperatura. La temperatura es uno de los factores ambientales ms importantes que
afectan al crecimiento y a la supervivencia microbiana.
Puede afectar a los
microorganismos vivos de dos formas muy diferentes. A medida que la temperatura sube,
las reacciones enzimticas son ms rpidas y el crecimiento se acelera. Sin embargo, por
encima de una cierta temperatura, las protenas, cidos nucleicos y otros componentes
celulares pueden daarse irreversiblemente. Por encima de este punto las funciones
celulares paran. A bajas temperaturas, los mecanismos regulatorios de la clula son
afectados, adems de las limitaciones difusionales como el transporte de sustratos hacia y
dentro de la clula. Por tanto, para cada microorganismo existe una temperatura mnima
por debajo de la cual no existe crecimiento, una temperatura ptima a la cual el
crecimiento es el ms rpido posible y una temperatura mxima sobre la cual no existe
crecimiento. La temperatura ptima siempre esta ms cerca de la mxima que de la
mnima. Para cada organismo estas tres temperaturas pueden variar ligeramente de acuerdo
con la composicin del medio de cultivo. La temperatura ptima de Escherichia coli en un
medio rico y complejo es de 39 0C, la mxima de 48 0C y la mnima de 8 0C.
185
dX / dt = X - X
= A e E/ RT
187
Existen los microorganismos halfilos, los cuales requieren para su crecimiento cloruro
sdico, variando la concentracin ptima de este compuesto de un microorganismo a otro.
Por tanto, los microorganismos que son halfilos extremos, moderadamente halfilos y
discretamente halfilos requieren de 15-30 %, 6-15 % y de 1-6 % de cloruro sdico,
respectivamente. Los organismos capaces de crecer en ambientes con altas concentraciones
de azcar se llaman osmfilos y los que crecen en ambientes muy secos se llaman
xerfilos. Los organismos halotolerantes pueden soportar cierta reduccin en la actividad
de agua de sus ambientes, pero generalmente crecen mejor en ausencia de cualquier soluto
que reduzca significativamente la actividad de agua.
Oxgeno. Los microorganismos varan en sus necesidades, o tolerancia de oxgeno. De
hecho, los microorganismos pueden ser divididos en diversos grupos dependiendo del
efecto del oxgeno. Los aerobios son capaces de crecer con tensin de oxgeno total, en el
aire el oxgeno es el 21 %, y muchos pueden soportar incluso concentraciones ms altas.
Los microaerfilos, por el contrario, son aerobios que pueden utilizar este gas slo cuando
su tensin es mas baja que la del aire, usualmente por su limitada capacidad de respirar, o
porque contienen alguna molcula o enzima(s) sensible al oxgeno. Los facultativos
presentan respiracin aerobia y anaerobia. Los organismos que carecen de sistemas
respiratorios no pueden utilizar el oxgeno como aceptor terminal de electrones. Tales
organismos se llaman anaerobios. Existen los anaerobios aerotolerantes, que pueden
tolerar el oxgeno y crecer en su presencia aun cuando no pueden utilizarlo y los
anaerobios estrictos u obligados que mueren en presencia de oxgeno. La razn por la
que los anaerobios estrictos son destruidos por el oxgeno es probablemente porque son
incapaces de eliminar algn producto txico derivado del metabolismo del oxgeno.
Cuando se reduce el oxgeno, se producen algunos compuestos txicos como el perxido de
hidrgeno (H2O2), el superxido (O2-) y radicales hidroxilo (OH). Muchos anaerobios
estrictos son ricos en enzimas flavnicas, que reaccionan con el oxgeno para dar estos
productos txicos. Los aerobios poseen enzimas que descomponen los productos txicos;
tales enzimas no estn presentes en los anaerobios.
Para el crecimiento de muchos microorganismos aerobios es necesario suministrar mucho
aire, debido a que el oxgeno es poco soluble en agua y el que es utilizado durante el
crecimiento microbiano, no es remplazado suficientemente rpido a partir de simple
difusin del aire. Es deseable por tanto aireacin forzosa de los cultivos, bien por agitacin
vigorosa, bien insuflando aire atomizado a presin.
Para el crecimiento de anaerobios existen procedimientos para disminuir la cantidad de
oxgeno en los cultivos; algunos sencillos y otros mucho ms complejos para los anaerobios
estrictos. Botellas, tubos o matraces completamente llenos con el medio de cultivo y
tapones adecuados, proporcionan condiciones anxicas suficientemente buenas para el
crecimiento de muchos anaerobios. Tambin es posible aadir algn compuesto qumico
que reacciona con el oxgeno del aire y lo reduce hasta agua. Un buen ejemplo de esto es el
tioglicolato, que se aade al medio denominado caldo de tioglicolato, comnmente
utilizado para ensayar el requerimiento de oxgeno de un microorganismo. Despus de que
el tioglicolato reaccione con el oxgeno del tubo, el oxgeno puede penetrar solamente en la
parte superior, donde el medio contacta con el aire. Los aerobios estrictos crecen en la
parte superior de estos tubos. Los facultativos lo hacen por todo el tubo, pero con
188
preferencia en la parte superior. Los microaerfilos crecen hacia la parte superior del tubo
pero no sobre el medio. Los anaerobios crecen hacia el fondo del tubo, donde el oxgeno
no puede penetrar. Los anaerobios aerotolerantes crecen por todo el tubo. Se aade al
medio un colorante indicador de oxidacin-reduccin (resazurina) que cambia de color
con el oxgeno; de manera que sirve para indicar el grado de penetracin del oxgeno en el
medio de cultivo (Brock, 2001)
Cuando se precisa de una incubacin en anaerobiosis, las placas de agar se colocan en una
jarra sellada (jarra de anaerobios) que se hace anxica reemplazando la atmsfera de la
jarra con una mezcla de gas libre de oxgeno (habitualmente se emplea una mezcla de N2 y
CO2) o aadiendo algn compuesto que elimine el oxgeno de la atmsfera de la jarra
cerrada. Por ejemplo, se genera H2 y en presencia de un catalizador adecuado, generalmente
paladio, el H2 se combina con el oxgeno libre para formar H2O, eliminndose de esta
forma el oxgeno contaminante.
Para el crecimiento de tales anaerobios estrictos, como es el caso de las bacterias
metanognicas, no basta con quitar todo el oxgeno sino que todas las manipulaciones han
de llevarse a cabo en ambientes anxicos, ya que una exposicin breve al oxgeno puede
acarrear la muerte de estos microorganismos. En estos casos el medio de cultivo se hierve
primero para eliminarle el oxgeno y entonces se aade un agente reductor, como es el
cido sulfdrico, y todo ello se sella en atmsfera libre de oxgeno. Todas las
manipulaciones se llevan a cabo insuflando nitrgeno o hidrgeno, libres de oxgeno, cada
vez que los recipientes hayan de ser abiertos. Se han diseado cmaras especiales que
permiten la manipulacin a travs de guantes impermeables al oxgeno.
Contaje de viables. Una clula viable se define como la que es capaz de dividirse para
189
dar lugar a descendencia y la forma habitual de llevar a cabo un contaje de este tipo, es
determinando un nmero de clulas capaces de generar colonias sobre la superficie de un
medio slido. Por esta razn, a menudo a este mtodo se le denomina contaje en placa o
contaje de colonias. Cada clula viable puede dar lugar a una colonia. Hay dos maneras
de llevar a cabo un contaje en placa por siembra en superficie o por vertido en placa. En
el mtodo de siembra en superficie, un volumen no mayor de 0,1 mL de la dilucin
apropiada se extiende por toda la superficie del medio utilizando una barra de vidrio
doblada y estril. La placa se incuba hasta que aparezcan las colonias, las cuales son
contadas. En el mtodo de vertido se pipetea un volumen conocido (0,1 1,0 mL) en el me
dio de cultivo fundido previamente y enfriado hasta aproximadamente 40 0C, despus de
mezclado se vierte rpidamente en una caja de petri y se incuba. Debido que la muestra se
mezcla con medio fundido el volumen puede ser muy superior al primer mtodo. El
organismo que vaya a ser contado debe resistir temperaturas de 40 a 45 0C.
Para obtener el nmero de colonias apropiado la muestra debe ser casi siempre diluida. Ya
que casi nunca se conoce el nmero de viables a priori, normalmente es necesario hacer
ms de una dilucin (Figura 3.11).
Figura 3.11. Procedimiento para contar viables utilizando diluciones seriadas de la muestra.
El diluyente puede ser simplemente agua, pero una solucin balanceada de
sales puede dar mejores resultados
Medidas de masa o peso seco celular. En algunos casos, es necesario estimar la masa
de clulas presentes en el cultivo ms que el nmero de clulas. El mtodo ms usado para
medir el crecimiento microbiano es secar volmenes conocidos de cultivo celular
190
lentamente hasta obtener un peso constante. Cuando se trata de clulas que sedimentan
rpidamente, como las levaduras, esto usualmente implica centrifugacin de muestras del
cultivo en tubos de centrfuga prepesados, el lavado de la pastilla celular concentrada con
solucin salina isotnica seguida por recentrifugacin a 4,6 x 10 rpm. Luego las clulas
concentradas se colocan en un horno a 90 0C durante 20 horas o a 105 0C. Durante 6 a 10
horas, hasta que hayan alcanzado un peso constante. Para clulas bacterianas difciles de
concentrar por centrifugacin, las muestras de cultivo se filtran a travs de membranas
hidroflicas con un tamao de poro de 0,2 m. las clulas, retenidas en el filtro, se lavan
con solucin salina isotnica y los filtros se colocan en un horno a 90 0C o a 105 0C hasta
obtener un peso constante. La masa seca de las clulas bacterianas es aproximadamente
entre el 10 y el 20 % de la masa hmeda.
En las determinaciones del peso seco celular existen fuentes de error significativas debido
a la absorcin de humedad atmosfrica por las clulas secas y los tubos de centrfuga o las
membranas durante el enfriamiento. Esto se puede evitar al enfriar en un desecador o
mediante la determinacin de la cantidad de agua absorbida por las membranas o tubos y
con la correccin adecuada del peso seco medido. La presencia de slidos en el medio, los
cuales se encuentran frecuentemente en muchos medios industriales importantes, requiere
que el peso seco medido sea corregido con respecto al peso de los slidos. La desventaja
principal de este mtodo es que son lentos y requieren muestras relativamente grandes del
cultivo.
Medida de turbidez. Un mtodo ms rpido y til para obtener una estimacin del
nmero de clulas o biomasa, consiste en la utilizacin de medidas de turbidez. Las clulas
microbianas desvan la luz de modo que la cantidad de sta que llega al detector del
espectrofotmetro, est relacionada directamente con el nmero de clulas presentes en la
muestra de cultivo de acuerdo con la Ley de Beer. Por lo general, se emplean longitudes de
onda de alrededor de 600 nm. La absorbancia es afectada por el tamao y la forma de las
clulas; por lo tanto, la relacin entre la absorbancia y el nmero de clulas cambia si el
tamao o la forma de stas vara durante el crecimiento del cultivo. Para organismos
unicelulares, las unidades de DO (densidad ptica) son proporcionales a la masa celular y
tambin al nmero de clulas.
Sin embargo, antes de utilizar la turbidez como mtodo de contaje, se debe realizar una
curva estndar que relacione medidas directas (microscpicas o por recuento en placa)
con las indirectas de la turbidez. Esta grfica puede usarse para experimentos posteriores
con el mismo organismo criado en condiciones similares. La pendiente de la curva
estndar no siempre es constante, ya que vara a medida que la concentracin de las clulas
aumenta y se da una respuesta no lineal del espectrofotmetro a valores de absorcin altos.
Por lo tanto, es importante trabajaren el intervalo lineal mediante la dilucin adecuada de
las muestras del cultivo, de modo que la absorcin este directamente relacionada con la
densidad celular.
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