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20/03/2006

CROMATOGRAFA SOBRE CAPA FINA

Anlisis de medicamentos, Doping y drogas de abuso

Q.F. Sergio Salas Ibez


Laboratorio de Anlisis Antidoping/Drogas de Abuso
Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacuticas
Universidad de Chile

MTODO DE SCREENING
SISTEMA MTTLC
* Tarea analtica de barrido para pesquisar la
presencia de drogas y/o productos de
biotransformacin (metabolitos) en las diversas
matrices biolgicas

ESTRUCTURA GENERAL

* Screening : primeras informaciones sobre la droga


posiblemente presente. Bsicamente es la primera
etapa en el trabajo de identificacin
* Identificacin : coleccin de datos analticos
suficientes para concluir que hay una droga presente y
no otra sustancia.

20/03/2006

Seleccin de una tcnica de Screening

Cobertura de drogas y rapidez de ensayo


Sensibilidad
Versatilidad y expansibilidad
Especificidad
Conveniencia
Costo

Seleccin de una tcnica de Screening

Cobertura de drogas y rapidez de ensayo


Sensibilidad
Versatilidad y expansibilidad
Especificidad
Conveniencia
Costo
...identificar el mayor n
nmero

de drogas en el menor tiempo


posible.

Seleccin de una tcnica de Screening

Cobertura de drogas y rapidez de ensayo


Sensibilidad
Versatilidad y expansibilidad
Especificidad
Conveniencia
...detectar la menor
Costo

concentraci
concentracin posible de
droga.

20/03/2006

Seleccin de una tcnica de Screening

Cobertura de drogas y rapidez de ensayo


Sensibilidad
Versatilidad y expansibilidad
Especificidad
Conveniencia
Costo

...rastrear una amplia variedad


de drogas y aceptar nuevas.
nuevas.

Seleccin de una tcnica de Screening

Cobertura de drogas y rapidez de ensayo


Sensibilidad
Versatilidad y expansibilidad
Especificidad
Conveniencia
Costo
...detectar el compuesto deseado
en presencia de interferentes.

Seleccin de una tcnica de Screening

Cobertura de drogas y rapidez de ensayo


Sensibilidad
Versatilidad y expansibilidad
Especificidad
Conveniencia
Costo
...f
...fcil aprendizaje e implementaci
implementacin.

20/03/2006

Seleccin de una tcnica de Screening

Cobertura de drogas y rapidez de ensayo


Sensibilidad
Versatilidad y expansibilidad
Especificidad
Conveniencia
Costo

...debe ser de
bajo costo.

Clasificacin

Lquida

Slida

Adsorcin ( TLC, Papel )

Lquida

Particin ( TLC, Papel )

CROMATOGRAFA

Gaseosa

Slida

C. Adsorcin

Lquida

C. Particin

segn la naturaleza
segn la
fsica de la fase mvil naturaleza
fsica de la fase
estacionaria

Cromatografa Lquida
Fase normal
Fase estacionaria ms
polar que fase mvil

Fase Reversa
Fase estacionaria menos
polar que fase mvil

20/03/2006

Cromatografa Lquida
Fase normal

Fase Reversa

Fase estacionaria ms
polar que fase mvil

Fase estacionaria menos


polar que fase mvil

.-. +

..
O
.. H

OH

slica
Ej.: TLC: slica polar, en los
grupos activos silanol se
establecen centros de cargas
positivas y negativas.

Cromatografa Lquida
Fase normal

Fase Reversa

Fase estacionaria ms
polar que fase mvil

Fase estacionaria menos


polar que fase mvil

.-. +

..
O
.. H

OH

OH Cl
OH +Cl - Si - C18
OH Cl

O
>

O Si - C18
O

slica
polar
Ej.: TLC: slica polar, en los
grupos activos silanol se
establecen centros de cargas
positivas y negativas.

slica polar + tricloro octadecil silano


Slica no polar
(slica bonded phase)
slica C18, RP18, ODS

Compuestos
Polares

Compuestos no
polares

Compuestos que tienen


cargas localizadas
positivas y negativas
(dipolos).
Contienen: O, N, S, P,
halgenos

Compuestos que no tienen


dipolos fuertes.
Contienen principalmente
C e H.

20/03/2006

Regla de oro de la cromatograf


cromatografa
Lo similar atrae lo similar
Ej. Crom. Normal (TLC
TLC)
Fase mvil apolar (hexano) movilizar rpidamente los
solutos apolares. La fase estacionaria polar (slica) atraer
fuertemente los solutos polares.
Ej. Crom. Reversa
Fase mvil polar (metanol-agua) movilizar rpidamente los
solutos polares. La fase estacionaria no polar atraer
fuertemente los solutos no polares.

MTTLC
1

Limpieza o extracci
extraccin

Separaci
eparacin de las drogas

Detecci
eteccin de las drogas

Etapas MTTLC

Limpieza o extracci
extraccin

Separacin de las drogas

Deteccin de las drogas

20/03/2006

Limpieza o extraccin
1
* Selectiva

mnimo de productos no deseados

* Limpia >>>>>> Concentrada

Limpieza o extraccin
1
* Selectiva ....... m
mnimo de productos no deseados
* Limpia >>>>>> Concentrada

* Cantidad de muestra ( 22- 5 mL)


mL)
* pH fase acuosa
* Solvente de extraccin

Limpieza o extraccin
1

* pH 3 fracci
fraccin cida

* pH
n b
fracci
bsica
* Selectiva ....... m
nimo9,5
de fracci
productos
no
deseados
m
* pH 55-6 fracci
fraccin neutra
* fracci
fraccin conjugada

* Limpia >>>>>> Concentrada

...optimizar la recuperacin y
eliminar la mayor cantidad de
interferentes..

* Cantidad de muestra ( 2-5 mL)


* pH fase acuosa
* Solvente de extraccin

20/03/2006

Limpieza o extraccin
1

Concentracin
* evitar prdida de drogas por:
- oxidacin al aire o luz
- adsorcin paredes del vidrio
- volatilizacin
* t < 50 C*, luz difusa*, * corriente de N2

Separacin de las drogas


2

Concentracin
* placas convencionales cortadas a 10cm
* aplicacin de extractos concentrados

Diagrama de aplicacin de muestras y


estndares
2

Cromatoplacas 60F254 Merck

10 cm.

4cm.

1cm.
20 cm.

20/03/2006

Diagrama de aplicacin de muestras y


estndares
2

10 cm.

5 B1 6

9 10 B2 11 12 13 14 B3 15 16 17 18

4cm.

1cm.
20 cm.

Diagrama de aplicacin de muestras y


estndares
2

MUESTRA
10 cm.

1 2 3

4 5 B1 6 7

* 10
L12extracto
.
conc
9 10
B2 11
13 14 B3 15conc.
16 17 18
*+/*+/- 2 mm di
dimetro

4cm.

1cm.
20 cm.

Diagrama de aplicacin de muestras y


estndares
2

EST
ESTNDAR
* m
mltiples f(x)
f(x) extracci
extraccin

* comparaci
comparacin
*identificaci
*identificacin presuntiva
10 cm.

1 2 3

4 5 B1 6 7 8 9 10 B2 11 12 13 14 B3 15 16 17 18

4cm.

1cm.
20 cm.

20/03/2006

Diagrama de cromatoplaca con estandar B2


1 morfina, 2 nicotinamida, 3 cafena, 4 fencanfamina

M3

10 cm.

B2

M1

M2

4
3
2
1

4cm.

1cm.
20 cm.

Desarrollo
2
* solvente de desarrollo
* distancia

Desarrollo
2
* solvente de desarrollo
* distancia

...de acuerdo al tipo de


extracto
que se analiza.

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20/03/2006

Desarrollo
2
* solvente de desarrollo
* distancia

Desarrollo
2
* solvente
* distancia

la velocidad del solvente disminuye


en la distancia y la mancha se hace
difusa...........

Desarrollo
2
* solvente
* distancias y tiempos cortos

La velocidad del solvente disminuye


en la distancia y la mancha se hace
difusa........... preferir distancias y
tiempos cortos siempre que se
obtengan buenas separaciones.

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20/03/2006

Seleccin del solvente de desarrollo


2

perfil de requisitos
material lastre
residuos
*gran pureza, *estabilidad,
*buena miscibilidad, *baja
toxicidad, *baja viscosidad
y *buena separacin

Seleccin del solvente de desarrollo


2

perfil de requisitos
material lastre
residuos

Drogas deben quedar en la


parte media del cromatograma

Seleccin del solvente de desarrollo


2

perfil de requisitos
material lastre
residuos

...de acuerdo al tipo


de residuo

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20/03/2006

Seleccin del solvente de desarrollo


2

perfil de requisitos
material lastre
residuo cido (A)

*CHCl3/MeOH/Ac. Actico (9:0.8:0.2)


*CHCl3/Ciclohexano/Ac. Actico (4:4:2)

Seleccin del solvente de desarrollo


2

perfil de requisitos
material lastre
residuo bsico (B)

*Davidow modif., Acetato de etilo/MeOH/NH4OH


(8.5:1:0.6)
*MeOH/NH4OH (10:0.15)

Seleccin del solvente de desarrollo


2

perfil de requisitos
material lastre
residuo conjugado bsico(AH)

*benceno/acetona(9.5:0.5)
*ciclohexano/acetona(9:1)

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20/03/2006

Seleccin del solvente de desarrollo


2

perfil de requisitos
material lastre
residuo conjugado bsico(BH)

*Davidow modificado
*CHCl3/MeOH/c. propinico
(7.2:1.8:1)

Seleccin del solvente de desarrollo


2

perfil de requisitos
material lastre
residuo(EP)

*Davidow modifado, acetato de etilo/MeOH/NH4OH


(8.5:1:0.6)
*CHCl3/MeOH/Acido Propinico (7.2:1.8:1)

Etapas MTTLC

Limpieza o extraccin

Separacin de las drogas

Detecci
eteccin de las drogas

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20/03/2006

Deteccin de las drogas


3
componentes normales
del extracto biol
biolgico

DROGAS

Deteccin de las drogas


3
componentes normales
del extracto biolgico

DROGAS

COMBINACIONES DE REACTIVOS
EN SECUENCIAS PREDETERMINADAS

Deteccin de las drogas


3

COMBINACIONES DE REACTIVOS
EN SECUENCIAS PREDETERMINADAS
* UV
* Ac.
Ac. Ac
Actico 5%
* Fluorescamina
* Marquis
*
* Mandelin
* calor
* diazo

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Deteccin de las drogas


3

COMBINACIONES DE REACTIVOS
EN SECUENCIAS PREDETERMINADAS
* UV
*Fluorescamina
* iodo
* ninhidrina
*
* calor
* Dragendorff
* CuCl2

Deteccin de las drogas


3

COMPARACI
COMPARACIN CON EST
ESTNDARES

Reacciones de
absorci
absorcin/fluorescencia, manchas
coloreadas.......... caracterizaci
caracterizacin de
la droga o
grupos de drogas (fluorescencia luz
UV, color, Rf).
Rf).

Lnea final 2

Origen 2
estndar

Lnea final 1
10 cm

4 cm

Muestra x
estndar

Origen 1
1 cm

10 cm

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20/03/2006

Lnea final 2

Origen 2

1 D

estndar

Lnea final 1
10 cm

4 cm

Muestra x
Origen 1

estndar

1 cm

10 cm

Lnea final 1

2 D

estndar

1 D
Lnea final 2

Origen 1

10 cm

4 cm

Origen 2

estndar

1 cm

Muestra x

10 cm

CONCLUSIONES MTTLC
La t
tcnica de MTTLC puede separar
perfectamente (fluorescencia luz UV, color,
Rf)
Rf) las diferentes drogas.

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20/03/2006

CONCLUSIONES MTTLC
La t
tcnica de MTTLC puede separar
perfectamente (fluorescencia luz UV, color,
Rf)
Rf) las diferentes drogas.

Las secuencias de revelado entregan una


gran cantidad de informaci
informacin (15 a 18
muestras simult
simultneas).

CONCLUSIONES MTTLC
La t
tcnica de MTTLC puede separar
perfectamente (fluorescencia luz UV, color,
Rf)
Rf) las diferentes drogas.
Las secuencias de revelado entregan una
gran cantidad de informaci
informacin (15 a 18
muestras simult
simultneas).
La correcta interpretaci
interpretacin de la informaci
informacin
anal
analtica permite discriminar con certeza si
una mancha tiene su origen en una droga o
en un componente normal de la orina.

Microtcnica de
cromatografa en capa
fina

18

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