AGROBIOTECNOLOGIA

CURSO 2015

Transformacin Gentica de Especies Vegetales

Dra. Marisa LOPEZ BILBAO

lopezbilbao.marisa@inta.gob.ar
Instituto de Biotecnologa, INTA

Departamento de Fisiologa, Biologa Molecular y Celular

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires

Para transformar una especie vegetal

Mercedes R
Sistema de cultivo de tejidos
Eficiente y reproducible,
Descendencia frtil
Mtodo de seleccin
(Sin escapes)

Vector de Transformacin (gen de

inters, gen de seleccin, promotor,
otras secuencias regulatorias)

Entrega: Cepa de Agrobacterium

o Gen Gun (otros mtodos
menos usados)

Ensayos de transformacin
Analizar las plantas obtenidas (presencia,
estabilidad y nivel de expresin del transgn)

Sistemas de transferencia gentica en plantas

-

Sistemas de transferencia de ADN basados

en vectores biolgicos
- Sistemas basados en Agrobacterium tumefaciens
y Agrobacterium rhizogenes
- Sistemas basados en virus vegetales

Entrega: Cepa de
Agrobacterium o
Gen Gun (otros
mtodos menos
usados)

Sistemas de transferencia directa de ADN

- Transferencia por biobalstica
- Transferencia mediada por cationes divalentes
y/o electroporacin
- Transferencia por microinyeccin

Biologa de Agrobacterium tumefaciens

Procesos celulares involucrados
en las etapas de interaccin entre
la bacteria y la planta

Etapas de infeccin
-

Procesos celulares

Agrobacterium se une a
la clula hesped

Reconocimiento clula
clula

Agrobacterium tumefaciens
BI

BD

Formacin del complejo T

inmaduro, compuesto por
VirD2 y la hebra T

Procesamiento del ADN

Hebra T

Empaquetamiento del ADN

Tumor de tallo provocado

por Agrobacterium tumefaciens

Formacin del complejo T

maduro, compuesto por
VirD2 y la hebra T cubierta
por VirE2

Transporte intercelular

Formacin del pilus para el

transporte del complejo T
dentro de la clula hesped

Importacin al ncleo

Importacin de la hebra T al
ncleo de la clula hesped

Integracin del ADN

y expresin de los genes

Integracin de la hebra T y la
formacin del tumor

Tomado de: Tzfira and Citovsky, Trends in Cell Biology, 2002.

Biologa de Agrobacterium tumefaciens

-

Mapa gentico del plsmido

Ti de octopina

Mapa gentico del

plsmido Ti de
octopina

Estructura de la
regin T de un
plsmido Ti de
octopina

Mecanismos moleculares implicados en la transformacin por Agrobacterium tumefaciens

-

Tomado de: Tzfira and Citovsky, Trends in Cell Biology, 2002.

Agrobacterium
tumefaciens posee
un sistema
regulatorio de dos
componentes para
reconocer las
clulas vegetales
susceptibles

Procesamiento de la hebra T y formacin

del complejo T maduro

Ensamblaje de las protenas de Agrobacterium

involucradas en el transporte del complejo T
-

VirB2

Se requieren
600 molculas
de VirE2 para
recubrir los 20
Kbp del ADN-T

Una nica molcula

de protena VirD2 se
halla unida
covalentemente al
extremo 5 del DNA.

La integracin
del ADN-T al genoma
de la clula vegetal
involucra
el apareamiento
no homlogo entre
ste y el ADN
cromosmico

(1) y (3): digestin de las cadenas desplazadas de ADN

de la planta por endonucleasas. (2): digestin del
extremo no apareado
del ADN-T por exo- o endonucleasas. (4) y (5): cortes
en la cadena desapareada del ADN de la planta

Protocolos de transformacin mediante Agrobacterium tumefaciens

Se obtienen plantas y su descendencia
portadoras del transgn
Transformacin transiente No se hereda y se usa para estudios en
el laboratorio de funcin, especificidad,
nivel de expresin, etc

Transformacin estable

Transformacin estable
Transformacin
girasol

Transformacin
tabaco

Explanto inicial plantas maduras

en macetas

Desinfeccin Explanto inicial semillas

Germinacin

en germinacin

Agroinfeccin
&
Co-cultivo
Re1
Re2
Regeneracin

Re3

Kan
50 mg/L

Enraizamiento

Invernculo

Re4

RA

Transformacin lechuga

Explanto inicial cotiledones expandidos y verdes

Transformacin estable
-

Transformacin
estable por floral dip
en Arabidopsis

Bombardeo en hojas de cebolla

Agroinfiltracin en Nicotiana benthamiana

Evaluacin
sobre el
explanto
inicial a los
das de la
agroinfeccin
estable de
girasol

Cultivo de races de tabaco transformadas

por Agrobacterium rhizogenes

Tumor de races producido por

Agrobacterium
rhizogenes en discos de remolacha

Fenotipo Ri en plantas de Brassica napus

No se necesita marcador de seleccin porque se ve

directamente la raz

Protocolos de transformacin mediante Agrobacterium rhizogenes

-

Genetic transformation of
Calibrachoa excellens via
Agrobacterium rhizogenes:
Changing morphological
traits

Transformacin estable
-

El uso de Agrobacterias implica el agregado de antibiticos para eliminar la

bacteria del medio de cultivo de plantas
Los ms utilizados son cefotaxina, carbenicilina, timentina, augmentina.
La evaluacin de estos antibiticos se realiza casi al mismo tiempo que la
puesta a punto del protocolo de cultivo de tejidos

Sistemas de transferencia directa de ADN

Ventajas

- Son considerados sistemas universales porque, al no depender de organismos

vectores, pueden aplicarse a cualquier especie vegetal

- No requieren eliminar las clulas del organismo vector de los tejidos o plantas
transgnicas
- Requieren construcciones ms simples y pequeas

- Son apropiados para estudios de expresin transitoria

Desventajas
- Pueden resultar en un alto nmero de copias y/o copias truncas del transgn y del
vector en varios sitios del genoma de las clulas transformadas
- Se caracterizan por la alta frecuencia de aparicin de re-arreglos en los transgenes

Bombardeo de
micropartculas
1984. Sandford et al.,
describen la tcnica de
bombardeo de
micropartculas para la
transferencia directa de
ADN (Universidad de
Cornell, EEUU).

Acelerador de micropartculas PDS 1000/He

por descarga de helio a alta presin
Modelo comercial actual

Medidor de presin de helio

Tubo de aceleracin de gas
Interruptores de control
Medidor de vaco
Portador del disco
de ruptura
Portador del
macroproyectil
Ensamblaje del propulsor
de microproyectiles
Cmara de
bombardeo
Clulas blanco
Soportedel
del tejido
blancoblanco
Soporte
Vlvula de medicin
de helio
Controles del flujo
de aire y de vaco

 Parmetros fsicos y qumicos que influyen en la transferencia

del
ADN

- Mtodo de aceleracin de las micropartculas

- Naturaleza qumica y fsica, densidad y volumen de micropartculas

- Naturaleza, preparacin, adherencia y concentracin del ADN

La transformacin
- Vaco y distancias de bombardeo
por biobalstica
- Dimetro de apertura de la placa de retencin
depende de
factores fsicos,
- Nmero de bombardeos
qumicos
Parmetros relacionados con la construccin gentica utilizada
y biolgicos
- Vector, promotores, intrones, genes reporteros y genes marcadores
de seleccin
Parmetros relacionados con el tejido o clulas blanco

- Transferencia de genes a clulas,

tejidos y rganos vegetales
- Transferencia de genes a
microorganismos y organelas
(cloroplastos)
- Estudio de expresin transitoria
- Anlisis de promotores y de
deleccin de genes
- Estudio de mecanismos de
expresin. y regulacin de genes

- Transferencia de ARN viral

Transformacin
gentica de plantas in
vivo usando una
pistola gnica Helios

Plantas transgnicas obtenidas por bombardeo de micropartculas

Transformacin de Festuca arundinacea
a partir de suspensiones celulares

Tipos de explantos
A

M
P

A y B: callos de maz. C: brotes

primordiales de maz. D y E: callos y
brotes de soja. F: pice de una plntula
de algodn de 4 das (M: meristema
apical y P: primordio foliar).

A: suspensin de clulas de Festuca arundinacea sobre papel de filtro

antes del bombardeo. B: seleccin de clulas transformadas en medio
de seleccin conteniendo higromicina. C y D: plntulas transgnicas
de Festuca arundinacea regeneradas a partir de callos resistentes.

Transferencia de ADN mediada por electroporacin y/o

mtodos qumicos
Electroporacin de protoplastos

Pulsador de
electroporacin

Cubetas de
electroporacin

Cultivo y regeneracin de
protoplastos de tabaco

Aislamiento y electroporacin de protoplastos de Citrus sinensis

(naranjo dulce) con el gen gfp

Lnea celular embriognica

usada como fuente
de protoplastos

Protoplasto fluorescente
a las 24 h de la electroporacin

Protoplastos luego de
la electroporacin

Callos embriognicos GFP positivos a los 6

meses de la transformacin

Callos embriognicos de 4
semanas derivados de protoplastos

Planta regenerada a partir de

callos en seleccin positiva

Expresin estable de genes transferidos a protoplastos de plantas por mtodos

qumicos y/o electroporacin
Gen marcador de
seleccin / agente de
seleccin

Tcnica de transformacin

Tipo de
transgnico

Nicotiana tabacum

Mtodos qumicos

Plantas frtiles

npt II / kanamicina

Lolium multiflorum

Mtodos qumicos

Callos

npt II / kanamicina

Triticum monococcum

Mtodos qumicos

Callos

npt II / kanamicina

Brassica campestris

Mtodos qumicos

Callos

npt II / kanamicina

Petunia hybrida

Mtodos qumicos

Plantas

npt II / kanamicina

Brassica napus

Electroporacin

Callos

npt II / kanamicina

Panicum maximum

Electroporacin

Callos

dhfr / metotrexato

Oryza sativa (Japonica)

Electroporacin

Plantas frtiles

hpt / higromicina

Dactylis glomerata

Mtodos qumicos / Electroporacin

Plantas

hpt / higromicina

Solanum tuberosum

Electroporacin

Plantas frtiles

npt II / kanamicina
hpt / higromicina
als / clorosulfuron

Arabidopsis thaliana

Mtodos qumicos

Plantas frtiles

hpt / higromicina

Oryza sativa (Indica)

Mtodos qumicos

Plantas frtiles

hpt / higromicina

Festuca arundinacea

Mtodos qumicos

Plantas frtiles

hpt / higromicina
pat / fosfinotricina

Zea mays

Mtodos qumicos

Plantas frtiles

npt II / kanamicina
pat / fosfinotricina

Especie

Para transformar una especie vegetal

Sistema de cultivo de tejidos

Eficiente y reproducible,
Descendencia frtil
Mtodo de seleccin
(Sin escapes)

Vector de Transformacin (gen de

inters, gen de seleccin, promotor,
otras secuencias regulatorias)

Entrega: Cepa de Agrobacterium

o Gen Gun (otros mtodos
menos usados)

Ensayos de transformacin
Analizar las plantas obtenidas (presencia,
estabilidad y nivel de expresin del transgn)

La capacidad de Agrobacterium
tumefaciens de introducir ADN
en el genoma de la planta permiti
desarrollar vectores plasmdicos
basados en el plsmido Ti

Vectores basados en el plsmidos T

-

Mapa de restriccin
de los plsmidos
pBIN19; pPZP111;
pMON10098;
pGreen0029.
Abreviaturas:
BI: borde izquierdo; ori:
origen de replicacin;
BD: borde derecho

diseo de vectores binarios

Tamao
(kb)

Sitios
nicos de
restriccin
en ADN -T

Seleccin
bacteriana

Marcador
de
seleccin
en:

LacZ

pBIN19

11777

Si

Kanamicina

pC22

17500

No

pGA482

13200

pPCV001

9200

pCGN1547

Vector

Origen de replicacin
Mobilizacin
Movilizacin
Agrobacterium

E. coli

BD

pRK2

pRK2

Si

Ampicilina ,
estreptomicina y
espectinomicina

BD

pRi

ColE1

Si

No

Tetraciclina

BD

pRK2

ColE1

Si

No

Ampicilina

BD

pRK2

ColE1

Si

14440

Si

Gentamicina

BI

pRi

ColE1

Si

pJJ1881

25700

No

Tetraciclina

BI

pRK2

pRK2

Si

pPZP111

8909

Si

Cloranfenicol

BI

pVS1

ColE1

Si

pGreen0029

4632

18

Si

Kanamicina

BI Tomado de: Hellens

pSaand Mullineaux,pUC
No
Trends in Plant Science, 2000.

GATEWAY vectors for

Agrobacterium-mediated plant
transformation
Mansour Karimi, Dirk Inz and Ann
Depicker
TRENDS in Plant Science Vol.7 No.5 May
2002

Genes Reporteros
Permiten ver la expresin del transgen (reportero)
GUS

Gen de la glucuronidasa

GFP (green fluorescent protein)

Otras protenas fluorescentes

No es destructiva

Genes reporteros utilizados en transformacin de plantas

-

Genes reporteros

Abreviatura

Origen

Deteccin

-glucuronidasa

gus/uidA

E. coli

Fluoromtrico (cuantitativo)
o histoqumico (in situ),
no radiactivo

Protena de fluorescencia
verde

GFP

Aequorea victoria

Fluorescencia,
no destructiva

Cloranfenicol
acetiltransferasa

Cat

E. Coli

Ensayo radiactivo
sensitivo, semi cuantitativo

Luciferasa

Luc

Photinus pyralis

Luminiscencia

Luciferasa

luxA, luxB

Vibrio harveyi

Luminiscencia

Ejemplo de utilizacin del gen reportero uid A

-

Promotores constitutivos vs tejido especfico

Promotores
-

Promotores constitutivos
todos los tejidos
independiente de factores ambientales
activos entre especies y reinos

Promotores inducibles
expresin dependiente de factores externos
factores abiticos (luz, temperatura, heridas)
factores biticos (ataque patgenos)

Promotores tejido o desarrollo especfico

expresin restringida en tiempo y/o espacio
desde rganos completos durante todo el desarrollo hasta pocas clulas en
corto tiempo
rgano especifico (semillas)

Esqueleto del vector

Bordes Izquierdo y Derecho
Gene de seleccin en bacterias (en E coli y en Agrobacterium)
Genes Reporteros o Genes de Inters
Promotores
Terminadores
Secuencias Enhancer

Para transformar una especie vegetal

Sistema de cultivo de tejidos

Eficiente y reproducible,
Descendencia frtil
Mtodo de seleccin
(Sin escapes)

Vector de Transformacin (gen de

inters, gen de seleccin, promotor,
otras secuencias regulatorias)

Entrega: Cepa de Agrobacterium

o Gen Gun (otros mtodos
menos usados)

Ensayos de transformacin
Analizar las plantas obtenidas (presencia,
estabilidad y nivel de expresin del transgn)

Genes de seleccin
Genes Marcadores
de Seleccin
Seleccin negativa
Kanamicina,
Higromicina,
Gentamicina,

Diferenciar clulas
transformadas de las
no transformadas
vs

Antibiticos

Seleccin Positiva
Manosa y
otros
azcares

manosa-6P
manosa6P
isomerasa

fructosa-6P

Glufosinato de
amonio
Glifosato

Herbicidas

Ejemplos de genes de seleccin

Gen de seleccin

Producto gentico

Fuente

Seleccin

nptII

Neomicina fosfotransferasa

Tn5

Kanamicina, G418,
paromomicina, neomicina

Ble

Resistencia a bleomicina

Tn5 y Streptoalloteichus
hindustanus

Bleomicina, fleomicina

dhfr

Dihidrofolato reductasa

Plsmido R67

Metotrexato

cat

Cloranfenicol acetil
transferasa

Fago p1Cm

Cloranfenicol

Higromicina fosfotransferasa

E. coli

Higromicina B

SPT

Estreptomicina
fosfotransferasa

Tn5

Estreptomicina

aacC3, aacC4

Gentamicin-3-Nacetiltransferasa

Serratia marcescens;
Klebsiella pneumoniae

Gentamicina

Fosfinotricin acetil
transferasa

Streptomices
hygroscopicus

Fosfinotricina, bialofos

5-enolpiruvilshikimato-3fosfato sintasa

Petunia hybrida

Glifosato

aphIV

bar

EPSP

Ya tenemos todos los elementos necesarios, por lo

que podemos armar un vector de transformacin

Para transformar una especie vegetal

Sistema de cultivo de tejidos

Eficiente y reproducible,
Descendencia frtil
Mtodo de seleccin
(Sin escapes)

Vector de Transformacin (gen de

inters, gen de seleccin, promotor,
otras secuencias regulatorias)

Entrega: Cepa de Agrobacterium

o Gen Gun (otros mtodos
menos usados)

Ensayos de transformacin
Analizar las plantas obtenidas (presencia,
estabilidad y nivel de expresin del transgn)

Despus de los ensayos de transformacin, sigue Anlisis T1, T2

Diseo experimental para los ensayos en semillas de lechuga

14 lneas T1 PrHaAP10

Ensayos fluoromtricos

Ensayos histoqumicos

Lneas T2

Tesis
Diego
Zavallo

Y este es el final del trabajo en un laboratorio

con plantas transgnicas??
Luego comienza el camino de los desafos a
los estreses, analizar la equivalencia
sustantiva, observar si aparece el
silenciamiento gnico, la estabilidad de los
transgenes, los niveles de expresin, etc.
Esto en invernculos de bioseguridad

Y as comienza el camino de la desregulacin

(Fase I).

Por ltimo comenzar el camino de la desregulacin en Fase II,

que son las pruebas a campo.

Hasta el momento no existen desarrollos argentinos liberados en el mercado