PRACTICA 3

EL MACRFAGO COMO SISTEMA INMUNOLGICO: EVALUACION

DE LA PRODUCCION DE OXIDO NITRICO

I. INTRODUCCIN
Dentro de la Medicina y dems ciencias biomdicas, una clula es
considerada como un sistema biolgico que permite al investigador hacer
estudios sobre respuesta de una clula frente a un determinado compuesto,
tambin es utilizado para poder expresar genes forneos, es decir utilizarlos
como verdaderas fabricas biolgicas en beneficio del hombre.
Una de las clulas de mamferos ms utilizadas como sistema biolgico para
hacer investigacin en el campo de la Inmunologa, son los macrfagos.
Los macrfagos son glbulos blancos de la sangre que son especializados en
la digestin de partculas y son distribuidos indistintamente en la sangre y
tejidos y participan en la defensa, tanto en la respuesta inmune adaptativa,
como en la respuesta inmune innata, a travs de la ingestin de patgenos,
estas clulas tambin participan en el importante rol de limpieza de clulas
daadas o muertas.
II. OBJETIVOS.
- Obtener macrfagos activados a travs de la infeccin de ratas con lisado
de bacterias.
- Extraer, Aislar y Cultivar macrfagos.
- Cuantificar la produccin de Oxido Nitrico (NO)
III. MATERIALES Y REACTIVOS.
-

Ratas adultas.
Cultivo de bacterias (E.coli).
Jeringas hipodrmicas
Pipetas pasteur
Pipetas de 1,2 y 5 ml
NaCI 0.9 % y NaCI 1.8 %.
Sulfanilamida
Naftilendiamina
Medio de Cultivo RPMI 1640

IV. PROCEDIMIENTO
A) Preparacin de lisado de bacterias:
1. Con la ayuda de una asa de col cosechar las bacterias crecidas en una
placa de agar nutritivo y resuspenderlas en un tubo de ensayo que
contiene 1ml de NaCI al 0.9%.
2. Calentar la suspensin de clulas bacterianas hasta ebullicin, durante
tres veces, agitando cuidadosamente el tubo para evitar que el
contenido se proyecte.

B) Infeccin de ratas con lisado de bacterias.

1. Proceder a inyectar intraperitonialmente los ratones con 1.0 ml de lisado
bacteriano, utilizando una aguja hipodrmica apropiada.
2. Al retirar la aguja, de la piel de la rata, hacerle masajes suaves en el
vientre durante unos veinte segundos.
3. Dejar en incubacin al ratn durante tres a cuatro das, cuidando que no
le falte la alimentacin.
C) Extraccin y aislamiento de macrfagos.
1. Transcurrido los das de incubacin, en donde los macrfagos migraran
desde la sangre hacia el lquido citico en donde se encuentra restos de
lisado bacteriano, inyectar 2 ml de NaCI al 0.9 % o PBS, por va
intraperitonial.
2. Hacer masajes en el vientre del ratn durante 1 min.
3. Abrir el abdomen del ratn como indica el esquema y con ayuda de una
pipeta, retirar cuidadosamente todo el lquido ctrico y colocarlo en un
tubo de ensayo.
4. Para concentrar los macrfagos, centrifugar la suspensin celular a 2000
r.p.m., durante cuatro minutos.
5. Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet con 1ml de NaCI a 0.9 %.
6. Realizar el recuento celular con objetivos de mediano aumento.
Nota: Si la suspensin celular se encuentra contaminada con glbulos
rojos, lo que se manifiesta con la presencia de una coloracin rojiza,
se recomienda eliminarlos mediante un choque osmtico:
resuspender el pellet en 2ml de agua destilada, y mezclar durante
veinte segundos e inmediatamente aadir 2ml de NaCI a 1.8 % y
proceder con el lavado normal.
D) Cultivo de macrfagos
En una placa de cultivo celular de 24 pozos que contiene 0,5 ml de medio
de cultivo para macrfagos (medio RPMI 1640) sembrar 1x106 clulas e
incubar a 37C en un atmosfera de O2 y 5% CO2 durante 30 a 40 minutos
E) Cuantificacin de Oxido Ntrico (NO)
1. Terminado el tiempo d cultivo transferir los macrfagos de la placa de
cultivo a un tubo eppendorf
2. Centrifugar la suspensin celular a 2000 r.p.m., durante cuatro minutos.
3. Transferir 500ul del sobrenadante a un nuevo tubo eppendorf
4. Agregar 500ul del reactivo de Grees
5. Incubar en oscuridad durante 10 min
6. Leer en el espectrofotmetro a 550nm
7. Multiplicar la Absorbancia de la muestra por el factor de calibracin
obtenido a partir de una curva de calibracin con nitrito de sodio

V. RESULTADOS
1. Esquematizar el proceso de obtencin de los macrfagos murinos
2. Determinar el nmero de clulas por ml de suspensin

3. Volumen de suspensin que contiene 1000 000 de clulas

4. Reportar el porcentaje de viabilidad celular
1: Esquematizar:
1.Abrir el abdomen del ratn como indica el esquema y con ayuda de
una pipeta, retirar cuidadosamente todo el lquido ctrico y colocarlo en
un tubo de ensayo.

2.-Para concentrar los macrfagos, centrifugar la suspensin celular a 2000

r.p.m., durante cuatro minutos

3.-Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet con 1ml de NaCI a 0.9 %.

4.-Realizar el recuento celular con objetivos de mediano aumento.

Resultados:

El conteo de macrfagos fue:

1175x2x100= 23500 clulas por 100 mililitros de suspensin

Hay 235 clulas por mililitro de suspensin

VIABLES
NO VIABLES
TOTAL

NO ACTIVOS
20
5
25

ACTIVOS
253
-253

Si

hay 235 por mililitro de suspensin en 1000000 clulas el volumen

seria:
4255,32ml.

VI. CUESTIONARIO.
1. Qu es un sistema biolgico?
Es un conjunto de rganos y estructuras similares que trabajan en conjunto para cumplir
alguna funcin fisiolgica en un ser vivo relacionado con la biologa. El sistema inmunitario
es aquel conjunto de estructuras y procesos biolgicos en el interior de un organismo que
le protege contra enfermedades identificando y matando clulas patgenas y cancerosas
Detecta una amplia variedad de agentes, desde virus hasta parsitos intestinales, y
necesita distinguirlos de las propias clulas y tejidos sanos del organismo para funcionar
correctamente

2. Describa una aplicacin que dara al sistema macrfago para hacer

investigacin en Inmunologa.
El sistema macrfago tiene aplicacin en la aplicacin de vacunas y trasplante de rganos,
tambin en el nuevo tratamiento de enfermedades autoinmunes como el VIH y lupus.
3. Indique 4 caractersticas de un macrfago activado :
Presenta antgenos, produce citoquinas, produce sustancias toxicas como O2, H2O2
OH-,NO. Tienen ms prolongaciones de membrana, mayor nmero de vacuolas, de
lisosomas, fagosomas y cuerpos residuales.

4. Describa la respuesta inmunolgica al inyectar LPS (lipopolisacaridos).

Los lipopolisacaridos al ser detectados por los macrfagos se unen al receptor CD4 y
ocurre la formacin de una vescula endolitica dentro del macrfago llamada fagosoma.

5. Cul es el mecanismo por el cual el macrfago produce NO?

Los macrfagos activados contienen el interferon gama el cual induce y activa a la enzima
iNOS, esta estimula la produccin de NO que ataca a virus y clulas tumorales.