H

H
N

HO

O
C

Polmero lineal de aminocidos

aa unidos en una sola lnea

Protenas: estructura primaria

Tienen funciones diversas:

Enzimas

Catlisis: Aceleran rxns bioq.

Estructura: Proteccin y sostn (ej. Colgeno)
Movimiento: ej. Actina, tubulina

Defensa: ej. Prots de coagulacin, Igs

Regulacin: ej. Insulina
Transporte: ej. Hemoglobina
Almacenamiento: ej. Casena de la leche
Respuesta a agresiones abiticas: ej. Metalotioneina, hsp

Protenas: estructura primaria

(Diversidad De
Polipptidos)

No. de aas= 20.

Si n= no. de residuos contenidos en un polipptido (protena)
20n es el nmero de secuencias posibles.
Ejemplo: para una protena con 100 residuos, existen 20100
polipptidos nicos posibles

1.27x10130

Protenas: estructura primaria

(Diversidad De
Polipptidos)

Tamao y composicin de polipptidos

A.

B.

Tamao (bioqumicamente ptimo)

No. mnimo de residuos 40.
Lmite superior de aas varios cientos (titina 26,926 residuos (2990 kDa).
Composicin (mayor restriccin!).

Diferencia en frecuencia de aparicin:

Aas ms abundantes: Leu, Ala, Gly, Ser, Val y Glu.

Aas raros: Trp, Cys, Met e His.

Identidad del aa?
(propiedades fsicas y qumicas)

Posicin especfica del aa en la

protena?

Fuerzas intramoleculares.
Fuerzas intermoleculares.

Unin de metales
(Ej.: Zn2+ y Ca2+)

Estructura
tridimensional

Unin covalente/no covalente

de grupos qumicos

(Diversidad De
Polipptidos)

Protenas: estructura primaria

Proprotena: trmino general que abarca precursores inactivos de protenas

(ej.: proinsulina, procolgeno) que son escindidas (cortadas) para formar
protenas activas.

Zimgeno (proenzima): precursor inactivo que es

escindido para formar la enzima proteoltica
(proteasa) activa. Ej.: tripsingeno
Puente disulfuro (-S-S-)
entre 2 residuos de Cys

Estructura primaria de la insulina bovina

Protenas: estructura primaria

(Purificacin Y
Anlisis De Protenas)

Microorganismo (E. coli) genticamente modificado para producir grandes

cantidades de proquimosina (protena) y almacenada en forma de cuerpo de
inclusin.

Cmo aislar o purificar las protenas

producidas en las bacterias o levaduras?
Qu factores debo cuidar para que la protena
no se degrade?

Protenas: estructura primaria

Aislamiento de molcula biolgica (protena)
Etapa I
Disgregacin del
tejido

Lisis
celular

Etapa I I I

Etapa I I
Filtracin/
Centrifugacin

Factores que afectan la

estabilidad de protenas
pH

Temperatura

(Purificacin Y
Anlisis De Protenas)

Eliminacin de
detritos celulares

Detergente/
solvente
orgnico

Solubilizacin de
lpidos (opcional)

Recomendacin a seguir para controlar el factor.

Consecuencia/riesgo en caso de NO controlar el factor.
Uso de soluciones amortiguadoras.
Riesgo: alteracin de estructura
desnaturalizacin.
Purificar a temps. cercanas a 0C.
Riesgo: inestabilidad trmica
desnaturalizacin.

Enzimas de degradacin

Inhibir proteasas y nucleasas: ajustar pH y temperatura; usar

inhibidores enzimticos.
Riesgo: degradacin de protenas.

Adsorcin a Superficies

Evitar contacto con: interfaz aire-agua, vidrio o plstico.

Riesgo: desnaturalizacin por contacto.

Inactivacin por almacenamiento

INICIA
SEPARACIN
DE
PROTENAS

Almacenar en nitrgeno lquido (-196C) o en argn, o a -80C.

Riesgo: lenta oxidacin, contaminacin microbiana.

Protenas: estructura primaria. Purificacin y anlisis de protenas

Tcnicas para cuantificar protenas.

I. Espectroscopa.

a) Espectroscopa de absorbancia de aas aromticos: la concentracin del soluto se

determina por medio de su absorbancia (o su densidad ptica). =280nm
Desventajas:
Sensibilidad moderada (mnimo 50100 g/mL).
Absorcin mxima de c. nucleicos a
= 260 nm.
Variacin del contenido de aas
aromticos.
=280 nm

pH=6
[Tyr]=[Trp]=10-3M

Ley de Lambert-Beer

Io
log
I

=280 nm

cl

I0= Intensidad de la luz incidente a una .

I= Intensidad de la luz transmitida.
= Absorbancia molar (coef. de extincin molar).
c=Conc. molar del soluto.
l= longitud del recorrido de haz de luz en cm.
MC Berenice Prez

Protenas: estructura primaria. Purificacin y anlisis de protenas

Tcnicas para cuantificar protenas.

I. Espectroscopa.
b) Espectroscopa de absorbancia: tcnica de Bradford la unin del reactivo de
Bradford (Coomassie brilliant blue) por las protenas hace que la absorcin
mxima del colorante cambie de 465 nm a 595 nm.

Ventajas:
El reactivo se fija en forma homognea a todos los
aminocidos.
Cambio de Absmax a = 595 nm (no hay
interferencia de cidos nucleicos).
Sensibilidad elevada ( 1 g/mL).

MC Berenice Prez

Protenas: estructura primaria. Purificacin y anlisis de protenas

Tcnicas para cuantificar protenas

II. Inmunoensayos
(procedimientos inmunoqumicos)

Elementos esenciales:
-Anticuerpos (Ac)

-Antgenos (Ag)

-Enzimas
-Substratos
Alta sensibilidad y especificidad.
Algunos utilizan radiomarcaje (RIA).
MC Berenice Prez

Protenas: estructura primaria. Purificacin y anlisis de protenas

Tcnicas para cuantificar protenas

II. Inmunoensayos Caractersticas del RIA:
Involucra radiomarcaje.
a) Radioinmunoensayo (RIA)
Prueba indirecta.
Competitivo.

MC Berenice Prez

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Tcnicas para cuantificar protenas

II. Inmunoensayos
b) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbant Assay)
Caractersticas de ELISA:
No requiere radioistopos.
Mltiples variantes.

http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072556781/student_view0/chapter33/animation_quiz_1.html

MC Berenice Prez

Protenas: estructura primaria. Purificacin y anlisis de protenas

Tcnicas para separar protenas

Propiedad fisicoqumica
aprovechada

Solubilidad

Carga inica

Polaridad

Tamao

Especificidad de unin

Cromatografa de
interaccin hidrfoba

Disminucin de
solubilidad

Cromatografa de
intercambio inico

Isoelectroenfoque

Electroforesis

Filtracin en gel

SDS-PAGE

Ultracentrifugacin
Cromatografa de
afinidad

Las propiedades pueden ser usadas en forma independiente durante diversas etapas
de separacin .
Un objetivo central es eliminar los componentes indeseables de la mezcla.
No es imperativo, al inicio, evitar la prdida de la protena.
MC Berenice Prez

Protenas: estructura primaria. Purificacin y anlisis de protenas

Tcnicas para separar protenas

I. Fraccionamiento por disminucin de la solubilidad
(salting out)

MC Berenice Prez

Protenas: estructura primaria. Purificacin y anlisis de protenas

Tcnicas para separar protenas

MC Berenice Prez

Protenas: estructura primaria. Purificacin y anlisis de protenas

Tcnicas para separar protenas

II. Cromatografa
a) Cromatografa de intercambio inico. Carga inica.
Usa:
*intercambiador de aniones (para atrapar aniones) = DEAE (+)
*intercambiador de cationes (para atrapar cationes) = CM ( )
*Buffer eluyente con sal en aumento o un pH

Pueden medirse a
280nm, Bradford,
ELISA, etc

MC Berenice Prez

Protenas: estructura primaria. Purificacin y anlisis de protenas

Tcnicas para separar protenas

II. Cromatografa
HPLC

Incrementa en la separacin:
Velocidad
Resolucin
Reproducibilidad

MC Berenice Prez

Protenas: estructura primaria. Purificacin y anlisis de protenas

Tcnicas para separar protenas

II. Cromatografa
b) Cromatografa de interaccin hidrfoba (fase reversa).
Polaridad
Usa:
* Matriz con grupos no polares para retener protenas
* Buffer eluyente con sal en disminucin y detergente en aumento o

de pH

MC Berenice Prez

Protenas: estructura primaria. Purificacin y anlisis de protenas

Tcnicas para separar protenas

II. Cromatografa
c) Cromatografa de filtracin en gel (exclusin). Tamao.
Molculas pequeas migran ms lento.
Usa:
* Como FE esferas de gel con poros

MC Berenice Prez

Protenas: estructura primaria. Purificacin y anlisis de protenas

Tcnicas para separar protenas

II. Cromatografa
d) Cromatografa de afinidad. Especificidad de unin.
Usa:
* Ligando (Ac, metal) covalentemente unido a la matriz

MC Berenice Prez

Protenas: estructura primaria. Purificacin y anlisis de protenas

Tcnicas para separar protenas

III. Electroforesis
a) Electroforesis en gel de poliacrilamida. Carga, tamao/peso y
forma
Molculas pequeas migran ms rpido

Usa: * Geles de agarosa o poliacrilamida con poro caracterstico. Electrodos

Para visualizar resultado:
Colorante Coomassie
Radioactividad
Anticuerpos (Western Blot)

SDS-PAGE (solo masa molecular)

MC Berenice Prez

PM

350 KDa
200
280
100
150
50

MC Berenice Prez

MC Berenice Prez

Protenas: estructura primaria. Purificacin y anlisis de protenas

Tcnicas para separar protenas

III. Electroforesis
b) Eletroforesis capilar. Carga, tamao/peso y forma
Resolucin muy alta

Usa: * Tubos capilares muy finos

MC Berenice Prez

Protenas: estructura primaria. Purificacin y anlisis de protenas

Tcnicas para separar protenas

III. Electroforesis
c) Isoelectroenfoque y electroforesis 2D. pI, carga y tamao/peso
Usa: * Solucin o gel con gradiente de pH
* gel de poliacrilamida con poro y SDS

MC Berenice Prez

pH1
(+)

9 645122

pH14
(-)

MC Berenice Prez

PM

5 6

12

MC Berenice Prez

MC Berenice Prez

Protenas: estructura primaria. Purificacin y anlisis de protenas

Tcnicas para separar protenas

IV. Ultracentrifugacin
Tamao, densidad, forma

Usa: * Gradientes de densidad

MC Berenice Prez

Protenas: estructura primaria. Purificacin y anlisis de protenas

Secuenciacin de protenas

MC Berenice Prez

Protenas: estructura primaria. Purificacin y anlisis de protenas

Secuenciacin de protenas
A. Pasos preliminares
Cuntas subunidades o
cadenas polipeptdicas
constituyen una protena?
=Tantas como residuos N-terminal.
Cloruro de dansilo

MC Berenice Prez

Protenas: estructura primaria. Purificacin y anlisis de protenas

Secuenciacin de protenas
A. Pasos preliminares
Los puentes disulfuro se deben cortar
*Reduccin con 2-mercaptoetanol

MC Berenice Prez

Protenas: estructura primaria. Purificacin y anlisis de protenas

Secuenciacin de protenas
A. Pasos preliminares
Cul es la composicin del polipptido?
(Qu aminocidos componen el polipptido?)
=Mediante hidrlisis completa seguida de Cromatografa

MC Berenice Prez

Protenas: estructura primaria. Purificacin y anlisis de protenas

Secuenciacin de protenas
B. Corte de polipptidos
Para fragmentar polipptidos:
Tripsina
a) Uso de proteasas:
Endopeptidasas: enzimas que catalizan la hidrlisis de enlaces peptdicos internos
Exopeptidasas:

de residuos N- y C-terminales

MC Berenice Prez

Protenas: estructura primaria. Purificacin y anlisis de protenas

Secuenciacin de protenas
B. Corte de polipptidos

MC Berenice Prez

Protenas: estructura primaria. Purificacin y anlisis de protenas

Secuenciacin de protenas
B. Corte de polipptidos
Para fragmentar polipptidos:
a) Uso de reactivos qumicos como Bromuro de Ciangeno (CNBr)

metionina

MC Berenice Prez

Protenas: estructura primaria. Purificacin y anlisis de protenas

Secuenciacin de protenas
C. Degradacin de Edman
Secuenciacin por ciclos repetidos de degradacin de Edman,
en el que se produce la eliminacin de aa, uno a uno, a partir del N-terminal

Feniltiocarbamilo

Ms
estable
Feniltiohidantona
MC Berenice Prez

Protenas: estructura primaria. Purificacin y anlisis de protenas

Secuenciacin de protenas
D. Espectrometra de masas
MS o EM: Mide con exactitud la relacin masa-carga (m/z) de los iones en fase gaseosa.
Par caracterizar y secuenciar polipptidos.

Ionizacin por electrospray

iones protonados

relacin m/z
espectro
iones que difieren en una carga
MC Berenice Prez

Protenas: estructura primaria. Purificacin y anlisis de protenas

Secuenciacin de protenas
D. Espectrometra de masas
Espectro de masas.

MC Berenice Prez

Protenas: estructura primaria. Purificacin y anlisis de protenas

Secuenciacin de protenas
D. Espectrometra de masas
Espectrometra de masas en tndem (MS-MS o EM-EM)
Comparacin de las masas moleculares de miembros sucesivamente ms largos de
una familia de fragmentos
Se deduce as la secuencia del polipptido

MC Berenice Prez

Protenas: estructura primaria. Purificacin y anlisis de protenas

Secuenciacin de protenas
E. Reconstruccin de la secuencia proteica
Generacin de fragmentos superpuestos para determinar la secuencia de aa
de un polipptido. En el orden correcto.

MC Berenice Prez

Protenas: estructura primaria. Purificacin y anlisis de protenas

Secuenciacin de protenas
E. Reconstruccin de la secuencia proteica
Paso final: determinar posiciones de S-S (si los hay)

MC Berenice Prez

MC Berenice Prez

MC Berenice Prez

Protenas: estructura primaria

Estructura primaria de la
quimotripsina

(Diversidad De
Polipptidos)

Acercamiento de la interaccin
entre el sitio cataltico de la
quimotripsina y un substrato

NOTA: Los residuos His57, Asp102 y

Ser195 forman el sitio cataltico.

Protenas: estructura primaria. Purificacin y anlisis de protenas

Diapo cancelada
Tcnicas para cuantificar protenas
II. Inmunoensayos
(procedimientos inmunoqumicos)

Elementos esenciales: Acs, Ags, enzimas y substratos.

Algunos utilizan radiomarcaje (RIA).
Alta sensibilidad y especificidad.
a) Radioinmunoensayo (RIA)
Hormona radiomarcada

Anticuerpo

Mezcla de hormona
radiomarcada y no marcada

Caractersticas del RIA:

Involucra radiomarcaje.
Prueba indirecta.
Competitivo.