Anlisis gentico de GHR debe contener la

secuenciacin de todos los exones de

codificacin especfica de Intrn Secuencias y
deteccin de exn supresiones
Resumen
Antecedentes: El trabajo de los pacientes con caractersticas clnicas y / o
bioqumicas de la insensibilidad de hormona de crecimiento (GHI) por lo
general contiene anlisis gentico del receptor de la hormona del crecimiento
gen (GHR), y si es negativa, de STAT 5 B, y IGFALS y IGF1. En un informe
anterior describimos 2 hermanos que presentan talla baja, bajos niveles de
IGF-1, la secrecin elevada GH y ningn aumento de IGF-1 despus de 1
semana de la administracin de GH. Anlisis repetido de GHR no mostr
alteraciones; Sin embargo, nuevas pruebas revelaron una heterozygous STAT5B
defecto en ambos hermanos .Subjects y Mtodos: Dos muchachos de Origen
Surinam-Hindustan mostr la falta de crecimiento hasta la edad de 6-7 aos,
seguida de la recuperacin del crecimiento parcial asociado con el aumento de
ndice de masa corporal. Reanlisis del GHR incluyendo publicacin secuencias
de intrones se realiz en el ADN de los pacientes recogidos 7 aos antes.
Resultados: La variante heterozygous STAT5B result ser funcionalmente
benigna. LA mutacin intrnica homocigotos del GHR, c.618 + 792A> G (IVS6
+ 792A> G), posteriormente fue encontrado, lo que resulta en la activacin del
pseudoexon 6, y explicar la GHI fenotipo de los pacientes. Conclusin: Una
mutacin intronica en el GHR se debe considerar en todos los pacientes con
signos de GHI y ningn codificacin de las mutaciones de exn, incluso si el
fenotipo es leve y aunque se han encontrado otras variantes genticas.
Introduccin
En nuestro reciente documento sobre el anlisis gentico de los nios
pequeos con la aparente insensibilidad de la hormona de crecimiento (GHI)
[1] se inform de que no se encontraron crecimiento homocigotos del receptor
de la hormona mutaciones (GHR), y slo tres variantes heterozygous GHR.
Tambin inform de 3 pacientes con dos variantes nuevas heterozygous
STAT5B, y en 2 pacientes este hallazgo se combin con la nuevas variantes
heterocigticas IGFALS. En nuestra cohorte de pacientes, hubo 2 hermanos (RZ
y IZ) con severa GHI en trminos de caractersticas clnicas as como los
hallazgos bioqumicos. Sin embargo, el anlisis gentico de GHR fue negativo
en dos laboratorios independientes. Los hermanos compartan una variante no
clasificados en heterocigotos STAT5B, pero en el anlisis de prediccin in silico
(PolyPhen-2 programa: http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) sugiri la
variante era benigno.

Fig. 1. Pedigree. Smbolos para 4 variantes genticas se indican. Altura SDS se

menciona segn la referencia de la OMS [3].
Hace muy poco se nos inform por uno de los laboratorios que se haba llevado
a cabo el anlisis gentico inicial que al reanlisis, una mutacin homocigota se
encontr en el intrn 6 de GHR, una regin que no se incluy en el proyecto
inicial. En esta breve nota se describe la clnica y los detalles de laboratorio de
estos pacientes, incluida su curvas de crecimiento y los resultados de estudios
functional STAT5B.
Sujeto y mtodos
IZ naci despus de 38 semanas de gestacin con un parto normal peso (0,2
SDS) [2] (longitud desconocida de nacimiento). Los padres eran de
ascendencia Surinam-Indostn. La altura del padre era 163 cm (-1,8 SDS segn
la Organizacin Mundial de la Salud, OMS, de referencia) [3] y la altura de la
madre era de 160 cm (-0,5 SDS; target altura -0,8 SDS) [4]. El rbol
genealgico se muestra en la figura 1. En el primer 7 aos de vida la altura del
paciente SDS disminuyeron y en el primer examen por el endocrinlogo
peditrico en 6,98 aos a su altura fue de 107 cm (-2,8 SDS para la referencia
de la OMS [3], -3,5 para el Referencia holandesa [5]), el ndice de masa
corporal (IMC) fue de 1.3 para holandesa 1980 referencias [6] y la
circunferencia de la cabeza fue -1.2 SDS [7]. Su IGF-1 nivel fue -4.2 SDS [8] y
mostraron ningn aumento en la administracin de altas dosis de rhGH por 1
semana (2,8 mg / m2). Curiosamente, su altura SDS se increment a partir de
entonces, sin ningn tratamiento, y el ms altura reciente SDS fue -1.2 SDS en
la carta de la OMS [3] (-2,0 en el grfico holands [5]) a 15,9 aos de edad (fig.
2 a). Al mismo tiempo, su ndice de masa corporal aumenta (fig. 2 b) y

actualmente es de 2,2 SDS. Pubertad comenzado a 13,6 aos. Curiosamente,

su nivel de IGF-1 aument de -4.2 SDS a 7,4 aos a 0 SDS a la edad de 14,5
aos. La prolactina fue 0,16 U / l (normal), y no hubo signos de
inmunodeficiencia. Su ms joven RZ hermano naci con un peso al nacer de
0,2 SDS y una longitud nacimiento de -2,3 SDS [2]. Su altura SDS disminuy en
los primeros 6 aos de vida, y en el primer examen en 3,3 aos de la edad de
su altura era de 83 cm (-3,9 SDS de acuerdo con el cuadro de la OMS [3], -4,4
para la referencia holandesa [5]), el IMC fue del -0,3 SDS [6] y circunferencia de
la cabeza era -2.5 SDS [7]. Su curva de crecimiento y el IMC la evolucin fue
similar a la de su hermano (fig. 2 c, d). Su IGF-1 nivel estaba por debajo del
lmite de deteccin del ensayo y permaneci indetectable despus de la
administracin de altas dosis de rhGH durante 1 semana. l tena una voz
aguda y su desarrollo psicomotor fue retrasado. l ha mostrado signos de
inmunodeficiencia. A 12.7 aos su altura es de -1.2 SDS de acuerdo con el
cuadro de la OMS [3] (-1,8 para la referencia holandesa [5]), y el ndice de
masa corporal es de 3,0 SDS [6]. La pubertad tiene no empezado. El ms
reciente nivel de IGF-1 fue de -1.8 SDS [8] y la prolactina fue de 0,12 U / l
(normal). De la nota, SDS altura actuales de ambos los nios no es diferente de
la altura del objetivo SDS.
Anlisis gentico de GHR
En 2007, ninguna aberracin patgena se pudo detectar con el cdigo de
exones (incluyendo las secuencias flanqueantes del intrn hasta 75
nucletidos) del gen GHR. En 2010, las pruebas genticas del GHR (codificacin
de exones incluyendo secuencias de acompaamiento intrn hasta 30
nucletidos en intrn y MLPA para detectar variantes de nmero de copias) y
varios otros genes [1] se repiti, y de nuevo no se encontraron aberraciones en
el GHR. En 2013, se volvieron a analizar las muestras de ADN de 104
pacientes GHI de 97 familias con etiologa desconocida. La secuencia genmica
que abarca la anteriormente definida GHR pseudoexon 6 [9, 10], fue
amplificado por PCR utilizando cebadores GHRX6psiF 5 'TCCCTCTCTTCCTTACCAAGC-3' y GHR-X6psiR 5 '-TTTGACTTAGCATCCAATCAGG-3',
seguido de dideoxi secuenciando el ADN de los productos de la PCR.
Otras pruebas genticas
Como se inform anteriormente [1], los dos hermanos llevan varias otras
variantes de genes (Fig. 1). IZ tambin lleva una variante heterocigota en
STAT5B (p.Glu315Ala). la variante STAT5B no se encontr en La madre. Por
desgracia, el padre no pudo ser probado. RZ tambin

Fig. 2. Altura (a) [5] y el ndice de masa corporal (b) [6] de IZ paciente.
lleva la variante STAT5B y, adems, un heterocigotos en la variante IGFALS
(p.Arg548Trp) y una delecin en el cromosoma X (Xq25 arr (SNP_A-2.190.162
SNP_A-215495) estera x0). La Variante IGFALS y la supresin en el cromosoma
X tambin fueron que se encuentra en la madre.
STAT5B p.Glu315Ala (p.E315A) Estudios funcionales
la Variante STAT5B p.Glu315Ala se gener y estudios funcionales (expresin
variante, la fosforilacin de la GH inducida variante, la actividad transcripcional
medida por ensayos de reportero de luciferasa) se realizaron en los HEK293
(hGHR) reconstitucin sistematica

Fig. 2. Altura (c) [5] y el ndice de masa corporal (d) [6] de RZ paciente
Como se describi anteriormente [1]. El N-terminal FLAG-STAT5BE315A (FE315A) se gener por mutagnesis especfica del sitio (QuickChange II dirigida
al sitio Kit de Mutagnesis, Stratagene, La Jolla, California, utilizando pcDNA3.1
que llevan de tipo salvaje N-FLAGSTAT5B como plantilla., EE.UU.)
Resultados
la Variante STAT5B p.Glu315A es Funcionalmente benigna Se determin
primero si el missense heterocigtica Variante STAT5B (exn 8) identificado en
ambos hermanos poda

Fig. 3. Estudios de la reconstitucin de la heterozygousSTAT5B variante

p.Glu315Ala. Vector (pcDNA3.1), N-terminalmente FLAGSTAT5B de tipo salvaje
variante (F-STAT5B) o F-STAT5B-Glu315Ala (F-E315A) se transfectaron en
HEK293 (hGHR) como anteriormente se describe [1] y tratados con GH a las
concentraciones indicadas. Cantidades iguales de lisados celulares se utilizaron
en la analysis.a Western anlisis de inmunotransferencia de GH inducida por
fosforilacin de la tirosina STAT5B (PY-STAT5). Los anticuerpos primarios se
indican a la izquierda lado de las actividades reportero de luciferasa inducida
por GH-panels.b. Relativa veces de induccin ( SD) en comparacin con no
tratados (GH 0 ng / ml) clulas transfectadas pcDNA3.1 (arbitrariamente
designados como 1) de 2 experimentos independientes, cada uno realizado al
menos por duplicado.
Poner en peligro las actividades STAT5b y explicar el Fenotipo GHI observado.
Sin embargo, en los estudios de la reconstitucin, la Variante F-STAT5BGlu315Ala (F-E315A; Fig. 3) se expres as como de tipo salvaje F-STAT5B y GH
inducida fosforilacin y actividades transcripcionales de la variante eran de
forma reproducible comparable a la de tipo salvaje F-STAT5B (fig. 3 a, b). Estos
resultados demostraron que el variante era funcionalmente benigno y poco
probable que sea la causa de la GHI en estos probandos.
La identificacin de un Homocigto GHR c. 618 + 792A> G Mutacin
Secuenciacin 104 pacientes de 97 familias, 3 pacientes incluyendo los 2
hermanos que se describen aqu (= 2 familias) fueron encontrado para llevar
mutacin del GHR 'pseudoexon'. Ambos hermanos son portadores homocigotos
de la c.618 + 792A> G mutacin (IVS6 + 792A> G) del GHR (fig. 4), como se
describe por Metherell et al. [10] y David et al. [11]. Esta mutacin da lugar a
la inclusin adicional de 108 bases entre el exn 6 y 7 (6 pseudoexon). Esto
se traduce en la adicin de 36 aminocidos en el dominio extracelular del
receptor. Estudios previos incluyendo funcional El anlisis mostr una reduccin
significativa en la expresin del GHR mutante en la superficie celular como el

resultado de un defecto de trfico [11]. Esto condujo a GHI con cierta

variabilidad de las manifestaciones fenotpicas [10]

Discusin
Este breve informe es presentado por tres razones. En primer lugar, ilustra que
el clnico siempre debe interpretar una resultado negativo de una prueba
gentica a la luz de las limitaciones de las tcnicas utilizadas en el laboratorio.
En el momento del primer anlisis GHR en 2007, la mutacin especfica en
intrn 6 haba sido descrita en 1 altamente consangunea Familia paquistan [9]
y se consider que era demasiado raro y demasiado especficas para un grupo
tnico especial que se incluirn en el anlisis de la mutacin rutinario de GHR.
La reciente reanlisis de un mayor nmero de pacientes revel que esta
mutacin en particular es ms frecuente de lo esperado. Por lo tanto, una
prueba negativa para algunos defectos genticos no es necesariamente
definitiva, y debe ser interpretado con cautela. Si se justifica, debe ser reevaluado cuando la nueva causa de defectos el fenotipo clnico est disponible.
La segunda razn es que sirve como una fe de erratas para el artculo anterior
donde se describen estos 2 pacientes como no teniendo ninguna mutacin en
el GHR y, por lo tanto, se centr en las otras variantes identificadas, en
particular la variante heterocigota STAT5B. Sin embargo, los pacientes
carecan de algunos de las caractersticas fenotpicas tpicas de la deficiencia
STAT5B: no haba seales de la inmunodeficiencia y niveles de prolactina
fueron normales. La variante STAT5B, adems, ha demostrado ser
funcionalmente normal (fig. 3).

Fig. 4. electroferogramas de anlisis de secuenciacin de ADN de los 2

hermanos IZ y RZ y un control de tipo salvaje (WT), que muestran la c.618
homozygousGHR + 792A> G mutacin (marco negro); -end 3 'de la 6
pseudoexon se indica por la flecha gruesa.

RZ tena dos variantes adicionales, con posible efecto en estatura. Se especul

que la Xq25 delecion, que contiene un gen (WDR40C), no tuvo ningn efecto
en la altura, pero que la Variante IGFALS podra contribuir a la baja estatura de
RZ. Esto fue apoyado por un 150-kDa pico complejo ternario inferior y un nivel
ALS srica menor que en IZ [1]. Sin embargo, la madre tambin llevado a
ambas variantes y tiene una altura dentro de la gama normal. Se trata sin duda
de que con el rpido surgimiento de nuevas metodologas analticas genticas,
numerosas variantes moleculares se encontraron en un solo paciente. Pese A la
mayora de estas variantes es probable que sean benignos, o digenicos incluso
efectos causales oligogenicos no hacen ms probable, especialmente cuando
se asocia con consanguinidad. Este es ilustra en un informe sobre un caso
reciente de un paciente con GHI causada por un c.618 homocigotos + 792A>
mutacin GGHR (IVS6 + 792A> G), que tambin se present con deficiencia de
cortisol primaria, que pareca ser el resultado de una mutacin homocigota en
el gen theAAAS - la causa de la triple A sndrome [12]. Por lo tanto, continu la
colaboracin entre los mdicos y el laboratorio de gentica es esencial. La
tercera razn es las presentaciones clnicas inusuales de los hermanos. En los
primeros 6-7 aos presentaron una patrn de crecimiento consistente con
mutacin a GHR, con disminuyendo gradualmente la altura SDS, despus de lo
cual ponerse al da Se observ el crecimiento, mientras que el IMC aumenta. Si
los pacientes se haban visto por primera vez en la adolescencia, cuando no
haba ponerse al da en el crecimiento y de IGF-1 los niveles estaban dentro del
rango normal, estos defectos del GHR improbables tendran que haber sido
considerado. El aumento de la IGF-1 en el tiempo es interesante, y sugiere que
en estos muchachos hay factores-GH independiente que estimulan la secrecin
de IGF-1. Tiene Se ha demostrado que el IGF-1 los niveles aumentan con el
avance etapa puberal, posiblemente por la accin de esteroides sexuales en
IGF-1 a travs de la secrecin de estradiol [9]. Esto podra explicar la aumento
de IGF-1 en IZ; sin embargo, RZ no tiene signos de la pubertad. Como los dos
chicos se han convertido en obesos, especular que factores hormonales
implicados en la obesidad podran desempear un papel en la el aumento de
IGF-1 y el crecimiento alcanzar observada circulante. En los ltimos aos, otros
14 pacientes de 6 no relacionada familias con una mutacin del GHR
pseudoexon 6 tienen han descrito [10, 11, 13]; 5 de estas familias eran de
Origen paquistan y 1 familia era de Palestina rabe- origen. Nuestra familia es
de ascendencia Surinam-Hindustan, lo que puede haber un efecto fundador
procedente de la Subcontinente indio. El fenotipo clnico es amplio, que van
desde los rasgos faciales normales a una tpica facies Laron. La talla baja es el
sntoma ms comn y va desde -3,3 a -6,0 SDS [10, 11, 13]. IGF-1 y IGFBP-3
niveles son generalmente bajos o en la parte baja de lo normal alcance. El
fenotipo leve es compatible con los pacientes diagnosticados con talla baja
idioptica. Se ha sugerido que los diferentes fenotipos pueden ser causados
por la presencia de heterogeneidad transcripcin y que los sujetos
medianamente afectadas podran tener relacin transcripcin a GHR a favor de

la protena normal, mientras que los pacientes gravemente afectados tener

una proporcin en favor de la protena mutante [10]. En nuestro pacientes la
velocidad de crecimiento cada vez mayor podran ser el resultado de un tipo
salvaje relacin de cambio / mutante con el tiempo. En adicin, la pubertad y la
obesidad tambin podran contribuir al patrn de crecimiento observado. Slo
2 pacientes se han reportado haber recibido rIGF-1 tratamiento [13]. La
velocidad de crecimiento en el paciente con la mutacin combinedGHR
andAAAS aument de 4,0 a 9,5 cm / ao en el primer ao, pero disminuy a
5.0 cm / ao en el segundo ao. Su hermano, que era homocigoto para la
mutacin GHR intrnico solamente, tena una mejor respuesta de 10,2 y 8,1 cm
/ ao durante el primer y segundo ao de rIGF-1 tratamiento, respectivamente.
Recientemente, una prometedor estudio en oligonucletidos antisentido
omisin de exn como una nueva herramienta teraputica para corregir el
aberrante empalme por defecto GHR 6 fue publicado como una alternativa
para rIGF-1 tratamiento en esta condicin [14]. En conclusin, las pruebas
genticas en nios con corta estatura requiere una estrecha colaboracin en
curso entre el clnico y el laboratorio de gentica. Los resultados de los anlisis
genticos deben interpretarse a la luz actual tcnicas y conocimientos. El
intronic descrito mutacin del GHR debe ser considerada en todos los
pacientes con signos de GHI y con la falta de codificacin de las mutaciones de
exn, incluso si el fenotipo es leve.