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A eletroforese a migrao de uma molcula carregada sob a influncia de um campo

eltrico. A mobilidade eletrofortica dada por:


=

v/E

= Z/f

Onde:
A mobilidade eletrofortica () a razo entre a velocidade(v) da macromolcula e o
potencial eltrico(E) que move a macromolcula ou a razo entre a carga lquida(Z) e o
coeficiente de atrito(f).

Suportes para eletroforese


Os suportes para eletroforese comumente empregados so os gis de poliacrilamida para
protenas e agarose para os cidos nuclicos, em virtude de estes polmeros funcionarem
como uma peneira molecular, ou seja, separar as espcies em funo de sua massa e
tamanho molecular, respectivamente, inibe a propagao do calor em virtude do atrito
causado pela migrao e pela aplicao do campo eltrico.
Os gis de poliacrilamida so comumente utilizados na separao de protenas em virtude de
ser quimicamente inertes, facilidade de colorao com nitrato de prata e corante azul de
Coomassie(corantes como esses coram totalmente a agarose impossibilitando a identificao
das espcies no eletroforetograma), os poros so facilmente ajustveis atravs do controle
de acrilamida e bis-acrilamida que so os polmeros que formam o gel.

Os gis de agarose so utilizados para macmolculas com massa molecular a superior a 200
kD visto que os cidos nuclicos apresentam massas moleculares extremamente grande. A
colorao do eletroforetograma de cidos nuclicos realizada como brometo de etdio, em
fuo dos outros corantes provocarem a corao total do gel de agrose impossibilitando a
identificao dos cidos nuclicos.

Eletroforese de macromolculas em Gel de SDS


A amostra de interesse deve ser preparada com o rompimento da matriz em que encontra-se
o composto de interesse, nesse caso uma clula que rompida por mtodos, fsicos ou
qumicos onde os mtodos fsicos incluem destruio mecnica ou macerao e mtodos
qumicos funcionam atravs do rompimento por meio da adio de compostos qumicos que
no afetem as caractersticas fsico-qumicas, do composto de interesse.
Aps a essa preparao a amostra colocada em uma soluo chamada de tampo de
amostra que contm em sua composio agentes qumicos redutores, desnaturantes e
tamponantes. Em seguida essa soluo aquecida a 90C por um perodos de 5 a 10
minutos para desnaturao da macromolcula. Um exemplo desses agentes so:
SDS ou dodecilsulfato de sdio: uma molcula anfiflica usada como desnaturante, ou
seja, um detergente que adicionado a soluo com o objetivo de proporcionar uma carga
liquida negativa para a biomolcula de interesse, de modo que ele agrega-se ao redor desta.
Agentes redutores: os agentes redutores comumente utilizados so -mercaptoetanol o
DTT (ditiotreitol), que agem causando a reduo das pontes dissulfeto que so responsveis
pela estrutura nativa da protena.

Resumidamente o procedimento para eletroforese de macromolculas o seguinte:


1.

As macromolculas so colocadas em uma soluo chamada tampo de amostra


contendo SDS, Azul de Bromo-fenol e DTT;

2.

A soluo tampo de amostra contendo as protenas aquecida a 90C de 5 a 10


minutos;

3.

Aps o aquecimento das protenas so desnaturadas, suas ligaes dissulfeto so


quebradas, e o SDS agrega-se ao redor das protenas proporcionando uma carga
lquida negativa.

Mecanismo da eletroforese
Abaixo descrito o mecanismo da eletroforese.
1 a amostra contendo as macromolculas devidamente desnaturadas e reduzidas
distribuda ao nos poos ou cavidades do gel de suporte;
2 - aps a distribuio o equipamento fechado e o campo eltrico aplicado no gel, atravs
de um dispositivo diferencial de energia eltrica e as macromolculas vo sendo distribudas
pela extenso do gel e so separadas em funo de sua massa e tamanho molecular que so
os principais fatores que determinam a mobilidade eletrofortica.
No topo do gel existe uma mistura de macromolculas de variados tamanhos e massas
moleculares de modo que quando o campo eltrico aplicado as molculas menores migram
primeiro, pela malha formada pelo gel. Ao passo que durante a distribuio o gel funciona
como uma peneira molecular e as molculas com massa molecular mais elevada vo sendo
retidas ao longo do processo pelas malhas gel o que permite que as macromolculas sejam
analisadas pela sua massa molecular.
No final do processo quando todas as macromolculas esto ditribuidas o gel mergulhado
em uma soluo corante.
Para protenas so usadas soluo de nitrato de prata que detecta protenas mesmo que a
concentrao seja muito baixa. Ou o gel mergulhado em uma soluo cida e alcolica de
corante azul de coomassie. Um perodo de tempo aguardo e em seguida observa-se o
eletroforetograma que nada mais do que o gel corado. Para analise de cidos nuclicos
(DNA e RNA) so usados corantes como brometo de etidio, laranja de acridina e profalvina
que so corantes com estrutura aromtica, quando sob a luz utravioleta apresentam
fluorescncia.

Focalizao Isoeltrica de protenas em gel de SDS


Uma tcnica muito poderosa para analise de protenas que proporciona alta resoluo
chamada Focalizao Isoeltrica onde as protenas so separadas, atravs de seu ponto
isoeltrico.
A focalizao isoeltrica consiste na neutralizao das cargas das protenas onde um gel
contendo anflitos (ons que se comportam como cido e base ao mesmo tempo),
submetido a um campo eltrico de modo que no momento em que os anflitos migram em
direo aos plos negativos e positivos de acordo com sua carga eltrica e distribuem-se
pelo gel cilndrico, estabelecendo assim um gradiente de pH estvel onde as protenas iro

migrar para um local onde seu ponto isoeltrico seja igual o do anflito. A focalizao
isoeltrica se processa da seguinte maneira:

No primeiro gel os anflitos adicionados so distribudos com a aplicao do campo


eltrico.

No segundo gel adicionada a soluo de protenas.

No terceiro gel aplicado o campo novamente e as protenas migram em direo a


seu ponto isoeltrico.

O processo de migrao termina por que as cargas se igualam, ou seja, pI = pH as cargas se


anulam de modo que na equao inicial Z=0, e a protena focalizada ou seja ela para
exatamente no ponto conhecido.

Eletroforese Bidimensional ou 2D
Essa tcnica oferece uma resoluo melhor, ou seja, um grau maior de detalhes no
eletroforetograma final por que combina a focalizao isoeltrica e a eletroforese em gel
SDS. De acordo com o esquema abaixo:
Na eletroforese bidimensional o gel da focalizao isoeltrica colocado horizontalmente
sobre um gel de sds, o campo eltrico aplicado e as macromolculas proticas so
separadas de acrodo com o ponto isoeltrico e em funo de sua massa molecular,
fornecendo um eletroforetograma que possibilita a visualizao e identificao de vrias
protenas de uma s vez.

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