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So Paulo
2012
So Paulo
2012
rea de Concentrao:
Engenharia Qumica
So Paulo
2012
AGRADECIMENTOS
RESUMO
ABSTRACT
LISTA DE FIGURAS
NaCl a 298,2 K. Dados experimentais (Grnwall, 1941): 0,001 mol L-1 NaCl (); 0,005
mol L-1 NaCl (); 0,01 mol L-1 NaCl (); 0,02 mol L-1 NaCl (). Modelagem: linha
contnua, 0,001 mol L-1; linha pontilhada, 0,005 mol L-1; linha semi-contnua, 0,01 mol
L-1; linha com travesses, 0,02 mol L-1.......................................................................56
Figura 4.1 - Valores de solubilidade da DL-Alanina a 298,15 K em soluo aquosa.
Dados experimentais (o), Tseng et al. (2009); soluo com NaOH ou HCl (),
Pradhan e Vera (1998); soluo com KOH ou HNO3 (), Pradhan e Vera (1998).
Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada). .........................70
Figura 4.2 - Valores de solubilidade de DL-Metionina a 303,0 K em soluo aquosa
(com HCl ou NaOH) em funo do pH. Dados experimentais (), Fuchs et al. (2006).
Modelagem: soluo ideal, linha pontilhada; modelo proposto, linha contnua.........70
Figura 4.3 - Valores de solubilidade da L-Isoleucina a 298,15 K em soluo aquosa
(com HCl ou NaOH). Dados experimentais (o), Tseng et al. (2009). Modelo Proposto
(linha contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada). .....................................................71
Figura 4.4 - Valores de solubilidade da L-Leucina a 298,15 K em soluo aquosa
(com HCl ou NaOH). Dados experimentais (o), Tseng et al. (2009). Modelo Proposto
(linha contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada).......................................................71
Figura 4.5 - Valores de solubilidade da DL-Fenilalanina a 298,15 K em soluo
aquosa (com HCl ou NaOH). Dados experimentais (o), Tseng et al. (2009). Modelo
Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada)........................................72
Figura 4.6 - Valores de solubilidade da L-Serina 298,15 K em soluo aquosa (com
HCl ou NaOH). Dados experimentais (o), Tseng et al. (2009). Modelo Proposto (linha
contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada).................................................................72
Figura 4.7 - Valores de solubilidade da tirosina 298,15 K em soluo aquosa. Dados
experimentais (o), Hitchcock (1924). Modelo considerando o grupo R ionizvel (linha
contnua). Modelo considerando o grupo R no-ionizvel (linha pontilhada)............75
Figura 4.8 - Curva de solubilidade em soluo aquosa (com HCl ou NaOH) em
funo do pH. Dados experimentais de glicina (), de diglicina () e de triglicina (),
Lu et al. (2006). Modelagem - Equao (4 - 23) - com valores de l da Tabela 4.4:
glicina, linha contnua; diglicina, linha semi-contnua; triglicina, linha pontilhada......77
Figura 4.9 - Curva de solubilidade em soluo aquosa (com HCl ou NaOH) em
funo do pH. Dados experimentais de tetraglicina (), de pentaglicina () e de
hexaglicina (), Lu et al. (2006). Modelagem - Equao (4 - 23) - com valores de l
da Tabela 4.4: tetraglicina, linha contnua; pentaglicina, linha semi-contnua;
Modelo proposto: 0,0 % (linha contnua), 15,0 % (linha com travesses), 30,0 %
(linha semi-contnua) e 50,0 % (linha pontilhada)......................................................85
Figura 4.21 - Valores de solubilidade do cido 6-aminopenicilnico 298,15 K em
soluo aquosa em funo do pH. Dados experimentais a diferentes fraes
mssicas de metanol: (o) 0,0 %, () 15,0 %, () 30,0 % e () 50,0 %. Santana;
Mattedi e Giordano (2010). Modelo proposto: 0,0 % (linha contnua), 15,0 %(linha
com travesses), 30,0 % (linha semi-contnua) e 50,0 % (linha pontilhada).............86
Figura 5.1 - Solubilidade da lisozima da clara de ovo de galinha em funo da
molalidade de cloreto de sdio. Dados experimentais (), Watanabe (2007).
Equao de Cohn (linha contnua).............................................................................95
Figura 5.2 - Valores do segundo coeficiente virial osmtico em funo da molalidade
de cloreto de sdio em pH = 4,5. Dados experimentais obtidos em Curtis et al.
(2002). Lisozima nativa, modelo (linha contnua), dados experimentais (). Lisozima
D101F, modelo (linha pontilhada), dados experimentais ()......................................96
Figura 5.3 - Valores da solubilidade da lisozima em funo do segundo coeficiente
virial osmtico. Dados experimentais obtidos em Guo et al. (1999). Lisozima a 25 C
e pH = 4,2 com variaes na concentrao de cloreto de sdio (). Lisozima a 18 C
e pH = 4,5 com variaes na concentrao de cloreto de amnio (). Lisozima a 23
C e pH = 7,8 com variaes na concentrao de brometo de magnsio (). Modelo
de Haas; Drenth e Wilson (1999) com z = 3 e A = 0.001 (linha pontilhada). Modelo de
Guo et al. (1999) com Dm = 250 kJ mol -1 (linha semi-contnua). Modelo de Ruppert;
Sandler e Lenhoff (2001), (linha com travesses). Equao (5 23) (linha contnua).
...................................................................................................................................97
Figura 5.4 - Solubilidade da ovalbumina em solues de sulfato de amnio. Dados
experimentais (), Judge; Johns e White (1996). Equao de Cohn (linha contnua).
...................................................................................................................................98
Figura 5.5 - Segundo coeficiente virial osmtico da ovalbumina em solues de
sulfato de amnio a pH = 4,0. Dados experimentais (), Mehta; White e Litster
(2011). Equao (5 21) com Ks = 2,45 kg mol -1, (linha contnua)............................99
Figura 5.6 - Segundo coeficiente virial osmtico da imunoglobulina humana (IgG)
em solues de cloreto de sdio. Dados experimentais (), estes dados ainda no
foram publicados, mas foram cedidos por Kelly Cristina do Nascimento Alves
Cruvinel (comunicao pessoal). Equao (5 21), (linha contnua)......................100
LISTA DE TABELAS
Letras latinas
aH+
atividade do on H+
ai
atividade do componente i
aP0
Bij
ck
C1
C2
ds
densidade do solvente
carga eltrica
fi
fugacidade do componente i
fi0
gk
gEX
gij
gij(.)
Gij
fora inica
kB
constante de Boltzmann
Ks
constante de salting-out
Kk
L(.)
operador lagrangeano
mi
molalidade do componente i
mi0
m0
msal
molalidade do sal
ction
nmero de conjuntos de dados experimentais
Ms
nA
nB
nC
nD
n+
NA
nmero de Avogadro
Ni
Ni(a)
presso
P0
Pk
+c
coordenada radial
entropia
solubilidade
SA
temperatura
uij
U(a)
volume do sistema
V(a)
volume da fase a
ws
massa do solvente
Wij
xi
nion
yi
zi
z+
z-
Letras gregas
aj
aij
a+1
a-1
g0
gi
gA0
e0
permissividade do vcuo
er
constante dieltrica
ejk
hj(.)
qjk(.)
ke
lk
lij
l-1
l+1
l0
lzwitt
coeficiente de salting-in
Lijk
md
mi
miL
miS
mi0
Dm*
nj
n+
n-
presso osmtica
ri
concentrao do componente i
tij
fA0
fk
fzwitt
f0
f-1
f+1
yj
Siglas
CQ
critrio quantitativo
pI
ponto isoeltrico
pKA
SUMRIO
1 Introduo...............................................................................................................22
2 Elementos fundamentais da termodinmica de equilbrio de fases........................25
2.1 A equao fundamental em sua representao entrpica................................25
2.2 A equao de Gibbs-Duhem.............................................................................26
2.3 Os critrios de equilbrio de fases....................................................................27
2.4 Fugacidade, atividade e convenes...............................................................29
2.5 Modelos termodinmicos de energia livre de Gibbs excedente.......................31
2.6 Modelos termodinmicos para solues eletrolticas.......................................32
3 Efeito do pH na solubilidade de protenas..............................................................35
3.1 Introduo.........................................................................................................35
3.2 Desenvolvimento terico..................................................................................36
3.2.1 Clculo da frao de protena eletricamente neutra...................................39
3.2.2 Extenso teoria de Linderstrm-Lang e Grnwall...................................41
3.2.3 Equivalncia entre as duas abordagens....................................................44
3.3 Resultados e Discusses.................................................................................45
3.3.1 Solubilidade da insulina em funo do pH e da temperatura.....................45
3.3.2 Solubilidade da b-lactoglobulina em funo do pH e da fora inica.........54
4 No-idealidade de solues de aminocidos e compostos b-lactmicos...............57
4.1 Introduo.........................................................................................................57
4.2 Desenvolvimento terico..................................................................................61
4.2.1 Clculo das fraes eletricamente neutras e carregadas ..........................61
4.2.2 Modelo de Pitzer ........................................................................................63
4.2.3 Uma abordagem por termodinmica estatstica da no-idealidade...........66
4.3 Resultados e Discusses.................................................................................69
4.3.1 Solubilidade de aminocidos em funo do pH.........................................69
4.3.2 Solubilidade da glicina e de seus oligopeptdeos em funo do pH...........76
4.3.3 Solubilidade de compostos b-lactmicos em funo do pH, da temperatura
e do solvente.......................................................................................................78
5 Segundo coeficiente virial osmtico de protenas e suas relaes.........................87
5.1 Introduo.........................................................................................................87
5.2 Desenvolvimento terico..................................................................................89
5.2.1 Potencial qumico de referncia.................................................................90
5.2.2 Equao de Cohn.......................................................................................92
5.2.3 Modelo proposto.........................................................................................93
22
1 Introduo
23
apropriados das leis da Termodinmica.
No h mais espao (se que antes houve algum) para a pesquisa cientfica que se
limite a uma nica rea do conhecimento. Dessarte, os profissionais de
Termodinmica tm na medida do possvel servido a comunidade cientfica como um
todo, com interpretaes, modelos e mesmo dados experimentais de propriedades
que auxiliam as pesquisas dedicadas s mais diversas reas.
No caso de sistemas que contm protenas, h uma grande e crescente demanda
por conhecimento devido s inmeras aplicaes, seja no setor farmacutico, seja
na indstria alimentcia. Aqui, estudar-se-o alguns destes sistemas. A abordagem
pretendida corresponde explorao dos limites da termodinmica clssica na
descrio destes sistemas.
Molculas de protena apresentam, entre outras, uma caracterstica que torna a sua
modelagem termodinmica um pouco mais complicada: a presena de ons na
cadeia. Pode-se dizer que a teoria de solues eletrolticas nasce, ou pelo menos,
ganha notoriedade com o trabalho de Petrus Debye e Erich Hckel, que no incio da
dcada de 1920, propuseram um mtodo de clculo da no-idealidade devida
presena de eletrlitos em soluo atravs da soluo linearizada e unidirecional da
equao de Poisson-Boltzmann. Mesmo assim, as solues contendo eletrlitos
ainda hoje so alvo de intensa pesquisa. At porque a prpria teoria de lquidos
ainda um captulo no qual h hoje muito esforo empregado. Quando se pensa em
protenas, que na verdade so polieletrlitos muito menos simples que polieletrlitos
de polmeros sintticos, a modelagem se apresenta repleta de simplificaes, sejam
de ordem geomtrica (tal como considerar a protena uma esfera), sejam de ordem
de distribuio de cargas, dotando a protena de uma carga lquida sem considerar
os diferentes estados de ionizao.
As principais intenes aqui pretendidas esto centradas em uma busca por uma
descrio termodinmica mais fiel na sua representao dos fenmenos estudados.
O segundo captulo ser dedicado a uma brevssima reviso dos conceitos
fundamentais de termodinmica de equilbrio de fases de modo a facilitar ao leitor,
desacostumado nomenclatura termodinmica, a compresso dos captulos
seguintes. Diferentemente do segundo captulo, os que o seguiro, com
pouqussimas excees que sero postas em relevo a medida que aparecerem,
integram os desenvolvimentos tericos inditos aqui propostos.
No terceiro captulo ser apresentado o desenvolvimento de uma relao terica
24
para a predio da curva de solubilidade de protenas em funo do pH
considerando que a fase slida nica e s contm molculas eletricamente neutras
de
protenas
pelo
princpio
de
eletroneutralidade
da
fase
em
equilbrio
25
,
(Pilatos, in Evangelho de So Joo)
(2 - 1)
26
Sendo uma diferencial exata, a equao fundamental pode ser associada s duas
primeiras leis da termodinmica de modo que a variao infinitesimal de entropia do
sistema seja dada por:
dS(U ,V , N 1 ,... , N m )=
1
p
dU+ dV i dN i
T
T
i =1 T
(2 - 2)
( )
1
S
=
T
U
(2 3)
V ,N
p a presso do sistema:
p=T
( )
S
V
(2 4)
U ,N
i =T
( )
S
N i
(2 5)
U ,V , N j ,i j
(2 6)
(2 7)
i=1
Sendo
transformada
de
Legendre
total
de
uma
dada
funo
T (f ( x ))=f ( x )
k =1
f (x)
xk
xk
(2 8)
27
m
(2 9)
i =1
i=1
i =1
(2 10)
SdT Vdp+ N i d i =0
(2 11)
i =1
Essa Equao (2 11) serve como uma restrio a ser respeitada por qualquer
modelagem termodinmica que se pretenda em equilbrio de fases. Na verdade, ela
usada como garantia de consistncia termodinmica a um dado modelo.
28
S=S(U , V , N 1 , ... ,N m)
(2 12)
(2 13)
(2 14)
(2)
( )
N i =[N (1)
i , N i , ... , N i ],
c o m i =1, 2, ... , m
(2 15)
g 1( U )= U ( )U=0
=1
g 2 (V )= V ( )V =0
=1
(2 16)
=1
(2 17)
k =1
(2 18)
L(U , V , N 1, ... ,N m , )
1
1=0, =1,... ,
U
T ( )
L (U , V , N 1, ... ,N m , ) p( )
= ( ) 2=0, =1,... ,
V ( )
T
()
L(U , V , N 1, ... , N m , )
i
=
i+2 =0, =1,... , e i =1,..., m
N(i )
T ( )
( )
(2 19)
29
Obviamente para completar as (m+2)(p +1) equaes a serem satisfeitas, devem-se
incluir as restries de igualdade que reaparecem nas derivada parciais do
lagrangeano pelo multiplicadores de Lagrange.
Logo, tem-se que para maximizar a entropia de um sistema isolado com m
componentes e p fases, devem-se obedecer as seguintes relaes:
1
(1)
(2)
( )
1 =T =T ==T
2
(1)
(2)
( )
1 =p =p ==p
i+2
(1)
(2)
( )
= i = i == i ,
1
i=1, ... , m
(2 20)
O potencial qumico tal como proposto por Gibbs na segunda metade do sculo XIX
30
(PRAUSNITZ; LICHTENTHALER; AZEVEDO, 1999) no de fcil assimilao,
porque no possvel sua percepo no mundo fsico real de modo to intuitivo
quanto o potencial trmico (temperatura) e o mecnico (presso). No entanto, a
definio de fugacidade d uma idia mais sensvel do fenmeno fsico. A
fugacidade, assim como definida por Lewis, substitui a presso no clculo do
potencial qumico de um processo isotrmico de um gs ideal de modo a contemplar
os efeitos no considerados no modelo de gs ideal:
i 0i
=exp
RT
f 0i
fi
(2 21)
), T a temperatura do sistema em K.
fi
=1
yi p
(2 22)
31
a soluo real e essa soluo ideal pelas propriedades de excesso, que no caso da
energia livre de Gibbs de excesso ou ainda, energia livre de Gibbs excedente
est relacionada ao coeficiente de atividade. Assim, cabe definir a atividade de um
componente e o coeficiente de atividade deste componente. Da prpria definio de
fugacidade expressa pela Equao (2 21), define-se a atividade como:
ai=
fi
(2 23)
f 0i
i=
ai
xi
(2 24)
ln i =
EX m
g
N
RT i =1 i
N i
(2 25)
T , p ,N j
32
energia livre de Gibbs excedente dada por:
m
g EX
= x
RT i=1 i
ji G ji x j
j=1
m
(2 26)
Gli x l
l=1
ji =
g ji g ii
RT
(2 27)
(2 28)
ji G ji x j
ln i =
j=1
m
Gli x l
l =1
+
j =1
x j G ij
m
G lj x l
l=1
x r rj Grj
ij r=1m
G li x l
l=1
(2 29)
33
complicaes adicionais a este tipo de modelagem e restries antes no
consideradas tais como o princpio de eletroneutralidade da fase termodinmica em
equilbrio estvel.
A teoria de Debye-Hckel publicada no incio dos anos de 1920 foi pioneira no
tratamento de solues eletrolticas e at hoje constitui um trabalho de referncia na
maioria das publicaes relacionadas a este tema. Este teoria est baseada na
soluo linearizada e unidirecional da equao de Poisson-Boltzmann (HILL, 1986):
2 j=
zi e i
4 e
z i i 1 k T
i
B
(2 30)
(2 31)
2=
4 e2
i z i2
kBT i
(2 32)
Muitas vezes esta Equao (2 32) escrita em termos da fora inica, I, que
definida como:
I=
1
m i z 2i
2 i
(2 33)
34
longo alcance que devido as interaes eletrostticas anlogas ao modelo de
Debye-Hckel, e um de curto alcance que uma expanso virial de modo a assumir
a hiptese que as interaes entre muitos corpos pode ser dividida em contribuies
de interaes de dois-a-dois, trs-a-trs e assim por diante. Este modelo tambm se
baseia em uma proposio para a energia livre de Gibbs excedente:
gEX
=f (I )+ m i m j ij (I)+ m i m j m k ijk +...
RTw s
i
j
i
j
k
(2 34)
em que ws a massa de solvente, f(I) uma funo dependente da fora inica, lij
o parmetro das interaes binrias (dois-a-dois) e Lijk o parmetro das interaes
ternrias (trs-a-trs).
Como as propriedades termodinmicas so usualmente medidas para eletrlitos
neutros e no espcies inicas individuais, convencionou-se escrever os modelos
para solues eletrolticas aplicando a restrio de eletroneutralidade em termos de
um coeficiente de atividade inica mdio que dado pela mdia geomtrica dos
coeficientes de atividade do ction e o do nion. Esta abordagem que para sistemas
salinos, por exemplo, muito interessante, no o para polieletrlitos, para os quais
algumas complicaes aparecem. Em termos do coeficiente de atividade inica
mdio, o modelo de Pitzer dado por:
1
e2
ln = z+ z -
3
0 r k B T
...+m
2 + ++ -
...+9m
){
(0)
2 +
( + - )
++ -
3/ 2
(2 d s N A )1/2 2
I +...
ln(1+b I )+
8
b
1+b I
[ (
]}
2 (1)
2I
1/ 2
1/ 2
1
1+
exp ( I ) +...
2
2
I
](
+ MMX + - MXX )
(2 35)
35
Si lon veut noncer le prncipe dans toute sa gnralit et en lappliquant lUnivers, on le voit pour
ainsi dire svanouir et il ne reste plus que ceci: il y a quelque chose qui demeure constant.
(Henri Poincar, in Thermodynamique)
3.1 Introduo
36
de um ajuste de um conjunto de dados experimentais.
Contudo, os trabalhos mais recentes se concentram na modelagem da curva de
solubilidade de aminocidos em funo do pH dando maior enfoque aos modelos
termodinmicos para solues no-ideais, tanto atravs de equaes de estado
como de modelos de energia livre de Gibbs excedente.
Entretanto, o primeiro trabalho dedicado exclusivamente modelagem e predio da
curva de solubilidade de protenas propriamente dita em funo do pH foi publicado
por Tjong e Zhou (2008). Neste trabalho, a solubilidade foi calculada a partir da
energia livre de transferncia da fase slida para a fase lquida. Para a execuo
deste clculo, a energia livre de transferncia foi dividida em duas contribuies:
uma de natureza eletrosttica, calculada pela mdia de 100 conformaes proticas
advindas da aplicao de dinmica molecular a pH constante; e outra, de natureza
no-eletrosttica, baseada na rea superficial acessvel ao solvente. Porm, o
esforo computacional requerido pelo modelo por eles proposto para calcular
apenas alguns pontos da curva no apresenta uma aplicabilidade razovel. Alm
deste trabalho, Tashima et al. (2009) propuseram uma modelagem termodinmica
para prever a curva de solubilidade especificamente da insulina suna aplicando o
modelo de Pitzer truncado aps o segundo coeficiente virial.
Aqui uma relao analtica entre a solubilidade de protenas em funo do pH ser
desenvolvida sob a hiptese de que a atividade da molcula de protena
eletricamente neutra permanece constante com o pH. Assim se entende a epgrafe
deste captulo e que encontrada no apenas neste mas em muitos
desenvolvimentos tericos: h alguma coisa que permanece constante.
Li ( T , p , x )= Si (T , p)
(3 1)
37
em que miL o potencial qumico do soluto na fase lquida e miS o potencial qumico
do soluto na fase slida. Desprezando-se os efeitos da presso sobre o clculo do
potencial qumico, hiptese comum a sistemas que no envolvam fase gasosa, temse que para um processo isotrmico no h variao do potencial qumico da fase
slida j que sua composio fixa; portanto, o potencial qumico do soluto na fase
lquida tambm no se altera em tal processo. Posto isto, conclui-se que mudanas
nas condies da fase lquida tais como variao de pH no alteram o potencial
qumico do soluto nesta fase.
A solubilidade de um soluto em fase lquida a concentrao de equilbrio deste
componente nesta fase. Assim, se a solubilidade do soluto for suficientemente
diminuta, para um processo isotrmico desprezando-se os efeitos da presso, podese adotar a considerao de uma soluo ideal segundo a lei de Henry e expressar
o potencial qumico deste soluto na fase lquida em termos de molalidade como:
Li (m)= 0i (m 0 )+RT ln
mi
m0i
(3 2)
em que:
m 0 =[0, 0, ... , 0, m0i =1, 0, ..., 0]
(3 3)
(3 4)
(3 5)
38
A partir destes equilbrios qumicos possvel notar que as molculas de protena
em uma soluo tm diferentes estados de protonao, e, portanto, distintos valores
de carga eltrica. Porm, a solubilidade determinada experimentalmente a soma
da concentrao de todas as molculas de protenas.
Sendo a fase slida composta apenas por protena e sendo uma fase em equilbrio
estvel, pelo princpio de eletroneutralidade nela deve haver somente molculas
eletricamente neutras. Isto significa que o equilbrio de fases se estabelece apenas
entre molculas de protena eletricamente neutras. Logo, a Equao (3 2) no
vlida para qualquer molcula de protena, mas apenas e to-somente para as
molculas de protena eletricamente neutras. E, por conseqncia do critrio de
equilbrio de fases expresso na Equao (3 1), a molalidade das molculas de
protena eletricamente neutras na fase lquida deve permanecer inalterada com a
variao do pH da soluo. A molalidade destas molculas uma frao da
solubilidade da protena nesta soluo. Assim pode-se escrever:
m 0 = 0 (pH )S (pH)
(3 6)
(3 7)
0( pI )S (pI )
0( pH )
(3 8)
39
3.2.1 Clculo da frao de protena eletricamente neutra
()
n!
= n =2n
=0 ( n )! ! =0
(3 9)
Dentre estes estados, alguns representam molculas de protena cuja carga total
seja nula. A carga de uma molcula de protena dada pela soma da carga
individual de cada resduo j em um dado estado de ionizao k:
n
c k = jk
(3 10)
j =1
jk =
(3 11)
j ( pH)=
1
pH pK
1+10
Aj
)[
( 1+ j ) ( j 1) pH pK
10
2
2
Aj
(3 12)
nj o estado carregado do grupo j (-1, para grupos cidos e, +1, para grupos
alcalinos).
Assim, a frao de molculas de uma dada protena em um dado estado de
ionizao k dada pelo produtrio da frao do grupo j com a carga especfica
40
associada ao estado de ionizao k:
n
(3 13)
i=1
Sendo que:
'j ( pH)=
j ( pH) , se jk 0
1 j ( pH ), se jk =0
(3 14)
k (pH )=
j=1
{(
1
1+10pH pK
Aj
)[(
1+ j
1
jk 10pH pK j
jk
2
2
Aj
)]}
(3 15)
jk =0
(3 16)
j=1
k (pH ) n
= pK Aj ( jk jl )
l ( pH ) j =1
(3 17)
S( pH)=S ( pI)
j =1
pH pK Aj
1+10
pIpK
1+10
Aj
[(
)
[(
)
)
(
(
1+ j
1
jk 10 pIpK j
jk
2
2
Aj
)]
)]
1+ j
1
jk 10 pHpK j
jk
2
2
Aj
(3 18)
41
para qualquer estado de ionizao k que respeite a restrio imposta na Equao (3
16). Basicamente a Equao (3 18) uma expresso para a predio da curva
de solubilidade de uma dada protena em funo do pH da soluo e requer como
parmetros apenas a solubilidade no ponto isoeltrico e informaes a respeito da
estrutura primria da protena, ou seja, a seqncia de aminocidos que a compe e
as respectivas constantes de equilbrio de ionizao. Isto torna esta abordagem
extremamente relevante e de fcil aplicao.
(3 19)
42
K k=
aP
+c
k
a P a cH
(3 20)
+
aP a H
m k =K k
k
(3 21)
(3 22)
k =1
k =1
ca
k =1
c 1
H+
Kk
k a P
a cH
k =1
Kk d k
2k d a H
(3 23)
+
aP
k =1
c
H+
Kk d k
=a P
2k d a H
+
a
k =1
c
H+
K k d ln k
d ln k
k d a = m k d a
k =1
H
H
+
(3 24)
( )
a
d ln S
= H
S
d ln a H
+
K
c a cH kk
d S k =1
=
d aH
+
k =1
c
+
H
Kk
k
c mk
= k =1
mk
k =1
=c
(3 25)
43
em que
(3 26)
c ( pH)= j j ( pH )
(3 27)
j=1
1
1
c ( pH)=
2 j=1 1+10 pH pK
Aj
[ 1+
(1 j ) 10pH pK
Aj
(3 28)
d log S
1
1
=
d pH
2 j=1 1+10 pHpK
Aj
[ 1+
(1 j ) 10pH pK
Aj
(3 29)
log S(pI)
pH
1
d log S=
2 pI
{(
n
j =1
1
1+10pH pK
Aj
[ 1+
(1 j )10pH pK
Aj
d pH
(3 30)
[ (
S ( pH)
1+10 pHpK
log
= log
S (pI ) j =1
1+10pIpK
Aj
Aj
(1+ j )
( pHpI )
2
(3 31)
Ou ainda:
n
log
[ (
S ( pH)
1+10 pH pK
=n+( pI pH )+ log
S (pI )
1+10 pIpK
j =1
Aj
Aj
)]
(3 32)
44
em que n+ o nmero total de grupos alcalinos na molcula de protena.
A Equao (3 32) relaciona a solubilidade da protena com a variao do pH da
soluo. A prxima subseo dedicada a provar que tanto a Equao (3 18)
quanto a Equao (3 32) so equivalentes.
S ( pH) n
1+10pH pK
= log
S ( pI ) j=1
1+10 pI pK
...+ log
j=1
[(
[(
Aj
Aj
)
)
+...
(
(
1+ j
1
jk 10 pIpK j
jk
2
2
Aj
)]
)]
1+ j
1
jk 10pH pK j
jk
2
2
Aj
(3 33)
j ( pH)=log
jk ( pH )=log
1+10pH pK
1+10pI pK
Aj
Aj
[(
[(
)
)
)
(3 34)
(
(
1+ j
1
jk 10pIpK j
jk
2
2
Aj
)]
)]
1+ j
1
jk 10pH pK j
jk
2
2
Aj
(3 35)
Fica evidente pela observao das Equaes (3 34) e (3 35) que a funo hj no
depende do estado de ionizao k, enquanto a funo qjk depende. Assim, pode-se
analisar cada possibilidade. Esta anlise da funo e qjk est na Tabela 3.1.
45
nj
-1
-1
+1
+1
ejk
-1
0
+1
0
Nmero de resduos
nA
nB
nC
nD
Pela Tabela 3.1, possvel inferir que a Equao (3 33) pode ser escrita como:
log
n
S ( pH)
=(n A +nD )( pIpH )+ j ( pH)
S (pI )
j =1
(3 36)
jk =0 n A=nC
(3 37)
j=1
(3 38)
(3 39)
A Tabela 3.2 apresenta os valores de pKA dos grupos ionizveis da insulina humana
para o clculo da curva de solubilidade desta protena em funo do pH de acordo
com a Equao (3 32). H na Tabela 3.2 dois conjuntos de valores de pKA: um
chamado isolado que o valor do pKA do aminocido livre obtido pela titulao
46
potenciomtrica do aminocido, e outro que o valor do pKA na cadeia protica e
obtido pela titulao potenciomtrica da protena.
Tabela 3.2 - Valores de pKA dos grupos ionizveis da insulina humana.
Aminocido
Grupo
Nmero
pKA(isolado)a
pKA(cadeia)b
Gly
-NH2 (terminal)
9,80
7,38
Glu
-COOH
4,30
4,37
Tyr
Fenol-OH
10,90
10,20
Asn
-COOH (terminal)
2,00
3,45
Phe
-NH2 (terminal)
910
7,38
His
Imidazol-NH2
6,00
5,98
Arg
Guanidina-NH2
12,50
11,10
Lys
-NH2
10,80
8,52
Ala
-COOH (terminal)
2,30
3,45
Stryer (1995).
47
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
pH
Figura 3.2 - Frao de molculas eletricamente neutras de
insulina em funo do pH. Dados de pKA de Kaarsholm; Havelung
e Hougaard (1990). Linha contnua, frao total. Linha pontilhada,
frao preponderante.
48
Observa-se pela Figura 3.2 que as fraes de molculas de protena eletricamente
neutras alcanam um ponto mximo exatamente no ponto isoeltrico, ponto este que
pode ser definido como pH no qual a carga lquida mdia das molculas de protena
nula. Ou seja, o ponto mximo da frao de molculas neutras corresponde ao
ponto de mnima solubilidade.
J as Figuras 3.3, 3.4 e 3.5 apresentam o resultado da modelagem para trs
diferentes temperaturas para a curva de solubilidade da insulina suna em funo do
pH. Comparam-se o modelo proposto calculado com diferentes valores de pKA
valores de pKA isolados; e, valores de pKA na cadeia com o modelo proposto por
Tashima et al. (2009).
32,0
28,0
20,0
Solubilidade x 10 / mol.kg
-1
24,0
16,0
12,0
8,0
4,0
0,0
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
pH
49
28,0
20,0
16,0
Solubilidade x 10 / mol.kg
-1
24,0
12,0
8,0
4,0
0,0
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
pH
15,0
9,0
Solubilidade x 10 / mol.kg
-1
12,0
6,0
3,0
0,0
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
pH
50
Deve-se notar que a validade do modelo restrita a regio prxima ao ponto
isoeltrico; j que para valores de pH distantes deste ponto a curva de frao de
molculas neutras tende a zero, resultando pela Equao (3 8) em uma
solubilidade infinita que fisicamente inverossmil.
Para uma anlise comparativa mais elaborada entre os modelos, um critrio
quantitativo necessrio. No entanto, a escolha de um critrio arbitrria e, por
isso, um tanto quanto subjetiva, mas mesmo assim este deve permitir uma
comparao equitativa entre os modelos. Aqui o critrio escolhido o seguinte:
calc
N
S exp
1
i S i
CQ=100
Sexp
N i =1
i
(3 40)
Nj
exp
calc
M
S ij S ij
1
1
CQG=100
M j N j i =1
Sexp
ij
)]
2
(3 41)
51
Tabela 3.3 - Valores de CQ [Equao (3 40)] e CQG [Equao (3 41)] entre os modelos
aplicados e os dados experimentais de solubilidade de insulina suna a diferentes
temperaturas.
Modelo proposto com
Modelo proposto com
valores de pKA de
Modelo de Tashima et
T/K
valores de pKA de
Kaarsholm; Havelung
al. (2009)
Stryer (1995).
e Hougaard (1990)
278,2
25,1 %
32,5 %
26,7 %
288,2
19,8 %
27,8 %
26,9 %
298,2
27,4 %
23,9 %
15,4 %
Global
24,3 %
28,3 %
23,6 %
Pela Tabela 3.3 possvel afirmar que a abordagem aqui proposta to eficaz na
correlao dos dados experimentais de solubilidade de insulina suna quanto o
modelo de Tashima et al. (2009), no entanto, no exigiu nenhum ajuste de
parmetros. Outra importante meno deve ser feita no tangente a escolha do
conjunto de dados de pKA na execuo do clculo: embora os valores de pKA na
cadeia resultem em uma melhor descrio do fenmeno, no h perda siginificativa
de preciso ao se utilizarem os dados de pKA de aminocidos isolados. Esse
resultado muito importante, porque rarssimos so os dados completos de pKA em
uma dada cadeia protica.
Alm da insulina suna que foi bastante bem correlacionada pelo modelo proposto,
ao menos na regio do ponto isoeltrico, h dados na literatura de solubilidade de
trs tipos de insulina mutante. Este dados foram publicados por Kaarsholm;
Havelung e Hougaard (1990) junto aos valores de pKA ajustados a partir da curva de
titulao potenciomtrica de cada tipo de insulina mutante.
A Tabela 3.4 apresenta os valores de pKA para estes trs tipos de insulina mutante.
Nesta tabela tambm so apresentados os nmeros de resduos que se ionizam na
forma catinica, esses nmeros so aqueles que corresponderam ao melhor ajuste
da Equao (3 32) aos dados de solubilidade das insulinas mutantes. Apesar dos
autores (KAARSHOLM; HAVELUNG; HOUGAARD, 1990) terem feito uma discusso
a respeito da determinao dos valores de pKA atravs do ajuste da curva de
titulao potenciomtrica de cada protena mutante, no fica claro qual resduo
especfico possui aquele valor de pKA. Portanto, no to trivial especificar o
nmero de resduos que se ionizam na forma catinica, at porque as formas
mutantes podem ter estruturas tercirias distintas da insulina nativa o que favorece a
blindagem de alguns resduos antes expostos ao solvente.
52
Tabela 3.4 - Valores de pKA e de nmero de resduo que se ionizam como ctions (n+) para
insulinas mutantes. Dados de Kaarsholm; Havelung e Hougaard (1990).
B13-GluGln
B9-SerAsp
B25-PheHis
Grupos
N
pKA
n+
N
pKA
n+
N
pKA
n+
1
3,40
3,52
4,66
6,85
3,63
4,28
3,99
5,56
4,74
7,85
6,82
6,18
9,33
7,05
7,24
9,83
8,23
7,61
11,23
9,74
8,62
10,12
10,00
11,00
11,03
100,0
% protena em soluo
80,0
60,0
40,0
20,0
0,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
pH
Figura 3.6 - Curva de solubilidade da insulina mutante B13GluGln em funo do pH em 0,1 M KCl a 23 oC. Dados
experimentais (), Kaarsholm; Havelung e Hougaard (1990).
Equao (3 - 32), linha contnua.
As Figuras 3.7 e 3.8 apresentam os resultados para as insulinas mutantes B9SerAsp e B25-PheHis, respectivamente.
53
100,0
% protena em soluo
80,0
60,0
40,0
20,0
0,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
pH
Figura 3.7 - Curva de solubilidade da insulina mutante B9SerAsp em funo do pH em 0,1 M KCl a 23 oC. Dados
experimentais (), Kaarsholm; Havelung e Hougaard (1990).
Equao (3 - 32), linha contnua.
100,0
% protena em soluo
80,0
60,0
40,0
20,0
0,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
pH
Figura 3.8 - Curva de solubilidade da insulina mutante B25PheHis em funo do pH em 0,1 M KCl a 23 oC. Dados
experimentais (), Kaarsholm; Havelung e Hougaard (1990).
Equao (3 - 32), linha contnua.
54
H uma primeira observao que deve ser feita: a mudana de apenas um resduo
na cadeia protica j produz efeitos notveis tais como a mudana do ponto
isoeltrico e o formato da curva de solubilidade. Dessarte possvel imaginar que
uma pequena mudana da estrutura primria pode causar alteraes significativas
na estrutura terciria da protena a ponto de alterar o acesso do solvente a um
determinado resduo, isso fica evidente ao se compararem os valores de pKA da
insulina nativa e suas respectivas mutantes.
Alm disso, importante notar que o modelo aqui proposto foi bastante exitoso tanto
na correlao dos dados da insulina suna quanto nos dados das insulinas mutantes.
Observam-se porm duas importantes constataes: se por um lado no caso da
insulina mutante B13-GluGln o modelo menos preciso na regio acima do ponto
isoeltrico, por outro no caso da mutante B25-PheHis o modelo menos preciso
na regio abaixo do ponto isoeltrico. Provavelmente isso se deve aos erros
associados a determinao dos valores de pKA. Um modo de contornar esse
problema ajustar o valor de pKA de um dos grupos. Aqui isso no ser feito, pois
no pertence ao escopo deste trabalho o ajuste de curvas, mas sim a proposio de
um modelo e a verificao de suas limitaes ao contrast-lo aos dados
experimentais.
H que se explicar que a ordenada dos grficos expostos nas Figuras 3.6, 3.7 e 3.8
no correspondem propriamente a solubilidade, mas sim a porcentagem de protena
em soluo, que relativa a quantidade de protena inicialmente colocada no
sistema no experimento de determinao de solubilidade. Assim, os patamares
observados em valores de pH distantes do ponto isoeltrico e correspondentes a
100 % de protena em soluo no esto relacionados a solubilidade naquele valor
de pH, significam apenas que toda a protena introduzida ao sistema foi solubilizada,
mas essa concentrao no corresponde a concentrao de equilbrio para essa
protena nesse pH.
A Tabela 3.5 apresenta os dados de pKA isolados para a molcula de blactoglobulina bovina. E a Figura 3.9 apresenta o resultado da modelagem das
55
curvas de solubilidade da b-lactoglobulina bovina em funo do pH para quatro
diferentes valores de concentrao de cloreto de sdio. Observa-se que apesar do
aumento da fora inica o modelo consegue descrever com grande preciso as
curvas de solubilidade. H que se dizer que os dados de pKA isolados no
reproduzem o valor experimental do ponto isoeltrico; deste modo, ajustou-se o
valor do pKA dos cidos glutmicos para efetuar o clculo da curva de solubilidade.
O valor ajustado foi de 5,14. A diferena entre o valor relatado na literatura e o
ajustado da mesma ordem de magnitude que as diferenas entre os valores de
pKA de aminocidos isolados e na cadeia de insulina.
Grupo
Nmero
pKA(isolado)a
Leu
-NH2 (terminal)
9,60
Glu
-COOH
16
4,25
Tyr
Fenol-OH
10,07
Cys
b-SH
8,18
His
Imidazol-NH2
6,00
Arg
Guanidina-NH2
12,48
Asp
b-COOH
11
3,65
Lys
-NH2
15
10,53
Ile
-COOH (terminal)
2,36
Pela Figura 3.9 possvel observar que o modelo descrito pela Equao (3 32) foi
bastante eficiente na representao das curvas de solubilidade da b-lactoglobulina
nas diferentes concentraes de cloreto de sdio.
H que se mencionar que as curvas apresentadas na Figura 3.9 representam
tambm um fenmeno aqui ainda no discutido e que ser objeto de um breve
estudo na captulo cinco: o efeito da concentrao de sal na solubilidade da
protena. Claramente, no caso destas curvas v-se que o aumento da concentrao
de sal implicou no aumento da solubilidade da protena, logo estas curvas se
localizam na regio se salting-in do diagrama de fases da b-lactoglobulina.
56
5,0
Solubilidade / g.L
-1
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
4,5
4,8
5,1
5,4
5,7
6,0
pH
57
4.1 Introduo
58
experimentais. O trabalho de Kirkwood (1934) est entre um dos primeiros
dedicados modelagem de solues zwitterinicas. A abordagem foi baseada na
soluo analtica da equao linearizada de Poisson-Boltzmann considerando as
trs direes do operador laplaciano para um zwitterion esfrico2. O autor obteve
uma expresso que relaciona o logaritmo do coeficiente de atividade de um on a
uma srie matemtica; o primeiro termo desta srie anlogo teoria de DebyeHckel, sendo nulo para zwitterions, porque eles no tm carga. Com algumas
simplificaes, o autor tambm mostrou a aplicao desta abordagem para um
zwitterion elipsoidal (KIRKWOOD, 1939).
Nass (1988) modelou a solubilidade de aminocidos em funo do pH assumindo
que a energia livre de Gibbs excedente dada pela soma de uma contribuio
qumica e uma fsica. A contribuio qumica foi calculada atravs de consideraes
sobre a dissociao dos aminocidos, de equaes de balano material e de
condies de equilbrio de fases, enquanto a contribuio fsica foi calculada pela
equao de Wilson (WILSON, 1964) para a mistura binria de gua e aminocido.
Embora os dados experimentais tenham sido bem correlacionados pelo modelo
proposto, o nmero de parmetros ajustveis pode ser muito alto at dez
parmetros foram usados para correlacionar uma nica curva de solubilidade. Chen;
Zhu e Evans (1989) consideraram que a energia livre de Gibbs excedente pode ser
dividida em trs termos: dois deles relacionados a interaes de longo alcance,
videlicet um termo de Pitzer-Debye-Hckel e um termo de Born, e um para levar em
conta interaes de curto alcance, o modelo NRTL. Para o coeficiente de atividade
de zwitterions, a contribuio Pitzer-Debye-Hckel nula. Os autores mostraram
que os dados experimentais de solubilidade foram correlacionados satisfatoriamente
com apenas um ou dois parmetros ajustveis para cada componente.
O trabalho de Gupta e Heidemann (1990) lanou as bases da maioria dos trabalhos
que foram publicados a posteriori. A equao desenvolvida por eles, que relaciona a
dissociao qumica de aminocidos e a condio de equilbrio slido-lquido, tem
sido usada por quase todos os autores para quem esta a principal questo. A noidealidade de solues aquosas de aminocidos nativos e modificados foi calculada
atravs do modelo UNIFAC (do ingls: UNIversal Functional Activity Coefficient)
modificado de Larsen; Rasmussen e Fredenslund (1987) com novos grupos tais
2 Este o principal avano em relao teoria de Debye-Hckel e apresentada na seo 2.6 porque
considera de certa forma a anisotropia das interaes.
59
como glicina e prolina. Seguindo este trabalho, Pinho; Silva e Macedo (1994)
propuseram um modelo UNIFAC combinado com um termo de Debye-Hckel para
calcular os coeficientes de atividade de aminocidos; estes autores modelaram a
solubilidade da glicina em funo do pH em acordo com os dados experimentais.
Entretanto, alguns autores questionam a introduo do termo de Debye-Hckel
neste caso (KHOSHKBARCHI; VERA, 1996b, 1996c). Rodrguez-Raposo et al.
(1994) ajustaram coeficientes osmticos de glicina em soluo aquosa usando a
equao de Pitzer e calcularam o coeficiente de atividade da glicina em soluo
aquosa com excelente preciso quando comparados aos dados experimentais.
Khoshkbarchi e Vera (1996b), para calcular o coeficiente de atividade de
aminocidos em soluo contendo um eletrlito, dividiram a energia livre de Gibbs
excedente em contribuies de interaes de curto e longo alcances. Eles testaram
para a contribuio de interaes de longo alcance os modelos de Bromley
(BROMLEY, 1973) e o deles mesmos (KHOSHKBARCHI; VERA, 1996a), e para o
termo de curto alcance o modelo NRTL, cuja formulao est explicitada no captulo
2, e o modelo de Wilson (WILSON, 1994). Para qualquer modelo escolhido, foram
necessrios somente dois parmetros, e foi possvel correlacionar com preciso os
dados experimentais de sistemas binrios gua-aminocido e ternrios guaeletrlito-aminocido. Ainda que a equao bsica para a predio da solubilidade
de glicina em funo do pH usada por Khoshkbarchi e Vera (1996c) siga a
abordagem de Gupta e Heidemann (1990), eles introduziram o uso da teoria de
perturbao para calcular a no-idealidade de aminocidos em soluo aquosa.
Santana et al. (2010) mostraram que este modelo falha na predio quantitativa da
solubilidade do antibitico b-lactmico ampicilina, da DL-fenilglicina e do cido 6aminopenicilnico.
Pradhan e Vera (1998) usaram uma equao similar quela proposta por Gupta e
Heidemann (1990) e aplicaram a equao NRTL para o cmputo da no-idealidade
da fase lquida; assim, eles conseguiram calcular a solubilidade da DL-Alanina em
funo do pH em excelente acordo com os dados observados experimentalmente na
regio do ponto isoeltrico. Park; Yoo e Lee (2003) correlacionaram o coeficiente de
atividade da valina, do cido a-aminobutrico, da alanina, da glicina e da glicilglicina
em soluo aquosa pela aplicao da equao de estado de fluidos reticulados por
pontes de hidrognio sem considerar a dissociao qumica do aminocido na gua.
Xu; Pinho e Macedo (2004) propuseram uma modificao no modelo de Wilson para
60
calcular a energia livre excedente de Gibbs de solues de aminocidos. Eles
assumiram que todas as molculas de aminocidos esto na forma zwitterinica em
gua pura, o que de algum modo restringe a aplicao do modelo deles ao clculo
da solubilidade de aminocidos em valores de pH na regio prxima ao ponto
isoeltrico.
Usando a equao de estado PC-SAFT (do ingls: Perturbed-Chain Statistical
Associating Fluid Theory) e levando em conta a dissociao de aminocidos em
soluo, Fuchs et al. (2006) descreveram as curvas de solubilidade em funo do
pH para a glicina, para a DL-Alanina e para a DL-Metionina em soluo aquosa com
boa preciso quando comparadas aos dados experimentais. Do mesmo modo, Seyfi
et al. (2009), seguindo Gupta e Heidemann (1990) e aplicando a equao de estado
SAFT, predisseram a curva de solubilidade da DL-Metionina em funo do pH e da
temperatura com grande acurcia. Tseng et al. (2009) investigaram a solubilidade da
DL-Alanina, L-Leucina, L-Isoleucina, L-Serina e DL-Fenilalanina em funo do pH
em soluo aquosa. Considerando a dissociao de aminocidos em soluo
aquosa e usando o modelo NRTL, eles obtiveram resultados satisfatrios com dois
parmetros ajustados. Em suma, a reviso da literatura mostra que enquanto os
modelos diferem consideravelmente em suas formulaes do modelo do coeficiente
de atividade, o clculo do equilbrio cido-base permanece uma etapa crucial na
descrio da curva de solubilidade. A Tabela 4.1 apresenta um quadro-resumo no
intuito de mapear as diferentes estratgias para o clculo da no-idealidade de
solues contendo aminocidos.
Tabela 4.1 - Quadro-resumo de trabalhos sobre a no-idealidade de solues de aminocidos.
Equao de PoissonBoltzmann
Contribuio de Grupos
Kirkwood (1934)
Nass (1988)
Kirkwood (1939)
Rodrguez-Raposo;
Fernndez-Mrida e
Esteso (1994)
Khoshkbarchi e Vera
(1996a)
Gupta e Heidemann
(1990)
Termodinmica
Estatstica
Khoshkbarchi e Vera
(1996b)
61
Do mesmo modo que foi feito para protenas no captulo anterior, para aminocidos
ao longo da curva de solubilidade vale a afirmao de que, com a variao do pH da
soluo, no se altera o potencial qumico da fase slida e, pelo critrio de equilbrio,
permanece inalterado o potencial qumico das molculas neutras de aminocido na
fase lquida. Supondo que a variao do potencial qumico de referncia desta
espcie na fase lquida seja desprezvel, a atividade das molculas eletricamente
neutras de aminocido deve ser constante com o pH:
a A ( pH)=constante
(4 1)
(pI )
S A ( pH )
=ln A
+ln A ( pI)ln A ( pH)
S A ( pI )
A ( pH)
0
(4 2)
(4 3)
NH +3 RCOOH NH +3 RCOO-+H +
(4 4)
62
[NH 2 RCOO- ][H +]
K A1=
[NH +3 RCOO -]
(4 5)
(4 6)
Sendo que as fraes das formas ionizadas dos aminocidos so dadas pela
equao de Henderson-Hasselbach:
10pH pK
1 ( pH )=
pH pK
1+10
A1
+1 ( pH )=
1
1+10pH pK
(4 7)
A1
A2
(4 8)
Assim, tem-se que as fraes de cada uma das espcies de aminocido em soluo
bem como suas respectivas cargas lquidas c so dadas por:
(4 9)
(4 10)
(4 11)
(4 12)
Uma observao importante que, assim como para protenas, a razo entre duas
fraes de configuraes de molculas eletricamente neutras distintas invarivel
com pH, logo indiferente qual configurao de molculas eletricamente neutras se
utiliza na Equao (4 2). Obviamente, a forma zwitterinica muito mais comum, e
sua utilizao evita problemas numricos. Para ilustrar isto, considere-se um
aminocido hipottico para o qual os valores de pKA1, pKA2 e pI sejam
respectivamente: 2,35; 9,87 e 6,11. Para este aminocido, no ponto isoeltrico, a
frao de molculas na forma zwitterinica ser de 0,9997 enquanto a frao de
molculas neutras na forma no-zwitterinica ser de 3,019 x 10-8. Ou seja, ao se
executar o clculo da solubilidade com a forma neutra no-zwitterinica, trabalharse- com nmeros em ordens de grandeza inferiores a 10-8. Alm disso, este clculo
feito ilustra tambm porque a forma neutra no-zwitterinica virtualmente
inexistente em soluo.
63
4.2.2 Modelo de Pitzer
(4 13)
Com o termo de longo alcance dado por uma extenso ao modelo de Debye-Hckel
apresentado no captulo segundo:
2
ln LR
i =A z i
2
I
ln(1+b I )+
b
1+b I
(4 14)
Sendo:
1
e2
A =
3 0 r kB T
3/2
1/ 2
( 2d s N A )
8
(4 15)
64
ln SR
i =2 ij ( I ) m j +3 ijk m j m k +...
j s k s
js
...z 2i M s 1ij
j s k s
[ (
a I
1
1 1+a (I )+
exp(a I) m j mk
2 2
2
a I
(4 16)
2
a 2 I2
(4 17)
1
m i z 2i
2 i
(4 18)
65
possvel (na seo seguinte, dar-se- uma justificativa terica para a forma desta
equao atravs de termodinmica estatstica):
ij (T )=C1+
C2
T
(4 19)
S A ( pH )
( pI )
=ln zwitt
+2 1 [ 1 ( pI )S A ( pI ) 1 ( pI ) S A ( pH )]+...
S A ( pI )
zwitt ( pH)
(4 20)
1 = +1= 0 = zwitt =
(4 21)
S A ( pH )
( pI )
=ln zwitt
+2 [ S A ( pI )S A ( pH ) ]
S A ( pI )
zwitt ( pH)
(4 22)
Uma deficincia deste modelo poderia ser encontrada no seguinte fato: a Equao
(4 22) pode ser obtida da mesma forma se a configurao neutra escolhida no
fosse a zwitterinica, isso significa que a interao entre as molculas carregadas e
as molculas neutras so iguais ainda que a molcula na forma zwitterinica se
comporte como uma molcula altamente polar ao contrrio da outra configurao
neutra. Mas apesar desta aparente inconsistncia, o fato que para qualquer efeito
prtico a frao de molculas neutras na configurao no-zwitterinica nula.
Pela direta substituio das Equaes (4 7) a (4 10) e (4 12) na Equao (4
22), tem-se uma relao explcita entre a solubilidade de aminocidos e o pH
66
apenas sendo necessrias informaes da estrutura primria, a solubilidade no
ponto isoeltrico e o parmetro de interao:
] [
S A ( pH)
(1+10pH pK )
(1+10pH pK )
log
=pI pH+log
+log
+...
pI pK
pIpK
S A (pI )
(1+10
)
( 1+10
)
...+
A1
A1
A2
A2
2
[ S A ( pI )S A ( pH) ]
ln 10
(4 23)
A epgrafe que est no caput deste captulo no faz sentido seno com esta seo
que intencionada a aprofundar o estudo das interaes que at agora foram
resumidas em um nico parmetro de ajuste sem uma interpretao fsica mais
profunda. A frase de Brecht (a grosso modo traduzida como: primeiro vem a comida,
depois a moral) resume o esprito desta seo, findado o trabalho propriamente de
engenharia qumica, o trabalho prtico de desenvolver um mtodo de clculo de
uma propriedade de interesse que est dado pela Equao (4 22) - ou em sua
outra representao (4 23) - pode-se agora dar-se ao trabalho de compreender
melhor as interaes responsveis pela no-idealidade de aminocidos em soluo.
Far-se- isso empregando uma abordagem que at o presente momento foi
ignorada neste texto: a termodinmica estatstica.
Pela teoria de gases imperfeitos, possvel escrever o logaritmo do coeficiente de
atividade como uma expanso virial desde que o potencial de interao possa ser
dividido em contribuies de interaes dois-a-dois, trs-a-trs e assim por diante.
Do mesmo modo, pela teoria de McMillan-Mayer possvel emular do ponto de vista
da modelagem termodinmica a situao dada pela no-idealidade de gases para a
situao de um soluto em um solvente lquido (HILL, 1986). No Apndice C esto
67
apresentados argumentos de um modo mais pormenorizado e rigoroso desta teoria.
Aqui, assumir-se- que isso possvel de tal modo que o logaritmo natural do
coeficiente de atividade da molcula zwitterinica seja escrito como:
ln zwitt =2 j B j , zwitt
(4 24)
+
1
Bij=
e
2
16 0 0 0 0 0 0
W ij (r )
kB T
)1 ]r
sen sen dr d d d d d
(4 25)
Considerando que o potencial de fora mdia seja dado pela contribuio de trs
potenciais: o de esferas rgidas (WHS), o potencial atrativo devido s foras de van
der Waals (WvdW) e o potencial devido s interaes eletrostticas (Welet) tal como a
teoria DLVO (Derjagun, Landau, Verwey e Overbeeck) sugere:
W ij (r )=W HS (r )+W vdW ( r)+W elet ( r )
(4 26)
+ ,
2 (r )
W ij (r )= z i z j e e
r (1+ )
r
6,
( )
(4 27)
68
apenas:
Bij=2
[e
1 ] r dr+ e
2
k BT r
( )
1 r dr
(4 28)
k BT r
( )
1+
kBT r
( )
(4 29)
r 2 dr
0
6
1
2 3
dr
=
1
4
k BT r
3
k BT
(4 30)
4 3
1
3
kB T
(4 31)
) [ S ( pI )S ( pH )]
A
(4 32)
2 3 N A
3
C2=C1
k BT
(4 33)
(4 34)
69
A Equao (4 23) por ser uma equao transcendental exige na sua aplicao
uma soluo numrica. Como a derivada analtica desta equao de simples
obteno, foi utilizado o mtodo de Newton-Raphson para o clculo da solubilidade
em um dado pH pela Equao (4 23). Alm disso, o parmetro de interao l deve
ser ajustado ao conjunto de dados experimentais. Para tanto utilizou-se o mtodo de
Nelder e Mead (1965) que apesar de ser um mtodo para otimizao de funes
multivariveis reduz-se a um simples mtodo de busca unidirecional no caso de uma
funo monovarivel. A funo objetivo considerada foi o prprio critrio quantitativo
expresso na Equao (3 40). A Tabela 4.2 apresenta o resultado do ajuste do
parmetro de interao para os sistemas de aminocidos estudados. Os dados de
pKA dos aminocidos estudados neste captulo esto tabelados no Anexo A.
Tabela 4.2 - Valores do parmetro de interao l e do CQ [Equao (3 40)] para diversos
conjuntos de dados experimentais de solubilidade de aminocidos em funo do pH.
Aminocidos
CQ
Ref. Dados Exp.
l / kg mol-1
DL-Alanina
0,0267
2,0 %
DL-Metionina
0,0935
6,8 %
L-Isoleucina
0,234
5,2 %
L-Leucina
0,273
9,4 %
DL-Fenilalanina
3,95
2,9 %
0,0165
4,6 %
L-Serina
As Figuras 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5 e 4.6 apresentam os resultados da aplicao de tais
modelos aos sistema de DL-Alanina, DL-Metionina, L-Isoleucina, L-Leucina, DLFenilalanina e L-Serina, respectivamente.
70
3,5
Solubilidade / mol.kg
-1
3,0
2,5
2,0
1,5
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
pH
1,0
Solubilidade / mol.kg
-1
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
pH
71
3,0
Solubilidade / mol.kg
-1
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
pH
3,0
Solubilidade / mol.kg
-1
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
pH
72
0,4
Solubilidade / mol.kg
-1
0,3
0,2
0,1
0,0
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
pH
12,0
Solubilidade / mol.kg
-1
10,5
9,0
7,5
6,0
4,5
3,0
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
pH
73
Pelas Figuras 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5 e 4.6 possvel afirmar que a aplicao do
modelo proposto uma abordagem profcua no tratamento termodinmico do
equilbrio slido-lquido destes sistemas dado o sucesso na correlao de dados
experimentais de diversos aminocidos. Tambm possvel observar que, apesar da
vasta literatura dedicada modelagem da no-idealidade de solues contendo
aminocidos, por vezes a considerao de soluo ideal suficiente para uma
descrio razoavelmente precisa da curva de solubilidade de aminocidos.
Para uma comparao quantitativa da aplicao dos modelos, a Equao (3 40) foi
usada como um critrio de validao. Alm do modelo proposto e do modelo
considerando soluo ideal, tambm foram comparados os resultados de Tseng et
al. (2009) que aplicaram o modelo NRTL (vide seo 2.5) para calcular a noidealidade considerando a interao entre as molculas de aminocidos DLAlanina, L-Isoleucina, L-Leucina, DL-Fenilalanina e L-Serina e as molculas do
solvente, no caso gua.
A Tabela 4.3 apresenta os valores do critrio quantitativo (CQ) dos trs modelos
avaliados.
Tabela 4.3 - Valores de CQ [Equao (3 40)] em porcentagem para os diferentes modelos
aplicados aos conjuntos de dados de solubilidade de DL-Alanina, L-Isoleucina, L-Leucina, DLFenilalanina e L-Serina a 298,15 K. Dados experimentais de Tseng et al. (2009).
Aminocido
Modelo proposto
Modelo proposto com
Modelo NRTL (TSENG
considerando soluo
valores de l da
et al., 2009)
ideal (l = 0)
Tabela 4.2
DL-Alanina
2,4 %
2,0 %
2,2 %
L-Isoleucina
24,9 %
5,2 %
6,3 %
L-Leucina
32,3 %
9,4 %
13,3 %
DL-Fenilalanina
62,5 %
2,9 %
3,0 %
L-Serina
6,0 %
4,6 %
5,1 %
A Tabela 4.3 mostra claramente que o modelo proposto na Equao (4 23) na sua
forma completa, isto , incluindo o termo de no-idealidade conseguiu correlacionar
os dados experimentais de solubilidade destes aminocidos com grande preciso.
Uma ressalva que deve ser feita que apesar dos desvios do modelo NRTL utilizado
por Tseng et al. (2009) serem apenas ligeiramente superiores, este modelo exige o
ajuste de no mnimo dois parmetros (considerando fixo o fator de no-aleatoriedade
na mistura, aij = 0,3).
74
importante notar tambm que tanto para a DL-Alanina quanto para a L-Serina a
considerao de soluo ideal uma hiptese razovel e que traz a vantagem de
no necessitar de nenhum ajuste de parmetros.
Interessante notar que o desvio em relao a considerao de soluo ideal
aumenta com o aumento da massa molecular destes aminocidos. Tendo por base a
interpretao dada ao parmetro de interao de Pitzer na seo 4.2.3, pode-se
inferir que o aumento da no-idealidade est diretamente ligado ao aumento do
efeito de volume excludo. No ensemble de McMillan-Mayer, o termo referente a
idealidade, assim como no gs ideal, considera partculas pontuais que no
interagem. O modelo de interao de van der Waals inclui um termo que considera
um volume molecular (no fundo, alm do termo atrativo de van der Waals, h um
termo de esferas rgidas que responsvel pelo aparecimento de um termo de
volume excludo) e, aqui, parece fazer sentido que quanto mais pesada a molcula,
maior seu volume; e, por conseqncia, maior o termo de no-idealidade devido ao
volume excludo. Essa observao contribui para a consistncia da modelagem aqui
desenvolvida. A abordagem mais precisa seria considerar a no-idealidade nos
equilbrios qumicos de ionizao, j que a constante de equilbrio o produtrio das
atividades
dos
componentes
elevadas
aos
correspondentes
coeficientes
75
aminocido e a forma zwitterinica. Se se adotar por hiptese que estes parmetros
so iguais, de fcil demonstrao que a forma final da equao do modelo seria:
] [
S A ( pH)
(1+10pH pK )
(1+10pH pK )
log
=pI pH+log
+log
+...
pI pK
pIpK
S A (pI )
(1+10
)
( 1+10
)
...+log
A1
A1
A2
A2
(1+10 pHpK )
2
+
[ S A ( pI )S A ( pH) ]
pIpK
ln 10
(1+10
)
A3
A3
(4 35)
40,0
Solubilidade / mol.kg
-1
30,0
20,0
10,0
0,0
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
pH
76
Pela Figura 4.7 possvel afirmar que a considerao do equilbrio qumico de
ionizao do grupo R da tirosina melhora a descrio do equilbrio slido-lquido.
Tambm observa-se que a hiptese de l = 0 razovel a este sistema.
0,200
11,1 %
Diglicina
3,26
6,9 %
Triglicina
13,8
9,8 %
Tetraglicina
93,6
1,7 %
Pentaglicina
238,8
4,7 %
Hexaglicina
258,2
7,9 %
77
7,0
6,0
Solubilidade / mol.kg
-1
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
pH
0,05
Solubilidade / mol.kg
-1
0,04
0,03
0,02
0,01
0,00
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
pH
78
Tanto pela observao dos valores de CQ da Tabela 4.4, quanto pela observao
das curvas do modelo contrastadas aos dados experimentais de solubilidade
apresentadas nas Figuras 4.8 e 4.9, possvel afirmar que o modelo foi exitoso na
reproduo da curva de solubilidade em funo do pH da glicina e de seus
oligopeptdeos.
Interessante notar que a magnitude do parmetro de interao l aumenta
consistentemente com o aumento da cadeia do peptdeo. Retomando a
interpretao via termodinmica estatstica dada ao parmetro de interao l, temse que:
2 3
N A 1
3
kB T
(4 36)
79
NH2
H H
H
N
H
S
CH3
CH3
OH
N
O
O
H H
S
H2N
CH3
CH3
OH
N
O
O
80
ajustadas. Os dados de pKA usados no clculo esto apresentados no Anexo A. O
cdigo-fonte do programa de clculo no ajuste de parmetros est apresentado no
Apndice D.
A Tabela 4.5 apresenta os valores de s e e ajustados bem como os valores de CQG
definido na Equao (3 41) tanto para a ampicilina quanto para o cido 6aminopenicilnico.
Tabela 4.5 - Valores dos parmetros s, e e CQG para os sistemas contendo ampicilina e cido
6-aminopenicilnico. Dados experimentais de Santana et al. (2010).
Molcula
CQG
s/
e/kB / K
Ampicilina
5,25
299,8
8,2 %
cido 6-aminopenicilnico
2,68
275,6
12,0 %
60,0
Solubilidade / mmol.L
-1
50,0
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0
pH
81
60,0
Solubilidade / mmol.L
-1
50,0
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0
pH
60,0
Solubilidade / mmol.L
-1
50,0
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0
pH
82
60,0
Solubilidade / mmol.L
-1
50,0
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0
pH
600,0
Solubilidade / mmol.L
-1
450,0
300,0
150,0
0,0
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0
pH
Figura 4.16 - Valores de solubilidade do cido 6aminopenicilnico 283,06 K em soluo aquosa (com HCl ou
NaOH) em funo do pH. Dados experimentais (o), Santana et al.
(2010). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha
pontilhada).
83
600,0
Solubilidade / mmol.L
-1
450,0
300,0
150,0
0,0
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0
pH
Figura 4.17 - Valores de solubilidade do cido 6aminopenicilnico 288,01 K em soluo aquosa (com HCl ou
NaOH) em funo do pH. Dados experimentais (o), Santana et al.
(2010). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha
pontilhada).
600,0
Solubilidade / mmol.L
-1
450,0
300,0
150,0
0,0
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0
pH
Figura 4.18 - Valores de solubilidade do cido 6aminopenicilnico 292,95 K em soluo aquosa (com HCl ou
NaOH) em funo do pH. Dados experimentais (o), Santana et al.
(2010). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha
pontilhada).
84
600,0
Solubilidade / mmol.L
-1
450,0
300,0
150,0
0,0
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0
pH
Figura 4.19 - Valores de solubilidade do cido 6aminopenicilnico 298,03 K em soluo aquosa (com HCl ou
NaOH) em funo do pH. Dados experimentais (o), Santana et al.
(2010). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha
pontilhada).
85
Mesmo assim, considerando apenas a variao da solubilidade do ponto isoeltrico
com a variao da concentrao de metanol no sistema foi possvel correlacionar os
dados experimentais de solubilidade de ampicilina e do cido 6-aminopenicilnico
com grande acurcia como pode ser visto nas Figuras 4.20 e 4.21.
As Figuras 4.20 e 4.21 apresentam os resultados da modelagem para os sistemas
contendo ampicilina e cido 6-aminopenicilnico, respectivamente, em diferentes
concentraes de metanol.
digno de ateno o fato de que o efeito da presena de metanol no sistema to
logo diminua a constante dieltrica do solvente alterando a magnitude da
concentrao de soluto em equilbrio na fase lquida no altera o formato da curva
de solubilidade o que coaduna com a hiptese de o termo de no-idealidade e os
valores de pKA permanecerem inalterados.
No entanto, ao assumir tal hiptese deixa-se de se discutir uma questo em aberto
na Termodinmica no ensemble de McMillan-Mayer: como devem ser tratadas as
misturas de solventes e at que ponto um componente deve ser tratado como cosoluto ou como co-solvente. No fazendo parte do escopo deste trabalho tratar
deste tema, ele apenas mencionado.
40,0
35,0
Solubilidade / mmol.L
-1
30,0
25,0
20,0
15,0
10,0
5,0
0,0
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
7,5
pH
86
600,0
Solubilidade / mmol.L
-1
500,0
400,0
300,0
200,0
100,0
0,0
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
7,5
pH
Figura 4.21 - Valores de solubilidade do cido 6aminopenicilnico 298,15 K em soluo aquosa em funo do pH.
Dados experimentais a diferentes fraes mssicas de metanol:
(o) 0,0 %, () 15,0 %, () 30,0 % e () 50,0 %. Santana; Mattedi e
Giordano (2010). Modelo proposto: 0,0 % (linha contnua), 15,0 %
(linha com travesses), 30,0 % (linha semi-contnua) e 50,0 %
(linha pontilhada).
87
The sciences, not yet split by nineteenth-century academicism into a superior 'pure' and an inferior
'applied' branch, devoted themselves to the solution of productive problems: the most striking
advances of the 1780s were those of chemistry, which was by tradition most closed linked to
workshop practice and the needs of industry.
(Eric Hobsbawm, in The Age of Revolution)
5.1 Introduo
O clebre trabalho de George et al. (1997) revelou uma importante interface entre as
teorias termodinmicas a respeito das foras de interao entre protenas e os
processos de cristalizao das mesmas, interface esta embasada na relao entre
os valores do segundo coeficiente virial osmtico e as condies de nucleao de
diversas protenas. Esta notvel observao da janela de cristalizao motivou uma
srie de pesquisas tanto de cunho experimental na determinao de valores de
segundo coeficiente virial osmtico quanto trabalhos de vis fundamentalmente
terico na proposio de modelos de potencial da fora mdia, como Lima et al.
(2009), e de equaes de estado (MOLLERUP; BREIL, 2009ab) no intuito de
calcular
valor
deste
parmetro
comparar
com
os
dados
obtidos
experimentalmente.
Segundo Prausnitz (2003) h pelo menos quatro mtodos bem estabelecidos para a
determinao experimental do segundo coeficiente virial osmtico: osmometria,
espalhamento de luz, medida do ponto de nuvem e fluorescncia anisotrpica.
Alm destes, Tessier; Lenhoff e Sandler (2002) empregaram a cromatografia de
auto-interao para determinar o valor do segundo coeficiente virial osmtico da
lisozima e do quimiotripsinognio; possvel relacionar a reteno relativa de
protenas na coluna cromatogrfica com o segundo coeficiente virial osmtico.
Mesmo assim, h poucos dados disponveis na literatura comparado ao nmero de
protenas de interesse industrial e a infinitude de condies a que estas protenas
podem ser submetidas. Por essa razo, a relao entre o segundo coeficiente virial
88
osmtico e a solubilidade de protena j apontada no trabalho de George et al.
(1997) tem atrado especial ateno na proposio de modelagens termodinmicas
que fundamentam esta observao at ento emprica.
H pelo menos trs trabalhos publicados que apresentam relaes tericas com
distintas formulaes: Guo et al. (1999), Haas; Drenth e Wilson (1999) e Ruppert;
Sandler e Lenhoff (2001). O primeiro aplica a teoria de McMillan-Mayer e a equao
de Gibbs-Duhem a fim de obter uma equao para o potencial qumico da protena
em soluo e assim relacionar o segundo coeficiente virial osmtico com a
solubilidade, ajustando a diferena entre o potencial qumico de referncia da
protena em soluo e o potencial qumico da protena no cristal (GUO et al., 1999).
Apesar da relao terica proposta, nenhuma aplicao concreta foi apresentada.
No trabalho de Haas; Drenth e Wilson (1999) foi desenvolvida uma relao entre o
segundo coeficiente virial e a solubilidade de protena partindo da definio do
segundo coeficiente virial dada pela termodinmica estatstica. Haas; Drenth e
Wilson (1999) fizeram tambm consideraes sobre a anisotropia das interaes
entre molculas no-esfricas e aplicaram o potencial de poo quadrtico e o
potencial de Yukawa para sistemas hipotticos. Por fim, o trabalho de Ruppert;
Sandler e Lenhoff (2001), considerando a lei de Henry e uma proposta de converso
do segundo coeficiente virial osmtico experimental para o segundo coeficiente virial
osmtico limite de McMillan-Mayer, chegaram a uma relao entre o segundo
coeficiente virial osmtico determinado experimentalmente e a solubilidade de
protena, porm com a necessidade de parmetros como o incremento do ndice de
refrao. Ruppert; Sandler e Lenhoff (2001) aplicaram esta relao a alguns
sistemas de lisozima e de ovalbumina.
H que se fazer meno tambm ao trabalho de Allahyarov et al. (2002) que
calcularam valores do segundo coeficiente virial em funo da concentrao de sal
para sistemas hipotticos de protenas atravs de dinmica molecular e concluram
que a dependncia entre estes parmetros no monotnica como aquela prevista
pela teoria de Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek.
No trabalho aqui apresentado, uma nova relao baseada exclusivamente em
termodinmica clssica proposta. Contudo, o desenvolvimento terico percorrido
permite em primeiro plano uma relao entre o segundo coeficiente virial osmtico e
a concentrao do agente precipitante, neste caso, sais; a partir da equao de
Cohn (COHN, 1925), obtm-se uma relao entre o segundo coeficiente virial
89
osmtico e a solubilidade de protena na regio de salting-out para variaes na
concentrao de sal.
De fato, como observado por Watanabe (2007), a fase slida pode conter sais e
gua alm de molculas de protena; no entanto, os ons salinos esto de tal forma
ligados a resduos da cadeia protica que tal complexo on-gua-protena se
comporta como um nico componente eletricamente neutro.
Considerando, ainda, que o potencial qumico da molcula eletricamente neutra de
protena da fase lquida possa ser escrito, para um processo isotrmico no qual o
efeito da presso sobre o potencial qumico seja desprezvel, como uma expanso
virial truncada aps o segundo coeficiente virial osmtico3, tem-se que:
L0 ( m)= 0* (m * )+RT ln
m0
m0
*
*
+2 RTBS
* +2RTB m i = 0 (m )+RT ln
m0
m *0
i
(5 1)
(5 2)
*
*
L
1 0 (m ) RT ln 0 ln S
ln B lnS
1 0 ( m)
+
+
+2 RT
+
=
(5 3)
S B m sal
S B msal m sal
msal msal
S B m sal
Pode-se considerar ainda que o sistema esteja em uma regio do diagrama de fases
onde no h variao do potencial qumico da fase slida; esta hiptese coerente
3 Outro modo de pensar a Equao (5 1) seria considerar a Equao (C 14), desenvolvida no Apndice C,
para o clculo do logaritmo natural do coeficiente de atividade de uma dada molcula neutra de protena e
assumindo por hiptese que os segundos coeficientes viriais entre as diversas configuraes proticas so
iguais.
90
com o trabalho publicado por Watanabe (2007) no qual fica evidente que o diagrama
de fases da lisozima da clara de ovo de galinha apresenta no mximo dois
precipitados verdadeiros em regies distintas do diagrama de fases. Pelo mesmo
critrio de equilbrio estabelecido na Equao (3 1), tem-se que o potencial
qumico da protena eletricamente neutra da fase lquida invariante e, por
conseqncia, a Equao (5 3) pode ser reescrita como:
*
*
1 0 (m ) RT ln 0 ln S
ln B lnS
+
+
+2 RT
+
=0
S B m sal
S B msal m sal
msal msal
(5 4)
( )
RT
pV
(5 5)
91
solvente aquoso alterada e no h alteraes significativas nas interaes entre a
protena e o sal, assume-se que o processo de transferncia de energia afetado
somente por mudanas em Dmcav e Dmelet. J que os outros termos permanecem
inalterados com a variao da concentrao de sal, suficiente avaliar apenas estes
dois termos que sofrem alteraes. Sendo que, assim como proposto por Melander
e Horvth (1977):
cav =[N A A+4.8 N 1/A 3 ( e1)V 2/ 3 ]
(5 6)
= 0 + m sal
(5 7)
B m sal
D d m sal
1+C m sal
(5 8)
Considerando, por outro lado, um estado de referncia infinita diluio para uma
molalidade de sal de equilbrio m1, e outro estado de referncia infinita diluio
para uma molalidade de sal de equilbrio m2, tem-se que a diferena entre os
potenciais qumicos destes estados igual a diferena de entre as energias livres
molares de transferncia entre estes estados e o estado de uma gs hipottico, tal
que:
(5 9)
(5 10)
92
Portanto, a Equao (5 10) pode, evidentemente, ser reescrita em termos
diferenciais como:
* cav elet
=
+
m sal
m sal
m sal
(5 11)
elet
D d =RT
msal
(5 12)
(5 13)
(5 14)
(5 15)
93
terem proposto um embasamento terico para justificar a forma da equao de Cohn
no a torna uma equao terica, apenas apresenta uma formulao interpretativa
dos parmetros desta equao.
A equao de Cohn, por sua grande capacidade de descrever diversos sistemas
com to poucos parmetros, ganhou notoriedade e ainda hoje bastante utilizada
no estudo de operaes unitrias fundadas na precipitao de protenas. Aqui, usarse- a equao de Cohn para facilitar a compreenso do que representa a Equao
(5 4).
Esta equao pode ser escrita como (COHN, 1925):
lnS = K s m sal
(5 16)
(5 17)
(5 18)
A Equao (5 18) acima escrita uma equao geral que relaciona o segundo
coeficiente virial, a solubilidade da protena e a molalidade do sal. A frao de
molculas neutras de protenas funo da molalidade de sal, do pH, da
temperatura, dos valores de pKA e das constantes de equilbrio qumico que
envolvem os ons salinos e os resduos polares da cadeia protica. Esta descrio
no trivial e nem geral, pois depende do tipo de sal usado. Para tanto aqui se
assumir a hiptese de que na regio do salting-out pode-se admitir que:
ln 0
0
m sal
(5 19)
94
Assim, a Equao (5 18) reduz-se a:
ln B
=K s
m sal
(5 20)
( )
B
*
* =K s ( m sal m sal )
B
(5 21)
(5 22)
B* S*
B
(5 23)
de importante meno que a Equao (5 23) tem sua validade restrita a valores
de solubilidade de protena em funo do segundo coeficiente virial para diferentes
valores de molalidade de sal, ou seja, mudanas em pH e em temperatura a priori
no esto contempladas neste modelo.
95
condies deve seguir a equao de Cohn Equao (5 16) e dela pode-se
obter o valor da constante de salting-out, Ks, por simples regresso linear. A Figura
5.1 apresenta esses resultados a partir de dados experimentais obtidos por
Watababe (2007).
3,0
2,0
1,0
ln S
0,0
-1,0
-2,0
-3,0
-4,0
0,0
1,0
2,0
3,0
mNaCl / mol.kg
4,0
5,0
6,0
-1
O valor de Ks para este sistema foi calculado como 0,93 kg mol-1e servir de base
para comparao com o valores de Ks ajustados pela Equao (5 21).
A Equao (5 21) foi aplicada a um conjunto de dados experimentais publicados
por Curtis et al. (2002). Nesse trabalho foram apresentados os valores do segundo
coeficiente virial osmtico em funo da molalidade de cloreto de sdio para a
lisozima nativa cujo resduo de nmero 101 um cido asprtico e para uma
variante da lisozima cujo resduo 101 uma fenilalanina. Esta variante da lisozima
ser referenciada no texto como lisozima D101F. Os valores do segundo coeficiente
virial osmtico foram obtidos por espalhamento de luz.
A Figura 5.2 apresenta os resultados da aplicao da Equao (5 21) aos dados
de Curtis et al. (2002).
96
-0,5
ln (B/B )
0,0
-1,0
-1,5
0,0
0,5
1,0
mNaCl / mol.kg
1,5
2,0
-1
97
60,0
50,0
Solubilidade / g.L
-1
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
-10,0
-7,5
-5,0
-2,5
4
0,0
B x 10 / mol.mL.g
2,5
5,0
-2
39,6 %
58,4 %
44,2 %
27,7 %
Observa-se pela Tabela 5.1 que todos os modelos so pouco eficientes para uma
avaliao quantitativa, no entanto pela Figura 5.3 observa-se que os modelos
98
conseguem ao menos representar qualitativamente o fenmeno estudado. Alm
disso, a modelagem proposta se equipara aos modelos j publicados na literatura no
que tange a eficcia de representao dos dados experimentais; sendo, todavia, que
esta nova modelagem resulta em uma equao muitssimo mais simples e que exige
muito menos parmetros.
H uma ressalva, no entanto, ao uso das Equaes (5 21) e (5 23). Sendo a
regio do diagrama de fases aquela de salting-out, as equaes so vlidas apenas
para valores negativos do segundo coeficiente virial osmtico, ou seja, para foras
intermoleculares atrativas entre as molculas de protena (PRAUSNITZ, 2003), que
fisicamente o que acontece na cristalizao e na precipitao de protenas.
4,0
3,0
ln S
2,0
1,0
0,0
-1,0
-2,0
4,0
4,5
5,0
5,5
I / mol.kg
6,0
6,5
-1
99
Usando a equao de Cohn para ajustar o valor de Ks com os dados de solubilidade
de ovalbumina em solues de sulfato de amnio, foi possvel predizer sem nenhum
ajuste de parmetro adicional a relao entre o segundo coeficiente virial osmtico e
a fora inica (no fundo, a concentrao de sulfato de amnio) pela Equao (5
21).
A Figura 5.5 traz os resultados desta modelagem para os dados do segundo
coeficiente virial osmtico da ovalbumina.
5,0
2,5
ln (B/B )
0,0
-2,5
-5,0
-7,5
-10,0
0,0
1,0
2,0
3,0
I / mol.kg
4,0
5,0
6,0
-1
100
5.3.3 Resultados para a imunoglobulina humana
0,2
0,0
ln (B/B )
-0,2
-0,4
-0,6
-0,8
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
w NaCl
101
6 Concluses
102
volume excludo.
H no captulo dedicado a este tema uma seo que contempla uma aplicao
tecnolgica bastante interessante do ponto de vista de engenharia: a modelagem do
equilbrio slido-lquido de sistemas que contm molculas com grupos blactmicos, por exemplo a ampicilina, cujo interesse industrial notrio dada a sua
funo antibitica.
Em termos de processo a dependncia da solubilidade com o pH crucial em
operaes como a precipitao isoeltrica, ainda assim parmetros como
temperatura e composio do solvente foram avaliados no caso da ampicilina e do
cido 6-aminopenicilnico com grande sucesso na correlao dos dados
experimentais.
Alm disso, foram desenvolvidas relaes entre o segundo coeficiente virial
osmtico, a concentrao de agente precipitante e a solubilidade de protenas.
Neste campo, alguns modelos foram desenvolvidos, mas a necessidade de ajuste
de parmetros e de informaes que estes modelos requerem evocam a
necessidade de relaes to precisas quanto, mas de mais fcil implementao.
Pde-se observar que os modelos at hoje desenvolvidos incluindo o que aqui se
apresenta conseguem descrever a relao entre o segundo coeficiente virial
osmtico e a solubilidade da protena ao menos em termos qualitativos. Contudo, os
prprios dados experimentais, por serem raros, limitam uma maior explorao da
validade dos modelos.
Ficou tambm evidente a caracterstica que o segundo coeficiente virial osmtico
tem de representar a magnitude das foras de interao entre as molculas de
protena, ou seja, quanto mais negativo ele o for, mais atrativas so as foras entre
as molculas de protena facilitando a agregao e diminuindo a solubilidade em
soluo. Este fato pode ser visualizado em todos os modelos.
Como sugestes a trabalhos futuros possvel elencar algumas questes que
permanecem em aberto tanto na rea experimental quanto em termos de
modelagem termodinmica: i) determinao experimental dos valores de pKA na
cadeia protica para diferentes protenas e em diferentes condies tais como
temperatura e composio do solvente; ii) determinao de curvas de solubilidade
de protenas em funo do pH em diversas condies a fim de consolidar a
validao do modelo proposto; iii) determinao experimental de curvas de
solubilidade de aminocidos com trs resduos ionizveis e estudo de como
103
contemplar a questo da no-idealidade nestes sistemas; iv) estudo de como levar
em conta o fato de uma dada protena em um dado pH ser de fato uma populao
de molculas com distintos estados de ionizao no cmputo do potencial da fora
mdia de protenas a fim de prever o diagrama de fases com uma abordagem mais
realstica; v) estudo da possvel relao entre uma dada configurao protica em
um estado de ionizao e a atividade biolgica desta protena; possvel supor que
sabendo qual esta configurao haja uma relao entre a curva da frao desta
configurao e a curva de atividade biolgica da protena em funo do pH.
104
7 Referncias bibliogrficas
FUCHS D.; FISCHER, J.; TUMAKAKA, F.; SADOWSKI, G. Solubility of Amino Acids:
Influence of the pH value and the Addition of Alcoholic Cosolvents on Aqueous
Solubility, Ind. Eng. Chem. Res., v. 45, p. 6578-6584, 2006
GEORGE, A.; CHIANG, Y.; GUO, B.; ARABSHAHI, A.; CAI, Z.; WILSON, W. W.
Second virial coefficient as predictor in protein crystal growth. Methods
Enzymol., v. 276, p. 100-110, 1997
105
GRENN, A. A. Studies in the physical chemistry of the proteins. J. Biol. Chem., v. 95,
p. 517-542, 1931
GREENSTEIN, J. P.; WINITZ, M. Chemistry of the Amino Acids, v. 1, John Wiley &
Sons, New York, 1961
GUO, B.; KAO, S.; MCDONALD, H.; ASANOV, A.; COMBS, L. L.; WILSON, W. W.
Correlation of second virial coefficients and solubilities useful in protein crystal
growth. J. Cryst. Growth, v. 196, p. 424-433, 1999
GUPTA, R. B.; HEIDEMANN, R. A. Solubility models for amino acids and antibiotics,
AIChE J., v. 36, p. 333-341, 1990
HAAS, C.; DRENTH, J.; WILSON, W. W. Relation between the solubility of proteins in
aqueous solutions and the second virial coefficient of the solution. J. Phys.
Chem. B, v. 103, p. 2808-2811, 1999
106
KHOSHKBARCHI, M. K.; VERA, J. H. A simplified perturbed hard-sphere model for
the activity coefficients of amino acids and peptides in aqueous solutions. Ind. Eng.
Chem. Res., v. 35, p. 4319-4327, 1996c
______. Theoretical studies upon dipolar ions. Chem. Rev., v. 24, p. 233-251, 1939
LARSEN, B. L.; RASMUSSEN, P.; FREDENSLUND, A. A modified UNIFAC groupcontribution model for prediction of phase equilibria and heats of mixing, Ind.
Eng. Chem. Res., v. 26, p. 2274-2286, 1987
LIMA, E. R. A.; BISCAIA JR.; E. C.; BOSTRM, M.; TAVARES, F. W.; PRAUSNITZ,
J. M. Osmotic second virial coefficients and phase diagrams for aqueous
proteins from a much-improved Poisson-Boltzmann equation. J. Phys. Chem.
C, v. 111, p. 16055-16059, 2009
LU, J.; WANG, X. J.; YANG, X.; CHING, C. B. Solubilities of Glycine and Its
Oligopeptides in Aqueous Solutions, J. Chem. Eng. Data, v. 51, p. 1593-1596,
2006
of
107
MOLLERUP, J. M.; BREIL, M. P. The osmotic second virial coefficient and the GibbsMcMillan-Mayer framework, Fluid Phase Equilibr., v. 286, p. 88-94, 2009b.
NEAL, B. L.; ASTHAGIRI, D.; VELEV, O. D.; LENHOFF, A. M.; KALER, E. W. Why is
the osmotic second virial coefficient related to protein crystallization? J. Cryst.
Growth, v. 196, p. 377-387, 1999
NELDER, J. A.; MEAD, R. A simplex method for function minimization, Comp. J.,
v. 7, p. 308313, 1965
PARK, B. H.; YOO, K. P.; LEE, C. S. Phase equilibria and properties of amino acids
+ water mixtures by hydrogen-bonding lattice fluid equation of state, Fluid
Phase Equilibr., v. 212, p. 175-182, 2003
PESSA FILHO, P. de A.; MAURER, G. An extension of the Pitzer equation for the
excess Gibbs energy of aqueous electrolyte systems to aqueous
polyelectrolyte solutions, Fluid Phase Equilibr., v. 269, p. 25-35, 2008
PINHO, S. P.; SILVA, C. M.; MACEDO, E. A. Solubility of amino acids: a groupcontribution model involving phase and chemical equilibrium. Ind. Eng. Chem.
Res., v. 33, p. 1341-1347, 1994
PRADHAN, A. A.; VERA, J. H. Effects of acids and bases on the solubility of amino
acids. Fluid Phase Equilibr., v. 152, p. 121-132, 1998
108
RENON, H.; PRAUSNITZ, J. M. Local Compositions in Thermodynamic Excess
Functions for Liquid Mixtures, AIChE J., v. 14, p. 135-144, 1968
SINANOLU. O.; ABDULNUR, S. Effect of water and other solvents on the structure
of biopolymers. Fed. Proc., v. 24, p. 12-23, 1965
TASHIMA, A. K.; OTTENS, M.; VAN DER WIELEN, L. A.; CINTRA, D. E.; PAULI, J.
R.; PESSA FILHO, P. A.; MIRANDA, E. A. Precipitation of porcine insulin with
carbon dioxide. Biotech. Bioeng., v.103, p. 909-919, 2009
109
TESSIER, P. M.; LENHOFF , A. M.; SANDLER, S. I. Rapid measurement of protein
osmotic second virial coeffcients by self-interaction chromatography. Biophys.
J., v. 82, p.1620-1631, 2002
TJONG, H.; ZHOU, H. X. Prediction of protein solubility from calculation of transfer
free energy. Biophys. J., v. 95, p. 2601-2609, 2008
TSENG, H. C.; LEE, C. Y.; WENG, W. L.; SHIAH, I. M. Solubilities of amino acids in
water at various pH values under 298.15 K. Fluid Phase Equilib., v. 285, p. 9095, 2009
110
pH
c ( pH) d pH=
pI
2 pI
{(
n
j=1
1
1+10 pH pK
Aj
)[
1+ j (1 j )10 pH pK
Aj
d pH
(C 1)
Aj
(C 2)
(C 3)
E, que:
d pH =
1 1
dy
ln10 y
(C 4)
c ( pH)d pH=
2y
0
pI
{ ( )[
n
j=1
1
1+y
1+ j (1 j ) y ]
( )
1 1
dy =...
ln 10 y
( )
1
1
1
y
1
...=
(1+ j )
dy (1 j )
dy =...
2ln 10 j=1
1+y y
1+y y
y
y
...=
{ [( )
1
( 1+ j )
2ln 10 j=1
n
...=
y0
{ [
( )
( )
1
1
1
dy
dy (1 j )
dy =...
y
1+y
1+y
y
y
0
1
y
(1+y )
(1+y )
( 1+ j ) ln 0 ln
0 (1 j ) ln
2ln 10 j=1
y
( 1+y )
(1+y 0)
(C 5)
111
pH
c ( pH)d pH= 12
j =1
pI
(1+ j ) log
(1+y )
(1+y )
y
=...
0 ( 1+ j )log
0 (1 j ) log
y
( 1+y )
(1+y 0 )
...=
n
(1+y )
1
y
(1+ j )log 0 [( 1+ j )+(1 j ) ] log
=...
2 j=1
y
(1+y 0 )
...=
n
(1+y )
1
y
( 1+ j )log 0 2 log
2 j=1
y
(1+y 0)
(C 6)
c ( pH)d pH=
j =1
pI
...=
j=1
(1+ j )
10 pHpK
log
2
10 pIpK
Aj
Aj
(1+10pH pK )
log
=...
(1+10 pIpK )
Aj
Aj
(1+ j )
(1+10pH pK )
( pHpI )log
=...
pI pK
2
(1+10
)
Aj
Aj
...=(pHpI )
j =1
] [
n
(1+ j )
( 1+10pH pK )
log
pI pK
2
j=1
(1+10
)
Aj
Aj
(C 7)
Entretanto:
n
j=1
(1+ j )
=n+
2
(C 8)
c ( pH)d pH=n+(pHpI )
pI
j =1
(1+10 pH pK )
pIpK
(1+10
)
Aj
log
Aj
(C 9)
112
/*****************************************************************************/
/* Escola Politcnica da Universidade de So Paulo
*/
/* Departamento de Engenharia Qumica
*/
/* Grupo de Engenharia de Bioprocessos (GenBio)
*/
/* Programa de clculo da solubilidade de protenas em funo do pH
*/
/* Lus Fernando Mercier Franco & Pedro de Alcntara Pessa Filho
*/
/*****************************************************************************/
/******************************************************************************/
1) Para usar este programa um arquivo de entrada requerido. A extenso deste
arquivo precisa ser .txt e este arquivo deve ser salvo nos mesmos diretrio e
pasta do executvel. Abaixo um exemplo para a insulina suna a 298.2 K, dados de
Tashima et al. (2009).
Nome_da_protena:
Insulina_suina
Nmero_de_resduos:
16
(Aminocidos,nu[j],pKA):
G
1
7.38
E
-1
4.37
Y
-1
10.20
E
-1
4.37
Y
-1
10.20
N
-1
3.45
F
1
7.38
H
1
5.98
H
1
5.98
E
-1
4.37
Y
-1
10.20
E
-1
4.37
R
1
11.10
Y
-1
10.20
K
1
8.52
A
-1
3.45
(pI,pIsol):
5.4 0.0000222
Nmero_de_dados_de_solubilidade:
8
Dados_de_solubilidade(pH,sol):
4.6 0.0000941
4.7 0.0000569
4.8 0.0000441
5.0 0.0000307
5.3 0.0000246
5.4 0.0000222
5.6 0.0000259
5.7 0.0000502
2) Um arquivo chamado "_helpfile.txt" criado durante a execuo do programa.
Este arquivo contm os valores dos parmetros discretos epsilon[j,k] para todos os
resduos e para todas as configuraes neutras possveis.
3) Os autores no tm qualquer responsabilidade sobre o uso deste programa.
/******************************************************************************/
113
#include
#include
#include
#include
#include
<stdio.h>
<stdlib.h>
<math.h>
<string.h>
<time.h>
*/
*/
*/
*/
*/
*/
*/
*/
*/
*/
*/
*/
*/
*/
*/
*/
*/
*/
*/
*/
*/
char name[NUM];
char res[NUM];
char nfile[NUM];
char get[NUM];
time_t t1, t2;
FILE *ARQUI, *HELPFILE;
(void) time(&t1);
printf("-----------------------------------------------------------------");
printf("\n");
printf("\n\t ESCOLA POLITECNICA DA UNIVERSIDADE DE SAO PAULO\n");
printf("\n\t
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUIMICA\n");
printf("\n\t
GRUPO DE ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS\n");
printf("\n\t
............................................. ");
printf("\n\t
: SOLUBILIDADE DE PROTENAS EM FUNO DO pH : ");
printf("\n\t
:...........................................:\n");
printf(" \n\t Desenvolvido por Luis Fernando Mercier Franco");
114
printf(" \n\t & Pedro de Alcantara Pessoa Filho");
/**************************************************************************/
/* Clculo da solubilidade da protena pela Equao (3 18)
*/
/**************************************************************************/
/* Clculo de configuraes neutras */
HELPFILE = fopen("_helpfile.txt", "w");
count = 0;
M = pow(2, n);
for (k = 0; k < M; k++){
aux = k;
c = 0;
for (j = 0; j < n; j++){
rem = aux % 2;
quot = aux / 2;
epsm[j] = rem;
aux = quot;
115
c = c + epsm[j] * nu[j];
}
if (c == 0){
for (j = 0; j < n; j++){
eps = epsm[j] * nu[j];
fprintf(HELPFILE, "%d ", eps);
}
count = count + 1;
}
}
fclose(HELPFILE);
pH[nexp] = pI;
/* Clculo da frao total e da mais comum */
for (i = 0; i <= nexp; i++){
frac = 0;
mc = 0;
HELPFILE = fopen("_helpfile.txt", "r");
for (k = 0; k < count; k++){
prod = 1.0;
for (j = 0; j < n; j++){
ex = pow(10.0, pH[i] - pKA[j]);
fscanf(HELPFILE, "%d", &eps);
AS = (1 + nu[j]) / 2 - eps;
BS = (nu[j] - 1) / 2 - eps;
prod = prod * (1.0 / (1.0 + ex)) * (1.0 * AS * ex - 1.0 * BS);
}
auxiliar = prod;
if (k > 0 && auxiliar > mc){
mc = auxiliar;
pmc = k;
}
frac = frac + prod;
}
fclose(HELPFILE);
phimc[i] = mc;
phitot[i] = frac;
}
HELPFILE = fopen("_helpfile.txt", "r");
for (k = 0; k < count; k++){
for (j = 0; j < n; j++)
fscanf(HELPFILE, "%d", &eps);
if(k == pmc - 1)
for (j = 0; j < n; j++)
fscanf(HELPFILE, "%d", &epsmc[j]);
}
fclose(HELPFILE);
/* Clculo da solubilidade */
for (i = 0; i < nexp; i++)
s18[i] = pIsol * phitot[nexp] / phitot[i];
/**************************************************************************/
/**************************************************************************/
/**************************************************************************/
/* Clculo da solubilidade da protena pela Equao (3 32)
*/
/**************************************************************************/
for (i = 0; i < MAX; i++){
/* Clculo da funo eta[j] - Equao (3 - 34) */
prod = 1;
npos = 0;
116
for (j = 0; j < n; j++){
ex = 1.0 + pow(10.0, pH[i] - pKA[j]);
ex0 = 1.0 + pow(10.0, pI - pKA[j]);
prod = prod * (ex / ex0);
npos = npos + (1 + nu[j]) / 2;
}
/* Clculo da solubilidade */
s32[i] = pIsol * pow(10.0, (1.0 * npos) * (pI - pH[i])) * prod;
}
/**************************************************************************/
/**************************************************************************/
/**************************************************************************/
/* Impresso dos resultados na tela
*/
/**************************************************************************/
printf("\n\n RESULTADOS:\n\n");
printf(" Proteina: %s\n\n", name);
printf(" Tabela 1 Parametros de calculo\n\n");
printf(" Residue | nu[j] | eps[j,k*] | pKA\n");
printf(" ---------------------------------------------\n");
for (j = 0; j < n; j++){
if (nu[j] > 0)
printf("
%c |
%d |", res[j], nu[j]);
else
printf("
%c | %d |", res[j], nu[j]);
if (epsmc[j] < 0)
printf("
%d
|", epsmc[j]);
else
printf("
%d
|", epsmc[j]);
if (pKA[j] < 10.0)
printf(" %.2lf\n", pKA[j]);
else
printf(" %.2lf\n", pKA[j]);
}
printf(" *Refere-se a configuracao mais comum.\n\n");
printf("\n\n Tabela 2 Carga e fracao de moleculas neutras\n");
printf("\n pH |
Z
| phimc | phitot\n");
printf(" ------------------------------------------------\n");
for (i = 0; i < nexp; i++)
printf(" %.2lf | %.2e | %.2e | %.2e\n", pH[i], Z[i], phimc[i],
phitot[i]);
printf("\n\n Tabela 3 Valores de solubilidade\n");
printf("\n pH |
s18
|
s32
| sexp\n");
printf(" ------------------------------------------------\n");
for (i = 0; i < nexp; i++)
printf(" %.2lf | %.2e | %.2e | %.2e\n", pH[i], s18[i], s32[i],
sexp[i]);
(void) time(&t2);
printf("\n\n Tempo de execuo = %d segundos\n", (int) t2-t1);
printf("---------------------------------------------------------------\n");
/**************************************************************************/
/**************************************************************************/
return 0;
}
117
118
Partindo, ento, da teoria de McMillan-Mayer e truncando a expanso virial da
presso osmtica aps o segundo coeficiente, tem-se que (PITZER, 1973):
= k B T
( )
u ij
1
3
g ij (r ) 4 r dr
i
j
6 i j
r
0
(C 1)
(C 2)
=N+ 1
N N B ,
k B T V V 2 i j i j ij
sendo N = N i
(C 3)
i =1
( ) ]
1
N
ln k =
kB T N k
v
dv ln
T , ,N l k
kBT
(C 4)
( )
]}
(N i N j )
N
1
1
= +
B ij
k B T N k
v N v2 i j
Nk
(C 5)
Logo:
v
ln k =
...=
1
V
(N i N j )
1 1
1
Bij dv ln
=...
2
v v Nv i j
Nk
kB T
(N i N j )
B ij ln
N k
kB T
(C 6)
119
] [
( Ni N j )
( N 1 N 1)
(N 1 N k )
(N 1 N m )
B ij =
B 11+...+
B 1k +...+
B 1m+...
Nk
Nk
N k
Nk
(N k N 1)
(N k N k )
( N k N m)
B k1+...+
B kk +...+
Bkm +...
Nk
Nk
N k
(N m N 1)
(N m N k )
(N m N m )
Bm1 +...+
B mk +...+
B mm
N k
N k
Nk
...+
...+
(C 7)
Contudo:
0, se ik , jk
(N i N j ) N j , se i=k , j k
=
Nk
N i , se i k , j =k
2N i , se i=k , j=k
(C 8)
Portanto:
( Ni N j )
B ij =0+...+N 1 B 1k +...+0+... N 1 B k1+...+2 N k B kk +...
Nk
(C 9)
Considerando ainda que Bij = Bji, ou seja, a matriz de interaes simtrica j que
por uma hiptese bastante razovel o modo e a intensidade da interao de i com j
deve ser o mesmo que de j com i, tem-se que:
( Ni N j )
B ij =2 N j B jk
Nk
j
(C 10)
2
V
N j B jk ln( k T )
j
(C 11)
k
=2 j B jk
kB T
j
(C 12)
120
ln
fk
=2 j B jk
k kB T
j
(C 13)
(C 14)
121
/******************************************************************************/
/* ESCOLA POLITCNICA DA UNIVERSIDADE DE SO PAULO
*/
/* DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICA
*/
/* GRUPO DE ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS
*/
/* SOLUBILIDADE DE AMINOCIDOS
*/
/******************************************************************************/
#include
#include
#include
#include
#include
#define
#define
#define
#define
<stdlib.h>
<stdio.h>
<math.h>
<string.h>
<dirent.h>
NPM 100
MAX 100
NITERMAX 1000
VEC 40
ndata:
4
AMP1
Temperature(K):
283.06
pKA1_pKA2:
2.27
7.66
122
pI_solpI:
5.5
nexp:
5
pH_sexp:
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
13.45
13.45
14.07
15.96
18.73
39.59
AMP2
Temperature(K):
288.01
pKA1_pKA2:
2.24
7.61
pI_solpI:
5.5
14.75
nexp:
5
pH_sexp:
5.5
14.75
6.0
16.35
6.5
17.19
7.0
19.29
7.5
47.00
AMP3
Temperature(K):
292.95
pKA1_pKA2:
2.14
7.45
pI_solpI:
5.5
16.88
nexp:
5
pH_sexp:
5.5
16.88
6.0
17.17
6.5
18.50
7.0
27.48
7.5
49.80
AMP4
Temperature(K):
298.03
pKA1_pKA2:
2.14
7.31
pI_solpI:
5.5
20.89
nexp:
5
pH_sexp:
5.5
20.89
6.0
21.61
6.5
22.27
7.0
28.39
7.5
51.37
123
printf("\n\t
GRUPO DE ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS
\n");
printf("\n\t
............................................. ");
printf("\n\t
:
SOLUBILIDADE DE AMINOACIDOS
: ");
printf("\n\t
:...........................................: \n");
printf(" \n\t Desenvolvido por Luis Fernando Mercier Franco");
printf(" \n\t & Pedro de Alcantara Pessoa Filho");
/**************************************************************************/
/* Leitura do nome do arquivo e da estimativa inicial
*/
/**************************************************************************/
printf(" Nome do arquivo com estimativa inicial = ");
scanf("%s", nfile);
strcat(nfile, ".txt");
ENT = fopen(nfile, "r");
fscanf(ENT, "%s", get);
fscanf(ENT, "%d", &N);
fscanf(ENT, "%s", get);
for (i = 0; i < N; i++)
fscanf(ENT, "%lf", &X1[i]);
fscanf(ENT, "%s", get);
for (i = 0; i < N; i++){
fscanf(ENT, "%lf", &XMIN[i]);
fscanf(ENT, "%lf", &XMAX[i]);
}
fclose(ENT);
printf(" Nome do arquivo com parametros de entrada = ");
scanf("%s", dfn);
strcat(dfn, ".txt");
/**************************************************************************/
/* Minimizao da funo objetivo (3 - 41) SIMPLEX (NELDER E MEAD, 1965)*/
/**************************************************************************/
EFAC = pow(10, -6);
Y = FO(X1, N, dfn);
printf(" Y(0) = %e\n", Y);
for (i = 0; i < N; i++){
XK[i] = 1.0;
EMAX[i] = 0.01 * (XMAX[i]-XMIN[i]);
X2[i] = X1[i];
X3[i] = X1[i];
}
YSTAR = Y;
LS = 0;
P100:
YTEST = YSTAR;
for (i = 0; i < N; i++){
if (X1[i] >= XMAX[i] && XK[i] > 0.0) goto P1010;
if (X1[i] <= XMIN[i] && XK[i] < 0.0) goto P1010;
X2[i] = X1[i] + XK[i] * EMAX[i];
if (X2[i] > XMAX[i]) X2[i] = XMAX[i];
if (X2[i] < XMIN[i]) X2[i] = XMIN[i];
Y1 = FO(X2, N, dfn);
if (Y1 >= YTEST) goto P1010;
XK[i] = 2.0 * XK[i];
if (XK[i] > 1.0) XK[i] = 1.0;
if (XK[i] < -1.0) XK[i] = -1.0;
goto P103;
P1010:
if (X1[i] <= XMIN[i] && XK[i] > 0.0) goto P1011;
if (X1[i] >= XMAX[i] && XK[i] < 0.0) goto P1011;
X2[i] = X1[i] - XK[i] * EMAX[i];
if (X2[i] < XMIN[i]) X2[i] = XMIN[i];
if (X2[i] > XMAX[i]) X2[i] = XMAX[i];
Y1 = FO(X2, N, dfn);
if (Y1 >= YTEST) goto P1011;
XK[i] = -1.0 * XK[i];
goto P103;
124
P1011:
X2[i] = X1[i];
XK[i] = 0.5 * XK[i];
if (XK[i] < 0.0) goto P1015;
if (XK[i] < 0.5 * EFAC) XK[i] = 0.5 * EFAC;
goto P1018;
P1015:
if (fabs(XK[i]) < 0.5 * EFAC) XK[i] = -0.5 * EFAC;
P1018:
Y1 = YTEST;
P103:
YTEST = Y1;
}
if (LS == 1) goto P350;
YBASE = YTEST;
if (YBASE < YSTAR) goto P300;
for (i = 0; i < N; i++)
if (fabs(XK[i]) > 0.5 * EFAC) goto P100;
goto P600;
P300:
for (i = 0; i < N; i++){
X1[i] = X3[i] + 2.0 * (X2[i] - X3[i]);
if (X1[i] < XMIN[i]) X1[i] = XMIN[i];
if (X1[i] > XMAX[i]) X1[i] = XMAX[i];
X3[i] = X2[i];
X2[i] = X1[i];
}
YSTAR = FO(X1, N, dfn);
LS = 1;
goto P100;
P350:
LS = 0;
if (YTEST >= YBASE) goto P500;
YBASE = YTEST;
goto P300;
P500:
for (i = 0; i < N; i++){
X1[i] = X3[i];
X2[i] = X1[i];
}
YSTAR = YBASE;
goto P100;
P600:
Y = FO(X1, N, dfn);
/**************************************************************************/
/* Impresso dos resultados
*/
/**************************************************************************/
printf("\n\n Valor otimo da funcao objetivo: %.3lf\n\n", Y);
printf("\t\t
Variaveis
| Valores de otimo\n");
printf("\t\t ---------------------------------\n");
for (i = 0; i < N; i++)
printf("\t\t
XOTM[%d]
|
%e\n", i + 1, X1[i]);
printf("-----------------------------------------------------------------\n");
return 0;
}
double FO(double par[MAX], int n, char dfn[VEC]){
int i, j, k, ndata, nexp;
int cont[MAX];
double pI, spI, pKA1, pKA2, exp, aminus, aplus, tau;
double fipI, lnf, dtau, FUN, tol, lam, T, penalty;
double fi[MAX], sol[NITERMAX], sexp[MAX], pH[MAX], s[MAX], F[MAX];
char get[MAX];
FILE *ENT;
tol = pow(10.0, -6.0);
125
penalty = 1000000.0;
FUN = 0.0;
ENT = fopen(dfn, "r");
fscanf(ENT, "%s", get);
fscanf(ENT, "%d", &ndata);
for (k = 0; k < ndata; k++){
fscanf(ENT, "%s", get);
fscanf(ENT, "%s", get);
fscanf(ENT, "%lf", &T);
fscanf(ENT, "%s", get);
fscanf(ENT, "%lf", &pKA1);
fscanf(ENT, "%lf", &pKA2);
fscanf(ENT, "%s", get);
fscanf(ENT, "%lf", &pI);
fscanf(ENT, "%lf", &spI);
fscanf(ENT, "%s", get);
fscanf(ENT, "%d", &nexp);
fscanf(ENT, "%s", get);
for (i = 0; i < nexp; i++){
fscanf(ENT, "%lf", &pH[i]);
fscanf(ENT, "%lf", &sexp[i]);
}
lam = par[0] + par[1] / T;
exp = pow(10.0, pI - pKA1);
aminus = exp / (1.0 + exp);
exp = pow(10.0, pI - pKA2);
aplus = 1.0 / (1.0 + exp);
fipI = aminus * aplus;
F[k] = 0.0;
cont[k] = 0;
for (i = 0; i < nexp; i++){
exp = pow(10.0, pH[i] - pKA1);
aminus = exp / (1.0 + exp);
exp = pow(10.0, pH[i] - pKA2);
aplus = 1.0 / (1.0 + exp);
fi[i] = aminus * aplus;
lnf = log(fipI / fi[i]);
sol[0] = spI;
/* Mtodo de Newton-Raphson para clculo da Equao (4 - 23) */
for (j = 0; j < NITERMAX; j++){
tau = log(sol[j]/spI)-lnf+lam*(sol[j]-spI);
dtau = 1.0 / sol[j] + lam;
sol[j+1] = sol[j] - tau / dtau;
if (fabs(sol[j+1] - sol[j]) < tol){
s[i] = sol[j+1];
cont[k] = cont[k] + 1;
j = NITERMAX + 1;
}
}
F[k] = F[k] + pow(((sexp[i] - s[i]) / sexp[i]), 2.0);
}
F[k] = F[k] + penalty * (nexp - cont[k]);
FUN = FUN + F[k];
}
fclose(ENT);
FUN = sqrt(FUN / (1.0 * ndata * nexp));
return FUN;
}
126
Tabela A.1 - Valores de pKA para aminocidos, peptdeos e molculas com grupos -lactmicos
estudados no captulo quatro.
Molcula
T/K
pKA1
pKA2
Referncias
DL-Alanina
298,15
2,35
9,87
DL-Metionina
298,15
2,12
9,28
L-Isoleucina
298,15
2,32
9,76
L-Leucina
298,15
2,33
9,74
DL-Fenilalanina
298,15
2,58
9,24
L-Serina
298,15
2,21
9,15
298,15
2,20
9,11
Glicina
298,15
2,34
9,60
Diglicina
298,15
3,12
8,17
Triglicina
298,15
3,26
7,91
Tetraglicina
298,15
3,05
7,75
Pentaglicina
298,15
3,05
7,70
Hexaglicina
298,15
3,05
7,60
Ampicilina
283,1
2,27
7,66
288,1
2,24
7,61
293,1
2,14
7,45
298,1
2,14
7,31
283,1
1,98
5,34
288,1
2,04
5,25
293,1
2,10
5,18
298,1
2,20
4,83
Tirosina
cido 6-aminopenicilnico