Cules son los cidos nucleicos no los cidos nucleicos?

Problemas de estimacin de pureza del cido nucleico por absorbancia UV

MANCHESTER

KEITH L

Departamento de bioqumica Universidad de Witwatersrand Johannesburgo Sudfrica

Introduccin
En 1942 Warburg y Christian ~ public un mtodo twowavelength para medir la concentracin de protena en la posible presencia
de contaminacin R N A.
Se mide la absorbancia de la misma muestra a 280 y 260nm y la concentracin de protena (mg/ml)
2 calculado como 1.55A2so-0.76A260.
Hoy en da, A260 lecturas y la A26o/Azs0 relacin se utilizan para medirlas cantidades de R N A y N D A
y su relativa pureza en lo referente a contaminacin por protenas. Segn Maniatis "un A26o de 1.0 corresponde a
aproximadamente 50 mg/ml de DNA trenzada doble...
Preparaciones puras de D N A tienen anA260/A2s0of 1.8. Si hay contaminacin con protenas o fenol al A260/A280 ser
significativamente menor". Desgraciadamente el lector quedo adivinar cmo mucho menos es significativamente menor.

Comparativa absorbancia
Publicaciones recientes en BioTechniques 4 ~ han sealado que la A260/A2s0relacin no es una medida particularmente sensible
de protena (o fenol) contaminacin del R N A o de D N A muestras. El punto que parece eludir muchos
los estudiantes trabajando en biologa molecular es cmo enormemente mayor es la absorcin relativa de cido nucleico en
relacin con la protena en la A26o a A280regin.
Muchos libros de texto proporcionan espectros de absorcin de los cidos nucleicos y protenas, pero stos estn siempre en
diferentes
captulos y es raro encontrar un diagrama de los dos espectros sobrepuestos. Un ejemplo es en Mathews y van Holde, 7but el
diagrama no representan concentraciones iguales de cido nucleico y protena, y de este diagrama se podra perdonar creyendo
que sus coeficientes de absorcin especfica a ser similares.
Figura 1, que viene de un documento por Caspersson 8 en 1936, es la nica figura publicada de que el autor sabe
que intenta comparar los espectros de absorcin de concentraciones similares de D N A y de protenas en la misma
ejes. La figura muestra, quiz ms claramente que los nmeros, la gran diferencia entre la absorbancia mxima de D N A 260 nm
y la de albmina srica (lnea quebrada) a 280 nm.
La figura tambin demuestra que las tres protenas diferentes utilizan, albmina srica, protamina y las histonas,
tienen diversos espectros. La absorbancia de las protenas a 280 nm es debido a su contenido de tirosina y especialmente
triptfano (Fig. 2) y por lo tanto vara con el contenido de estos aminocidos que son bajos o ausentes en el
histonas y protaminas.
Figura 1 Espectros de absorcin de DNA y protenas diferentes en el rango de 200-300 nm.
(1) timo de becerro ADN (sal de sodio, 0,5 mg/ml); (2) lnea de quebrado: albmina srica (0.5 mg/ml); (3)
sulfato de protamina (5 mg/ml); (4) sulfato de histona (0.5 mg/ml)

Figura 2 Espectros de absorcin de los aminocidos triptfano, tirosina y fenilalanina en el rango de 230-300 nm. Es
la ordenada de la absorbancia molar notethat (absorbancia de un
solucin molar) en contraposicin a simplemente muestra como en la Fig 1 (de referencia 9)
Qu significa 'mucho menor'?
Para volver a Maniatis y lo que constituye significativamente menos, la contaminacin de una muestra de ARN o ADN de
protena est dada por la expresin % protena en la muestra sobre una base de masa a masa donde un ADN es el coeficiente de
absorcin especfico (1 mg/ml) de D N A la longitud de onda especificada en el subndice, un prot
que para la protena en la misma concentracin y son el
A260/280 relacin de . Si tenemos una protena promedio con un a-280 de 1.0 y una a260 de 0.57, entonces, si una relacin
de 1.80 indica 100% de pureza del ADN, una relacin de 1,70 implica 50% contaminacin y 1,6 casi el 70%. La frmula puede ser
replanteada en la forma
obviamente lo mismo. RNA, si un cociente de 2.0 implica 100% de pureza, de 1.9 sugiere ARN de 57% y 38 1,8%. Claramente no
es necesario que la proporcin disminuir por mucho antes de que aparezca probable que
grandes cantidades de protenas estn presentes. Por otra parte, si los contaminantes son las histonas o protaminas influir en la
relacin an menos.
Conclusin
No se sugiere que measuringA26o/A2so relaciones no es un ejercicio til. Claramente una baja relacin implica mucha
contaminacin, pero tambin podra indicar un mal funcionamiento del espectrofotmetro. Si este fuera el caso, conclusiones
llegaron de A260 lecturas solo sera poco fiables. Se trata de utilizar la relacin con la comprensin.
Referencias