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Extraccin y cuantificacin por HPLC de licopeno en tomate y polvo de tomate

Candelas Cadillo Mara Guadalupe1, Alans Guzmn Mara Guadalupe de Jess2 y Del Ro
Olague Felipe1.
Facultad de Ciencias Qumicas de la UJED, Gmez Palacio, Dgo. Facultad de Ciencias
Biolgicas de la UANL, San Nicols de los Garza, N. L. lupecandelas@prodigy.net.mx
Resumen
El objetivo de este trabajo fue comparar el contenido de licopeno en el jugo de tomate fresco
y en el polvo obtenido de ste mediante secado por aspersin, utilizando cromatografa de
lquidos de alta resolucin para la cuantificacin. Se deshidrat jugo de tomate adicionado
con maltodextrina 10 DE como encapsulante en un secador por aspersin marca Buchi
modelo B-191, con temperatura del aire de entrada 170 y 180C; y para la concentracin de
maltodextrina, 80 y 100% en base a slidos totales de tomate. De cada uno de los cuatro
tratamientos se hicieron tres repeticiones. Se determin la concentracin de licopeno en g/g
de slidos de tomate (g/gst), tanto en jugo como en el polvo de tomate mediante
cromatografa lquida de alta resolucin en fase reversa. En trminos de porcentaje de
diferencia en la concentracin de licopeno entre el jugo y el polvo de tomate se obtuvieron
las siguientes medias: con 170C y 80%, 32.83; con 170C y 100%, 33.69; con 180C y 80%,
74.94; y con 180C y 100%, 14.49. En cuanto a la estabilidad del licopeno, no se encontr
diferencia significativa correspondiente a la temperatura del aire de entrada, pero la
concentracin de maltodextrina si la afect (p=0.0336).
Abstract
The objective of this work was to compare lycopene content in fresh juice tomato and spray
dried tomato powder using high performance liquid chromatography. Juice was extracted
from raw tomatoes and 110 DE maltodextrin was added for encapsulation Spray drier Bchi
B-191 it was feeding. Processing variables were inlet air temperature (170 and 180C) and
maltodextrin concentration (80 and 100% on tomato solids basis). It was carried out four
treatments and three repetitions. Juice and powder lycopene concentration was determined
(g/g tomato solids) through high performance liquid chromatography on reverse phase.
Means of lycopene concentration difference percent were 32.83 (170C and 80%), 33.69
(170C and 100%), 74.94 (180C and 80%), y 14.49 (180C and 100%). Inlet air temperature
was no effect in Lycopene stability. It found significant difference on lycopene stability
because of maltodextrin concentration (p=0.0336).
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Introduccin
Los carotenoides son nutrientes que actan como antioxidantes y como secuestradores de
radicales libres; son los responsables de los colores amarillos, anaranjados y rojos de frutas
y verduras. Entre ellos se encuentran el licopeno, -caroteno y lutena (Vasconcellos, 2000).
El licopeno es un caroteno que se encuentra en tomates, toronjas rojas, sandas y pimientos
rojos. Es un antioxidante probado que posee el mayor efecto protector contra los radicales
libres. En variedades comunes de tomate, la concentracin de licopeno es de 3 a 12.2
mg/100 g de fruta madura (Arias y col., 2000: Martnez-Valverde, 2002; Tonucci y col., 1995;
Kachik y col. 1992). La causa principal del deterioro en los carotenoides es la oxidacin, que
es mayor cuando se pierde la integridad celular. El alto grado de insaturacin los hace
fcilmente oxidables, siendo especialmente sensibles a la luz, calor y oxgeno (Mnguez,
1997). Otros factores fsicos y qumicos que se sabe degradan otros carotenoides, son
temperaturas elevadas, exposicin a la luz, al oxgeno y a pH extremos. Adems de la
degradacin oxidativa, con facilidad se lleva a cabo la isomerizacin cis-trans (Nguyen y
Schwartz, 1999; Shi y Le Maguer, 2000).
La isomerizacin no existe, o es muy poca, cuando se lleva a cabo la extraccin de
carotenoides con tetrahidrofurano (THF), metanol (MeOH) y acetonitrilo (ACN) (Ball, 1992).
Diversos autores reportan que el licopeno se separa de otros carotenoides usando columnas
C18 en fase reversa y que para separar sus ismeros se usa una columna C30. La deteccin
del licopeno se hace de 470 a 475 nm. En la mayora de los estudios usaron para la fase
mvil metanol, ACN, THF y otro solvente (diclorometano, agua, 2 propanol). La velocidad de
inyeccin est entre 1 y 2 ml/min y el volumen de inyeccin generalmente fue de 20 l
(Anguelova y Warthesen, 2000; Arias y col., 2000; Wagner y Warthesen, 1995; Sadler y col.,
(s/a))
El objetivo de este trabajo fue comparar el contenido de licopeno en el jugo de tomate fresco
y en el polvo obtenido de ste mediante secado por aspersin, utilizando cromatografa de
lquidos de alta resolucin para la cuantificacin.
Materiales y Mtodos
El trabajo se llev cabo en el periodo comprendido de agosto de 2003 a enero de 2004, en
dos instituciones. En los laboratorios de Alimentos de la Facultad de Ciencias Biolgicas de
la Universidad Autnoma de Nuevo y en el taller de alimentos y en los laboratorios de la
Facultad de Ciencias Qumicas de la Universidad Jurez del Estado de Durango.
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Se trabaj con 1000 g de jugo de tomate bola originario de Guasave, Sin., adquirido en un
centro comercial de Gmez Palacio, Dgo. Para elegir la muestra, se midieron los parmetros
de color, L, a* y b* en cada tomate cinco veces con el colormetro Minolta CR-300 en la
superficie alrededor de la regin ecuatorial (Arias y col., 2000).
Se extrajo el jugo con un extractor marca Moulinex domstico modelo 753 y se midieron los
parmetros de color al jugo extrado para tenerlos como referencia. Despus se le
determinaron slidos solubles totales con el refractmetro Atago HSR-500. De acuerdo con
el porcentaje de slidos determinado y al peso de jugo extrado, se calcul la cantidad en
gramos de maltodextrina 10 DE que se adicion segn el porcentaje correspondiente al
tratamiento en turno. Se trabaj con 80% y 100% en base a los slidos solubles totales,
como se puede ver en la Figura 1. Esta maltodextrina se aadi al jugo lentamente y
mediante agitacin continua durante un minuto con una batidora Osterizer de cinco
velocidades, utilizando la mayor de ellas.
El jugo con el encapsulante se aliment al secador por aspersin experimental marca Buchi
modelo B-191, donde se seleccion la temperatura del aire de entrada, cuyos valores fueron
170 y 180 C. La velocidad de alimentacin se ajust de manera que la temperatura mxima
del aire a la salida fuera de 80C. Una vez obtenido el polvo de tomate en cada tratamiento,
se coloc en bolsas de polietileno que se pusieron dentro de un frasco de vidrio y
posteriormente se cubrieron con papel aluminio. Luego se almacenaron en un lugar fresco y
seco, debidamente etiquetados.
Para la extraccin de carotenos se trabaj con muestras de 10 g de tomate fresco, de 1 g de
polvo cuando procedan de tratamientos con 80% de maltodextrina, y de 1.25 g de polvo en
el caso de los de 100%. Enseguida se reconstituyeron y se transfirieron a un filtro colocado
en un embudo Buchner de 50 ml. Se aadi una solucin de tetrahidrofurano y metanol (1:1
v/v THF:MeOH) y se filtr la suspensin a vaco. La combinacin de los filtrados se traslad
a un embudo de separacin y se agregaron ter de petrleo y una solucin de NaCl al 10%,
luego se mezclaron agitando cuidadosamente. La capa superior de ter de petrleo se lav
con 100 ml de agua. La fraccin etrea se transfiri a un matraz de 50 ml y se evapor hasta
sequedad en una estufa de vaco marca Napco durante 12-14 horas a una presin absoluta
de 60 mm de Hg y a 50C. El residuo se redisolvi hasta un volumen final de 6 ml con
hexano. Se filtr y se analiz por cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) en un
cromatgrafo Agilent 1100 Series, en el que se instal una columna Supelco Disovery

C18
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(15 cm x 4.6 mm y 5 m) en fase reversa. Se us un sistema de fase mvil isocrtico


compuesto por acetonitrilo:metanol:2 propanol (38:60:2 v/v/v). La velocidad de flujo fue de 1
ml/min y se inyectaron 20 l de la muestra. El licopeno all-trans se cuantific a una longitud
de onda de 470 nm. La identificacin del licopeno, -caroteno y xantofila se bas en el
tiempo de retencin de estndares conocidos de la marca Sigma. Las concentraciones de
los estndares fueron las siguientes: licopeno, 50 g/ml; -caroteno, 100 g/ml; y xantofila,
100 g/ml. Todo el proceso se llev a cabo bajo luz reducida.

MUESTREO

EXTRACCIN
DEL JUGO

Medicin de L, a* y b*

ADICIN DEL
ENCAPSULANTE

Maltodextrina 10 DE 80 y 100%

"
!

"

SECADO POR
ASPERSIN

Temperatura 170 y 180C

RECUPERACIN
DEL POLVO

Figura 1. Diagrama de flujo del proceso de obtencin y anlisis del polvo de tomate
deshidratado por aspersin.
Se us un experimento bifactorial con dos niveles para la temperatura del aire de entrada y
dos niveles para la concentracin de maltodextrina. Para analizar el porcentaje de
disminucin en la concentracin de licopeno, se utiliz el anlisis de varianza de dos vas, y
para la comparacin de medias, la prueba de la diferencia mnima significativa (LSD). Se
emple el programa Statistica versin 4.2.
Resultados y Discusin
El orden de aparicin de los picos de los carotenoides son iguales a los reportados por
Anguelova y Warthesen (2000), primero aparece la xantofila, luego el all-trans licopeno y
despus el -caroteno. Cabe mencionar que reportan la aparicin de los cis-ismeros de
licopeno inmediatamente antes del pico de la forma all-trans.En la Figura 2 se muestra el
cromatograma para el jugo fresco de una de las repeticiones con 170C de temperatura del
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aire de entrada y 80% de maltodextrina; en ella se sealan los picos de xantofila, licopeno y
-caroteno, en ese orden. La Figura 3 corresponde al polvo de tomate secado por aspersin
a 170C de temperatura del aire de entrada y 80% de maltodextrina. Tambin se indican los
picos de xantofila, licopeno y -caroteno, en ese orden. Se nota una ligera inflexin en la
base del pico de licopeno, la cual aparentemente se debe a la presencia de los cis-ismeros,
segn lo que reportan Anguelova y Warthesen (2000).
El clculo de la concentracin de licopeno se hizo tomando como base la relacin entre la
concentracin conocida del estndar y el rea del pico correspondiente; as, conociendo el
rea del pico en cada muestra, su concentracin de maltodextrina y su humedad, se pudo
calcular la concentracin respectiva. En la Tabla 1 se pueden ver los promedios de la
concentracin de licopeno, -caroteno y xantofila, en g/g de slidos y en mg/100g, para el
tomate fresco y el tomate en polvo tratados en

este estudio. Algunos resultados de la

concentracin de licopeno en el tomate fresco, en g/g de slidos, reportados en la literatura


son los siguientes: 784 (Khachik y col., 1992), 176 840 (Clinton, 1998) y 1854 (Tonucci y
col., 1995). Los tres primeros datos son del mismo orden que la concentracin de licopeno
encontrada en este trabajo, slo el ltimo es mayor.

Figura 2 Cromatograma de los carotenos extrados de tomate fresco antes del secado
por aspersin con 170C de temperatura del aire de entrada y 80% de maltodextrina.

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Figura 3. Cromatograma de los carotenos extrados de polvo de tomate secado por


aspersin con 170C de temperatura del aire de entrada y 80% de maltodextrina.

Tabla 1. Concentracin de carotenoides en g/g de slidos del tomate fresco y del


tomate en polvo
Tomate Fresco
Tomate en Polvo
mg/100g
mg/100g
g/gs
g/gs
Carotenoide
Desv.
Desv.
Desv.
Desv.
Media
Media
Media
Media
Std.
Std.
Std.
Std.
917.61 140.89
4.59 0.704
521.36 252.70
47.20
22.88
Licopeno
34.58
17.77
0.17 0.088
24.91
18.18
2.26
1.65
-caroteno
234.11
65.55
1.17 0.328
210.10
86.94
19.02
7.87
Xantofila
Y en cuanto al polvo, Anguelova y Warthesen (2000) informan que la concentracin de
licopeno est entre 821 y 883 g/g de slidos, la cual es mayor que el promedio que se
encontr en este estudio, aunque la desviacin estndar fue de 252.70 (Tabla 1). La
concentracin de -caroteno para el tomate fresco fue menor que la reportada por Tonucci y
col. (1995) de 0.23 mg/100g, Kachick y col. (1992) de 0.28 mg/100g, Heinonen y col. (1989)
de 0.66 mg/100g. En contraparte, la concentracin de xantofila, tambin para tomate fresco,
fue alrededor de 10 veces mayor que la referida por Tonucci y col. (1995) de 0.08 mg/100g,
Kachick y col. (1992) de 0.13 mg/100g, Heinonen y col. (1989) de 0.1 mg/100g.

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Las concentraciones de licopeno en cada tratamiento para el tomate fresco y en polvo se


presentan en la Tabla 2.
g/gs)
Tabla 2. Concentracin de licopeno (
Tratamiento

Tomate fresco Polvo de tomate

170C, 80%

996.24

664.83

170C, 100%

788.16

518.64

180C, 80%

1030.17

257.80

180C, 100%

825.00

705.55

La estabilidad del licopeno se evalu en trminos de la diferencia de su concentracin en el


tomate fresco y en el polvo, expresada en porcentaje. En la Tabla 3 se muestran las medias
del porcentaje de disminucin en la concentracin de licopeno para los cuatro tratamientos.
Los valores a 170C son parecidos para las dos concentraciones de encapsulante, pero a
180C son muy diferentes. La mayor prdida de licopeno ocurri a 180C y 80% de
maltodextrina; y la menor, cuando se deshidrat a 180C y 100% de maltodextrina. Por otra
parte, se puede decir que hay diferencia significativa en la estabilidad del licopeno a causa
de la maltodextrina, con p=0.099. No se alcanz la significancia al 0.05, debido a que la
varianza en cada tratamiento fue muy grande.
Tabla 3. Porcentaje de disminucin en la concentracin del licopeno
deshidratar el tomate.
Medias por
% de maltodextrina 10 DE
Temperatura
temperatura
C
80
100
170
32.83
33.69
33.26
180
74.94
14.49
44.71
53.88
24.09
41.21
Medias por concentracin
Temperatura p=0.488
Maltodextrina p=0.099
Interaccin p=0.091

al

Como ya se ha mencionado, la degradacin de licopeno se produce por isomerizacin y por


oxidacin (Mnguez, 1997; Nguyen y Schwartz, 1999; Anguelova y Warthesen, 2000). Al
observar la forma de los picos en los cromatogramas, no se advierten inflexiones marcadas
en el pico del licopeno all-trans, por lo que se puede pensar que no hay gran presencia de
cis ismeros; por esta razn es probable que la degradacin del licopeno ocurriera
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principalmente por oxidacin. Esto es posible debido a la gran cantidad de oxgeno a que se
expone el tomate cuando se deshidrata por aspersin; lo cual est de acuerdo con Shi y Le
Maguer (2000), quienes afirman que los tomates deshidratados y en polvo tienen una pobre
estabilidad del licopeno.
Es recomendable cuantificar los cis ismeros formados en el proceso de secado pues,
aunque estos compuestos sean menos coloreados que el all-trans licopeno, tambin tienen
actividad antioxidante y mayor biodisponibilidad.
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