Anlisis a nivel de Protenas:

Separacin de protenas,
protenas Cromatografa,
Cromatografa Electroforesis
Electroforesis,
Western, RIA, ELISA.

Introduccin:
A lo largo del cursado de la materia se han ido desarrollando
diversos temas en torno al dogma central de la Biologa,
ADN-RNA-Protena.

En esta clase presentaremos algunas de

las tcnicas ms utilizadas en la separacin, deteccin y
cuantificacin de Protenas as como sus fundamentos y
aplicaciones.

PURIFICACINYAISLAMIENTODEPROTENAS
Suspensinde
Cl l jid Ul
Clulastejidos:Ultrasonidos
id
Detergente
mbolorotatorio(potteraspas)

Homogenado

FRACCIONAMIENTODELHOMOGENADOCELULAR

CENTRIFUGACINDIFERENCIAL
C
UG C
C
SOBRENADANTE
1

SOBRENADANTE
2

SOBRENADANTE
3

Centrifugacin a
baja velocidad

Homogenado
celular

PRECIPITADO 1
Cl l enteras,
Clulas
t
ncleos,
citoesqueleto

PRECIPITADO 2
mitocondrias,
it
di
lisosomas,
peroxisomas

PRECIPITADO 3
Mi
Microsomas,
otras vesculas
pequeas

PRECIPITADO 4
Ribosomas,virus
macromolculas

SEPARACINYPURIFICACINDEPROTENAS
Sebasaenladiferenciade:
Tamao
Cargaelctrica
Carga elctrica
Densidad
Afinidadporotrasmolculas
Solubilidad

SEPARACINDEPROTENAS
CROMATOGRAFAENCOLUMNA
Lasdiferentesprotenasseretrasansegnsusinteraccionesconlamatriz,deacuerdoasu
Las
diferentes protenas se retrasan segn sus interacciones con la matriz, de acuerdo a su
carga,hidrofobicidad,tamaoouninagruposqumicos

SEPARACINDEPROTENAS
CROMATOGRAFAENCOLUMNA
Lasdiferentesprotenasseretrasansegnsusinteraccionesconlamatriz,deacuerdoasu
Las
diferentes protenas se retrasan segn sus interacciones con la matriz, de acuerdo a su
carga,hidrofobicidad,tamaoouninagruposqumicos
Muestra
aplicada
li d

Elsolventeseaplica
contnuamenteala
bocadelacolumna

Matriz
slida

Molculasfraccionadas
eludasyrecogidas

Tapn
poroso
p
Tubo de
ensayo

tiempo

TRESCLASESDECROMATOGRAFAENCOLUMNA
A)Intercambioinico:
enbasealacarga
DependedelpHy
p
p y
delafuerzainica
Flujodesolvente

C)deAfinidad:

B)Filtracinengel:
enbasealtamao

Flujodesolvente

Flujodesolvente

Partculacargada
positivamente

Molculacargada
negativamente
unida
Molculacargada
positivamente
ii
libre

Partculacon
sustratounido
covalentemente
Partculasporosas
Molculade
enzimaunida
Molcula
pequea
pequea
retrasada
Molculagrande
noretrasada

Otrasprotenas
Otras
protenas
pasandelargo

A:CROMATOGRAFADEFILTRACINOEXCLUSINMOLECULAR

Lasprotenasseseparansegn
sutamao

B:CROMATOGRAFADEINTERCAMBIOINICO
(Ej:intercambiocatinico)
Lasprotenasseseparansegn
sucargaaunpHdeterminado

C:CROMATOGRAFADEAFINIDAD
Lasprotenasseseparanenfuncindela
especificidaddeuninaunligando.Enesteejemplo
elligandoeslaglucosayseseparanaquellas
protenasqueseunenaella.Lasprotenasde
inters se eluyen aadiendo un exceso de ligando
intersseeluyenaadiendounexcesodeligando
libre.

ELECTROFORESISENGEL
Electroforesis
en SDSPAGE
ElectroforesisenSDS
PAGE

ELECTROFORESISENGEL:
Trasaplicaruncampoelctricolas
protenasmigranenfuncindel
tamaoydelacarga

(solubiliza
protenas)

EjemplodeanlisisdeprotenasporSDSPAGEencadapasodeunapurificacin.Enel
ltimopasohayunanicabanda,loqueindicaquetenemoslaprotenadeinters
completamentepurificada
p
p

ISOELECTROENFOQUE
EsuntipodeelectroforesisengelconanfolitosquecreanungradientedepH.Cada
protena migra hasta su punto isoelctrico
protenamigrahastasupuntoisoelctrico.

http://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html

GELESBIDIMENSIONALES(2D)
Primeroisoelectroenfoqueyluego
SDS PAGE
SDSPAGE

Ejemplodegelbidimensional

Tcnicasdedeteccindeprotenas
medianteanticuerpos.
d
InteraccinAg
Interaccin AgAb:
Ab:tiposdeenlaces.
tipos de enlaces.
Tcnicasdeprecipitacin:engelyensolucin.
Tcnicasdeaglutinacin:variantes
Tcnicas de aglutinacin: variantes
Inmunoensayo:ELISAvsRIA.Variantesprincipalesdel
ELISAyaplicaciones
y p
Westernblot
Tcnicasconfluorescencia:Inmunofluorescencia
directaeindirecta
CitometradeFlujo

ELISA
F
Fases
de
d un ensayo

Conjugacin del anticuerpo o del antgeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa

alcalina,...). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos
e indirectos, sandwich, etc.. El antgeno marcado se emplea en ensayos de
competicin de antgeno.

Unin del antgeno, o del anticuerpo a los pocillos. La unin de anticuerpos o

antgenos se realiza con facilidad a la superficie de plsticos tratados que tienen gran
afinidad por protenas.

Formacin de una o ms capas de inmunocomplejos. En el caso del antgeno

unido
id a lla placa
l
se puede
d d
detectar
t t mediante
di t un anticuerpo
ti
anti-antgeno
ti t
marcado
d
(ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antgeno y un secundario
anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo mtodo permite la
amplificacin de la seal al poderse unir uno o ms anticuerpos secundarios a cada
anticuerpo
ti
primario.
i
i

Revelado de la reaccin enzimtica. Despus de un lavado para eliminar todos las

molculas marcadas no fijadas
j
en forma de inmunocomplejos
p j se aade el sustrato
enzimtico en solucin. Se deja reaccionar y se lee la densidad ptica (D.O.)
mediante espectrofotometra.

TiposdeensayosELISA/RIA
SehandesarrolladomltiplesvariantesdeensayosELISAquepermitendesdelacuantificacindeun
antgenoensolucin,ladeteccindeunanticuerpoenunasolucinoladeterminacindelasubclase
de un anticuerpo etc A continuacin se describen los ms comunes
deunanticuerpo,etc.Acontinuacinsedescribenlosmscomunes.
ELISAdirecto (ensayoELISAsimplededoscapas).LasplacasELISAsepreparanrecubriendolospocillos
conlassolucionesenlasquesesospechaseencuentraelantgeno.Seincubanconanticuerpos
marcados.Indicanlapresenciadeantgenoenlasolucinanalizada.Esnecesarioincluircontroles
p
g
negativosquesernmuestrasdelmismotipodelasanalizadas(sangre,orina,.)peroenlasquese
tengalacertezadelaausenciadelantgenobuscado.Asimismoseincluyencontrolespositivos
(solucionesdondeseencuentraelantgenobuscado,obienselehaaadido).
ELISAindirecto.
ELISA
indirecto LasplacasELISAsepreparandeunaformaidnticaalaanterior.Loscontrolespositivos
Las placas ELISA se preparan de una forma idntica a la anterior Los controles positivos
ynegativossonlosmismos.Elsistemadedeteccinempleadosanticuerpos:unoprimariocontrael
antgeno,yunosecundariomarcadocontraelprimario.Ladeteccintienemayorsensibilidadpor
presentarunaamplificacindeseldebidaalaunindedosomsanticuerposecunadariosporcada
primario.Eselensayomspopular,comoloeslainmunofluorescenciaindirecta,puesunmismo
secundario marcado y un mismo sistema enzimtico permite cuantificar una gran cantidad de
secundariomarcadoyunmismosistemaenzimticopermitecuantificarunagrancantidadde
antgenos.
ELISAsandwich. (ensayodecapturadeantgenoydeteccinmedianteinmunocomplejos).Setratade
unensayomuyempleadoenelqueserecubreelpocilloconunprimeranticuerpoantiantgeno.
y
y
p
q
p
p
p
g
Despusdelavarelexcesodeanticuerposeaplicalamuestraproblemaenlaqueseencuentrael
antgeno,queserretenidoenelpocilloalserreconocidoporelprimeranticuerpo.Despusdeun
segundolavadoqueeliminaelmaterialnoretenidoseaplicaunasolucinconunsegundoanticuerpo
antiantgenomarcado.Aspuescadamolculadeantgenoestarunidaaunanticuerpoenlabase
q
queloretieneyunsegundoanticuerpo,almenos,quelomarca.Esteensayotieneunagran
y
g
p
q
y
g
especificidadysensibilidaddebidoalaamplificacindesealquepermiteelsegundoanticuerpo.

 Indirecto

EjemploRIAcompetitivoparaelarmadodecurvasde
referencia

En ausencia de antgeno fro (no radioactivo), todos los complejos Ag-Ac sern radioactivos. La radioactividad medida es mxima

Se construye una curva de calibrado (color rojo) que relacione la medida de radioactividad (cpm) con la concentracin de antgeno fro en la muestra
Si se realiza el ensayo con una muestra que contiene una cantidad desconocida del antgeno no marcado y se mide la radioactividad asociada a los
anticuerpos, por interpolacin sobre la curva de calibrado se puede estimar la concentracin del antgeno fro en la muestra.
La tcnica ha sido prcticamente reemplazada por el mtodo ELISA el cual mide la unin Ag-Ac mediante colorimetras en lugar de radiometras.

EJERCICIOS