Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
Gua de Laboratorio
METABOLISMO
Versin:
MC-2012-08-21
04
Pgina:
1 de
Fecha de Emisin:
Aprobado por:
Dr. Jos Ma. Satizabal
ENZIMAS II
CINETICA ENZIMATICA DE LA FOSFATASA ALCALINA
Vi =
V max [S ]
Km + [S ]
Cdigo:
Versin:
MC-2012-08-21
Gua de Laboratorio
METABOLISMO
04
Pgina:
1 de
Fecha de Emisin:
Elaborado por:
Profesional: Lic. Martha Solrzano
Revisado por:
Dr. Adalberto Snchez
Aprobado por:
Dr. Jos Ma. Satizabal
corresponde a -1/Km. Una alternativa que se puede utilizar para hallar la Vmax y Km de una enzima
es la Ecuacin de Eadie Hoftsee.
OBJETIVO GENERAL
Objetivos Especficos:
1. Determinar la Km y la Vmax de la Fosfatasa Alcalina utilizando la ecuacin de de Linerweaver
Burk.
2. Identificar el tipo de inhibicin efectuada por el fosfato inorgnico y citrato de sodio sobre la
actividad enzimtica de la fosfatasa alcalina.
3. Evaluar el efecto del Cl2Mg sobre la actividad enzimtica de la Fosfatasa Alcalina.
PROCEDIMIENTO
1. EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE SUSTRATO.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Marque el tubo blanco y los tubos del 1-5 con cinta de enmascarar.
Prepare los tubos tal como se indica en la tabla exceptuando la adicin de la enzima.
Calibre el equipo con el Blanco a 405 nm.
Preincube los tubos a 37 C 3minutos.
Agregue el extracto enzimtico y mezcle por 5 segundos.
Incube los tubos a 37 C durante 3 minutos y lea inmediatamente la absorbancia a 405nm.
SOLUCION
TUBO (ml)
2
3
Blanco
Agua Destilada
2.7
1.35
1.3
Buffer pH 9.6
0.3
1.5
pNFP 1 mM
------
Enzima FAL
0.1
Absorbancia
1.2
1.1
0.8
1.5
1.5
1.5
1.5
0.05
0.1
0.2
0.30
0.60
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
Cdigo:
Versin:
MC-2012-08-21
Gua de Laboratorio
METABOLISMO
04
Pgina:
1 de
Fecha de Emisin:
Aprobado por:
Dr. Jos Ma. Satizabal
Con los resultados de esta prueba realice una grfica de velocidad Vs. Concentracin de sustrato.
Para calcular la velocidad es necesario conocer la concentracin de producto formado en cada tubo.
Esto se logra extrapolando las absorbancias obtenidas en la grfica de absorbancia vs
concentracin de p-nitrofenol (pNF) dibujada en la prctica de colorimetra. La concentracin de
pNF se divide por el tiempo en minutos y se obtiene la velocidad de la reaccin para cada tubo.
[ pNF ]
V=
3 min
VI CI = VF CF
1) Calcule la Km y la velocidad mxima para esta Enzima. Anexe sus clculos de manera clara en
una hoja de papel cuadriculado.
Km=
Vmax=
Marque el tubo blanco y los tubos del 1-5 con cinta de enmascarar.
Prepare los tubos l como se indica en la tabla exceptuando la adicin de la enzima.
Calibre el equipo con el Blanco a 405 nm.
Preincube los tubos a 37 C 3 minutos.
Agregue el extracto enzimtico y mezcle por 5 segundos.
Incube los tubos a 37 C durante 3 minutos y lea inmediatamente la absorbancia a 405nm.
TUBO (ml)
SOLUCION
Blanco
Agua Destilada
2.7
1.5
0.4
0.1
0.3
Buffer pH 9.6
0.3
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
Fosfato 0.1 M
------
0.3
0.60
0.3
pNFP 1 mM
------
0.7
0.7
0.7
2.1
2.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
Enzima
Absorbancia
Cdigo:
Versin:
MC-2012-08-21
Gua de Laboratorio
METABOLISMO
04
Pgina:
1 de
Fecha de Emisin:
Elaborado por:
Profesional: Lic. Martha Solrzano
Revisado por:
Dr. Adalberto Snchez
Aprobado por:
Dr. Jos Ma. Satizabal
1) Con los resultados anteriores explique qu tipo de inhibicin se presenta con la adicin del fosfato.
2) Mencione cuntos tipo de Fosfatasas hay en suero y cul es su valor normal?
3) Cual es la especificidad como biomarcador de la Fosfatasa Alcalina para el Diagnostico de
enfermedades:
4. EFECTO DEL MAGNESIO Y EL CITRATO SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Marque el tubo blanco y los tubos del 1-5 con cinta de enmascarar.
Prepare los tubos tal como se indica en la tabla exceptuando la adicin de la enzima.
Calibre el equipo con el Blanco a 405 nm.
Preincube los tubos a 37 C 3 minutos.
Agregue el extracto enzimtico y mezcle por 5 segundos.
Incube los tubos a 37 C durante 3 minutos y lea inmediatamente la absorbancia a 405nm.
TUBO (ml)
SOLUCION
Blanco
Agua Destilada
2.7
0.8
0.6
0.7
0.4
Buffer pH 9.6
0.3
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
pNFP 1 mM
------
0.9
0.9
0.9
0.9
0.9
Cl2Mg 0.1M
------
-------
0.2
0.4
------
0.4
Citrato de Sodio
0.2M
-------
------
-----
-------
0.3
0.2
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
Enzima
Absorbancia