Datos generales del proyecto

Ao de registro: 2016

Ao de inicio: 2017

Ttulo: Evaluacin de cultivo in vitro con diferentes hormonas a partir de explantes foliares
en orqudea mariposa (Phalaenopsis amabilis).
Lugar donde se realizar la investigacin:
Estado: Estado de Mxico

Municipio: Texcoco de Mora.

Datos del responsable

Nombre: Alumna. Jessica Yahaira Santiago Guzmn
Departamento de Adscripcin: Fitotecnia

Grado. Sexto 6

Categora: Alumna

Acadmico:

Licenciatura
en agronoma en horticultura
protegida.
Sexo: F

Nacionalidad: Mxico

Edad: 22

Padece alguna enfermedad: NO

Telfono: 5569897936

Correo electrnico: jess071793@gmail.com

Palabras clave: MS, hormonas, BAP, propagacin, callo.

Justificacin
Desde hace muchos aos en Mxico ya se utilizaban las orqudeas como parte de la
actividad diaria de las personas, unos lo utilizaban como perfume o como adorno para
bodas. El saqueo indiscriminado de estas valiosas plantas es un problema muy grande ya

que ya hay muchas especies de orqudeas en peligro de extincin, el caso de la Laelia

spaciosa es una de las especies ya extintas, se reporta en la NOM- 059 segn
(SEMARNAT, 2010). La propagacin in vitro de plantas en general es un mtodo til que
puede ser utilizada con fines comerciales o para fines de conservacin, como una
alternativa que podra ayudar en la disminucin de la presin de extraccin en las
poblaciones naturales de las plantas en peligro de extincin (De la Barrera et al., 2015)
Sin embargo, la propagacin in vitro de orqudeas requiere un mtodo especfico de la
especie para la produccin masiva y rpida de estas plantas (Arditti 1977, Colli y Kerbauy
1993, Shimura y Koda 2003).
El mtodo para propagacin in vitro nos permite producir plantas libres de enfermedades y
tambin nos permite reproducir gran nmero de plantas en un mismo periodo.
Actualmente no existen suficiente informacin ni estudios cientficos sobre cultivo in vitro
utilizando explantes de hojas de orqudea mariposa (Phaleonopsis spp) por lo que se hace
necesario el experimento.

INTRODUCCIN
La orqudea forma parte de la familia orchidacea, una de las flores ms cotizadas a nivel
mundial. La palabra orqudea es de origen griega orchis que significa testculo (Garcia
2011). Las orqudeas comprenden alrededor de 35 000 especies y constituyen la familia
ms numerosa del reino vegetal (Estudio, 2009). A la fecha se han identificado 30,000
especies de orqudeas en el mundo y en Mxico ms de 1,200 (Hgsater et al., 2005). En el
ao 2008, Mxico se ubic entre los primeros cinco lugares del mundo con 23,424 plantas

vasculares, slo superado por Brasil (56,215), Colombia (48,000), China (32,200) e
Indonesia (29,375) segn un estudio de CONABIO en 2008 (Soberon et al. 2008).
Segn Malln (2012) las regiones de Mxico ms ricas en orqudeas se localizan en la zona
de Puerto Vallarta y la Sierra de Manantln, en Jalisco; Temascaltepec, Estado de Mxico;
el sistema Teotepec, en Guerrero; la Sierra Jurez, la regin de Teojomulco y Los
Chimalapas en Oaxaca; y en la regin Lacandona, as como en la Sierra Madre de Chiapas.
Debido a la dependencia de las micorrizas que presentan las semillas de las orqudeas para
germinar en forma natural, se han desarrollado metodologas de germinacin asimbitica
bajo condiciones in vitro segn Arditti, (1993).
Debido a la gran importancia econmica que se les atribuyen a estas flores se propaga
como las otras plantas de forma asexual y sexual; en la forma asexual se reproduce al
dividir una planta por nmero de psedobulbos, por medio de keikis o brotes, o cultivo in
vitro como son a partir de: yemas, tallos, races, entre otros y en la forma sexual slo por
medio de germinacin (Garcia 2011). En el cultivo in vitro se puede cultivar: clulas en
suspensin, clulas inmovilizadas o como tejidos u rganos como se mencion
anteriormente. En el cultivo de rganos se pueden utilizar para la produccin de
metabolitos secundarios, pero en el caso de las clulas no transformadas el tejido se obtiene
a partir de un explante logrando la diferenciacin con la ayuda de hormonas (Arias 2009)
he aqu donde entran los explantes foliares y el uso de las diferentes hormonas en este caso
para obtencin de callo.
El cultivo in vitro a partir de explantes de hojas es uno de los mtodos de propagacin de
forma asexual, lo cual nos es de gran ayuda para obtener plantas libres de plagas,

enfermedades o virus, as como tambin es muy factible para clonacin obteniendo

numerosas plantas.
Existe un medio de cultivo que es el MS ( (Murashige y Skoog), ste se puede modificar su
uso mediante aplicaciones y concentraciones de distintos hormonas como auxinas: cido
Naftalactico (ANA), Acido indolbutrico (AIB), Acido indolactico (AIA), 2,4-D y 2,4,5T, citocininas: Zeatina, Kinetina y Benziladenina (BAP) y giberelinas: GA1, GA3, GA4,
GA7 y GA9 mencionando slo las ms comunes, Acido abcsico y etileno (CH2=CH2), el
uso de cualquier hormona y sus mezclas son manejadas respecto a lo que se pretende
conseguir ya sea obtencin de callos, de brotes o el crecimiento acelerado de stos.
En esta evaluacin se pretende encontrar cul es la hormona ms eficiente en formacin de
callo utilizando explantes de hojas de orqudeas para aplicarlo en orqudea mariposa
(Phaleonopsis amabilis (Linnaeus)), pues esta especie figura mucha importancia
econmica, es una de las ms hermosas y populares, por lo que en los ltimos aos se ha
incrementado rpidamente su demanda como planta de maceta y flor de corte
convirtindose as una de las especies ms demandadas en el mercado (Vences y Gonzlez
1962).
Con el cultivo in vitro no solo podemos reproducir gran nmero de plantas sino tambin las
podemos obtener libres de enfermedades y en un lapso relativamente corto. En este
experimento se pretende probar dos hormonas el cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D) y
la bencilaminopurina (BAP), esto nos permitir conocer si es conveniente su utilizacin de
acuerdo a los objetivos y cul es ms eficiente.

Objetivos
Evaluar el crecimiento y vigor de los callos de acuerdo a la hormona cido 2,4diclorofenoxiactico (2,4-D) y la bencilaminopurina (BAP) que se le aadir al medio de
cultivo a partir de explantes foliares.
Encontrar cul de las dos hormonas es ms eficiente para induccin de callos.

Hiptesis
El uso de hormonas: cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D) y la bencilaminopurina (BAP)
facilita el alargamiento de las clulas y la induccin de los callos, obteniendo brotes con
ms vigor y mayor nmero de plantas, obtenindolas libre de plagas y enfermedades.

Revisin de literatura
El cultivo de clulas y tejidos vegetales se refiere al conjunto de tcnicas usadas para crecer
clulas, tejidos u rganos vegetales in vitro, bajo condiciones aspticas, controladas y libres
de microorganismos (Street 1977, Calva y Ros 1999 citado por (Calva y Prez 2005). Se
basa en el principio de totipotencia, que indica que cualquier clula vegetal contiene una
copia ntegra del material gentico de la planta a la que pertenece sin importar su funcin o
posicin en ella,(Ferl y Paul 2000 citado por (Calva y Prez 2005).

Haberlandt fue el pionero en el cultivo in vitro de clulas vegetales completamente

diferenciadas, habiendo reportado sus estudios y resultados en 1902, segn lo indican
Krikorian y Berquam (1969) citado por (Calva y Prez 2005)
Actualmente, la mayora de los medios son de composicin conocida, estando constituidos
bsicamente por cinco grupos de ingredientes: nutrientes inorgnicos, fuente de carbono,
fuente de nitrgeno, vitaminas y reguladores del crecimiento que in vivo son sintetizados
por una parte u rgano de la planta para luego ser transportados a otros rganos donde se
metabolizan y/o acumulan (Seabrook 1980, Yasuda et al 1972 citado por (Calva y Prez
2005)
Las fitohormonas y sus inhibidores son substancias producidas por las plantas y regulan su
respuesta a estmulos ambientales como luz, temperatura y humedad, ayudando de esta
manera a regular y coordinar los procesos esenciales para el desarrollo normal de las
plantas (Wain 1980, Doerner 2000, Crozier et al., 2000). Este tipo de substancias se pueden
dividir principalmente en auxinas, giberelinas, citocininas, cido abscsico, etileno,
brasinoesteroides, poliaminas, cido jasmnico y el cido saliclico (Calva y Prez 2005)
Las auxinas y giberelinas promueven el alargamiento celular, pero inhiben la
diferenciacin, mientras que las citocininas estimulan la divisin mediante la cual se
producen nuevas clulas y pueden tambin evitar el envejecimiento celular. El etileno
estimula la maduracin principalmente de frutos, el cido abscsico inhibe la accin de las
auxinas, giberelinas y citocininas operando como sistema de defensa natural contra efectos
de estrs fisiolgicos. Las ms usadas en cultivos de clulas vegetales son las auxinas y
citocininas. De las auxinas, el cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D) es la ms usada para
la induccin y mantenimiento de tejido calloso debido a que suprime severamente la

organognesis. De las citocininas, la ms activa es la 2-indolaminopurina (2iP); sin

embargo, las ms utilizadas en cultivo de clulas vegetales son la bencilaminopurina (BAP)
y la cinetina (Cin), una citocinina sinttica afectada por la luz en el rango de longitud de
onda de 300-800nm (Aitchison et al 1977, Street 1969 y 1977, Crozier et al 2000) citado
por (Calva y Prez 2005)
Jimnes y Guevara (1996) utilizaron ejes florales post senescentes provenientes de hbridos
comerciales de Phaleonopsis spp., para su propagacin in vitro, con una modificacin del
medio de cultivo Murishage y Skoog, con la mitad de macronutrimentos, la concentracin
normal de micronutrimentos, aadiendo 10mg/L de tiamina, 1 mg/L de cido nicotnico,
100mg/L de inositol, 0.5 mg/L de 2,4-D, 3mg/L de BAP, 0.86 mg/L de Kinetina, 5 mg/L de
adenina, 200 mg/L de agua de coco, adems de manitol, sacarosa y glucosa en
concentracin de 10 mg/L cada uno. El mejor resultado fue para los explantes provenientes
de las estructuras con mayor grosor. Y mencionan que el xito de su experimento se debi
en gran parte a la presencia de las dos citoquininas BAP y Kin, as como a un precursor de
las mismas, que promovieron el crecimiento vegetativo, oponindose al floral.
Segn Uribe-Moraga y Cifuentes (2004), Los mejores resultados se obtienen con medio de
cultivo MS y combinacin hormonal 0,1/0,5 mg/l de AIB y BAP respectivamente.

Materiales y mtodos
El experimento se realizar en un laboratorio de biotecnologa vegetal de la Universidad
Autnoma Chapingo ubicado en el Km. 38.5 Carretera Mxico-Texcoco, 56230. Chapingo,
Estado de Mxico, Mxico. Se utilizarn explantes de hojas de orqudea mariposa

(Phaleonopsis amabilis), estos se tomarn de un invernadero sometidos a aclimatizacin. El

proceso de desinfeccin ser con alcohol al 95 %, las hojas se cortarn por segmentos con
aproximadamente 2 cm de longitud, stas se desinfectarn con una solucin de hipoclorito
de sodio al 0.525 % v/v adicionada con una gota de tween.
Despus se lavarn 3 veces con agua destilada estril. Y de ah se dejarn escurrir,
posteriormente se colocar en el medio de cultivo de Murashige y Skoog (MS,1962), con la
mitad de la concentracin de los macronutrientes se adicionar diferentes dosis de
hormonas de cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D) y la bencilaminopurina (BAP), las
dosis irn desde 0.1 hasta 10 mg por litro (se utilizarn diferentes dosis), giberelinas para
crecimiento y citocininas para reproduccin.
El diseo del experimento ser utilizado un diseo de boques al azar con 2 tratamientos
(cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D) y la bencilaminopurina (BAP)) y 30 repeticiones
por tratamiento (frascos).

Cronograma de actividades
Actividad
May
Anlisis de
literatura
(artculos y
libros)
Anlisis de
estructura del
proceso de
extensin
Se empezar con
el experimento
(Se cultivarn los
explantes)
Se mantendrn

Jun
x

Jul

Agosto

en observacin
durante el
proceso
Se anotarn cada
x
x
x
detalle y cambios
que se presente
en el proceso del
cultivo.
Fin del
xx
experimento
(fecha deseada)
Nota: Si alguno de los tratamientos se infecta por hongos se volver a repetir el
experimento.
Se pretende llevar a cabo este experimento con un tiempo mnimo de 3 meses a 6 meses
como mximo.

Presupuesto solicitado
Concepto
MS

completo

Cantidad
(asal

Salt

Macronutrient 1L

Costo U.

Total

620

620

Solution)
Sacarosa
BAP
ANA
Tween 20
Jabn Liquido

1 kg
50ML
600 ml
4L
1L

18
575
800
3,029.00
50

18
575
800
3,029.00
50

Alcohol Antisptico

0.5 ml

20

25

Cloro
Captan
TOTAL, PRESUPUESTO SOLICITADO

1
250 gr

20
608

20
608
$ 5745

Literatura citada
ARDITTI, J. 1993. Micropropagacin of orchids. Ed. John Wiley and Sons. New York.
949 p.

Arias, M. et al., 2009. Aspectos ingenieriles del cultivo in vitro de clulas vegetales para la
produccin de metabolitos secundario. Revista de ingeniera DYNA, 76. Available at:
http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=49611942011.
Boletn de Lingstica, 2009. Estudio Lingstico de la fitonimia cientfica de las orqudeas
desde una perspectiva multidisciplinaria. Boletn Lingstica, XXl, pp.6794.
Available at: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=34712067005.
Calva, G. & Prez, J., 2005. Cultivo de clulas y tejidos vegetales: fuente de alimentos para
el futuro. Revista Digital Universitaria, 6(11), pp.116. Available at:
http://www.revista.unam.mx/vol.6/num11/art104a/art104a.htm\nResumen\nhttp://ww
w.itescam.edu.mx/principal/sylabus/fpdb/recursos/r102683.PDF.
Garcia, R., 2011. Manual para la propagacin de orqudeas. Comision Nacional Forestal,
1(Micropropagacin de orqudeas), pp.3038. Available at:
http://www.conafor.gob.mx/biblioteca/documentos/MANUAL_PARA_LA_PROPAG
ACION_DE_ORQUIDEAS.PDF.
Jimnes, V. & Guevara, E., 1996. Propagacin in vitro de Phalaenopsis (Orchidaceae)
mediante el cultivo de secciones de ejes florales despues de la senescencia de las
flores. Agronoma Costarricense, 20(1), pp.7579.
De la Barrera, E. et al., 2015. In vitro germination and development of two endangered
endemic Colombian orchids Cattleya mendelii and Cattleya quadricolor. Gaytana Bot.,
72(2), pp.213220.
Malln, C., 2012. Revista mexicana de ciencias forestales. Journal of Chemical
Information and Modeling, 3(9), pp.910.
SEMARNAT, 2010. SEMARNAT (Secretara de Medio Ambiente y Recursos Naturales).

Diario Oficial de la Federacin, p.78. Available at:

http://dof.gob.mx/nota_detalle.php?codigo=5173091&fecha=30/12/2010.
SHIMURA, H. y Y. KODA. 2004. Micropropagation of Cypripedium macranthos var.
rebunense through protocorm-like bodies derived from mature seed. Plant Cell Tissue
and Organ.
Soberon, J., Halffter, G. & Llorete-Bousquets, J., 2008. Comisin Nacional para el
Conocimiento y Uso de la Biodiversidad (CONABIO). Capital natural de Mxico, 1,
pp.428. Available at: http://www.biodiversidad.gob.mx/pais/pdf/CapNatMex/Vol
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Uribe-Moraga, M. & Cifuentes, L., 2004. Aplicacin de tcnicas de cultivo in vitro en la
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at: http://www.scielo.cl/scielo.php?pid=S071792002004000100012&script=sci_arttext.
Vences, C. & Gonzlez, H., 1962. Micropropagacin de Phalaenopsis amabilis ( Linnaeus )
Blume. Revista de estudios territoriales, pp.5761.
Vences, C. & Gonzlez, H., 1962. Micropropagacin de Phalaenopsis amabilis ( Linnaeus )
Blume. Revista de estudios territoriales, pp.5761.