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JAIR ALVES DIONSIO

IDA CHAPAVAL PIMENTEL


DIANA SIGNOR
ALESSANDRA MONTEIRO DE PAULA
ARLEI MACEDA
ANA LUIZA MATTANA

GUIA PRTICO DE BIOLOGIA DO SOLO

GUIA PRTICO DE BIOLOGIA DO SOLO

4 Livro Guia Pratico.indb 1

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Ncleo Estadual do Paran

Diretor
Arnaldo Colozzi Filho
Vice-diretor
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Coordenador do Projeto de Extenso Universitria Areia na Escola


Valentim da Silva
Vice Coordenadora do Projeto de Extenso Universitria Areia na Escola
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Coordenador do Projeto de Extenso Universitria Solo na Escola/UFPR


Valmiqui Costa Lima
Vice Coordenador do Projeto de Extenso Universitria Solo na Escola/UFPR
Marcelo Ricardo de Lima

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Sociedade Brasileira de Cincia do Solo


Ncleo Estadual Paran
Universidade Federal do Paran
Setor de Cincias Agrrias
Departamento de Solos e Engenharia Agrcola

GUIA PRTICO DE BIOLOGIA DO SOLO


Jair Alves Dionsio
Ida Chapaval Pimentel
Diana Signor
Alessandra Monteiro de Paula
Arlei Maceda
Ana Luiza Mattana

Ncleo Estadual do Paran

Curitiba PR
2016

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Ncleo Estadual do Paran

Todos os direitos reservados.


proibida a reproduo parcial ou total desta obra, por qualquer meio, sem autorizao
expressa, por escrito, da Sociedade Brasileira de Cincia do Solo/Ncleo Estadual Paran.
Conselho Editorial
Marcelo Ricardo de Lima Presidente
Alisson Neri
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Editor Executivo
lisson Nri
Reviso e Diagramao
MultCast
Capa
Paulo Marangoni

Sociedade Brasileira de Cincia do Solo / Ncleo Estadual Paran


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Universidade Federal do Paran - Bairro Cabral - CEP 80035-050 - Curitiba, Paran
contato@sbcs-nepar.org.br | http://www.sbcs-nepar.org.br

Dados Internacionais de Catalogao-na-Publicao (CIP)


G943

Guia prtico de biologia do solo / Autores: Jair Alves


Dionsio...[et al.]. Curitiba : SBCS/NEPAR, 2016.
152 p. : il. ; 24 cm.
Inclui bibliografia.
ISBN: 978-85-69146-00-1
1. Biologia do solo Manuais, guias, etc. 2. Microorganismos do solo. 3. Solos Qualidade. I. Dionsio, Jair
Alves. II. Sociedade Brasileira de Cincia do Solo. Ncleo
Estadual Paran. III. Universidade Federal do Paran. Setor
de Cincias Agrrias. Departamento de Solos e Engenharia
Agrcola.
CDU 631.46
Impresso no Brasil / Printed in Brazil
2016

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AUTORES
Jair Alves Dionsio

Engenheiro-agrnomo, Doutor em Biologia do Solo


Universidade Federal do Paran/Setor de Cincias Agrrias
Departamento de Solos e Engenharia Agrcola
jair@ufpr.br

Ida Chapaval Pimentel

Engenheira-agrnoma, Doutora em Processos Biotecnolgicos


Universidade Federal do Paran/Setor de Cincias Biolgicas
Departamento de Patologia Bsica
ida@ufpr.br

Diana Signor

Engenheira-agrnoma, Doutora em Solos e Nutrio de Plantas


Embrapa Cocais e Plancies Inundveis (CPACP)
diana.signor@embrapa.br

Alessandra Monteiro de Paula

Engenheira-agrnoma, Doutora em Solos e Nutrio de Plantas


Universidade de Braslia
Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinria
ampaula21@gmail.com

Ana Luiza Mattana

Biloga, Mestre em Entomologia


Universidade Federal do Paran/Setor de Cincias Biolgicas
Departamento de Gentica
almattana@ufpr.br

Arlei Maceda

Engenheiro-agrnomo, Mestre em Entomologia


Agncia de Defesa Agropecuria do Paran
Laboratrio Marcos Enrieti
arleimaceda@seab.pr.gov.br

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PREFCIO
Qualidade do solo a capacidade do solo cumprir suas funes na natureza.
Um bom indicador de qualidade do solo aquele capaz de elucidar os processos
biolgicos, fsicos e qumicos do solo e integrar propriedades ecolgicas do sistema
solo-planta.
As transformaes e as reaes que ocorrem no solo so realizadas
pelos organismos edficos, responsveis pelas mudanas no sistema, e o seu
comportamento reflete as alteraes ocorridas no solo, sejam induzidas pelo homem
ou por eventos naturais.
Por este motivo, os atributos biolgicos do solo so os mais sensveis e
apropriados para discriminar sistemas quanto sua capacidade de cumprir funes.
O Guia Prtico de Biologia do Solo vem ao encontro da demanda atual da cincia do solo
em determinar a qualidade do solo de sistemas manejados pelo homem, possibilitando
o estudo da capacidade desses sistemas oferecerem servios ambientais sociedade.
Este Guia prtico oferece mais do que a metodologia adequada, oferece o
passo a passo necessrio para que pesquisadores, estudantes e interessados possam
lograr xito nos seus estudos em qualidade do solo.
Profa. Dra. Fabiane Machado Vezzani
UFPR/SCA/DSEA

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SUMRIO
CAPTULO I
Jair Alves Dionsio e Diana Signor
NOES DE SEGURANA EM LABORATRIO.................................... 11
CAPTULO II
Jair Alves Dionsio e Ida Chapaval Pimentel
AMOSTRAGEM E PREPARO DO SOLO.................................................. 14
CAPTULO III
Ida Chapaval Pimentel, Jair Alves Dionsio e Diana Signor
BACTRIAS............................................................................................... 17
PROTOCOLO I CONTAGEM DE BACTRIAS
PELO MTODO DE SEMEADURA EM SUPERFCIE...................... 20
CAPTULO IV
Ida Chapaval Pimentel, Jair Alves Dionsio e Diana Signor
BACTRIAS ESPORULADAS.................................................................... 23
PROTOCOLO II CONTAGEM DE BACTRIAS
ESPORULADAS PELO MTODO DE SEMEADURA
EM SUPERFCIE (CLARK, 1965)...................................................... 25
CAPTULO V
Ida Chapaval Pimentel, Jair Alves Dionsio e Diana Signor
FUNGOS.................................................................................................... 27

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PROTOCOLO III CONTAGEM DE FUNGOS PELO


MTODO DE SEMEADURA EM SUPERFCIE................................. 30
CAPTULO VI
Alessandra Monteiro de Paula
MICORRIZAS ARBUSCULARES.............................................................. 33
PROTOCOLO IV A EXTRAO DE ESPOROS DE FUNGOS
MICORRZICOS ARBUSCULARES DO SOLO PELO MTODO
DO PENEIRAMENTO MIDO (GERDEMANN; NICOLSON,
1963) E DETERMINAO DO NMERO DE ESPOROS
DE FMA EM AMOSTRA DE SOLO................................................... 36
PROTOCOLO IV B CLARIFICAO E COLORAO
DE RAZES DE PLANTAS DE ACORDO COM (BRUNDRETT
et al., 1996A) PARA AVALIAO DA TAXA DE COLONIZAO
MICORRZICA PELO MTODO DE GIOVANNETTI
E MOSSE (1980)................................................................................ 39
CAPTULO VII
Ida Chapaval Pimentel, Jair Alves Dionsio e Diana Signor
ACTINOBACTRIAS................................................................................. 43
PROTOCOLO V CONTAGEM DE ACTINOBACTRIAS
PELO MTODO DE SEMEADURA EM SUPERFCIE...................... 46
CAPTULO VIII
Ida Chapaval Pimentel, Jair Alves Dionsio e Diana Signor
MICRO-ORGANISMOS CELULOLTICOS.............................................. 49
PROTOCOLO VI CONTAGEM DE MICRO-ORGANISMOS
CELULOLTICOS PELO MTODO DE SEMEADURA
EM SUPERFCIE................................................................................ 51

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CAPTULO IX
Ida Chapaval Pimentel, Jair Alves Dionsio e Diana Signor
MICRO-ORGANISMOS SOLUBILIZADORES DE FOSFATO................. 54
PROTOCOLO VII CONTAGEM DE MICRO-ORGANISMOS
SOLUBILIZADORES DE FOSFATO PELO MTODO DE
SEMEADURA EM SUPERFCIE........................................................ 57
CAPTULO X
Jair Alves Dionsio, Ida Chapaval Pimentel e Diana Signor
ISOLAMENTO DE RIZBIOS DE RAZES DE LEGUMINOSAS............ 60
PROTOCOLO VIII ISOLAMENTO DE RIZBIO
DE RAZES DE PLANTAS LEGUMINOSAS...................................... 63
CAPTULO XI
Diana Signor, Jair Alves Dionsio e Ida Chapaval Pimentel
INOCULAO DE SEMENTES DE LEGUMINOSAS.............................. 67
PROTOCOLO IX INOCULAO DE SEMENTES
DE LEGUMINOSAS........................................................................... 70
CAPTULO XII
Jair Alves Dionsio, Ida Chapaval Pimentel e Diana Signor
RESPIRAO MICROBIANA................................................................... 72
PROTOCOLO X RESPIRAO BASAL DO SOLO
EM SISTEMA ESTTICO, MTODO DE ALEF (1995).................... 75

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CAPTULO XIII
Jair Alves Dionsio, Ida Chapaval Pimentel e Diana Signor
BIOMASSA MICROBIANA....................................................................... 78
PROTOCOLO XI MTODO DE RESPIRAO INDUZIDA
(RIS) PELO SUBSTRATO (ANDERSON; DOMSCH, 1978
DESCRITO POR HOPPER, 2006)..................................................... 81
CAPTULO XIV
Diana Signor e Jair Alves Dionsio
DECOMPOSIO DE RESDUOS ORGNICOS..................................... 84
PROTOCOLO XII DETERMINAO DA TAXA
DE DECOMPOSIO DE RESDUOS ORGNICOS........................ 87
CAPTULO XV
Jair Alves Dionsio, Ana Luiza Mattana e Diana Signor
PROTOZORIOS...................................................................................... 89
PROTOCOLO XIII MTODO CULTURAL PARA
CONTAGEM DE PROTOZORIOS DO SOLO,
ADAPTADO DE SINGH (1946)......................................................... 92
CAPTULO XVI
Arlei Maceda
NEMATOIDES........................................................................................... 96
PROTOCOLO XIV MTODO DE AVALIAO DA
DENSIDADE DE NEMATOIDES NO SOLO........................................99

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CAPTULO XVII
Jair Alves Dionsio e Diana Signor
MESOFAUNA.......................................................................................... 103
PROTOCOLO XV EXTRAO DA MESOFAUNA
EDFICA PELO MTODO DO FUNIL DE BERLESETULLGREN MODIFICADO............................................................. 107
CAPTULO XVIII
Diana Signor e Jair Alves Dionsio
MACROFAUNA....................................................................................... 113
PROTOCOLO XVI MTODO DE EXTRAO DA
MACROFAUNA EDFICA (ANDERSON; INGRAM, 1993)........... 116
CAPTULO XIX
Jair Alves Dionsio e Diana Signor
MINHOCAS............................................................................................. 119
PROTOCOLO XVII MTODO DE EXTRAO DE
MINHOCAS DO SOLO COM EXTRATO DE CEBOLA
(STEFFEN et al., 2010).................................................................... 123
REFERNCIAS....................................................................................... 125
ANEXOS.................................................................................................. 142
ANEXO 1................................................................................................. 142

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ANEXO 2
TESTE DE GRAM EM SOLUBILIDADE COM KOH (RYU, 1940)........144
ANEXO 3
DETERMINAO DA CAPACIDADE DE RETENO DE GUA
DO SOLO CONFORME MONTEIRO E FRIGHUETTO (2000)........145
ANEXO 4
PADRONIZAO DE SOLUO DE HIDRXIDO
DE SDIO 0,5 N........................................................................................ 147
ANEXO 5
SOLUO DESS (250 ML).................................................................149
ANEXO 6
CHAVE PICTRIA PARA IDENTIFICAO DE FAMLIAS
(COLLEMBOLA, ENTOGNATHA) (GISIN, 1960).............................150
ANEXO 7
CHAVE PICTRIA PARA IDENTIFICAO DE FAMLIAS
(COLLEMBOLA; SAUTTER, 1994)....................................................151
ANEXO 8
CHAVE PARA IDENTIFICAO DE ALGUMAS FAMLIAS
DE OLIGOCHAETA (TALAVERA, 1990)...........................................152

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11

CAPTULO I
NOES DE SEGURANA EM LABORATRIO
Jair Alves Dionsio
Diana Signor
O laboratrio, independentemente do tipo de atividade, um local de trabalho onde as pessoas esto expostas a riscos fsicos, qumicos, biolgicos, ergonmicos e, por isso, possui grande potencial para a ocorrncia de acidentes. Em razo
disso, so apresentadas neste captulo algumas normas que devem ser seguidas
pelos usurios visando a minimizar acidentes.
a)

Segurana de ordem pessoal


Evitar brincadeiras;
Utilizar roupas adequadas: cala comprida, sapato fechado, jaleco
de algodo com manga comprida e abotoado;
No colocar alimentos nas bancadas, armrios e geladeiras; e,
No se alimentar, beber ou fumar nas dependncias do laboratrio.

b)

Segurana com produtos qumicos


L
istar os reagentes e verificar a disponibilidade antes de iniciar as
atividades;
Antes de utilizar reagentes que no conhea, consultar a bibliografia adequada, como a ficha de informao e segurana de produtos qumicos (FISPQ), e se informar sobre como manuse-los e
descart-los;
Selecionar, com base na FISPQ, os Equipamentos de Proteo Individual (EPIs): a luva especfica e os culos de proteo, principalmente para substncias que apresentam potencial carcinognico;
Evitar danificar rtulos de reagentes;
Nunca abrir frascos de reagentes antes de ler o rtulo;
No testar substncias qumicas pelo odor ou sabor;

12

Nunca pipetar soluo do frasco original, pois essa conduta pode


inutiliz-la;
I dentificar as solues aps o preparo, com no mnimo: nome ou
frmula da soluo, concentrao, data e responsvel. Ex.: Hidrxido de sdio / NaOH 0,5 N; Data: 19/06/07; Luiz Antnio da Silva;
No retornar reagentes aos frascos originais, mesmo que no
tenham sido utilizados; e,
P
ara correto descarte de produtos qumicos nas pias, consulte o
Guia de descarte de produtos qumicos perigosos de laboratrio1.
c)

Segurana com vidrarias


A
ntes de iniciar qualquer atividade no laboratrio que envolva
vidrarias, necessrio listar as que sero utilizadas;
No utilizar vidrarias trincadas ou quebradas;
No utilizar pipetas como basto de vidro;
No utilizar material identificado por outro usurio, sem a devida
permisso;
Nunca armazenar solues em vidrarias de preparo: balo, proveta
e bquer;
Nunca segurar vidrarias pelo gargalo e sim pelo bojo;
Nunca secar pipetas com pancadinhas ou solavancos; e,
Nunca pipetar com a boca e sempre utilizar pera insufladora, pipetador automtico ou pipeta descartvel de poliestireno.

d) Segurana em laboratrios
E
m grande parte, os acidentes em laboratrio esto associados
ocorrncia de fogo, provenientes de produtos qumicos inflamveis
ou falhas na rede eltrica. Em virtude disso, para evitar incndios
fundamental localizar a chave geral de eletricidade do laboratrio e
aprender a deslig-la;
Verificar a existncia de extintores de incndio, confirmar se esto
dentro do prazo de validade, reconhecer o seu tipo em funo das
classes de fogo e certificar-se da forma correta de utiliz-los;
Disponvel em: http://www.unesp.br/proex/repositorio/programasproex/proema/gere/Guia_de_
neutralizacao_quimicos.htm

13

Certificar-se da tenso eltrica dos aparelhos antes de conect-los


energia e mant-los desconectados quando no esto em uso; e,
Comunicar todos os acidentes aos demais usurios do laboratrio.
e)

Telefones de emergncia
Empresas ou instituies de ensino necessitam de orientaes
para atendimento emergencial de acidentes em laboratrios. Dessa
forma, fundamental que os nmeros dos telefones de emergncia (Tabela 1) estejam fixados em local visvel, alm do Servio de
informaes de emergncia: Pr-Qumica (0800 11 8270).

Tabela 1. Telefones de emergncia.


Instituio
Corpo de Bombeiros
Polcia Militar
Centro de Informaes Toxicolgicas
Servio Especializado de Segurana e Medicina do Trabalho

Telefone

14

CAPTULO II
AMOSTRAGEM E PREPARO DO SOLO
Jair Alves Dionsio
Ida Chapaval Pimentel
A base fundamental para estimar a densidade populacional microbiana
ou a atividade biolgica do solo a maneira de realizar a sua amostragem, pois dela
dependero os resultados esperados e as interpretaes para os mais diversos tipos
de solo, sistemas de manejo e coberturas.
No tocante biologia do solo, diferentemente da fertilidade, no existem parmetros estabelecidos para se determinar o nmero de amostras por rea.
Recomenda-se retirar o maior nmero possvel, para melhor representar a rea,
evitando-se erros por sub ou superestimao de valores. Para tal, podem ser seguidas as orientaes utilizadas na avaliao da fertilidade do solo, na qual a rea
dividida em subreas homogneas. Dessa forma, so utilizados como critrios para
subdiviso da rea: relevo, tipo de solo (cor, textura e profundidade), cobertura
vegetal, uso de condicionadores, corretivos e/ou fertilizantes.
Aps a diviso da rea, obtm-se subreas homogneas que podem atingir
at 20 ha. De acordo com Serrat et al. (2002), sero realizadas coletas de amostras
compostas por subrea. Cada amostra composta formada por nmero varivel de
amostras simples, em funo da dimenso da rea (Tabela 2).
Outra definio importante a determinao da profundidade de coleta das subamostras, devido s grandes diferenas nas formas de preparo do solo.
Lynch (1986) e Catellan e Vidor (1990), observaram que no plantio direto as amostragens devem ser realizadas na camada superficial do solo (0 a 5 cm), pois onde
h maiores concentraes de matria orgnica e biota do solo e, no plantio convencional, as amostragens devem explorar a camada mais profunda (0 a 20 cm).
Em reas de cultivo agrcola ou em experimentos nos quais as culturas
so semeadas com espaamento definido (milho, soja e trigo, por exemplo), a
amostragem deve ser feita nas entrelinhas, para no superestimar os parmetros
microbiolgicos em consequncia da adio de fertilizantes. Quando no h definio de linhas de plantio (campo nativo e pastagens, por exemplo), coletam-se
amostras ao acaso.

15

Tabela 2. Nmero de subamostras por talho/rea.


Nmero de amostras simples para
formar uma amostra composta

Fonte

10 m2 a vrios hectares

20

Comisso (1994)

Nunca superior a 20 hectares

20

Raij et al. (1997)

Menor ou igual a 10 hectares

10 a 20

Tamanho do talho homogneo

Menor ou igual a 4 hectares (uniformes)

15

IAPAR (1996)
Machado (1999)

As ferramentas utilizadas na coleta de solo podem ser trados (calador,


holands e rosca), p de corte e enxada. Porm, tem-se mostrado mais prtico o uso
do trado calador (forma de cilindro). importante destacar que, aps a seleo da
ferramenta, esta seja a nica a ser utilizada, para padronizar a coleta das amostras
quanto profundidade, o massa e o volume.
No campo, as amostras de solo so colocadas e homogeneizadas em baldes plsticos de polietileno (5 a 8 L), que devem estar limpos, isentos de fertilizantes, calcrio e agroqumicos, e, de preferncia, que estejam desinfetados com lcool
70 %. Posteriormente, aproximadamente 500 g de solo so transferidos para sacos
plsticos de polietileno limpos e sem uso, com a devida identificao externa (local,
cultura e data). Dos 500 g da amostra, aproximadamente 300 g devem ser utilizados para a caracterizao fsico-qumica do solo, na determinao dos parmetros:
pH, umidade gravimtrica, textura, macro e micronutrientes, para que os dados
biolgicos obtidos possam ser mais bem interpretados.
As amostras de solo coletadas dessa forma so denominadas amostras
perturbadas, devido sua homogeneizao, e devem ser encaminhadas ao laboratrio o mais rpido possvel, mantidas em caixas de isopor contendo gelo (isolante
trmico). importante evitar vibraes e agitaes para no causar alteraes nos
parmetros a serem avaliados.
Antes das avaliaes, necessrio retirar fragmentos de matria orgnica
visveis a olho nu (razes e folhas, por exemplo), que possam interferir diretamente
nos resultados. Como nem sempre possvel realizar as anlises aps a chegada ao
laboratrio, Moreira e Siqueira (2006) recomendam que as amostras sejam mantidas em cmara fria (2 a 4 C) por at quatro semanas ou a -20 C (freezer) por
perodos maiores. Para realizar as avaliaes aps perodos de armazenamento,

16

necessrio que as amostras sejam pr-incubadas temperatura ambiente por um


perodo de 24 a 48 h, para restabelecer o equilbrio da atividade microbiana. Para
o estudo da biomassa microbiana, os mesmos autores recomendam um perodo de
oito dias de incubao no escuro.

17

CAPTULO III
BACTRIAS
Ida Chapaval Pimentel
Jair Alves Dionsio
Diana Signor
Os organismos procariotos so agrupados em dois domnios Bacteria e
Archea. As principais diferenas entre eles esto na composio qumica, na atividade e no ambiente em que se desenvolvem. A composio qumica da parede
celular das bactrias constituda por peptideoglicano, que lhes d forma, confere
fora e rigidez. J as arqueas apresentam grande diversidade e no contm peptideoglicano, alm de possuir capacidade de se desenvolver em condies extremas
de temperatura, salinidade e presso.
As clulas bacterianas so constitudas por parede celular, membrana
plasmtica e algumas espcies possuem uma terceira camada externa denominada
cpsula, formada por polissacardeos com consistncia de muco, o que lhes confere resistncia. Flagelos e fmbrias tambm podem fazer parte da sua constituio
(TORTORA et al., 2013).
De acordo com a composio qumica e a integridade da parede celular,
as bactrias se dividem em: Gram-positivas e Gram-negativas. As Gram-positivas
possuem uma espessa camada de peptideoglicano e cidos teicoicos e as Gram-negativas possuem peptideoglicano e uma membrana externa composta de lipopolissacaredos, lipoprotenas e fosfolipdios (TORTORA et al., 2013; DUNLAP, 2010). Reproduzem-se muito rpido por diviso simples (fisso binria) que pode acontecer
em aproximadamente 20 minutos, como o caso da Escherichia coli. Por isso, a partir
de uma nica bactria pode-se chegar a cinco bilhes delas aps 12 h de cultivo.
As bactrias so os seres vivos mais antigos da terra, esto amplamente
distribudas no ar, no solo e na gua e so os micro-organismos mais simples, do
ponto de vista estrutural, e de menor tamanho (0,2 a 2,0 mm de dimetro e 2,0 a
8,0 mm de comprimento). Durante o processo de diviso celular, por fisso binria,
o material gentico (DNA), que no est envolvido por uma membrana, duplicado
e a clula se divide em duas (TORTORA et al., 2013).
Bactrias podem ser autotrficas ou heterotrficas. No solo, a maioria
heterotrfica e necessita de uma fonte de carbono orgnico para sua nutrio. De

18

acordo com as exigncias de oxignio, podem ser: aerbias obrigatrias, anaerbias


facultativas, anaerbias obrigatrias, anaerbias aerotolerantes e microaerfilas
(TORTORA et al., 2013; DUNLAP, 2010).
Quanto forma, podem ser: arredondadas (cocos), alongadas ou em forma de bastonetes (bacilos), em forma de espiral (espiroquetas e espirilos) e em forma de vrgula (vibries).
De acordo com Siqueira et al. (1993), a faixa de pH para o crescimento da
maioria das bactrias varia de 6,5 a 7,5, podendo algumas espcies atingir limites
extremos entre 0,5 e 9,5. Em funo da faixa de temperatura, dividem-se em: psicrfilas, que podem desenvolver-se a 0 C ou em temperaturas mais baixas; mesfilas, que se desenvolvem entre 15 e 25 C; termfilas, que crescem na faixa de 40 C;
e, termfilas extremas, que crescem com temperatura acima de 60 C.
A populao de bactrias no solo estimada em torno de 108 a 109 organismos por grama de solo (esse nmero varia conforme o mtodo de contagem).
Entretanto, devido ao tamanho reduzido, contribuem com menos da metade do
carbono da biomassa microbiana (CBM) do solo, mas, mesmo assim, podem atingir
valores de CBM entre 100 e 4.000 kg ha-1 (GRISI, 1988).
As bactrias de importncia agrcola, que fixam nitrognio atmosfrico,
podem ser agrupadas em trs categorias:
1) Simbiontes (nodulam leguminosas): Rhizobium e Bradyrhizobium;
2) Associativas (vivem endofiticamente ou na rizosfera de gramneas):
Azospirillum, Herbaspirillum e Gluconobacter; e,
3) De vida livre: Beijerinkia, Derxia e Azotomonas.
No entanto, os gneros de maior ocorrncia no solo so: Pseudomonas,
Arthrobacter, Achromobacter, Flavobacterium, Xanthomonas e Micrococcus (EWEIS
et al., 1999).
Catellan e Vidor (1990a) compararam a densidade populacional de bactrias
heterotrficas do solo, expressas em unidade formadora de colnia (UFC g-1) de solo,
sob diferentes sistemas de cultivo em duas profundidades. Esses autores observaram na camada 0 a 5 cm, para os sistemas de cultivo: campo nativo, aveia+ervilhaca/
milho+caupi e siratro, respectivamente 88 x 105; 12,5 x 106 e 15,3 x 106 e na camada
5 a 15 cm, respectivamente: 45 x 105; 75 x 105 e 82,9 x 105. Barros et al. (2010)

19

observaram em rea de minerao e metalurgia de chumbo as seguintes densidades populacionais de bactrias: 1,97 a 34,53 x 105 e 7,6 a 103 x 104 (UFC g-1) de
solo seco, respectivamente para os solos Neossolo Litlico sobre mata nativa sem
evidncia de contaminao com Pb e Neossolo Litlico Quartzarnico com cobertura de samambaias (Pteridium aquilinum) e capim elefante (Peninsetum purpureum),
com pilhas de rejeito na superfcie do solo.
As bactrias exercem importante funo na decomposio da matria orgnica, na ciclagem de nutrientes, na fixao biolgica de nitrognio (simbitica e
assimbitica, na agregao do solo), e no desenvolvimento de doenas, como tambm so indicadoras de qualidade do solo.

20

PROTOCOLO I
CONTAGEM DE BACTRIAS PELO MTODO DE
SEMEADURA EM SUPERFCIE
1. Material
a)

Solo mido coletado da camada superficial, obtido conforme o Captulo II


(p. 14);

b)

Vidrarias: Erlenmeyer de 250 mL, tubos de ensaio (16 x 1,5 cm) com rosca,
placas de Petri ( 90 mm), ala de Drigalsky e esferas de vidro ( 2,00 mm);

c) Equipamentos: agitador de frasco, estufa de esterilizao, estufa de


incubao, capela de fluxo laminar, autoclave, peagmetro, esterilizador infravermelho ou bico de Bunsen ou lamparina, agitador de tubos e
microscpio estereoscpio (lupa);
d) Solues: salina esterilizada (NaCl 0,85 %), meio de cultura de Thorton
(Tabela 3);
e) Outros: funil de plstico ( 10,0 cm), micropipeta de volume varivel (10
a 100 L), ponteiras autoclavveis, peneira nmero 10 (abertura de 2,00
mm), lixeira para resduos biolgicos, luvas de proteo (nitrlica descartvel), parafilm e gs butano; e,
f)

Alternativos: pipetas de 1,0 mL, algodo hidrofbico e pera insufladora.

2. Metodologia
a)

Pesar 10,00 g de solo mido, previamente tamizado, em peneira nmero


10, em duplicata, sendo uma parte destinada contagem de bactrias e a
outra para a determinao da massa de solo seco (item 3);

b) Com um funil, transferir o solo para Erlenmeyer de 250 mL contendo


cinco esferas de vidro e 90,0 mL de soluo salina esterilizada (Anexo 1)
(diluio 1:10);
c)

Dispersar as unidades formadoras de colnia (UFC) em agitador de frasco


(usar @ 3,4 G) durante 15 minutos e aguardar a precipitao das partculas maiores;

d)

Com uma micropipeta, contendo ponteira esterilizada, transferir 1,0 mL


da suspenso para um tubo de ensaio contendo 9,0 mL de soluo salina esterilizada e dispersar, no agitador de tubos ou manualmente, cinco
vezes (diluio 1:100);

21

Tabela 3. Meio de cultura de Thorton.


Reagente

Quantidade (g L-1)

K2HPO4

1,0

MgSO4.7H2O

0,2

CaCl2.2H2O

0,1

NaCl

0,1

FeCl3

0,002

KNO3

0,5

Asparagina

0,5

Manitol

1,0

gar

15,0

gua destilada q.s.p.

1.000,0 mL

Fonte: Parkinson et al. (1971).


Obs. Adicionar ciclohexamide (40 mg L-1 de meio) esterilizado por filtrao, dissolvido em 10 mL de gua destilada,
antes de verter em placas com o meio de cultura temperatura de 45 a 50 C.

e) Com uma micropipeta contendo outra ponteira esterilizada, transferir


1,0 mL da soluo anterior para outro tubo de ensaio contendo 9,0 mL
de soluo salina esterilizada e agitar manualmente cinco vezes (diluio
1:1.000);
f) Repetir o item e duas vezes consecutivas para atingir as diluies
1:10.000 e 1:100.000;
g) Descartar as ponteiras utilizadas em um bquer contendo soluo de
hipoclorito de sdio (NaClO 2,0 %) (Anexo 1) aps cada transferncia;
h) Com uma micropipeta contendo ponteira esterilizada, transferir 0,1 mL
das etapas e, f e g para a superfcie das placas de Petri, contendo o
meio de cultura de Thorton;
i)

Espalhar o inculo (0,1 mL) na superfcie do meio com o auxlio da ala de


Drigalsky, tomando o cuidado de esteriliz-la por flambagem, inserindoa em lcool etlico (95 ou 96 GL) e passando-a imediatamente na chama
da lamparina. Repetir o processo, aps o uso em cada placa de Petri;

22

j)

Identificar as placas de Petri (tratamento, repetio, meio de cultivo, data


e responsvel), selar com parafilm e incub-las em estufa a 25 C, invertidas, por aproximadamente uma semana;

k) Selecionar as placas de Petri com as diluies que contenham entre 20 e


200 (UFC) isoladas; e,
l)

Contar as UFC com contador de colnias ou a olho nu.

3. Clculo
UFC g-1 = (mdia das contagens x diluio selecionada x 10) g-1*
*Obtido aps a secagem do solo mido em estufa (105 C) at massa constante.

4. Resultados
Tabela 4. Densidade populacional de bactrias em diferentes solos.
Unidades formadoras de colnias (UFC g-1)
Solo

Diluio
selecionada

Repeties
1

A
B
C
D
E

Mdia
3

23

CAPTULO IV
BACTRIAS ESPORULADAS
Ida Chapaval Pimentel
Jair Alves Dionsio
Diana Signor
Algumas bactrias, quando em condies ambientais adversas, iniciam
um processo em que a clula se desidrata e forma-se uma parede espessa, dentro
da membrana celular, ao redor de seu citoplasma e cromossomo, formando uma estrutura conhecida como endsporo (esporo bacteriano). As bactrias que formam
esses endsporos so conhecidas como bactrias esporuladas (BROCK, 2012).
Os endsporos bacterianos so capazes de permanecer em estado latente, desidratados, por longos perodos de tempo e sobreviver em condies de escassez de umidade, temperatura elevada, presena de cidos e lcalis e falta de
nutrientes. Quanto necessidade de oxignio, as bactrias esporuladas podem ser
aerbias estritas, anaerbias facultativas, anaerbias obrigatrias ou microaerfilas (TORTORA et al., 2013). Os principais gneros que formam endsporos so
Bacillus e Clostridium.
Cada endsporo contm uma cpia completa do cromossomo bacteriano,
concentraes mnimas restritas de protenas, alta concentrao de clcio e circundado por uma parede de peptidoglicano, crtex (pseudopeptidoglicano), capa
(queratina) e membrana lipoproteica. Este revestimento responsvel pela resistncia a muitas substncias agressivas (TORTORA et al., 2013).
O endsporo uma estrutura que no apresenta metabolismo, podendo ser reativada quando as condies ambientais voltam a ser favorveis. Por
exemplo, esporos com 7.500 anos de Thermoactinomyces vulgaris, isolados do lodo
congelado, germinaram quando reaquecidos e colocados em um meio nutriente
(TORTORA et al., 2013).
A germinao do esporo bacteriano pode ser comparada germinao de
uma semente. Entretanto, nas bactrias o esporo est relacionado sobrevivncia e
no reproduo. O endsporo no se divide e a clula-me origina, normalmente,
apenas um esporo (TORTORA et al., 2013).

24

Aps a colorao da clula e a observao em microscpio, o endsporo


poder ser classificado como terminal (em uma das extremidades), subterminal
(prximo de uma das extremidades) ou central. Alm da posio, a possibilidade
de causar intumescimento na clula so caractersticas utilizadas para identificar a
bactria (BURTON; ENGELKIRK, 2005).
As bactrias esporuladas so bem conhecidas quando associadas a doenas, como o caso do Bacillus antracis, que causa Antraz ou Antrax, uma doena
do gado, ovelhas e cavalos que pode ser transmitida ao ser humano. Outra bactria
de destaque o Bacillus thurigiensis, patgeno microbiano de insetos, que quando
esporula internamente forma cristais intracelulares de glicoprotenas txicas (toxinas), causando a paralisia do intestino do inseto e fazendo com que este pare de
se alimentar (TORTORA et al., 2013). Porm, as espcies de Clostridium, que so
anaerbias, esto associadas s seguintes doenas: ttano, botulismo e gangrena
gasosa, respectivamente, causadas por: C. tetani; C. botulinum e C. perfringens.
Ao avaliar a populao microbiana do solo em diversos sistemas de cultura
e em duas profundidades, Catellan e Vidor (1990) observaram maior proporo de
endsporos em solos descobertos e justificaram esse fato como reflexo das condies
adversas desse sistema para o desenvolvimento microbiano. J no solo com a leguminosa siratro (Macroptilium atropurpureum), apesar do maior nmero de bactrias,
ocorreu a menor proporo de endsporos entre os tratamentos analisados. A estabilidade desse sistema, associada boa conservao da umidade, responsvel pela
baixa porcentagem de endsporos. Os mesmos autores constataram que as condies
se tornam mais adversas aos micro-organismos conforme aumenta a profundidade,
aumentando o nmero de endsporos, consequentemente.
Dionsio (1996), trabalhando com a populao microbiana em reas de Eucalyptus grandis, encontrou uma variao de 14,1 a 39,9 % na proporo de esporos
nas densidades populacionais bacterianas, sendo que os tratamentos com adubao
mineral apresentaram maiores propores do que aqueles que receberam composto
orgnico e calagem. Alm disso, a quantidade de endsporos atingiu valores mximos em perodos de estiagem, demonstrando que em condies adversas as bactrias esporuladas entram em repouso no solo, permanecendo inativas.
Devido sua resistncia a condies ambientais adversas, as bactrias
esporuladas do solo apresentam grande potencial, juntamente com os demais parmetros microbiolgicos, para avaliar os impactos resultantes de aes antrpicas
das mais diversas naturezas, desde uma simples adubao ou perda do horizonte do
solo at o derramamento de produtos qumicos.

25

PROTOCOLO II
CONTAGEM DE BACTRIAS ESPORULADAS
PELO MTODO DE SEMEADURA EM SUPERFCIE
(CLARK, 1965)
1. Material
a)

Solo mido coletado da camada superficial, obtido conforme o Captulo II


(p. 14);

b)

Vidrarias: Erlenmeyer de 250 mL, tubos de ensaio (16 x 1,5 cm) com rosca,
placas de Petri ( 90 mm), ala de Drigalsky, esferas de vidro ( 2,00 mm);

c)

Equipamentos: agitador de frasco, estufa de esterilizao, estufa de incubao, capela de fluxo laminar, autoclave, banho-maria, peagmetro,
esterilizador infravermelho ou bico de Bunsen ou lamparina, agitador de
tubos e microscpio estereoscpio (lupa);

d) Solues: salina esterilizada (NaCl 0,85 %) e meio de cultura de Thorton


(Tabela 3);
e) Outros: funil de plstico ( 10,0 cm), micropipeta de volume varivel
(10 a 100 L), ponteiras autoclavveis, peneira nmero 10 (abertura de
2,00 mm), lixeira para resduos biolgicos, luvas de proteo (nitrlica
descartvel), parafilm e gs butano; e,
f)

Alternativos: pipetas de 1,0 mL, algodo hidrofbico e pera insufladora.

2. Metodologia
a)

Pesar 10,00 g de solo mido, previamente tamizado, em peneira nmero


10, em duplicata, sendo uma parte destinada contagem de bactrias
esporuladas e a outra para a determinao da massa de solo seco (item 3);

b)

Transferir o solo, com um funil, para um Erlenmeyer de 250 mL contendo


cinco esferas de vidro e 90,0 mL de soluo salina esterilizada (Anexo 1)
(diluio 1:10);

c) Dispersar as unidades formadoras de colnias (UFC) em agitador de


frasco (usar @ 3,4 G) durante 15 minutos e aguardar a precipitao das
partculas maiores;
d) Aquecer o Erlenmeyer, em banho-maria a 80 C, por, no mnimo, 15
minutos, para que as formas vegetativas das bactrias sejam eliminadas;

26

e)

Com uma micropipeta, contendo ponteira esterilizada, transferir 1,0 mL


da suspenso para um tubo de ensaio contendo 9,0 mL de soluo salina
esterilizada e agitar cinco vezes (diluio 1:100);

f)

Descartar as ponteiras utilizadas em um bquer contendo soluo de detergente (Anexo 1) aps cada transferncia;

g) Transferir, com outra ponteira esterilizada, 1,0 mL da soluo anterior


para outro tubo de ensaio contendo 9,0 mL de soluo salina esterilizada
e agitar 5 vezes (diluio 1:1.000);
h) Repetir o item g novamente para atingir a diluio 1:10.000;
i)

Com outra ponteira esterilizada, pipetar 0,1 mL das etapas e, g e h,


e transferir para a superfcie das placas de Petri contendo meio de cultura
Thorton (Tabela 3). Para cada diluio utilizar trs repeties. Logo, sero
feitas nove placas de Petri para anlise posterior;

j)

Espalhar o inculo na superfcie do meio com o auxlio da ala de Drigalsky, tomando o cuidado de esteriliz-la por flambagem, inserindo-a em
lcool etlico (95 ou 96 GL) e passando-a imediatamente na chama da
lamparina. Repetir o processo, aps o uso em cada placa de Petri;

k) Identificar corretamente as placas de Petri, selar com parafilm e incublas em estufa a 25 C, invertidas, durante 7 dias;
l)

Selecionar as placas de Petri com as diluies que contenham entre 20 e


200 (UFC) isoladas; e,

m) Contar as UFC com contador de colnias ou a olho nu.

3. Clculo
Realizar o clculo conforme Captulo III (p. 22).

4. Resultados
Preencher os dados conforme Tabela 4 (p. 22).

27

CAPTULO V
FUNGOS
Ida Chapaval Pimentel
Jair Alves Dionsio
Diana Signor
Os fungos so micro-organismos eucariticos, pertencentes ao domnio Eucarya, podendo ser unicelulares (leveduras) ou multicelulares, micro ou macroscpicos.
So os principais decompositores da natureza, desdobrando os produtos orgnicos e
reciclando carbono, nitrognio e outros compostos do solo (TORTORA et al., 2013).
A maioria dos fungos multicelular formando uma rede de filamentos denominados hifas, as quais podem ser septadas ou asseptadas (cenocticas). O conjunto de hifas recebe o nome de miclio, um tecido prprio dos fungos responsvel
por todas as funes vegetativas do organismo. O componente principal da parede
celular dos fungos a quitina, porm outros polissacardeos como mananas, galactosanas e quitosanas substituem a quitina em algumas paredes celulares fngicas
(DUNLAP et al., 2010)
Quanto nutrio e fisiologia os fungos no possuem pigmentos fotossintetizantes, crescem melhor em pH cido, a maioria aerbico e quimio-heterotrficos (TORTORA et al., 2013).
A obteno de alimento efetua-se por absoro, o miclio secreta enzimas
extracelulares que digerem compostos orgnicos complexos. Em outras situaes,
o miclio emite haustrios, que so estruturas que penetram no tecido dos organismos hospedeiros absorvendo o alimento (TORTORA, 2013).
Os fungos se reproduzem de forma sexuada e assexuada. Ocorre o crescimento por meio da disseminao de filamentos de hifas, produo de esporos
ou simples diviso celular, como nas leveduras com brotamento (DUNLAP et al.,
2010). A sistemtica de classificao dos fungos baseada em aspectos macroscpicos (aspecto das colnias) e microscpicos (presena ou ausncia de septos nas hifas e caractersticas dos esporos) e, recentemente, utilizando a filogenia molecular.
Estes micro-organismos esto agrupados no Reino Fungi, subdivididos
nos Filos Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota e Basidiomycota (KIRK et al.,

28

2008). O Filo Chytridiomycota apresenta zosporos mveis uniflagelados polarmente, pode ser parasito de plantas, algas e larvas de insetos, decompem celulose,
queratina e quitina (ex.: Alomyces e Rhizophydium). O Filo Zygomycota possui hifas
no septadas, a estrutura de reproduo assexuada o esporngio e o zigsporo
o esporo sexual. A maioria saproftica, alguns fitopatognicos ou parasitas de
outros fungos e englobam parte das endomicorrizas arbusculares (ex.: Mucor; Rhizopus e Zygorhynchus). O Filo Ascomycota possui hifas septadas, esporos sexuais
denominados ascsporos e formam esporos de resistncia: os clamidsporos ou
esclercios. Decompe substncias recalcitrantes, como celulose e lignina, formam
lquens e micorrizas, sendo alguns fitopatgenos (ex.: Endothia, Claviceps e Saccharomyces). O Filo Basidyomycota apresenta hifas septadas, reproduo assexuada,
produzindo condios ou artrosporos, ou sexuadamente, pela produo de um basdio com seus basidisporos haplides. So decompositores de materiais lenhosos,
fitoparasitas, sendo representados pela maioria das ectomicorrizas, muitos cogumelos, inclusive os comestveis (ex.: Agaricus, Porta e Boletus).
A partir da adoo de parmetros moleculares para estudos filogenticos,
foi criado um grupo artificial denominado de fungos mitospricos (antigo filo Deuteromycota), para agrupar aquelas espcies que possuem somente a fase de reproduo assexuada. Eles, muitas vezes, possuem tambm a alternativa do sexo denominada de ciclo parassexual ou parassexualidade. A maioria saprfita, muitos so
parasitas de plantas, animais e outros fungos e muitos deles so endofticos (ex.:
Aspergillus, Penicillium e Fusarium) (ARAJO et al., 2010).
Os fungos predominam em solos cidos, onde h menor competio
com bactrias e actinobactrias. So encontrados em faixas de pH variando de 2,0
a 9,0. A umidade ideal para o desenvolvimento est entre 60 e 70 % da capacidade
de campo do solo. Toleram ampla faixa de temperatura, mas as espcies mesoflicas so predominantes nos solos. A disperso dos esporos ocorre por diversos
agentes como a gua, o vento, as sementes, os insetos, outros artrpodos, e o
homem (JONES; HARRISON, 2004).
Os fungos contribuem com a maior parcela da biomassa microbiana do
solo, de 70 a 80 %, e podem atingir at 5 t ha-1 (BRANDO, 1992). Apesar de
apresentarem baixa densidade populacional (de 104 a 106 g-1 de solo), possuem
hifas de elevado comprimento e dimetro, o que eleva a biomassa (ALEXANDER,
1980). Os principais gneros que ocorrem no solo so Aspergillus, Penicillium, Rhizopus e Rhizoctonia. Nakagawa e Andra (2006) constataram densidade popula-

29

cional, (UFC g-1) de solo, de fungos 7 x 102, em solo contaminado com hexacloro
benzeno (BHC), no entanto quando o solo recebeu adio de bagao de cana-de-acar e cal essa densidade atingiu 15,35 x104.
As principais funes dos fungos no solo so atividade quimioheterotrfica sobre os restos vegetais, formao de relaes simbiticas mutualsticas (micorrizas) e parasticas (doenas) na maioria das plantas e produo de antibiticos.
So ainda agentes de controle biolgico de fungos fitopatognicos e nematoides
fitoparasitas (ex.: Arthrobotrys, Dactylaria e Dactyella) (GRAMINHA et al., 2001),
como tambm, indicadores de qualidade do solo.

30

PROTOCOLO III
CONTAGEM DE FUNGOS PELO MTODO DE
SEMEADURA EM SUPERFCIE
1. Material
a) Solo mido coletado da camada superficial, conforme o Captulo II
(p. 14);
b)

Vidrarias: Erlenmeyer de 250 mL, tubos de ensaio (16 x 1,5 cm) com rosca,
placas de Petri ( 90 mm), ala de Drigalsky e esferas de vidro ( 2,00 mm);

c)

Equipamentos: agitador mecnico, estufa de esterilizao, estufa de incubao, capela de fluxo laminar, autoclave, peagmetro, esterilizador
infravermelho ou bico de Bunsen ou lamparina, agitador de tubos e microscpio estereoscpio (lupa);

d) Solues: salina esterilizada (NaCl 0,85 %) e meio de cultura de Martin


(Tabela 5);
e)

Outros: funil de plstico ( 10,0 cm), micropipeta com ponteiras de 0,1


mL, peneira nmero 10 (abertura de 2,00 mm), luvas de proteo (nitrlica descartvel), parafilm, pera insufladora, gs butano, lixeira para
resduos biolgicos; e,

f)

Alternativos: pipetas de 1,0 mL, algodo hidrofbico e pera insufladora.

Tabela 5. Meio de cultura de Martin (MENZIES, 1965).


Reagente

Quantidade (g L-1)

K2HPO4

1,0

MgSO4.7H2O

0,5

Peptona

5,0

Dextrose

10,0

Rosa Bengala1

0,3

gar

15,0

gua destilada q.s.p.

1.000,0 mL

Dissolvida em 10 mL de gua destilada antes de ser adicionada ao meio.

Obs.: Ajustar o pH para 5,4 com HCl diludo, antes da adio do gar; Adicionar sulfato de estreptomicina (30 mg L-1
de meio) esterilizado por filtrao, dissolvido em 10 mL de lcool etlico a 1 %, antes de verter em placas, com o
meio de cultura temperatura de 45 a 50 C.

31

2. Metodologia
a)

Pesar 10,00 g de solo mido, previamente tamizado, em peneira nmero


10, em duplicata, sendo uma parte destinada contagem de fungos e a
outra para a determinao da massa de solo seco (item 3);

b) Transferir o solo, com um funil, para um Erlenmeyer de 250 mL contendo cinco esferas de vidro e 90 mL de soluo salina esterilizada (Anexo 1)
(diluio 1:10);
c) Dispersar as unidades formadoras de colnias (UFC) em agitador
mecnico (usar @ 3,4 G) durante 15 minutos e aguardar a precipitao
das partculas maiores;
d)

Com uma micropipeta, contendo ponteira esterilizada, transferir 1,0 mL


da suspenso para um tubo de ensaio contendo 9,0 mL de soluo salina
esterilizada e agitar, no agitador de tubos ou manualmente, cinco vezes
(diluio 1:100);

e) Transferir com uma micropipeta, contendo outra ponteira esterilizada,


1,0 mL da soluo anterior para outro tubo de ensaio contendo 9,0 mL
de soluo salina esterilizada e agitar manualmente cinco vezes (diluio
1:1.000);
f)

Repetir o item e novamente para atingir a diluio 1:10.000;

g) Aps cada transferncia, descartar a ponteira utilizada em um bquer


contendo soluo de detergente (Anexo 1);
h) Pipetar, com ponteiras diferentes, 0,1 mL das etapas d, e e f e transferir para placas de Petri contendo o meio de cultura de Martin, especfico para fungos (Tabela 5);
i)

Espalhar o inculo na superfcie do meio especfico com o auxlio da ala de


Drigalsky, tomando o cuidado de esteriliz-la por flambagem, inserindo-a
em lcool etlico (95 ou 96 GL) e passando-a imediatamente na chama da
lamparina. Repetir o processo, aps o uso em cada placa de Petri;

j)

Identificar as placas de Petri (tratamento, repetio, meio de cultivo, data


e responsvel), selar com parafilm e incub-las em estufa a 25 C, invertidas, por aproximadamente uma semana;

k) Selecionar as placas de Petri com as diluies que contenham entre 20 e


200 (UFC) isoladas; e,
l)

Contar as UFC com contador de colnias ou a olho nu.

32

3. Clculo
Realizar o clculo conforme descrito no Captulo III (p. 22).

4. Resultados
Preencher os dados conforme Tabela 4 (p. 22).

33

CAPTULO VI
MICORRIZAS ARBUSCULARES
Alessandra Monteiro de Paula
Os fungos micorrzicos arbusculares (FMA) formam uma associao simbitica mutualstica com as razes da maioria das plantas terrestres, originando
as micorrizas arbusculares. Os FMA so atualmente classificados como um grupo
monofiltico, Filo Glomeromycota, Classe Glomeromycetes (glomeromicetos), organizados em quatro ordens, treze famlias, dezenove gneros e, aproximadamente, 215 espcies (SOUZA et al., 2010). A participao desses fungos no processo de
colonizao do ambiente terrestre pelas plantas foi confirmada com a identificao
da presena de trs genes micorrzicos em um ancestral comum das plantas terrestres (WANG et al., 2006).
As micorrizas arbusculares (MA), associao simbitica formada pelos
FMA e as razes das plantas, podem ser encontradas na maioria dos taxa vegetais,
sendo a ausncia da simbiose restrita a poucas famlias de plantas. Como exemplo, podem ser mencionadas as famlias Juncaceae, Caryophyllaceae e Brassicaceae
(BERBARA et al., 2006), possivelmente em consequncia do processo evolutivo,
relacionado com algumas caractersticas peculiares como: a presena de compostos
fungistticos, a insuficincia de sinais moleculares ou fatores estimulantes para o
estabelecimento da simbiose ou, ainda, a existncia de barreiras fsicas para a penetrao da hifa do fungo (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006). Descritos como simbiotrficos obrigatrios, os FMA apenas completam seu ciclo de vida na presena de
um hospedeiro compatvel. Essa caracterstica limita os estudos de determinados
tpicos da biologia desses fungos e, tambm, restringe a aplicao biotecnolgica
desses organismos (SOUZA et al., 2010).
Os glomeromicetos so assexuados, formam esporos que variam de 22 a
1.050 mm de dimetro, destacando-se entre os maiores do Reino Fungi, e formam
miclio asseptado ou cenoctico, podendo ocorrer formao ocasional de septos em
alguns estgios do desenvolvimento de alguns gneros (SOUZA et al., 2010), distribudos em hifas externas que se ramificam, ocupando os espaos entre as partculas
do solo e hifas intrarradiculares, que colonizam os tecidos das razes das plantas.

34

Ao colonizar essas razes, os FMA no promovem alteraes morfolgicas visveis


a olho nu e para confirmao da presena da simbiose so necessrias observaes
microscpicas de razes clarificadas e coloridas com corantes especficos para micorrizas arbusculares (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).
As razes das plantas que fazem a associao micorrzica so colonizadas
pelas hifas dos FMA que ocupam o apoplasto e as clulas do crtex, preenchendo o
espao intercelular e tambm intracelular, que resulta da invaginao da membrana
plasmtica vegetal e da formao de uma hifa modificada morfolgica e fisiologicamente, denominada de arbsculo, que conduz a troca de nutrientes e de fotoassimilados entre os simbiontes. Em algumas espcies de Glomeraceae, as hifas intrarradiculares se diferenciam e formam estruturas ricas em lipdios, denominadas
de vesculas, com aparente funo de reserva (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006). Para
o estabelecimento da simbiose entre os FMA e as plantas, necessria a presena
de propgulos infectivos no solo, que podem ser segmentos de razes de plantas
colonizadas, hifas ou esporos de FMA.
Siqueira et al. (1994) propuseram uma sequncia de procedimentos para
a avaliao da ocorrncia e das relaes ecolgicas das micorrizas arbusculares, na
qual a partir da coleta de amostra de solo e razes so indicadas algumas avaliaes
como: extrao de esporos do solo, contagem dos esporos e montagem de lminas
para caracterizao e identificao de espcies. A partir dessas mesmas amostras de
solo podem ser montados vasos com culturas-armadilha, para multiplicao de esporos no identificados na extrao da amostra original e, ainda, podem ser feitos
estudos das razes de plantas para avaliao da colonizao dos FMA por meio do
mtodo de clarificao e colorao das razes.
Os benefcios das micorrizas arbusculares no desenvolvimento das plantas so (SILVEIRA, 2000):
a) Efeito no crescimento das plantas: consequncia de seu efeito sobre a
nutrio mineral, principalmente no aumento da absoro do fsforo e
de outros elementos (Zn, Cu, Ca e S);
b) Efeito na relao gua-planta: plantas micorrizadas so mais resistentes
ao estresse hdrico e usam a gua absorvida com mais eficincia;
c)

Efeito na fixao de N2: leguminosas com dupla simbiose (rizbio e MA)


apresentam maior nodulao, atividade da nitrogenase e concentrao
de leghemoglobina, e teor de nitrognio;

35

d)

Efeito sobre fitopatgenos: pode atuar como agente de controle biolgico;

e)

Efeito na estrutura do solo: pela agregao das partculas e da estabilizao dos agregados; e,

f)

Efeitos anatmicos e fisiolgicos: por meio de modificaes anatmicas,


histoqumicas, bioqumicas e fisiolgicas.

A importncia das micorrizas para o crescimento vegetal e a revegetao


de reas degradas determinada por algumas condies predominantes do ambiente, como o baixo nvel de nutrientes e gua disponveis no solo. Diversas espcies de FMA tm sido encontradas nas mais variadas situaes de reas degradadas
no Brasil, o que evidencia a alta capacidade de adaptao desse grupo de fungos a
condies adversas (SIQUEIRA et al., 2010).

36

PROTOCOLO IV A
EXTRAO DE ESPOROS DE FUNGOS MICORRZICOS
ARBUSCULARES DO SOLO PELO MTODO DO
PENEIRAMENTO MIDO (GERDEMANN; NICOLSON,
1963) E DETERMINAO DO NMERO DE ESPOROS
DE FMA EM AMOSTRA DE SOLO
1. Material
a)

Solo mido coletado da camada superficial, obtido conforme o Captulo II


(p. 14);

b)

Vidrarias: provetas de 50 mL, basto de vidro e placas de Petri ( 85 mm);

c)

Equipamentos: centrfuga de bancada, de no mnimo 3.000 RPM, e microscpio estereoscpio (lupa);

d) Soluo: sacarose 50 %; e,
e)

Outros: conjunto de peneiras (malhas de 750, 250, 100 e 45 m), com


suporte para sustentar o jogo de peneiras, bqueres plsticos de 50 e
2.000 mL ou recipiente de plstico de volume semelhante, tubos plsticos de 50 mL com rosca para centrfuga, pisseta, luvas de proteo (nitrila descartvel) e lixeira para resduos biolgicos.

2. Metodologia
a)

Medir 50 mL de solo mido e transferi-lo para um bquer de 2.000 mL ou


recipiente de volume semelhante;

b)

Acrescentar 1 L de gua potvel e agitar com um basto de vidro, at formar uma suspenso de solo;

c) Dispensar a suspenso no jogo de peneiras, devidamente disposto da


maior para a menor e abertura das malhas de 750, 250, 100 e 45 m;
d) Transferir, com uma pisseta com gua, o material retido nas peneiras
(malhas de 250, 100 e 45 m) para tubos de centrfuga de 50 mL, devidamente identificados, completar o volume para 50 mL e centrifugar, por 3
minutos, a 3.000 RPM;
e)

Descartar o sobrenadante, acrescentar soluo de sacarose 50 % para ressuspender o material depositado no fundo do tubo e centrifugar novamente por 2 minutos a 2.000 RPM;

37

f)

Dispensar o sobrenadante de cada tubo, em separado, em peneira (malha


de 45 m), lavar o material para retirar o excesso de sacarose e conduzir
os esporos para avaliao em placas de Petri ou armazenar a 4 C por at
30 dias, para leitura posterior;

g)

Para a contagem do nmero de esporos em cada amostra de cada malha,


determinar, inicialmente, com uma rgua graduada, a rea do campo visual do microscpio estereoscpico que ser utilizado para a contagem de
esporos de FMA;

h) Determinar a rea da placa de Petri que ser utilizada para depositar os


esporos de FMA, conduzir a contagem do nmero de esporos e calcular
a relao entre a rea da placa de Petri e a rea do campo visual do microscpio estereoscpico. Essa relao indicar o nmero total de campos
visuais que podem ser observados na placa de Petri. Por exemplo, tomando-se como dimetro do campo visual do microscpio estereoscpio a
medida de 5 mm, no aumento de 4 X, a rea do campo visual ser de 19,6
mm2. Considerando o dimetro da placa de Petri de 85 mm, a rea da
placa de Petri ser de 5.672 mm2. Dessa forma, a relao entre a rea da
placa de Petri e do campo visual do microscpio estereoscpico ser de
5.672/19,6 = 289; e,
i)

Agitar o recipiente contendo os esporos de FMA e retirar uma alquota


de 5 a 10 mL para distribuir na placa de Petri. Uniformizar a distribuio
da alquota na placa de Petri antes de iniciar a contagem. Se na primeira
contagem, no campo visual, forem observados menos de 30 a 40 esporos
de FMA, devem ser selecionados, ao acaso, 40 campos visuais na placa de
Petri e ser feita a contagem do nmero de esporos. Ao final da contagem,
calcular a mdia dos 40 campos visuais e multiplicar pelo valor obtido no
item h. Caso haja mais de 40 esporos na primeira contagem, diluir em
gua a alquota da amostra que contm os esporos extrados do solo na
relao 1:1, agitar e remover uma nova alquota para retomar a contagem
de esporos.

3. Clculo
(N de esporos de FMA) g-1 de solo = [(mdia dos 40 campos visuais x 289) g*
*Obtido aps a secagem do solo mido em estufa (105 C) at massa constante.

38

4. Resultados
Tabela 6. Densidade de esporos de fungos micorrzicos arbusculares (FMA) nos diferentes
solos.
Solo
A
B
C
D
E

Esporos (n g-1)
250 mm

100 mm

45 mm

Total

39

PROTOCOLO IV B
CLARIFICAO E COLORAO DE RAZES
DE PLANTAS DE ACORDO COM (BRUNDRETT
et al., 1996A) PARA AVALIAO DA TAXA DE
COLONIZAO MICORRZICA PELO MTODO DE
GIOVANNETTI E MOSSE (1980)
1. Material
a) As razes da planta que ser avaliada devero ser lavadas em gua corrente para retirar o excesso de terra. A partir das razes limpas, retirar
de 1,00 a 2,00 g de razes finas e jovens para conduzir os processos de
clarificao e colorao;
b)

Vidrarias e materiais: bqueres de 25 ou 50 mL, placas de Petri ( 85 mm),


lminas e lamnulas;

c) Equipamentos: banho-maria, autoclave ou chapa aquecedora e microscpio estereoscpio (lupa);


d) Solues: soluo de KOH 10 % (utilizar recipiente resistente ao calor).
Essa soluo utilizada para clarificao das razes (soluo de tinta de
caneta tinteiro azul 5,0 %). Essa soluo pode ser utilizada em substituio soluo de azul de tripano, como soluo de colorao; soluo de
hipoclorito de sdio 3 % (para retirar o excesso de corante das razes);
soluo de 50 % de glicerol/gua para retirar o excesso de corante e armazenar as razes coloridas; e,
e)

Outros: pinas e agulhas, pisseta, luvas de proteo (nitrila descartvel)


e lixeira para resduos biolgicos.

2. Metodologia
a)

Colocar as amostras de raiz em bquer de 25 ou 50 mL, individuais, para


cada amostra ou em cpsulas plsticas perfuradas que permitam a entrada da soluo, ou ainda, em redes de nilon com malha que possibilitem a entrada da soluo e dispostas em recipiente maior que agrupe
todas as cpsulas imersas na soluo. A raiz deve permanecer imersa na
soluo de KOH 10 % (Anexo 1) e aps aquecida em banho-maria, em

40

temperatura variando de 60 a 90 C. O tempo de aquecimento e de permanncia na soluo de KOH pode variar entre espcies de planta, em
funo das caractersticas das razes (as mais escuras e fibrosas demandam maior tempo para clarificao). Recomenda-se retirar uma amostra
e avaliar em microscpio estereoscpico aps um perodo de 15 a 30 minutos para razes mais finas, como de gramneas e, entre 45 e 60 minutos para razes mais grossas, como de espcies arbreas. Em alternativa
ao banho-maria, possvel utilizar o autoclave para realizar essa etapa.
De acordo com Brundrett et al. (1996a), 1 h a 60 C em banho-maria
equivale a 5 minutos em autoclave a 121 C;
b) Uma vez clarificadas, lavar a amostra em gua ou em soluo cida diluda vrias vezes antes de seguir para a etapa de colorao;
c)

Para colorao, a amostra deve ser imersa na soluo contendo o corante soluo de tinta de caneta 5 % (Anexo 1). Para acelerar o processo, a
amostra pode ser novamente conduzida ao aquecimento, em banho-maria,
recomendando-se o mesmo perodo de observao da eficincia do tempo
de exposio ao corante, como descrito na etapa de clarificao, ou apenas
deixada em repouso na soluo corante por 12 h. A soluo de colorao
pode ser reutilizada de 5 a 10 vezes ou at perder a intensidade do corante,
devendo-se ter o cuidado de filtrar com uma peneira de malha fina, aps o
uso na colorao de uma amostra;

d)

Aps a colorao, as razes esto prontas para avaliao da taxa de colonizao micorrzica. A amostra deve ser retirada da soluo de colorao e
pode ser preservada em soluo de glicerol 50 % (Anexo 1) em quantidade suficiente para cobrir as razes;

e) Uma vez coloridas, as razes seguem para avaliao da colonizao radicular e clculo da porcentagem de colonizao ou taxa de colonizao
micorrzica;
f)

As razes devem ser dispostas de forma aleatria em uma placa de Petri


de 8,5 cm de dimetro, contendo um grid de linhas de 1,27 cm (Figura 1).
Sero avaliados os fragmentos de razes contendo estruturas fngicas,
com um microscpio estereoscpico ou microscpico fotnico;

g) O observador visualizar, com o auxlio do microscpio esteroscpico,


em cada campo visual, a interseco da raiz com a linha horizontal do grid
e anotar a presena ou ausncia de colonizao micorrzica do segmento
da raiz que est em contato com a linha do grid (Figura 2); e,

41

h) recomendada a observao de no mnimo 100 interseces de razes


com a linha do grid para avaliar uma amostra e ter segurana do resultado
da taxa de colonizao.

Fonte: http://mycorrhizas.info/method.html#am1.

Figura 1. Colonizao micorrzica em placa de Petri pelo mtodo de Giovannetti e

Mosse (1980).

Fonte: http://mycorrhizas.info/method.html#am1.

Figura 2. Exemplificao da contagem da colonizao micorrzica pelo mtodo de

Giovannetti e Mosse (1980).

42

3. Clculo
% de colonizao micorrzica = [pontos de razes colonizadas
(pontos de razes colonizadas + pontos de razes no-colonizadas)] * 100

4. Resultados
Tabela 7. Taxa de colonizao micorrzica em plantas.
Planta
A
B
C
D
E

Colonizao micorrzica (%)

43

CAPTULO VII
ACTINOBACTRIAS
Ida Chapaval Pimentel
Jair Alves Dionsio
Diana Signor
Os actinomicetos, atualmente denominados actinobactrias (BRENNER et
al., 2004), so classificados dentro do Filo e da Classe Actinobacteria, que compreende seis ordens, 39 famlias, 139 gneros e centenas de espcies. As actinobactrias
compartilham duas caractersticas: todas so Gram positivas e apresentam alta razo
de G + C (guanina/citosina) em seu DNA, podendo exceder 70 % do total de bases
nucleotdicas, variando de 51 % em Corynebacterias a mais de 70 % em Streptomyces
e Frankias. Podem ser aerbias, microaerfilas ou anaerbias (LACAZ et al., 2002).
Actinobactrias apresentam grande variedade morfolgica, podendo ser
cocoides (Micrococcus) ou cocobacilos (Arthrobacter), outros em forma de hifas curtas
e rudimentares (Nocardia spp.) e, ainda, alguns com miclio ramificado (Streptomyces
spp.) (VENTURA et al., 2007). Tambm, exibem diversas propriedades fisiolgicas
e metablicas, tais como a produo de enzimas extracelulares e a formao de uma
ampla variedade de metablitos secundrios. A maioria dos antibiticos utilizados
atualmente so derivados de produtos naturais de actinobactrias e fungos (RAJU
et al., 2010). Tambm, exibem diversas propriedades fisiolgicas e metablicas, tais
como a produo de enzimas extracelulares e a formao de uma ampla variedade de
metablitos secundrios (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).
As actinobactrias possuem diferentes estilos de vida, assim o Filo inclui
os patgenos humanos (Mycobacterium spp., Nocardia spp., Tropheryma spp., Corynebacterium spp. e Propionibacterium spp.), os habitantes do solo (Streptomyces spp.), os
comensais de plantas (Leifsonia spp.), as fixadoras de nitrognio simbiontes (Frankia)
e as do trato gastrointestinal (Bifidobacterium spp.) (VENTURA et al., 2007).
As actinobactrias produzem elementos filamentosos em forma de miclio, semelhantes a hifas fngicas (SCHLEGEL, 1993). Em algumas espcies, reproduzem-se pela formao de esporos, esporangisporos ou conidisporos. Os
esporos constituem a sua principal forma de multiplicao, so resistentes a dessecaes e podem auxiliar na sobrevivncia das espcies durante a estiagem. Em

44

outros gneros, como o Nocardia, a reproduo ocorre por meio da fragmentao


das hifas em muitas clulas baciliformes e cocoides, cada uma capaz de formar um
novo miclio (VENTURA et al., 2007).
A presena de actinobactrias Streptomyces coelicoler no solo constatada
pelo cheiro de terra molhada, que se deve produo de geosmina, um lcool tercirio
(1,10-dimetil-9-decalol) que se acumula nos poros do solo (SIQUEIRA, 1993). Esse
composto pode representar problemas para a aquicultura, indstria de alimentos,
bebidas e gua potvel, pois o olfato humano pode detect-la mesmo em baixas concentraes (4 a 15 ng L-1) (CHAVEZ et al., 2011).
So predominantemente heterotrficas e utilizam fontes de carbono orgnico, que utilizado desde as molculas mais simples at as mais complexas no
decompostas por fungos e bactrias como: fenis, quitina, parafinas e hmus. So
capazes de decompor matria orgnica em temperaturas mais elevadas, como em
compostagens e esterqueiras, e de degradarem celulose e protenas com pequena
imobilizao de nitrognio (RAMREZ; COHA, 2003). So fracos competidores em
relao s bactrias e fungos, pois estes dois grupos so os primeiros decompositores que atacam com maior rapidez os resduos orgnicos frescos adicionados ao
solo, enquanto as actinobactrias aparecem em segundo plano e atacam os compostos de maior resistncia (CAMPBELL; BIEDERBECK, 1982).
O pH fator determinante para a maioria das espcies, sendo timo entre
6,5 e 8,0 e limitante para a maioria das espcies em 5,5. Valores de pH superiores
a 5,5 favorecem o aparecimento da sarna comum da cultura da batata, importante
doena causada por actinobactrias do solo (13 espcies de Streptomyces). Dentre as
medidas de controle recomendadas para S. scabies, destacam-se: o uso de batatas-sementes sadias, a rotao de culturas com gramneas, a manuteno do pH do
solo abaixo de 5,5 e evitar o dficit hdrico durante a tuberizao (FISCHER, 2007).
Os representantes do gnero Frankia vivem em simbiose com as razes de
plantas superiores de oito famlias pertencentes a sete ordens, envolvendo 24 gneros e 279 espcies, distribudas em todos os continentes (MOREIRA; SIQUEIRA,
2006). A simbiose leva formao de ndulos, no interior dos quais ocorre a fixao
de nitrognio, semelhante fixao que ocorre entre rizbios e leguminosas. As
espcies actinorrizas compreendem desde ervas e arbustos at rvores dos gneros:
Casuarina, Myrica, Alder e Eleagnus, entre outros (AKKERMANS et al., 1992).
Dias-Jnior et al. (1998), avaliando o efeito da contaminao dos rejeitos
de zinco sobre a populao microbiana do solo, observaram que nos tratamentos:

45

a) com cobertura vegetal predominante de Brachiaria decumbens, sobre Latossolo


Vermelho-Amarelo plntico; b) com cobertura vegetal predominante de Andropogon
sp., Trema micrantha e Inga sp. sobre Latossolo Vermelho, as densidades (UFC g-1)
de solo seco, de actinobactrias foram de 37,7 x 104 e 113 x 104, respectivamente.
As actinobactrias so decompositoras de alguns componentes resistentes de tecidos animais e vegetais, contribuem para a formao do hmus, causam
doenas em plantas (Streptomyces scabies) e animais (Nocardia asteroides), fixam N2
e regulam a comunidade microbiana (TSAVKELOVA, 2007), como tambm so indicadoras da qualidade do solo.

46

PROTOCOLO V
CONTAGEM DE ACTINOBACTRIAS PELO MTODO
DE SEMEADURA EM SUPERFCIE
1. Material
a)

Solo mido coletado da camada superficial, obtido conforme o Captulo II


(p. 14);

b)

Vidrarias: Erlenmeyer de 250 mL, tubos de ensaio (16 x 1,5 cm) com rosca,
placas de Petri ( 90 mm), ala de Drigalsky e esferas de vidro ( 2,00 mm);

c)

Equipamentos: agitador de frasco, estufa de esterilizao, estufa de incubao, capela de fluxo laminar, autoclave, banho-maria, peagmetro,
esterilizador infravermelho ou bico de Bunsen ou lamparina e agitador
de tubos; e,

d) Solues: salina esterilizada (NaCl 0,85 %) e meio de cultura casenatodextrose-gar (Tabela 8);
e)

f)

Outros: funil de plstico ( 10,0 cm), micropipeta de volume varivel (10


a 100 L), ponteiras autoclavveis, peneira nmero 10 (abertura de 2,00
mm), parafilm, lixeira para resduos biolgicos, luvas de proteo (nitrlica descartvel) e gs butano; e,
Alternativos: pipetas de 1,0 mL, algodo hidrofbico e pera insufladora.

Tabela 8. Meio de cultura casenato-dextrose-gar (CLARK, 1965).


Reagente

Quantidade (g L-1)

Amido

10,0

Casena

0,3

KNO3

2,0

NaCl

2,0

K2HPO4

2,0

MgSO4.7H2O

0,05

FeSO4.7H2O

0,01

gar
gua destilada q.s.p.
Obs. Ajustar o pH para 6,5 ou 6,6, com HCl diludo, antes da adio do gar.

15,0
1.000,0

47

2. Metodologia
a)

Pesar 10,00 g de solo mido, previamente tamizado, em peneira nmero


10, em duplicata, sendo uma parte destinada contagem de fungos e a
outra para a determinao da massa de solo seco (item 3);

b)

Transferir o solo, com um funil, para um Erlenmeyer de 250 mL contendo


cinco esferas de vidro e 90,0 mL de soluo salina esterilizada (Anexo 1)
(diluio 1:10);

c)

Aquecer, em banho-maria a 50 C, por 15 minutos;

d) Dispersar as unidades formadoras de colnias (UFC) em agitador


mecnico (usar @ 3,4 G) durante 15 minutos e aguardar a precipitao
das partculas maiores;
e)

Com uma micropipeta, contendo ponteira esterilizada, transferir 1,0 mL


da suspenso para um tubo de ensaio contendo 9,0 mL de soluo salina
esterilizada e agitar, no agitador de tubos ou manualmente, cinco vezes
(diluio 1:100);

f)

Transferir com uma micropipeta, contendo outra ponteira esterilizada,


1,0 mL da soluo anterior para outro tubo de ensaio contendo 9,0 mL
de soluo salina esterilizada e agitar manualmente cinco vezes (diluio 1:1.000);

g) Repetir o item e duas vezes consecutivas para atingir as diluies


1:10.000 e 1:100.000;
h) Aps cada transferncia, descartar a ponteira utilizada em um bquer
contendo soluo de detergente (Anexo 1);
i)

Pipetar, com ponteiras diferentes, 0,1 mL das etapas f e g e transferir


para placas de Petri contendo o meio de cultura casenato-dextrose-gar
(Tabela 8);

j)

Espalhar o inculo na superfcie do meio especfico com o auxlio da ala de


Drigalsky, tomando o cuidado de esteriliz-la por flambagem, inserindo-a
em lcool etlico (95 ou 96 GL) e passando-a imediatamente na chama da
lamparina. Repetir o processo, aps o uso em cada placa de Petri;

k) Identificar corretamente as placas de Petri, selar com parafilm e incublas em estufa a 25 C, invertidas, durante uma semana;
l)

Selecionar as placas de Petri com as diluies que contenham entre 20 e


200 (UFC) isoladas; e,

m) Contar as UFC com contador de colnias ou a olho nu.

48

3. Clculo
Realizar o clculo conforme descrito no Captulo III (p. 22).

4. Resultados
Preencher os dados conforme Tabela 4 (p. 22).

49

CAPTULO VIII
MICRO-ORGANISMOS CELULOLTICOS
Ida Chapaval Pimentel
Jair Alves Dionsio
Diana Signor
A celulose o mais abundante composto orgnico presente na natureza,
representando de 15 a 60 % da matria seca dos vegetais incorporados ao solo.
Encontra-se em plantas, sementes, algas, fungos e cistos de protozorios, sendo
o principal componente dos vegetais, constituindo, por exemplo, quase 100 % do
algodo (CARVALHO et al., 2009).
Celulose um carboidrato composto de unidades de anidroglicose unidas
pelas ligaes b 1-4 nos tomos de carbono, com nmero varivel entre 2.000 e
10.000 unidades por molcula e, em alguns casos, atingindo at 15.000 unidades,
em longa cadeia linear no ramificada (CERRI et al., 1993). Possui frmula emprica
(C6H1005)n, com um valor mnimo de n = 200. A estrutura da molcula de celulose
pode ser visualizada na Figura 3:

Fonte: Polymar (2013).

Figura 3. Estrutura qumica da molcula de celulose.

A celulose tem uma estrutura linear ou fibrosa, na qual se estabelecem


mltiplas pontes de hidrognio entre os grupos hidroxilas das distintas cadeias
justapostas de glicose, fazendo-as impenetrveis gua e originando fibras compactas que constituem a parede celular dos vegetais (CERRI et al., 1993). um dos
principais constituintes da parede celular das plantas (cerca de 33,0 % da massa da
planta). Em combinaes com a lignina, a hemicelulose e a pectina no so digeridas pelo homem, constituindo uma fibra diettica (SEABRIGHT, 1995), porm, animais ruminantes, como bovinos, girafas e camelos, podem digerir a celulose com
uma bactria celuloltica do gnero Celulomonas.

50

O contedo de celulose das plantas superiores nunca fixo e a concentrao varia com a idade e a espcie da planta. especialmente abundante em materiais lenhosos, na palha, restolho e folhas.
Grande parte das populaes microbianas heterotrficas do solo representada por bactrias, fungos e actinobactrias, e caracteriza-se pela habilidade de decompor celulose, utilizando-a como fonte de carbono e energia. Esses
micro-organismos constituem um grupo funcional denominado micro-organismos celulolticos.
A degradao da celulose no solo se d pelo complexo enzimtico denominado celulase, produzido por bactrias aerbias e anaerbias, actinobactrias e fungos, sendo estes os principais agentes de degradao (CATELLAN; VIDOR, 1990a).
A celulase uma mistura de enzimas envolvidas na degradao da celulose. Os trs
maiores grupos de celulase que participam da hidrlise so: endoglucanase, hexoglucanase ou cellobiohydrolase e betaglucosidase (SUN; CHANG, 2002).
Em ambiente aerbio, os micro-organismos oxidam a glicose via ciclo
dos cidos tricarboxlicos (CTA) e a decomposio resulta na produo de CO2 e
substncia celular, com a participao de todos, principalmente dos fungos, Aspergillus, Cladosporium, Fusarium, Geotrichun, Myrothecium, Paecolomyces, Penicillium
e Trichoderma (LYND et al., 2002). As principais bactrias aerbias produtoras de
celulase, que desdobram a celulose, so Cellulomonas, Bacillus subtilis, B. polymyxa, B. brevis, B. licheniformis e B. cereus. Entre as actinobactrias, destacam-se as
termoflicas Thermomonospora e Thermoactinomyces e a mesoflica Streptomyces
(SINGH; HAYASHI, 1995).
As actinobactrias so estimuladas somente no final da decomposio
dos resduos orgnicos, por apresentarem desenvolvimento mais lento (MOREIRA;
SIQUEIRA, 2006).
Silva Filho e Vidor (1984) constataram que a maior populao de micro-organismos celulolticos, no Rio Grande do Sul, ocorreu em solos com pastagem
cultivada (103 UFC g-1 de solo), superior ao solo submetido a diferentes sistemas de
manejo convencional, plantio direto, rotao de culturas e campo nativo.
Dionsio (1996), trabalhando em reas de cultivo de Eucaliptus grandis com
calagem, adubao mineral e orgnica, e combinaes das formas de adubao, constatou que as densidades de micro-organismos celulolticos na camada do solo de 0,0
a 5,0 cm foram superiores nos tratamentos que receberam adubao orgnica.

51

PROTOCOLO VI
CONTAGEM DE MICRO-ORGANISMOS
CELULOLTICOS PELO MTODO DE SEMEADURA
EM SUPERFCIE
1. Material
a)

Solo mido coletado da camada superficial, obtido conforme o Captulo II


(p. 14);

b) Vidrarias: Erlenmeyer de 250 mL, tubos de ensaio de 15 mL com rosca,


placas de Petri e ala de Drigalsky;
c)

Equipamentos: agitador mecnico, estufa de esterilizao, estufa de incubao, capela de fluxo laminar, autoclave, peagmetro, esterilizador
infravermelho ou bico de Bunsen ou lamparina e agitador de tubos;

d) Solues: salina esterilizada (NaCl 0,85 %) e meio de cultura celulosegar (Tabela 9);
e)

Outros: funil plstico ( 10,0 cm), micropipetas com ponteiras de 0,1 mL,
peneira nmero 10 (abertura de 2,00 mm), lixeira para resduos biolgicos,
luvas de proteo (nitrlica descartvel), parafilm, pera insufladora e gs
butano; e,

f)

Alternativos: pipetas de 1,0 mL, algodo hidrofbico e pera insufladora.

Tabela 9. Meio de cultura celulose-gar.


Reagente

Quantidade (g L-1)

NaNO3

0,5

K2HPO4

1,0

MgSO4.7H2O

0,5

FeSO4.7H2O

0,01

Celulose*

12,0

gar

15,0

gua destilada q.s.p.


Fonte: Parkinson et al. (1971).
* Carboximetil celulose.

1.000,0

52

2. Metodologia
a)

Pesar 10,00 g de solo mido, obtido conforme o Captulo II (p. 14), previamente tamizado, em peneira nmero 10, em duplicata, sendo uma parte
destinada contagem de micro-organismos celulolticos e a outra para a
determinao da massa de solo seco (item 3);

b) Transferir o solo, com um funil, para um Erlenmeyer de 250 mL contendo 90,0 mL de soluo salina esterilizada (Anexo 1) (diluio 1:10);
c)

Dispersar as unidades formadoras de colnias (UFC) em agitador mecnico (@ 3,4 G) durante 15 minutos e aguardar a precipitao das partculas
maiores;

d)

Com uma micropipeta, contendo ponteira esterilizada, transferir 1,0 mL


da suspenso para um tubo de ensaio contendo 9,0 mL de soluo salina
esterilizada e agitar, no agitador de tubos ou manualmente, cinco vezes
(diluio 1:100);

e)

Transferir com uma micropipeta, contendo outra ponteira esterilizada,


1,0 mL da soluo anterior para outro tubo de ensaio contendo 9,0 mL
de soluo salina esterilizada e agitar manualmente cinco vezes (diluio 1:1.000);

f)

Repetir o item e novamente para atingir a diluio 1:10.000;

g)

Aps cada transferncia, descartar as ponteiras utilizadas em um bquer


contendo soluo de detergente (Anexo 1);

h) Pipetar, com ponteiras diferentes, 0,1 mL das etapas d, e e f e transferir para placas de Petri contendo o meio de cultura celulose-gar;
i)

Espalhar o inculo na superfcie do meio especfico com o auxlio da ala de


Drigalsky, tomando o cuidado de esteriliz-la por flambagem, inserindo-a
em lcool etlico (95 ou 96 GL) e passando-a imediatamente na chama da
lamparina. Repetir o processo, aps o uso em cada placa de Petri;

j)

Identificar corretamente as placas de Petri, selar com parafilm e incublas em estufa a 25 C, invertidas, durante 7 dias;

k)

Aps 7 dias, considerar somente as colnias que formarem, ao seu redor,


um halo transparente, que corresponde celulose degradada;

l)

Selecionar as placas de Petri com as diluies que contenham entre 20 e


200 (UFC) isoladas; e,

m) Contar as UFC com contador de colnias ou a olho nu.

53

3. Clculo
Realizar o clculo conforme descrito no Captulo III (p. 22).

4. Resultados
Preencher os dados conforme Tabela 4 (p. 22).

54

CAPTULO IX
MICRO-ORGANISMOS SOLUBILIZADORES DE
FOSFATO
Ida Chapaval Pimentel
Jair Alves Dionsio
Diana Signor
Entre os elementos essenciais, o fsforo (P) ocupa, aps o nitrognio
(N), posio de destaque em relao composio dos seres vivos, tendo em vista
sua atuao estrutural, funcional e na transferncia de energia. O fsforo ocorre no solo em quantidade total normalmente elevada, porm em baixas quantidades disponveis para as culturas, principalmente nos solos tropicais. Diante
dessas circunstncias, a solubilizao biolgica causada pelos micro-organismos
do solo surge como uma alternativa para elevar a disponibilidade de fsforo nestas regies. Este fato tem despertado a ateno para a utilizao desses micro-organismos como inoculante comercial ou no manejo de suas populaes a fim
de promover uma melhor utilizao do P existente no solo ou daquele adicionado
como fertilizante (SILVA FILHO; VIDOR, 2001).
Os micro-organismos solubilizadores de fosfato, que constituem um grupo funcional, esto presentes na maioria dos solos investigados e o processo de solubilizao que realizam pode ser influenciado pelo tipo de solo, espcie e idade da
planta. Com relao s plantas, h maior quantidade de bactrias solubilizadoras
na rizosfera de leguminosas do que em gramneas (NAHAS et al., 1994). Segundo
Barroti e Nahas (2000), a populao de micro-organismos solubilizadores varia de
105 a 106 clulas g-1 de solo seco em leguminosas forrageiras e de 103 a 106 clulas g-1
em gramneas forrageiras.
Dentre os principais grupos microbianos que apresentam capacidade de
solubilizar fosfato no solo destacam-se vrios gneros de bactrias, como Bacillus,
Thiobacillus, Mycobacterium, Micrococcus entre outros; quanto aos fungos, os gneros Aspergillus, Penicillium, Sclerotium e Rhizopus apresentam atividade solubilizadora; para actinobactrias merece destaque o gnero Streptomyces. De acordo com
Kucey (1983), os fungos so mais eficientes na solubilizao do que as bactrias,
mas estas so mais numerosas podendo atingir densidades populacionais de 105
a 107 por grama de solo.

55

Nahas et al. (1994), estudando micro-organismos solubilizadores de fosfato em diversos solos, avaliaram que o nmero de fungos solubilizadores em termos relativos (30,2 %) foi superior ao de bactrias (16,4 %). No mesmo estudo,
afirmam ainda que os fatores que favorecem o aumento da populao microbiana
do solo tambm estimulam a populao de solubilizadores.
De acordo com Eira (1992), o mecanismo bsico de solubilizao do fosfato se d por trs maneiras distintas: a) cidos minerais fracos (H2CO3), formados
a partir das excrees radiculares e do metabolismo respiratrio dos micro-organismos; b) cidos minerais fortes (HNO2, HNO3, H2SO4), formados pela oxidao
do nitrognio e do enxofre, respectivamente; c) cidos orgnicos (ctrico, oxlico,
glucnico entre outros), formados no metabolismo microbiano ou excretados pelas
plantas superiores.
A mineralizao do fosfato ocorre por ao das enzimas fosfatases, oriundas da atividade de plantas e de micro-organismos, sobre o fsforo orgnico, tambm liberando fosfato disponvel s plantas. Fungos apresentam atividade principalmente da fosfatase cida, enquanto que, em bactrias, predomina a ao da
fosfatase alcalina (EIRA, 1992). Segundo Dionsio (1996), a taxa de solubilizao
maior em solos com mais material energtico, como restos de cultura, disponveis
aos micro-organismos, resultando numa maior produo de cidos orgnicos.
Os elementos C, N, Fe, Ca e K apresentam funes que sugerem as suas
participaes no processo de solubilizao de fosfatos. Oefeito da fonte de N tem
sido relacionado ao balano de ons absorvidos (FERNANDES; SOUZA, 1990; DARRAH, 1993). Demodo geral, a solubilizao aumenta com a absoro de fontes amoniacais e diminui com as ntricas. Redues nos nveis de Fe, Ca e K interferem na
sntese de vrias enzimas e a diminuio destas, provoca acmulo de cidos orgnicos que vo contribuir para a solubilizao do fosfato no solo (SILVA FILHO, 2001).
O manejo agrcola do solo tambm contribui para o tamanho e a atividade da populao microbiana. Todavia, os fatores que regulam a composio da
populao microbiana no so, ainda, plenamente conhecidos, sendo esta uma importante rea a ser explorada pela pesquisa. Mais importante do que o nmero
de solubilizadores a determinao da atividade da populao existente no solo
(SILVA FILHO; VIDOR, 2001).
Silva Filho e Vidor (1984) avaliaram a populao microbiana do solo, na
camada de 0 a 20 cm de profundidade, submetido a diferentes sistemas de manejo, no municpio de Santo ngelo-RS, e observaram que a densidade populacional,

56

UFC g-1 de solo, de solubilizadores de fosfato foi: 13 x 104; 48 x 104 e 53 x 104, respectivamente, solo erodido, plantio convencional e solo em recuperao.
Os micro-organismos solubilizadores de fosfatos inorgnicos representam um grande potencial para a agricultura em clima tropical, porm atualmente
no possvel contar com essa tecnologia.

57

PROTOCOLO VII
CONTAGEM DE MICRO-ORGANISMOS
SOLUBILIZADORES DE FOSFATO PELO MTODO
DE SEMEADURA EM SUPERFCIE
1. Material
a)

Solo mido coletado da camada superficial, obtido conforme o Captulo II


(p. 14);

b) Vidrarias: Erlenmeyer de 250 mL, tubos de ensaio de 15 mL com rosca,


placas de Petri, ala de Drigalsky;
c)

Equipamentos: agitador mecnico, estufa de esterilizao, estufa de incubao, capela de fluxo laminar, autoclave, peagmetro, esterilizador
infravermelho ou bico de Bunsen ou lamparina, agitador de tubos;

d) Solues: salina esterilizada (NaCl 0,85 %), Meio de cultura dextroseextrato de levedura (Tabela 10);
e)

Outros: funil de plstico ( 10 cm), micropipetas com ponteiras de 0,1 mL,


peneira nmero 10 (abertura de 2,00 mm), parafilm, lixeira para resduos
biolgicos, luvas de proteo (nitrlica descartvel); gs butano; e,

f)

Alternativos: pipetas de 1,0 mL, algodo hidrofbico e pera insufladora.

2. Metodologia
a) Pesar 10,00 g de solo mido, obtido conforme o Captulo II (p. 14), previamente tamizado, em peneira nmero 10 em duplicata, sendo uma parte
destinada contagem de micro-organismos solubilizadores de fosfato e a
outra para a determinao da massa de solo seco (item 3);
b) Transferir o solo, com um funil, para um Erlenmeyer de 250,0 mL contendo cinco esferas de vidro e 90,0 mL de soluo salina esterilizada (Anexo 1) (diluio 1:10);
c) Dispersar as unidades formadoras de colnias (UFC) em agitador
mecnico (usar @ 3,4 G) durante 15 minutos e aguardar a precipitao
das partculas maiores;
d)

Com uma micropipeta, contendo ponteira esterilizada, transferir 1,0 mL


da suspenso para um tubo de ensaio contendo 9,0 mL de soluo salina
esterilizada e agitar, no agitador de tubos ou manualmente, cinco vezes
(diluio 1:100);

58

Tabela 10. Meio de cultura dextrose-extrato de levedura.


Reagente

Quantidade (g L-1 ou mL L-1)

Glicose

10,0 g

Extrato de levedura

0,5 g

Soluo MgSO4.7H2O (10 %)

2,0 mL

Soluo CaCl2 (1 %)

2,0 mL

Soluo NaCl (10 %)

1,0 mL

Soluo de micronutrientes

2,0 mL

Fe-EDTA

10,0 mL

KNO3

0,1 g

gar

15,0 g

gua destilada q.s.p.

1.000,0 mL

Fonte: Sylvester-Bradley et al. (1982).


1
Soluo contendo 0,2 g de Na2MoO4.2H2O; 0,235 g de MnSO4.2H2O; 0,28 g de H3BO3; 0,008 g de CuSO4.5H2O e
0,024 g de ZnSO4.7H2O em 200 mL de gua destilada; 2Soluo obtida pela dissoluo de 3,72 g de Na-EDTA e 3,78
g de FeSO4.7H2O em 900 mL de gua destilada aquecida a 80 C at a dissoluo completa, seguida de ajustamento
do volume para 1.000 mL; Obs. Aps a dissoluo dos reagentes e antes da adio do gar, corrigir o pH para 7,0,
com soluo diluda de NaOH (0,1 %). Antes de verter o meio, com temperatura de 45 a 50 C, adicionar 50 mL da
soluo K2HPO4 a 10 % e 100 mL da soluo de CaCl2 a 10 %, esterilizadas separadamente.

e) Transferir com uma micropipeta, contendo outra ponteira esterilizada,


1,0 mL da soluo anterior para outro tubo de ensaio contendo 9,0 mL
de soluo salina esterilizada e agitar manualmente cinco vezes (diluio
1:1.000);
f)

Repetir o item e novamente para atingir a diluio 1:10.000;

g)

Descartar a ponteira utilizada em um bquer contendo gua e detergente, aps cada transferncia;

h) Pipetar, com ponteiras diferentes, 0,1 mL das etapas d, e e f e transferir para placas de Petri contendo o Meio de cultura dextrose-extrato de
levedura. Para cada diluio usar trs repeties. Logo, sero utilizadas
nove placas de Petri para anlise posterior;
i)

Espalhar o inculo na superfcie do meio especfico com o auxlio da ala


de Drigalsky, tomando o cuidado de esteriliz-la por flambagem, inse-

59

rindo-a em lcool etlico (95 ou 96 GL) e passando-a imediatamente na


chama da lamparina. Repetir o processo, aps o uso em cada placa de
Petri;
j)

Identificar corretamente as placas de Petri, selar com parafilm e incub-las


em estufa a 25 C, invertidas, durante uma semana;

k)

Aps 10 a 12 dias, considerar somente as colnias que formarem, ao seu


redor, um halo transparente, que corresponde solubilizao do fosfato;

l)

Selecionar as placas de Petri com as diluies que contenham entre 20 e


200 (UFC) isoladas; e,

m) Contar as UFC com contador de colnias ou a olho nu.

3. Clculo
Realizar o clculo conforme descrito no Captulo III (p. 22).

4. Resultados
Preencher os dados conforme Tabela 4 (p. 22).

60

CAPTULO X
ISOLAMENTO DE RIZBIOS DE RAZES
DE LEGUMINOSAS
Jair Alves Dionsio
Ida Chapaval Pimentel
Diana Signor
O nitrognio um nutriente requerido em grandes quantidades pelas
plantas, representando 78 % da composio da atmosfera, porm encontra-se na
forma elementar (N2), utilizvel apenas por determinadas espcies de micro-organismos procariticos. Para assegurar a utilizao pelos vegetais, necessria que
ocorra a reduo deste elemento para a forma de amnia (NH3), por meio do processo denominado fixao biolgica de nitrognio (FBN).
A FBN, uma reao bioqumica extraordinria que ocorre por ao da enzima nitrogenase, ocorre em micro-organismos diazotrficos e o segundo processo
biolgico mais importante do planeta, perdendo apenas para a fotossntese (SIQUEIRA; FRANCO, 1988). Pode ser realizada de forma simbitica, definida por associaes mutualistas entre micro-organismos fixadores de nitrognio e espcies vegetais,
quanto assimbitica, promovida por micro-organismos fixadores de vida livre.
A quebra da tripla ligao covalente, presente na molcula de N2, demanda grande quantidade de energia e pode ser feita industrialmente ou por micro-organismos diazotrficos. O processo industrial conhecido como reao de Haber-Bosch e utiliza temperaturas que variam de 400 a 600 C e presses superiores a
107 Pascal (de 100 a 200 atm), com utilizao de energia de derivados de petrleo
(HUNGRIA et al., 1994, 2006). A reao industrial representada por:
N2 + 3 H2 2 NH3.
Quando ocorre a FBN (N2 reduzido a NH3), tambm h um grande custo
energtico para o organismo que realiza a fixao. No entanto, devido ao da
nitrogenase, a reao pode ocorrer temperatura e presso atmosfrica ambiente, com consumo de trifosfato de adenosina (ATP) e representada por (HUNGRIA et al., 1994):

61

N2 + 16 ATP + 8 e- + 8H+ 2 NH3 + H2 + 16 ADP + 16 Pi


Os micro-organismos diazotrficos simbiontes com leguminosas pertencem Ordem Proteobacteria, Classe Alphaproteobacteria, Famlia Rhizobiaceae:
Allorhizobium spp., Rhizobium spp., Ensifer spp., Famlia Bradyrhizobiaceae: Bradyrhizobium spp., Famlia Phyllobacteriaceae: Mesorhizobium spp., Famlia Hyphomicrobiaceae: Azorhizobium spp., outros: Burkholderia, Cupriavidus, Devosia, Herbaspirillum, etc. Uma importante diferena entre eles a espcie vegetal com a qual
realizam simbiose. O gnero Rhizobium, por exemplo, associa-se com plantas de
feijo e o Bradyrhizobium com plantas de soja. A simbiose caracteriza-se pela formao de ndulos, diferentemente da galha, causada por nematoides fitoparasitas.
Em algumas culturas como soja, ervilha e trevo, leguminosas forrageiras, arbreas
e adubos verdes, o uso de inoculante comercial substitui a adubao nitrogenada.
O tempo de formao dos ndulos nas leguminosas e o incio da atividade
da nitrogenase so variveis, dependendo das espcies leguminosas e do rizbio.
A nitrogenase sensvel ao oxignio, que pode destru-la ou inativ-la irreversivelmente, sendo assim, cada organismo desenvolveu uma estratgia diferente para
livrar-se do excesso de O2. No caso da simbiose rizbio-leguminosas, a planta induzida a produzir a leghemoglobina, que representa um sistema tampo para o O2,
pois o transporta mantendo concentraes suficientes ao metabolismo aerbio dos
bacteroides e sntese do ATP necessrios fixao, sem prejudicar a nitrogenase
(NEVES; RUMJANECK, 1992).
A eficincia da fixao simbitica do nitrognio pode ser avaliada pelo aspecto do ndulo, levando-se em conta: forma, tamanho, cor interna e a maneira
como eles se distribuem no sistema radicular da planta. Ndulos eficientes so relativamente grandes, pouco numerosos, de superfcie rugosa, presentes na raiz principal e secundrias de primeira ordem e de colorao interna rsea-avermelhada
(KUSDRA, 2002). A soja, quando bem nodulada, apresenta de 15 a 30 ndulos ou
de 100 mg a 200 mg de ndulos secos por planta (HUNGRIA et al., 1994).
De forma resumida, as etapas do processo de formao do ndulo, segundo Freire (1992), podem ser assim compreendidas:
1) Liberao dos flavonoides pelas razes das plantas;
2) Quimiotaxia do rizbio em direo superfcie das razes;
3) Aderncia do rizbio s razes;
4) Encurvamento do pelo radicular e formao da via de infeco;

62

5) Mltipla infeco das clulas do ndulo e crescimento do ndulo;


6) Crescimento do ndulo e diferenciao dos bacteroides; e,
7) Comeo da fixao simbitica.
Diversos fatores podem interferir na FBN, atuando de forma limitante,
reduzindo a eficincia do processo. Dessa forma, segundo Siqueira e Franco (1988),
destacam-se os fatores biticos (gens nif, especificidade hospedeira, capacidade
competitiva), climticos (temperatura, umidade e aerao), a fertilidade do solo
(acidez e nutrientes minerais) e o uso de agrotxicos.
Para que a soja alcance produtividade aproximada de 4.000 kg ha-1 necessrio que seja utilizado um inoculante capaz de fornecer 1.200.000 clulas por
semente, tratadas com fungicidas menos txicos, no seja aplicado nitrognio mineral e os micronutrientes cobalto e molibdnio sejam fornecidos nas doses de 2,0
a 3,0 g ha-1 e de 20,0 a 30,0 g ha-1, respectivamente (EMBRAPA, 2009).

63

PROTOCOLO VIII
ISOLAMENTO DE RIZBIO DE RAZES
DE PLANTAS LEGUMINOSAS
1. Material
a)

Razes de plantas recm-colhidas, com ndulos frescos;

b)

Vidraria: placas de Petri, tubos de ensaio, basto de vidro e lminas;

c) Equipamentos: microscpio fotnico, estufa de esterilizao, estufa de


incubao, capela de fluxo laminar, autoclave, peagmetro, esterilizador
infravermelho ou bico de Bunsen ou lamparina;
d) Solues: meio de cultura extrato de levedura-manitol-gar-YMA (Tabela 11); e,
e)

Outros: bico de Bunsen ou lamparina, gs butano, pina, peneira nmero


10 (abertura de 2,00 mm) p, saco plstico, papel toalha e luva de proteo (nitrlica descartvel).

Tabela 11. Meio de extrato de levedura-manitol-gar-YMA (FRED; WAKSMAN, 1928) com


adio do corante azul de bromotimol1.
Reagente

Quantidade (g L-1)

Manitol

10,0

K2HPO4

0,5

MgSO4.7H2O

0,2

NaCl

0,1

Extrato de levedura

0,5

gar

15,0

gua destilada q.s.p.

1.000,0

Obs.: Ajustar o pH final para 6,8; 1Acrescentar azul de bromotimol (5 mL L-1 de meio de cultura, Anexo 1)

64

2. Metodologia
2.1. Coleta de ndulos
a)

Selecionar a planta leguminosa;

b) Demarcar um crculo ao redor da planta, correspondente rea do sistema radicular;


c) Para leguminosas herbceas como soja, feijo e guandu, recomenda-se
fazer um crculo, em volta da planta, com cerca de 15 cm de raio;
d) Para arbreas, so necessrios dois crculos: um prximo raiz principal
e outro mais distante, que se aproxime das razes secundrias;
e)

Cavar a uma profundidade de 30 cm para plantas herbceas e a uma profundidade maior para arbreas;

f)

Remover a terra cuidadosamente para no danificar o sistema radicular; e,

g)

Retirar o excesso de solo com as mos sobre uma peneira, cuidando para
que os ndulos no se percam.

2.2. Isolamento do rizbio


a)

Colocar as plantas ou razes em sacos plsticos;

b) Levar o material ao laboratrio e lavar com gua da torneira, com cuidado, sobre uma peneira (malha de 2,0 mm), para evitar que as razes e
os ndulos se percam;
c)

Secar as razes com papel toalha e retirar os ndulos, deixando-se 0,5 cm


de raiz para facilitar a manipulao do ndulo e diminuir as chances de
danific-lo durante o isolamento;

d) Na capela de fluxo laminar, os ndulos dessecados devem ser reidratados, ficando de molho em frascos com gua por 30 a 40 minutos;
e)

Imergir os ndulos por um perodo de 5 a 10 segundos em lcool 90-95 %,


para quebrar a tenso superficial e remover bolhas de ar do tecido;

f)

Transferir os ndulos para uma soluo de hipoclorito de sdio ou clcio


a 5,0 % (Anexo 1);

g)

Lavar os ndulos pelo menos cinco vezes em gua destilada e esterilizada;

h)

Aps a ltima lavagem, macerar os ndulos com basto de vidro, aproveitando a gua da ltima lavagem;

65

i)

Riscar o material em placas de Petri contendo meio de extrato de levedura-manitol-gar-YMA;

j)

Incubar a 25-30 C ou na temperatura ideal para a leguminosa da qual o


ndulo foi coletado; e,

k) Verificar diariamente o crescimento das colnias de rizbio.

3. Resultados
Algumas caractersticas morfolgicas e culturais do rizbio em meio de
cultura YMA com azul de bromotimol.

3.1. Caractersticas morfolgicas das clulas de rizbio


(GILLER; WILSON, 1993)
a)

Realizar o teste de Gram, em solubilidade com KOH, para confirmar que os


rizbios so Gram negativos. Realizar observaes ao microscpio fotnico
com aumento de 1.000 vezes, para confirmar que so bastonetes curtos; e,

b)

Confirmar a presena de flagelos conforme WANG et al. (2008):


Polar ou subpolar. Ex.: Bradyrhizobium;
Peritrquios. Ex.: Rhizobium e Azorhizobium.

3.2. Caractersticas dos rizbios relacionadas ao pH


do meio de cultivo YMA com azul de bromotimol
(MARTINS et al., 1997)

Alcalinizao, colorao azul do meio de cultivo e rizbio de crescimento


lento. Ex.: Bradyrhizobium japonicum;

Acidificao, colorao amarela do meio de cultivo e crescimento rpido.


Ex.: Rhizobium tropici; e,

Inalterao, colorao verde do meio de cultivo e crescimento rpido. Ex.:


Albizia lebbeck.

3.3. Caractersticas culturais em meio de cultura YMA


com azul de bromotimol
O rizbio em meio rico de nutrientes no absorve o corante, diferenciando-se dos contaminantes.

66

a)

Tempo de crescimento das colnias incubadas em placas de Petri a 28 C:


Rpidas: at 3 dias;
Intermedirias: at 5 dias;
Moderadas: at 9 dias; e,
Lentas: igual ou superior a 10 dias.

b) Dimetro, aspecto e formato das colnias em meio de cultura YMA com


azul de bromotimol:
Inferior a 1,0 mm: opacas e puntiforme; e,
Superior a 1,0 mm: translcidas com brilho, circulares no incio do
crescimento e irregulares quando mais velhas.
Obs.: Para a confirmao que o isolado rizbio, deve ser realizada a inoculao na leguminosa hospedeira, observando-se a formao de ndulos, ou a
identificao por biologia molecular.

67

CAPTULO XI
INOCULAO DE SEMENTES DE LEGUMINOSAS
Diana Signor
Jair Alves Dionsio
Ida Chapaval Pimentel
Para que uma leguminosa seja cultivada, sem adio de adubo nitrogenado, mineral ou orgnico, preciso que forme uma associao simbitica mutualstica com uma bactria denominada rizbio. Nessa associao, formam-se ndulos nas
razes da planta, que fornece energia na forma de carboidrato para a bactria, que
cede, em troca, nitrognio amoniacal, fixado a partir do N2 atmosfrico.
A maneira mais prtica de transferir rizbio para a semente por meio da
inoculao. Segundo Brasil (2004), inoculante todo material que possui micro-organismos, atua favoravelmente no desenvolvimento das plantas e contm bactrias
vivas, especficas para cada espcie ou grupo de leguminosas.
Os inoculantes brasileiros para leguminosas devem atender s normas
definidas pelo Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento (MAPA), conforme recomenda Embrapa (2011):

A concentrao de clulas deve ser superior a 1 x 109 clulas g-1 ou


mL-1 e devem estar presentes no produto ao menos uma das quatro estirpes recomendadas (Semia 587; Semia 5019, Semia 5079 e
Semia 5080);

A quantidade mnima de inoculante a ser utilizada deve fornecer


1.200.000 clulas/semente;

O volume de inoculante lquido a aplicar no deve ser inferior a


100 mL, sem qualquer diluio em gua, por 50 kg de semente; e,

A base de clculo para o nmero de clulas por semente a concentrao do produto comercial registrada no MAPA impressa na
embalagem do inoculante.

Existem inoculantes comerciais para leguminosas em duas formas fsicas:


slidos (em p, tendo a turfa como suporte para as bactrias), utilizados desde o

68

incio do sculo XX, e fludos (lquidos, com a bactria estabilizada em seus processos metablicos por protetores celulares). No incio dos anos 1990, comearam
a surgir os inoculantes lquidos, que hoje representam a maior parte do mercado
nacional, em funo da facilidade de sua aplicao.
So consagradas as seguintes vantagens do uso de inoculantes:

Melhoria da qualidade do solo;

Evita o uso de adubao nitrogenada;

Proporciona economia aos agricultores;

Aumenta a produtividade da lavoura; e,

No causa prejuzos ao meio ambiente.

A inoculao de sementes de leguminosas feita com o objetivo de estabelecer uma populao vigorosa de rizbios em torno das razes, sendo a inoculao simples e a peletizao os principais mtodos utilizados. A primeira consiste
na aplicao do produto contendo as estirpes do rizbio nas sementes antes da semeadura, sendo utilizado para leguminosas de sementes grandes como soja, feijo
e amendoim, por exemplo, que so semeadas em reas sem problemas de acidez ou
deficincia nutricional e sob condies fsicas favorveis (umidade e temperatura).
A segunda utilizada principalmente com sementes de leguminosas forrageiras de
tamanho pequeno (trevos, alfafa e estilosantes, por exemplo), semeadas a lano; nelas o rizbio pode encontrar no solo condies adversas que afetem sua sobrevivncia, tais como baixa umidade, altas temperaturas, pH cido e deficincia nutricional.
A peletizao consiste em revestir sementes com material seco, inerte e
de gro fino, como o carbonato de clcio ou o fosfato de rocha, formando uma capa
protetora. Esta estrutura protege o inoculante durante a fase que antecede a emisso de razes, transporta nutrientes e possibilita que as sementes inoculadas sejam
misturadas ao adubo. Alm disso, permite a incorporao de inseticidas, fungicidas, fertilizantes e reguladores de crescimento (VIDOR et al., 1983).
A inoculao pode ser realizada nas sementes, com inoculante lquido ou
turfoso, ou no solo. Nas sementes, realiza-se preferencialmente, em mquinas prprias, mquina de tratamento de sementes, betoneira ou tambor com eixo excntrico, para garantir a maior aderncia do inoculante semente (EMBRAPA, 2011).
Para que a inoculao das sementes de leguminosas tenha sucesso, algumas medidas devem ser adotadas, dentre as quais destaca-se a aplicao de micro-

69

nutrientes e o uso de fungicidas. Para a cultura da soja, recomenda-se de 2,0 a 3,0 g ha-1
de cobalto e de 12,0 a 30,0 g ha-1 de molibdnio via semente ou em pulverizao
foliar, nos estdios de desenvolvimento V3 (3 interndio) a V5 (5 interndio)
(EMBRAPA, 2013).
Para minimizar o efeito de doenas do solo e outras transmitidas pelas
sementes, necessrio, na maioria das vezes, utilizar fungicidas. Porm, muitos
apresentam toxicidade ao rizbio, causando expressiva mortalidade. Como alternativa menos prejudicial ao rizbio, so recomendadas pela Embrapa (2013) as
seguintes misturas:

Carboxin + Thiram;

Difenoconazole + Thiram;

Carbendazin + Captan;

Thiabendazole + Tolylfluanid; e,

Carbendazin + Thiram.

Alguns cuidados devem ser adotados para se obter sucesso na inoculao:


Certificar-se de que o inoculante tenha sido guardado em geladeira


at a sua utilizao;

Utilizar somente inoculantes dentro do prazo de validade;

Abrir os pacotes somente quando for realizar a inoculao das


sementes;

Espalhar bem e rapidamente as sementes aps a inoculao; e,

As sementes aps inoculadas devem ser preservadas do sol e das


altas temperaturas, cobrindo-as com solo imediatamente aps a
semeadura.

70

PROTOCOLO IX
INOCULAO DE SEMENTES DE LEGUMINOSAS
1. Material
a) Sementes de soja e trevo;
b)

Inoculante turfoso e lquido;

c)

Solues: goma caseira 7,0 % (adesivo) e sacarose (10,0 %); e,

d) Outros: bandejas, sacos plsticos, calcrio ou fosfato de rocha, esptula,


luva de proteo (nitrlica descartvel) e lixeira para resduos biolgicos.

2. Metodologia
2.1. Inoculao Simples Inoculante turfoso
a)

Misturar separadamente a soluo de sacarose a 10,0 % (Anexo 1) ao inoculante em um bquer de 500 mL;

b) Adicionar esta pasta s sementes, misturando-as em betoneira ou tambor com eixo excntrico, at que apresentem uma camada de revestimento uniforme do inoculante envolvendo-as;
c)

Espalhar as sementes e deix-las secando em local sombreado, fresco e


arejado; e,

d) Semear imediatamente em vasos ou no campo.

2.2. Inoculao Simples Inoculante lquido


a) Verificar a quantidade de calda (inoculante + gua)/50 kg de semente, de
acordo com as recomendaes do fabricante;
b) Misturar a calda com as sementes utilizando betoneira ou tambor com
eixo excntrico;
c)

Espalhar as sementes e deix-las secando em local sombreado, fresco e


arejado; e,

d) Semear em vasos ou no campo.

2.3. Peletizao de sementes


a)

Misturar o adesivo com o inoculante, respeitando as propores em funo da quantidade de semente a ser inoculada (Tabela 12 );

71

b)

Acrescentar a mistura (adesivo + inoculante) s sementes e revolver com


uma esptula, at que todas as sementes do lote estejam umedecidas;

c)

Acrescentar a substncia veculo em p (calcrio ou fosfato de rocha);

d) Aguardar entre 12 e 24 h, temperatura ambiente, na sombra, para firmar o pellet (camada); e,


e)

Semear em vasos ou no campo.

Tabela 12. Quantidades de material utilizado em funo do tamanho das sementes de leguminosas a serem peletizadas (FARIA et al., 1984 citado por DE-POLLI, 1985).
Materiais utilizados na inoculao e no revestimento de sementes
Goma arbica
40 % ou goma
caseira 7 % (mL)

Inoculante (g)

Semente (kg)

Calcrio ou
calcrio +
micronutrientes
(1:1) (kg)

Sementes
grandes:
soja, feijo,
fava, caupi,
amendoim,
guandu, leucena,
ervilha, etc.

500

100

25

Sementes
mdias:
calopognio,
siratro, soja
perene,
centrosema, etc.

500

100

10

08

Sementes
pequenas:
estilosantes,
lotononis,
desmodium, etc.

500

100

10

Leguminosa

72

CAPTULO XII
RESPIRAO MICROBIANA
Jair Alves Dionsio
Ida Chapaval Pimentel
Diana Signor
A respirao microbiana (absoro de O2 e/ou liberao de CO2), resultante da atividade exclusiva das bactrias, fungos, algas e protozorios do solo e
incluem as trocas gasosas provenientes dos metabolismos aerbio e anaerbio (ANDERSON, 1982). O procedimento realizado em laboratrio, sob temperatura e
umidade controladas. J o termo respirao do solo resulta de toda atividade metablica dos organismos do solo (micro e macro-organismos e razes de plantas).
O mtodo de estudo utiliza a insero de cmaras (respirmetros) na superfcie do
solo para quantificar a liberao de CO2.
A respirao microbiana corresponde oxidao da matria orgnica por
organismos do solo que, portanto, utilizam o O2 como aceptor final de eltrons, at
CO2 (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006). Assim, essa microbiota a principal responsvel pela decomposio dos resduos orgnicos, pela ciclagem de nutrientes e pelo
fluxo de energia no interior do solo, exercendo influncia tanto na transformao
da matria orgnica, quanto na estocagem do carbono e nutrientes minerais, com
consequente liberao de CO2 para a atmosfera (JENKINSON; LADD, 1981).
Para se estimar as respiraes microbiana ou do solo diversos mtodos podem ser utilizados, baseando-se no consumo de O2 ou na liberao de CO2.
Para o consumo de O2, utiliza-se a cromatografia gasosa ou o eletrorespirmetro.
Para a liberao de CO2, utiliza-se a titulao (quando este gs capturado por
NaOH ou KOH), condutividade eltrica, cromatografia gasosa, espectroscopia de
infravermelho (IRGA) ou por 14C, neste caso quando se deseja monitorar compostos orgnicos especficos.
A vantagem de se medir o CO2 ao invs do O2 est no fato deste refletir
a atividade de micro-organismos aerbios e anaerbios (RODRIGUES; DE-POLLI,
2000), pois no solo, em ambiente aerbio, pode haver stios de anaerobiose.
Segundo Grisi (1995), o estudo da respirao do solo ou da respirao
microbiana pode ser realizado em dois sistemas:

73

1) Esttico: com a utilizao de cmaras de incubao, sem aerao; e,


2) Dinmico: com aerao constante em cmara de medio.
A respirao microbiana do solo um dos mais antigos parmetros para
quantificar a atividade microbiana (ALEF, 1995) tambm conhecida como respirao basal (RBS), ou seja, aquela atividade microbiana que o solo apresenta em funo
do seu prprio teor de matria orgnica. Alm disso, possvel avaliar, no solo, a respirao induzida (RIS) por um substrato, na qual se adiciona uma fonte especfica de
substrato orgnico, como a glicose, por exemplo.
A atividade dos micro-organismos no solo pode ser estimada em termos metablicos, por indicadores como CO2 evoludo, O2 absorvido, degradao
de substratos, transformaes de nutrientes e formao de metablicos (WAID,
1984). De acordo com Moreira e Siqueira (2006), a respirao microbiana do solo
est diretamente relacionada decomposio da matria orgnica no solo e
mineralizao do hmus, sendo capaz de fornecer uma indicao aproximada do
metabolismo total do solo. Alm disso, conhecida como a forma mais precisa
na determinao da atividade microbiana, refletindo diretamente a atividade de
micro-organismos heterotrficos do solo, os quais so importantes no processo
de ciclagem de nutrientes, o que afeta diretamente a fertilidade e a qualidade do
ambiente (ANDRA; PETTINELLI, 2000).
A velocidade de decomposio do resduo orgnico no solo determinada principalmente pelas caractersticas intrnsecas desse material, tais como:
relao C/N; teor de carboidrato e lignina; grau de agregao; caractersticas do
solo (pH, teor de nutriente e umidade, etc.) e do ambiente (temperatura e precipitao), ambos diretamente proporcionais atividade microbiana no solo (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).
Os micro-organismos so os principais transformadores da matria orgnica, realizam a decomposio de resduos orgnicos e utilizam os elementos carbono e nitrognio na proporo de 30/1, eliminando dois teros do carbono para
a atmosfera na forma de CO2 e imobilizando, no seu protoplasma, um tero com
relao C/N 10/1 (SIQUEIRA, 1993).
Quando a relao C/N do material orgnico em decomposio for baixa (inferior a 30/1), como em leguminosas at o perodo da florao, ocorre rpida decomposio com liberao do NH4+. Em caso de materiais com relao C/N alta (superior

74

a 30/1), poder ocorrer imobilizao temporria do N mineral pelos micro-organismos do solo, o que pode induzir a uma deficincia temporria de N para as plantas.
A estimativa das respiraes, microbiana ou do solo, por meio da liberao de CO2, uma das mais eficientes ferramentas para se avaliar a recuperao de
reas degradadas, pelo baixo custo, eficincia e indicar mudanas rpidas (PASSIANOTO et al., 2001).
Catellan e Vidor (1990b), trabalhando com diferentes sistemas de culturas, entre eles siratro, campo nativo e solo descoberto, encontraram os seguintes
valores de respirao microbiana, respectivamente: 92,3; 207,0 e 57,8 mg C-CO2
kg-1 de solo, mdia de 12 coletas, na camada de 0 a 5 cm, durante dez dias de incubao. Os resultados permitem concluir que os sistemas com cobertura vegetal e
efeito rizosfrico tendem a apresentar maiores valores de respirao basal, se comparados com solos sem cobertura vegetal.

75

PROTOCOLO X
RESPIRAO BASAL DO SOLO EM SISTEMA
ESTTICO, MTODO DE ALEF (1995)
1. Material
a)

Solo mido coletado da camada superficial, obtido conforme o Captulo II


(p. 14);

b)

Vidraria: bureta automtica de 10,0 mL, frascos de vidro escuros de 1,0 L


com tampa, tubos de ensaio de 15,0 mL e Erlenmeyer de 125,0 mL;

c)

Equipamentos: estufa de incubao, balana de preciso centesimal, geladeira e agitador magntico;

d) Solues: fenolftalena (0,1 %), HCl 0,5 N, BaCl2 (50 %) e NaOH 0,5N;
e) Outros: micropipetas com ponteiras de 1,0 mL e 10,0 mL, trado calador, peneiras nmero 10 (abertura de 2,00 mm) e nmero 20 (abertura
de 0,85 mm), luvas de proteo (nitrlica descartvel), pera insufladora,
balde plstico de 5,0 L ou 8,0 L, esptula, substratos orgnicos: aveia,
milho, soja, alfafa, hmus, serragem, celulose, esterco bovino; e,
f)

Alternativos: pipetas de 1,0 mL e 10,0 mL.

2. Metodologia
2.1. Respirao basal do solo (RBS)
a) Pesar 10,00 g de solo mido para determinar a massa de solo seco (item 3);
b)

Determinar a capacidade de reteno de gua (CRA) e corrigir a umidade


para 60,0 % da CRA, com gua destilada (Anexo 3);

c)

Pesar 100,00 g de solo mido, previamente tamizado, em peneira nmero 10 (abertura de 2,00 mm), em triplicata, e transferir para um frasco de
vidro com tampa hermtica;

d) Colocar dentro do frasco de vidro um tubo de ensaio contendo 15,0 mL


de NaOH 0,5 N padronizado (Anexos 1 e 4) para capturar o CO2 produzido e outro tubo de ensaio contendo 10,0 mL de gua destilada para
manter a umidade do ambiente;
e)

Para cada dez frascos de vidro a serem incubados, realizar uma prova em
branco, que corresponde a um frasco contendo apenas um tubo de ensaio
com 15 mL de NaOH 0,5 N padronizado (Anexos 1 e 4) e outro contendo
10,0 mL de gua destilada;

76

f)

Fechar hermeticamente os frascos de vidro e incub-los em estufa a 25 C


por uma semana (168 h);

g) Aps o perodo de incubao, retirar dos frascos de vidro os tubos de


ensaio contendo NaOH e transferir a soluo para um Erlenmeyer de
125,0 mL, adicionar 1,0 mL de BaCl2 (50 %) (Anexo 1) e duas gotas de
fenolftalena (Anexo 1); e,
h)

Aps a padronizao (Anexo 4), titular o excesso de NaOH com HCl 0,5 N
(Anexo 1).

2.2. Respirao induzida pelo substrato (RIS)


Para determinar a RIS, o procedimento o mesmo utilizado para a RBS,
porm, adicionam-se ao solo, individualmente, substratos orgnicos em propores conhecidas e homogeneza-se com uma esptula. Os substratos so previamente secados em estufa a 60 C, modos e tamisados em peneira nmero 20
(abertura de 0,85 mm).

2.3. Sugestes de tratamentos


a)

Solo Testemunha (ST) = RB;

b)

Solo Testemunha + 1,0 % de palha de aveia (ST + PAV) = RIS;

c)

Solo Testemunha + 1,0 % de palha de milho (ST + PMI) = RIS;

d) Solo Testemunha + 1,0 % de palha de alfafa (ST + PAL) = RIS;


e)

Solo Testemunha + 1,0 % de palha de soja (ST + PSO) = RIS;

f)

Solo Testemunha + 1,0 % de p de serragem (ST + PSE) = RIS;

g)

Solo Testemunha + 1,0 % de celulose (ST + CE) = RIS;

h) Solo Testemunha + 1,0 % de esterco bovino (ST + EB) = RIS; e,


i)

Solo Testemunha + 1,0 % de hmus (ST + HU) = RIS.

3. Clculo
1. Calcular a respirao basal do solo (RBS) de acordo com Stotzky (1965):
RBS ou RIS C-CO2 mg kg-1 h-1 = {[(b-a) x N x E x 1.000]/g*}/h
*Obtido aps a secagem do solo mido em estufa (105 C) at massa constante.

77

Onde:
b: Volume de HCl gasto na prova em branco;
a: Volume de HCl gasto na amostra;
E: Equivalente do carbono;
N: Normalidade do HCl;
g: massa de solo seco; e,
h: horas de incubao.

4. Resultados
Tabela 13. Respirao microbiana do solo (mg C-CO2 kg-1 h-1) acumulada em funo da adio de resduos orgnicos.
Tratamento
1. Solo testemunha (ST)
2. ST + palha de aveia
3. ST + palha de milho
4. ST + palha de alfafa
5. ST + palha de soja
6. ST + p de serragem
7. ST + celulose
8. ST + esterco bovino
9. ST + hmus de minhoca

Repeties
I

II

III

IV

Mdia

78

CAPTULO XIII
BIOMASSA MICROBIANA
Jair Alves Dionsio
Ida Chapaval Pimentel
Diana Signor
A biomassa microbiana do solo (BMS), tambm conhecida como carbono
da biomassa microbiana (C-BMS), definida como a parte viva da matria orgnica
do solo e inclui bactrias, fungos, actinobactrias, algas e microfauna, excluindo-se
as razes e os animais maiores que 5 x 10 mm3, sendo considerada o compartimento
central do ciclo do carbono (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006). Esse reservatrio contm, em mdia, de 2,0 a 5,0 % do C orgnico do solo (JENKINSON; LADD, 1981) e
de 1,0 a 5,0 % do N total do solo (SMITH; PAUL, 1990).
O estudo do C-BMS foi apresentado inicialmente por Jenkinson e Powlson
(1976) e tem crescido nos ltimos anos. De acordo com Siqueira e Franco (1988), a
sua importncia se justifica por trs aspectos:
1) formada por clulas vegetativas vivas, capazes de promover mudanas
importantes no solo;
2) Devido grande quantidade e ao fato de ser o maior componente lbil
da matria orgnica do solo, torna-se um importante reservatrio de
nutrientes; e,
3) Representa um indicador de grande sensibilidade para avaliar mudanas
no solo.
Dessa forma, o C-BMS pode ser utilizado como indicador de qualidade
do solo, pois grandemente influenciado pelo manejo, considerando que qualquer
estresse no sistema afetar a densidade, a diversidade e a atividade das populaes
microbianas (PANKHURST et al., 1995). Assim, o monitoramento dos nveis do
C-BMS uma medida adequada para se determinar se um conjunto de prticas
sustentvel (TTOLOA; CHAER, 2002).
Conforme Rodrigues (1997), os valores do C-BMS indicam o potencial de
reserva de carbono no solo, que participa do processo de humificao. Portanto,

79

permite aferir o acmulo ou a perda de carbono em funo de determinado manejo:


quanto maior a biomassa microbiana, maior ser a reserva de carbono no solo, o
que expressa menor potencial de decomposio da matria orgnica.
O interesse em estimar a biomassa microbiana tem sido crescente, principalmente, pelo fato de que por meio dela podem-se avaliar modificaes no solo
muito antes de ser possvel detectar alteraes fsico-qumicas (POWLSON, 1987).
Alm disso, mudanas na biomassa microbiana podem indicar os efeitos dos xenobiticos no solo (ANDRA; PETTINELLI-JNIOR, 2000).
A quantidade mdia de nitrognio (N), fsforo (P), potssio (K) e clcio
(Ca) armazenada nas clulas vegetativas dos micro-organismos alcanam valores
de 108, 83, 70 e 11 kg ha-1, respectivamente (ANDERSON; DOMSCH, 1980). A
liberao do N proveniente das clulas microbianas mortas por secamento/reumidecimento do solo cinco vezes mais rpida do que a liberao provinda da matria
orgnica do solo (ANDERSON; DOMSCH, 1980). Considerando que a BMS um
reservatrio de nutrientes, nesta podero ser determinados: nitrognio (N-BMS),
fsforo (P-BMS), potssio (K-BMS), entre outros.
As populaes microbianas contribuem de maneira diferenciada para a formao do C-BMS. Conforme Coleman (1994), os fungos, as bactrias e a microfauna
podem atingir, respectivamente, os seguintes valores: de 700 a 2.700 kg ha-1; de 500
a 750 kg ha-1 e de 25 a 30 kg ha-1 de C-BMS. Apesar de apresentarem maior densidade
no solo, as bactrias tm contribuio menor, devido ao seu tamanho reduzido.
O C-BMS pode ser estimado de forma direta por microscopia dos componentes celulares (bactrias e fungos). De forma indireta, pode ser estimada pelos
seguintes mtodos:

Fumigao-Incubao (FI) (JENKINSON; POWLSON, 1976);

Respirao Induzida pelo Substrato (RIS) (ANDERSON; DOMSCH,


1978);

Fumigao-Extrao (FE) (VANCE et al., 1987); e,

Irradiao-Extrao (IE) (ISLAM; WEIL, 1998).

A FI e a FE so as mais utilizadas (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006). Mas,


deve-se destacar que ambas utilizam o clorofrmio e a IE, o cromo, que so reagentes qumicos com potencial carcinognico (BRASIL, 2005).

80

Utilizando-se o mtodo de FI, Catellan e Vidor (1990b) observaram na


camada de 0 a 5 cm, mdia de doze coletas mensais, valores de C-BMS/100 g de
solo 32,0; 40,7; 61,5 mg, respectivamente, para pangola, siratro e campo nativo.
Rodrigues et al. (1995), trabalhando com trs classes de solo: Podzlico Vermelho-Amarelo, Gley pouco hmico e Planossolo arenoso, com amostragens em duas profundidades (0 a 5 cm e 5 a 20 cm) observaram valores de C-BMS de 8 a 229 mg g-1 de
solo e de 63 a 269 mg g-1 de solo, respectivamente, pelos mtodos FI e FE.
A partir dos valores de respirao microbiana do solo, biomassa microbiana
e carbono orgnico total do solo (COT) possvel obter os seguintes ndices ecolgicos:
1) Quociente metablico (qCO2), que representa a quantidade de C-CO2
evoludo por unidade de C microbiano (g h-1 de C-CO2/mg g-1 de C-biomassa microbiana do solo); e,
2) Quociente microbiano (qMIC), que a relao C-BMS/COT.
O qCO2 prediz que a biomassa microbiana se torna mais eficiente a partir
do momento que menos carbono perdido na forma de CO2 pela respirao, possibilitando assim, maior incorporao de carbono aos tecidos microbianos.
Segundo Ttola e Chaer (2002), valores mais elevados de qCO2 indicam
maior consumo de carbono prontamente mineralizvel, elevando as perdas de CO2,
o que no desejado.

81

PROTOCOLO XI
MTODO DE RESPIRAO INDUZIDA (RIS) PELO
SUBSTRATO (ANDERSON; DOMSCH, 1978 DESCRITO
POR HOPPER, 2006)
1. Material
a) Solo mido coletado da camada superficial, conforme o Capitulo II, glicose anidra;
b) Vidraria: pipetas de 10 mL, bureta automtica de 10,0 mL, frascos de
vidro escuros (1.000 mL) com tampa, tubos de ensaio de 15,0 mL, Erlenmeyer de 125 mL e dessecador;
c)

Equipamentos: estufa de incubao, balana de preciso centesimal, geladeira e agitador magntico;

d)

Outros: peneira de nmero 10 (abertura de 2,00 mm), luva de proteo e


papel toalha;

e)

Solues: BaCl2 50 %, fenolftalena (0,1 %), NaOH 0,1 N e HCl 0,1 N; e,

f)

Alternativos: pipetas de 1,0 mL, algodo hidrofbico e pera insufladora.

2. Metodologia
Esse mtodo, proposto por Anderson e Domsch (1978), baseado no aumento inicial da taxa de respirao da populao microbiana, at o mximo, quando
uma fonte de carbono, prontamente decomponvel, adicionada em excesso ao solo.
a) Pesar 10,0 g de solo mido, em duplicata, para determinar a massa de
solo seco (item 3);
b) Determinar a capacidade de reteno de gua (CRA) e a partir desse
valor calcular a quantidade de gua necessria para atingir 60 % da CRA
(Anexo 3);
c)

Pesar 20,0 g de solo seco e transferi-lo para frascos de vidro (250 mL)
com, no mnimo, trs repeties;

d) Acrescentar 60 mg de glicose anidra diluda em gua destilada, calculada


de acordo com o item b;

82

e)

Homogeneizar o solo e a glicose com um basto de vidro, fechar hermeticamente e pr-incubar em estufa a 22 C por 2 h;

f)

Colocar no frasco de vidro um tubo de ensaio contendo 10 mL de NaOH


0,1N (Anexo 1) e incubar em estufa a 22 C por 4 h;

g) Realizar a prova em branco, utilizando um frasco de vidro de 250 mL,


contendo apenas um tubo de ensaio com 10,0 mL de NaOH 0,1N;
h) Transferir o NaOH 0,1 N do tubo de ensaio para um Erlenmeyer de
125 mL;
i)

Adicionar 0,5 mL de BaCl2 50,0 % (Anexo 1) e duas gotas de fenolftalena


0,1 % (Anexo 1); e,

j)

Titular com HCl 0,025 N (Anexo 1) e anotar a quantidade de cido consumida.

3. Clculo
Calcular a biomassa microbiana do solo conforme Anderson e Domsch
(1978) descrito por Hoper (2006).
BMS (g C g-1) = 30(b-a)x{(Kx22x1.000)/(1,8295 x PAx4)}
Onde:
BMS: carbono da biomassa microbiana (g C g-1);
30: constante (mg Cmic h mL CO2-1);
b: mdia do volume (mL) de HCl gasto para titular as provas em branco;

a: mL HCl gastos para titular as amostras;


K: concentrao da soluo de HCl;
22: fator de converso (1,0 mL HCl 1,0 M corresponde a 22,0 mg de CO2);
1.000: fator de converso de kg de solo para g de solo;
1,8295: densidade do CO2 a 22 C;
PA: massa da amostra (g de solo seco); e,
4: fator de converso para transformao de 4 para 1 h.

83

4. Resultados
Tabela 14. Carbono da biomassa microbiana do solo (g C g-1) em diferentes solos.
Solo

Repeties
I

II

III

IV

Mdia

A
B
C
D
E

Tabela 15. Quociente metablico (RBS C-BMS-1) em diferentes solos.


Solo

Repeties
I

II

III

IV

Mdia

A
B
C
D
E

Tabela 16. Quociente microbiano do solo (C-BMS COT-1*) em diferentes solos.


Solo

Repeties
I

A
B
C
D
E
*COT: carbono orgnico total do solo.

II

III

IV

Mdia

84

CAPTULO XIV
DECOMPOSIO DE RESDUOS ORGNICOS
Diana Signor
Jair Alves Dionsio
O termo decomposio utilizado para descrever um grande nmero de
processos inter-relacionados nos quais a matria orgnica desintegrada em partculas menores e formas solveis de nutrientes, que so absorvidos pelas plantas,
formando o hmus.
O estudo da produo e decomposio da serapilheira, com a consequente
transferncia de nutrientes para o ambiente, essencial para caracterizar os padres de ciclagem, pois representa a principal via de retorno desses e da matria
orgnica superfcie do solo (AIDAR et al., 2003).
Resduos vegetais sob a superfcie do solo ou incorporados a ele, em condies aerbias, sofrem rpido ataque de micro-organismos heterotrficos em busca de carbono, energia e nutrientes, sendo os fungos e as bactrias os seres mais
ativos na decomposio da matria orgnica do solo.
A decomposio, usualmente, no contnua, apresentando fases ativas e
perodos de inibio, intercalados. Assim, os nutrientes minerais so liberados pela
desintegrao fsica dos tecidos e aumento da rea superficial pela ao da fauna
edfica, para:

Posterior ao por bactrias e fungos;

Decomposio seletiva de materiais (acares, celulose e lignina);

Transformao dos resduos vegetais em material hmico;

Mistura da matria orgnica decomposta camada superior do


solo; e,

Formao de complexos agregados entre a matria orgnica e a frao mineral do solo.

A maioria dos fatores ambientais que interferem na decomposio de resduos orgnicos est relacionada atividade dos micro-organismos decompositores. So eles:

85

Temperatura;

Umidade;

Teor de matria orgnica do solo;

Localizao e quantidade de material adicionado;

pH;

Concentrao de O2 livre no solo; e,

Presena de adubos verdes, fertilizantes, araes, gradagens, manejo do solo e uso de herbicidas.

Tambm exercem influncia na decomposio do resduo, as caractersticas intrnsecas do material, tais como (CERETTA et al., 2002):

Carbono/nitrognio (C/N);

Carbono/fsforo (C/P);

Nitrognio/fsforo;

Lignina; e,

Polifenis.

O grau de maturao das plantas tambm regula a permanncia dos resduos no solo, j que o aumento na relao C/N dificulta a sua decomposio.
A estimativa do tempo necessrio para a quase completa decomposio
dos resduos vegetais importante. A permanncia da palha na superfcie do solo
de fundamental importncia para a manuteno do sistema plantio direto. Isso
refora a preocupao de produzir resduos vegetais de decomposio mais lenta,
para manter o resduo sobre o solo por maior perodo de tempo (KLIEMANN et al.,
2006). Deve-se, pois, planejar rotaes de culturas mais adequadas e compatveis
com os sistemas de manejo conservacionistas do solo, ou seja, planejar e adotar, de
acordo com as possibilidades, rotaes de culturas cujos resduos persistam o maior
tempo possvel (BERTOL et al., 2004).
Kliemann et al. (2006) estabeleceram a hierarquia de decomposio para
algumas espcies vegetais em ordem decrescente de decomposio: gramneas
sorgo (80 %) > capim Mombaa (64 %) > milheto (58 %) > braquiria em cultivo solteiro (56 %) e em cultivo consorciado (48 %); e leguminosas estilosantes (72 %) >
guandu (65 %).

86

A velocidade de liberao de nutrientes dos resduos culturais durante o


processo de decomposio depende da localizao e da forma em que se encontram
no tecido vegetal.
Em geral, os estudos de decomposio so feitos em laboratrio pela incubao do material vegetal com solo ou em condies de campo. A taxa de decomposio estimada pela perda de massa, de carbono na forma de CO2, ou com o uso
de carbono e nitrognio marcados.
Em sistemas terrestres, a decomposio estudada pelo mtodo de litter
bags (sacolas de decomposio). A tcnica a mais utilizada atualmente e consiste
em acondicionar massa vegetal conhecida, ou quimicamente conhecida, em recipientes fechados. Um grande nmero de sacolas colocado no campo e, temporariamente, um grupo retirado para analisar a perda de massa ou a mudana na composio qumica do litter. Todavia, esse mtodo pode induzir a vrios erros, tais como,
excluir certos organismos, causar modificao no microclima dentro das bolsas,
diferindo do ambiente natural, afetando as taxas de decomposio (COLLEMAN;
CROSSLEY, 1996). O mtodo ainda suscetvel a grandes erros, devido perda de
fragmentos e entrada de materiais exgenos na sacola (EDWARDS, 1977).
Scheer (2008) estudando a decomposio e a liberao de nutrientes da
serapilheira foliar em um trecho de floresta ombrfila densa aluvial em regenerao, em Guaraqueaba PR, pelo mtodo de litter bags, estimou tempo mdio de
um ano, para que pelo menos a metade do material foliar depositado no solo da
capoeira fosse decomposto. O autor ressalta que o tempo foi inferior ao obtido para
florestas tropicais, mas similar a outros estudos realizados na Floresta Atlntica.

87

PROTOCOLO XII
DETERMINAO DA TAXA DE DECOMPOSIO DE
RESDUOS ORGNICOS
1. Material
a) Equipamentos: estufa e balana de preciso centesimal; e,
b)

Outros: serapilheira de diferentes reas, sacola plstica para coleta, sacolas de nilon (malhas de 0,2; 0,5; 1,0 e 2,0 mm), p de corte, bquer de
200 mL, pina, pincel fino e luva de proteo (nitrlica descartvel).

2. Metodologia
a)

Coletar, em sacola plstica, aproximadamente 500 g serapilheira de diferentes reas;

b)

Determinar a umidade da serapilheira em estufa a 65 C por 48 h;

c)

Calcular fator de correo para umidade do item anterior (massa mida


massa seca-1);

d) Colocar 10 g de serapilheira de cada amostra em sacolas de nilon (15 x


10 cm) com diferentes espessuras (malhas de 0,2; 0,5; 1,0 e 2,0 mm), para
evidenciar a ao dos diferentes componentes da fauna edfica em funo
do dimetro do corpo dos animais;
e)

Fazer, no mnimo, cinco repeties para cada amostra analisada;

f)

Identificar devidamente as sacolas de nilon e distribu-las na superfcie


do solo;

g) Aps perodos variveis de tempo (30, 60 e 90 dias), recolher as sacolas


de nilon, tomando cuidado para no danificar o material;
h) Levar as sacolas para laboratrio, retirar cuidadosamente, com um pincel
fino, o solo que ficou aderido s partculas da serapilheira de diferentes
reas; e,
i)

Colocar a serapilheira em bquer de 200 mL e secar em estufa a 65 C por


48 h e pesar.

3. Clculo
a)

Fitomassa remanescente (%) = (massa seca final/massa seca inicial) x 100; e,

88

b)

Calcular a constante de decomposio K ao longo do perodo de avaliao


(OLSON, 1963):
Wt = WO-ekt

Onde:
Wt: fitomassa remanescente (%);
WO: massa inicial do material (utilizado sempre como 100 %);
e: exponencial;
k: taxa de decomposio; e,
t: tempo em que o material ficou no campo (dias).

4. Resultados
Tabela 17. Porcentagem de biomassa residual com diversas coberturas vegetais em funo
da malha das sacolas de decomposio (litter bags) e do tempo.
Tratamento (mm)

Repeties (%)
I

II

III

IV

Mdia

1. Malha 0,2
2. Malha 0,5
3. Malha 1,0
4. Malha 2,0

Tabela 18. Constante de decomposio K com diversas coberturas vegetais em funo da


malha das sacolas de decomposio (litter bags) e do tempo.
Tratamento (mm)
1. Malha 0,2
2. Malha 0,5
3. Malha 1,0
4. Malha 2,0

Repeties (%)
I

II

III

IV

Mdia

89

CAPTULO XV
PROTOZORIOS
Jair Alves Dionsio
Ana Luiza Mattana
Diana Signor
Os protozorios representam uma das formas mais primitivas de vida que
ocorre no solo, so protistas superiores, unicelulares, sem parede celular, aerbios,
assimtricos e possuem capacidade de regenerao, cujo tamanho pode variar de
alguns micrmetros at um ou mais centmetros (RUPPERT et al., 2005). Reproduzem-se predominantemente de forma assexuada, por fisso binria e, sexualmente,
porm raramente, pela unio dos gametas (BRANDO, 1992).
O ciclo de vida dos protozorios dividido em duas fases: ativa (trofozoto) e de repouso (dormncia ou estgio de cisto). A fase ativa ocorre quando o
protozorio encontra condies nutricionais e ambientais favorveis sua alimentao e a reproduo, enquanto a fase cstica ocorre em condies adversas sua
sobrevivncia, na qual poder persistir por vrios anos (RUPPERT et al., 2005).
De acordo a estrutura de locomoo, os protozorios so classificados em:

Mastigofora ou flagelados: locomoo por flagelos (Bodo, Cercobodo


e Tetramitus);

Ciliata: locomoo por clios (Colpoda, Balantiophorus e Uroleptus); e,

Sarcodina (rizpodos ou amebas): locomoo por pseudopodos


(Biomyxa, Naegleria e Euglypha).

As amebas podem, ainda, ser classificadas de acordo com o envoltrio


celular (com ou sem tecas) que, quando presente, pode ser orgnico, silicoso, orgnico-silicoso ou composto de materiais estranhos incrustados em uma matriz
cimenteira (RUPPERT et al., 2005).
Dos grupos de protozorios que habitam os solos, os maiores so os ciliados, que podem variar de 10 a 80 mm de comprimento, conter milhares de clios em
cada clula e consumir os outros tipos de protozorios (USDA, 1999). No entanto,

90

os flagelados so os menores protozorios do solo, com comprimento longitudinal


que varia de 5 a 20 mm, contendo geralmente de 1 a 4 flagelos (BRANDO, 1992).
De acordo com a forma de obteno de nutrientes, os protozorios podem ser classificados como quimiorganotrficos, que necessitam de substncias
orgnicas pr-formadas no ambiente e fotolitotrficos, que so capazes de sintetizar compostos orgnicos pela fotossntese, como Euglena gracilis, por exemplo. Os
quimiorganotrficos dividem-se ainda em: saprfitas, que obtm seus nutrientes
por absoro direta do meio onde se encontram e holozoicos, que ingerem micro-organismos (principalmente bactrias, mas podem consumir matria orgnica solvel, outros protozorios, algas e alguns fungos), por fagocitose, sendo o alimento
digerido no vacolo e a frao no digerida eliminada no ambiente.
Os protozorios Ciliata so principalmente predadores, utilizando-se de
algas e bactrias; j os Sarcodina so primariamente saprofticos, mas incluem formas predatrias; e os Mastigofora incluem ambas as formas, saprofticos e predadores (JOPKIEWICZ; SZTRANTOVICZ, 1993). Porm, o grupo das Sarcodina
denominado vampirellides se alimenta do fungo fitopatgeno Gaemannomyces
graminis (USDA, 1999).
Os protozorios halozoicos apresentam, em suas clulas, concentrao de
nitrognio inferior das bactrias ingeridas, pois a relao C/N desses organismos
pode variar de 10:1, ou mais, e nas bactrias de 3/1 a 10/1. Bactrias consumidas
por protozorios contm muito mais N do que a quantidade requerida de carbono.
Assim, o excesso de N gerado no predador liberado na forma de amnio, geralmente prximo ao sistema radicular das plantas (USDA, 1999). Representam importante fonte alimentar para outros organismos rotferos e aneldeos (CUTOLO;
ROCHA, 2000) e, por outro lado, ajudam a suprimir doenas dos vegetais, por competirem com os fitopatgenos ou por alimentarem-se deles (USDA, 1999).
Solos de reas florestais, com pH normalmente cido, onde h predominncia de fungos, geralmente tem mais amebas testceas e ciliados do que os outros
solos. Em solos dominados por bactrias, h predominncia de flagelados e amebas
no testceas. A densidade populacional de protozorios no solo est associada
reunio de condies favorveis sua sobrevivncia, quer seja saproftica ou predadora (USDA, 1999).
A populao de protozorios varia em funo da fertilidade do solo, de
-1
104 g a 105 g-1 de solo (BRANDO, 1992), com biomassa de 15 a 150 kg ha-1 (SIQUEIRA, 1988), e localiza-se nos espaos interagregados (JASTROW; MILLER,

91

1991). Geralmente, em solos com altos teores de argila, predominam os protozorios menores: flagelados e amebas no testceas, porm em solos com textura
mdia a arenosa h predomnio de flagelados maiores, como amebas e ciliatas
(USDA, 1999).
Os protozorios so os maiores controladores da densidade populacional
de bactrias introduzidas no solo, tais como Rhizobium e Bacillus thuringiensis (CASIDA JUNIOR, 1989). Os microporos do solo, com dimetro entre 2 e 6 mm, so
micro-habitat favorveis s bactrias, pois servem de proteo contra a predao
por protozorios. Heijnen e Van Venn (1991) demonstraram que a sobrevivncia de
rizbio introduzido no solo aumentou com a adio da argila bentonita, devido ao
aumento de microporos que servem de micro-habitat para essa bactria.

92

PROTOCOLO XIII
MTODO CULTURAL PARA CONTAGEM DE
PROTOZORIOS DO SOLO, ADAPTADO
DE SINGH (1946)
1. Material
a)

Solo mido, coletado conforme o Captulo II (p. 14);

b) Vidrarias: Erlenmeyer de 250 mL, pipetas de 1 mL, tubos de ensaio de


15 mL com rosca, placas de Petri e ala de Drigalsky;
c)

Equipamentos: agitador mecnico, estufa de esterilizao, estufa de incubao, capela de fluxo laminar, autoclave, peagmetro, esterilizador
infravermelho ou bico de Bunsen ou lamparina, microscpio tico, gs
butano e agitador de tubos;

d)

Solues: soluo salina (NaCl 0,85 %), safranina 0,5 % (Anexo 1) e meio
de cultura gar nutriente (Tabela 19); e,

e) Outros: micropipetas com ponteiras de 0,1 mL, peneira de nmero 10


(abertura de 2,00 mm) e luva de proteo (nitrlica descartvel).
Tabela 19. Meio de cultivo gar Nutriente.
Reagente

Quantidade (g L-1 ou mL L-1)

Caldo nutritivo*

1.000,0 mL

gar

15,0 g

Obs. Ajustar o pH para 7,2 com NaOH 1,0 N

Caldo nutritivo
Reagente

Quantidade (g L-1)

Extrato de carne

3,0

Peptona

10,0

gua destilada q.s.p.

1.000,0

93

2. Metodologia
2.1. Cultivo bacteriano
a)

Utilizar bactria digervel (Aerobacter aerogenes, Azotobacter chroococcum,


Escherichia coli ou Rhizobium phaseoli);

b) Cultivar a bactria em tubo de ensaio, inclinado, contendo o meio gar


nutriente por, no mnimo, 72 h a 25 C;
c)

Preparar placas de Petri com meio gar nutriente;

d) Acrescentar cinco anis de vidro (10 x 20 mm), esterilizados, de forma


equidistante, no meio de cultura;
e)

Suspender o cultivo bacteriano em soluo salina esterilizada;

f)

Pipetar 0,1 mL da suspenso e inocular uma gota em cada anel; e,

g)

Incubar a 25 C por, no mnimo, trs dias.

2.2. Diluio e inoculao do solo


a)

Pesar 10,0 g de solo mido, obtifdo conforme o Captulo II (p. 14), previamente tamizado, em peneira nmero 10 (abertura de 2,00 mm) em
duplicata, sendo uma parte destinada contagem de protozorios e a
outra para determinao da massa de solo seco (item 3);

b)

Transferir o solo para Erlenmeyer de 250 mL contendo 90 mL de soluo


salina esterilizada (diluio 1:10);

c)

Dispersar as clulas e cistos de protozorios do solo em agitador mecnico (@ 3 G) durante 15 minutos;

d)

Com uma micropipeta, contendo ponteira esterilizada, transferir 1,0 mL


da suspenso para um tubo de ensaio contendo 9,0 mL de soluo salina
esterilizada e agitar, no agitador de tubos ou manualmente, cinco vezes
(diluio 1:100);

e) Transferir, com outra ponteira esterilizada, 1,0 mL da soluo anterior


para outro tubo de ensaio contendo 9,0 mL de soluo salina esterilizada
e agitar cinco vezes (diluio 1:1.000);
f)

Repetir o item e para atingir a diluio 1:10.000. Repetir a operao


para obter a diluio de 1:100.000;

94

g)

Inocular de cada diluio (10-1; 10-2; 10-3, 10-4 e 10-5) uma gota (@ 0,05 mL)
no centro do anel, realizando-se quatro repeties/diluio;

h) Incubar a 25 C por 14 dias;


i)

Realizar as contagens, com uma lupa, considerando-se como casos positivos os anis que apresentam clareamento do cultivo bacteriano;

j)

Contar os casos positivos e obter os valores correspondentes na Tabela


do Nmero Mais Provvel2; e,

k)

Dos casos positivos, transferir com ala de platina uma poro do crescimento para uma lmina de vidro, contendo gua deionizada, homogeneizar e realizar a identificao das classes de protozorios por microscopia
tica, com auxlio das ilustraes (Figura 4).

Fonte: Alexander (1980).

Figura 4. Classes de protozorios do solo.


Disponvel em: www.funasa.gov.br/site/wp-content/files_mf/eng_analAgua.pdf

95

3. Clculo
(N de protozorios) g-1 = diluio x n cdigo (NMP)* x 10 g-1*
*Obtido aps a secagem do solo mido em estufa (105 C) at massa constante.

4. Resultados
Estimar a densidade de protozorios pelo mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP) (Anexo 5) e completar a Tabela 20.
Tabela 20. Densidade populacional de protozorios g-1 em diferentes solos.
Solo
A
B
C
D
E

Classes*
Sarcodina

Mastigofora

Ciliata

Total

96

CAPTULO XVI
NEMATOIDES
Arlei Maceda
Nematoides, Filo Nemata (=Nematoda) Cobb, 1919, so vermes de corpo cilndrico, geralmente esguios e alongados, afilando-se de modo gradual ou
abrupto nas extremidades anterior e posterior. Podem variar de tamanho, de
acordo com o meio onde vivem. Nematoides de vida livre e fitoparasitos medem
de 0,3 a 3,0 mm de comprimento, j os parasitas de animais so maiores, cerca
de 15,0 cm, para Ascaris lumbricoides ou 8,0 m para Placentonema gigantissima,
parasito da baleia de espermacete (FERRAZ, 2007).
A populao de nematoides a mais expressiva da fauna do solo (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006) e, segundo Jastrow e Miller (1991), localiza-se entre os
micro e os macroagregados. composta por diferentes grupos trficos, que podem atingir valores de 106 m-2 a 107 m-2 e biomassa de 2 a 100 kg ha-1 (SIQUEIRA,
1988). Distinguem-se, pelo menos cinco grupos, pelo hbito alimentar (YEATES
et al., 1993):

Bacterifagos;

Fitfagos;

Micfagos;

Onvoros; e,

Predadores.

Em solo de cerrado nativo, Huang (1996) observou que nematoides representaram, aproximadamente:

Fitonematoides: 40 %;

Onvoros: 30 %;

Bacterifagos: 20 %;

Micfagos: 7 %; e,

Predadores: 3 %.

97

Porm, os mais importantes no solo so os fitoparasitas e os bacterifagos (MATTOS et al., 2006).


Os diferentes grupos trficos so atrados para a rizosfera das plantas devido presena de bactrias e fungos que ali se agrupam, estimulados pela presena
de exsudatos radiculares (MATTOS et al., 2006), caracterizando o aspecto dinmico
da comunidade de nematoides.
Nematoides bacterifagos podem reduzir significativamente as populaes
de bactrias e incrementar a mineralizao (COLEMAN et al., 1991), porm, alimentam-se indistintamente de bactrias benficas, saprofticas e patognicas (CHANTANAO; JENSEN, 1969). Assim, podem interferir na nodulao de leguminosas induzida pelo rizbio (KO et al., 1984) ou, ainda, alimentar-se de bacteroides, conforme
constatado por (WESTCOTT; BARKER, 1976) na cultura de Pisum sativum.
De acordo com Nielsen (1961), uma populao de nematoides de 106 m-2
pode consumir 800 kg ha-1 ano-1 de biomassa bacteriana. Ao se alimentarem dessa
biomassa, com baixa relao C/N, contribuem para aumentar o N disponvel, pois excretam volume significativo de N mineral no solo, afetando o crescimento das plantas
(MATTOS et al., 2006). Os nematoides fitfagos so muito conhecidos pelos prejuzos que causam agricultura, com efeito mais evidente em solos mais secos.
Os nematoides terrestres so, tambm, aquticos pois requerem um pequeno filme de gua em volta das partculas de solo na qual sobrevivem, movimentam-se e se reproduzem (FRECKMAN; BALDWIN, 1990). Dessa forma, vivem em
quaisquer condies onde exista gua, sendo sensveis a fortes estresses hdricos.
Chistopher e Womersley (1990) e Kung et al. (1990), ambos citados por Acevedo
et al. (2005), afirmam que solos com baixo contedo de umidade inativam juvenis
infectantes, estimulando processos de quiescncia e anidrobiose, que causam diminuio de metabolismo chegando, s vezes, morte, se a umidade do solo permanecer baixa por um longo perodo de tempo. Algumas espcies, no entanto, suportam
ambientes com baixa umidade por meses ou anos, como o interior de sementes
armazenadas. Temperaturas muito baixas ou excessivamente altas podem reduzir
a atividade e at mesmo provocar a morte dos nematoides (FERRAZ, 2007).
Os nematoides tambm podem ser disseminadores de bactrias, fungos, actinobactrias e micoplasmas por transmisso de propgulos, internamente e externamente (FRECKMAN; BALDWIN, 1990).
A textura do solo influencia a distribuio dos nematoides. Geralmente, em
solos orgnicos, de textura arenosa e franco-arenosa, a sobrevivncia e o deslocamento desses organismos so maiores que em textura argilosa (AZEVEDO et al., 2005).

98

A distribuio horizontal dos nematoides no solo afetada pela movimentao de animais, mquinas, implementos agrcolas e enxurradas, enquanto a
distribuio vertical sofre efeitos dos fatores climticos, profundidade de razes e
estdio de desenvolvimento das plantas (DIAS-ARIEIRA, 2003). O manejo da rea
tambm um fator importante, pois segundo Sereia et al. (2007), a monocultura
de soja em plantio convencional por oito anos exerceu efeito significativo sobre a
populao de Rotylenchulus reniformis. Por outro lado, em sistemas com maior diversificao de culturas (plantio direto e integrao lavoura-pecuria), a populao
de nematoides foi significativamente semelhante ao que ocorreu na mata primria.
A no deteco de R. reniformis em sistema de pastagem contnua reflete a resistncia da braquiria, utilizada como pastagem, a esta espcie de nematoide.
Mattos et al. (2006) observaram predomnio de nematoides micfagos em
sistemas perenes e de bacterifagos em reas sob cultivo anual. No cultivo convencional, a distribuio da populao de bacterifagos mais homognea, enquanto no
cultivo mnimo, h concentrao na regio da rizosfera. Assim, destacaram-se entre
outros grupos de animais e passaram a ser estudados como indicadores de impacto
ambiental, podendo diferenciar diversos sistemas de uso do solo (MATTOS, 2002).

99

PROTOCOLO XIV
MTODO DE AVALIAO DA DENSIDADE DE
NEMATOIDES NO SOLO
H uma variao muito grande nos mtodos de extrao de nematoides
de solos ou de tecidos/rgos vegetais. O mtodo flotao centrfuga em soluo
de sacarose internacionalmente aceito e utilizado, pois relativamente fcil e de
rpida execuo (JENKINS, 1964).
Para se estimar a populao de nematoides no solo com mais preciso,
aconselha-se fazer, no mnimo, trs repeties do mtodo por amostra.

AMOSTRAGEM E ACONDICIONAMENTO DE
AMOSTRAS
Coletar o solo com os mesmos princpios da amostragem para fins de fertilidade, ou seja, amostras compostas, representativas e de reas homogneas, nas
camadas de 0 a 30 cm, descartando-se a camada de 0 a 5 cm.
Acondicionar as amostras (aproximadamente 1 L) em sacos plsticos e
identific-las externamente. Coletar solos com a umidade prxima capacidade de
campo, evitando-se solos muito secos ou excessivamente encharcados. Durante o
procedimento de coleta da amostra, no exp-la a altas temperaturas, caso seja
necessrio, mant-la em caixa de isopor. Enviar o mais rapidamente possvel ao
laboratrio, no sendo vivel mant-la em refrigerador a temperaturas de 4 a 8 C.
O ideal ter uma amostra por hectare, entretanto, em grandes reas, uma amostra
pode representar at 20 hectares.

EXTRAO PELO MTODO FLOTAO CENTRFUGA


EM SOLUO DE SACAROSE (JENKINS, 1964)
1. Material
a)

Amostra de solo;

b) Equipamentos: centrfuga (com tubos para 100 mL), balana analtica,


refrigerador e microscpio tico;
c) Solues: sacarose com densidade (1,15 a 1,18), Dimetilsulfoxido
DMSO (20,0%);

100

d)

Vidrarias: basto de vidro, bqueres de 100 mL, pipetas de 1 mL e 10 mL,


tubos de ensaio graduados aos 4 mL; e,

e)

Outros: cubas, contador manual de clulas de mltiplas entradas, grades


para tubos de ensaio, lmina de Peters, lixeira para resduos biolgicos,
luvas de proteo, peneiras de nmero 10 (abertura de 2,00 mm) e nmero 400 (abertura de 0,037 mm) e papel toalha.

2. Metodologia
2.1. Peneiramento
Fundamentao da fase: separar fisicamente os nematoides (tamanhos
diferentes) dos componentes do solo, utilizando diferentes aberturas de peneiras.
a) Misturar bem e, utilizando um bquer, tomar 100 cm (ou 100 mL) de
solo (no necessrio compact-lo);
b) Transferir o solo para um recipiente de 2.000 a 3000 mL, acrescentar
gua ( 500 mL) e homogeneizar, de tal maneira a destorro-lo totalmente; acrescentar mais gua ( 1.000 mL) e aguardar 15 segundos para
a sedimentao da argila;
c)

Tamisar o sobrenadante em peneira nmero 10 (abertura de 2,00 mm),


sobreposta em recipiente de 2.000 a 3.000 mL;

d) Tamisar a suspenso obtida no item c em peneira nmero 400 (abertura de 0,037 mm), com jatos fracos de gua de torneira, concentrar o
contedo em um dos lados da peneira, com batidas leves na lateral ou
dedilhamento no fundo externo da peneira; e,
e) Recolher o sobrenadante da peneira de nmero 400, com uma pisseta,
em um bquer de 100 mL.

2.2. Centrifugao e leitura


Fundamentao da fase: separar os nematoides do solo (clarificando a suspenso) por diferena de gravidades especficas da gua (1,0), dos nematoides (1,02
a 1,09), da soluo de sacarose (1,15 a 1,18) e do solo (@ 1,2). Algumas espcies de
nematoides ou formas so mais densas e o mtodo no apresenta recuperao alta.

101

a)

Transferir a suspenso para tubos de centrfuga de 100 mL e equilibrar as


massas, em uma balana, com gua (colocar no mximo 80 mL no tubo).
Caso o volume obtido seja superior ao volume dos tubos, retorna-se
peneira nmero 400 e recoleta-se a suspenso;

b)

Centrifugar a suspenso a 1.750-1800 rpm por, no mnimo, 4 minutos;

c) Passado o tempo, retirar os tubos e, cuidadosamente, descartar o


sobrenadante;
d) Limpar os bordos do tubo (com os dedos) para retirar possvel acmulo
de impurezas e acrescentar a soluo de sacarose (de 60 a 80 mL);
e)

Agitar com um basto de vidro para ressuspender o sedimento. Ao mudar


de amostra, limpar bem o basto com papel toalha;

f)

Equilibrar as massas com a soluo de sacarose e centrifugar a suspenso


a 1.750-1.800 rpm, por 1 minuto;

g)

Verter o sobrenadante de cada tubo, individualmente, em peneira nmero 400;

h) Deixar escorrer gua de torneira sobre a peneira para retirar o excesso de


sacarose (jatos fracos);
i)

Recolher o contedo da peneira em um bquer de 100 mL, com uma pisseta (40 mL);

j)

Transferir o contedo para um tubo de ensaio graduado a 4 mL;

k)

Deixar repousar por, no mnimo, 1 h em refrigerador;

l)

Aps esse perodo, retirar a gua alm dos 4 mL, com uma pipeta; e,

m) Agitar a suspenso, retirar 1,0 mL e transferir para a lmina de Peters, e


ento levar ao microscpio tico para contagem e identificao (aumento
de 100 vezes).

2.3. Procedimentos para preservao


a)

Aps a extrao dos nematoides, concentr-los em gua deionizada (verificar em esteromicroscpio a presena de nematoides);

b)

Tomar a suspenso extrada e despej-la em uma peneira de nmero 400


ou 500, concentrando os nematoides na parte inferior dela;

c) Com uma pisseta, adicionar a soluo de DESS (Anexo 5) no lado da

102

peneira em que os nematoides esto concentrados. Aps, os nematoides


encolhem um pouco, mas, passados cerca de 15 minutos, retornam forma original;
d) Recolher o contedo para um bquer, lavando a malha com DESS; e,
e)

Passar o contedo do bquer para um frasco, rotular e armazenar temperatura ambiente ou sob refrigerao.

3. Clculo
Estimativa da densidade final de nematoides.
N/100 cm3 de solo
Onde:
N: nmero de nematoides/1,0 mL da lmina de Peters; e,
4: volume final do lquido concentrado na extrao.

4. Resultados
Realizar a identificao dos nematoides em grupos trficos e preencher a
Tabela 21.
Tabela 21. Grupos trficos e ndice de frequncia (IF %) de nematoides do solo.
Grupos trficos
Solo

1
2
3
4
5

Bacterifagos

Fitoparasitas

Total

Total

IF

IF

Micfagos
Total

IF

Predadores
Total

IF

Onvoros
Total

IF

103

CAPTULO XVII
MESOFAUNA
Jair Alves Dionsio
Diana Signor
A biota edfica representada por uma gama de organismos com diferentes tamanhos e metabolismos, aos quais se atribuem inmeras funes no solo. A
diversidade quantitativa, qualitativa, gentica e funcional so suas caractersticas
marcantes (LAVELLE et al., 1994).
Inmeros so os grupos taxonmicos que compem a fauna de invertebrados do solo. Algumas classificaes, baseadas no tamanho do corpo e na sua
mobilidade, so bastante difundidas entre os pedobilogos tropicais (DUCATTI,
2002), porm algumas apresentam diferenas no limite das classes.
Lavelle et al. (1994) propuseram uma subdiviso da fauna edfica de invertebrados apoiada no tamanho e na mobilidade dos organismos:

Microfauna: animais higrfilos, ligeiramente mais mveis do que


os micro-organismos, com tamanho microscpico (< 0,2 mm), que
penetram nos capilares do solo. Frequentemente, possuem formas
de resistncia seca com o perodos de quiescncia, estado de desidratao ou de enquistamento (ASSAD, 1997).

Mesofauna: organismos terrestres, com tamanho de 0,2 a 4,0 mm,


higrfilos ou xerfilos, que se movimentam nos poros, nas fissuras e
na interface entre a serapilheira e o solo. formada por caros, colmbolos, miripodes, aracndeos e diversas ordens de insetos, alguns
oligoquetos e crustceos. So decompositores primrios e/ou secundrios da matria orgnica, exercendo funo no processo de humificao do solo; e,

Macrofauna: dimetro corporal de 4,0 mm a 20,0 cm, acima disso,


pertencem megafauna (algumas espcies de oligoquetos, diplpodes, quilpodes e colepteros). Ambos fragmentam os detritos
vegetais e animais, modificam a estrutura do solo por meio de escavao e produo de coprlitos, constroem ninhos, cavidades, galerias e transportam material de solo.

104

A mesofauna um conjunto de organismos que, apesar de extremamente


dependente da umidade do solo, terrestre. Como representantes da mesofauna,
tm-se principalmente os representantes dos filos:

Arthropoda Aranae;

Pseudoescorpione;

Acari;

Diplura;

Protura;

Collembola;

Coleoptera;

Diptera;

Hymenoptera; e,

Annelidae Oligochaeta.

Os caros so considerados os microartrpodos mais diversos do solo,


o que reflete na diversidade de hbitos alimentares do grupo (BRUSSARD et al.,
1997). Despertam interesse em vrias reas de conhecimento do homem (AQUINO
et al., 2006):

Agricultura;

Sade;

Produtos armazenados;

Controle biolgico; e,

Esttica.

Os caros de vida livre esto entre os mais importantes decompositores


secundrios (WOLLEY, 1990).
A mesofauna edfica possui hbito gregrio e sua distribuio no solo
heterognea, concentrando-se prximo superfcie. Sua presena depende de diversos fatores, como:

105

pH;

Umidade;

Temperatura do solo;

Textura;

Porosidade;

Matria orgnica;

Fauna e flora edficos;

Cobertura vegetal;

Interferncia do homem;

Clima;

Regio geogrfica; e,

Eventos naturais.

As mudanas no ambiente influenciam o nmero e as espcies remanescentes da mesofauna edfica. Portanto, a avaliao do impacto de aes humanas
no solo pode ser realizada por meio da avaliao da populao de microartrpodos
(SOCARRS, 1998; MORSELLI, 2004).
Estima-se que 95,0 % dos microartrpodos do solo sejam constitudos
por Acari e Collembola (SEASTEDT; CROSSLEY JUNIOR, 1984) e so considerados
bastante sensveis a alteraes do ambiente. Em decorrncia dessas caractersticas,
a mesofauna tem sido utilizada como indicadora de impactos ambientais em agroecossistemas (MELLO; LIGO, 1999).
Os colmbolos so amplamente distribudos no solo e na serapilheira,
e tm como principal atividade promover a decomposio de resduos orgnicos.
Isso ocorre diretamente pela alimentao de resduos orgnicos em decomposio
e hifas fngicas e, indiretamente, pelo estmulo no aumento dos micro-organismos
envolvidos na decomposio (AQUINO et al., 2006). Em alguns ecossistemas terrestres, os colmbolos podem atingir densidades de 104 a 105 indivduos m-2 (PETTERSON; LUXTON, 1982).
O equilbrio ambiental dos solos pode ser medido pela observao das
caractersticas populacionais de grupos de organismos especficos, considerados
bioindicadores do grau de alterao ou fragmentao de um local (WINK et al.,

106

2005). Morselli (2004) afirma que um dos bioindicadores utilizados o monitoramento da mesofauna e sua avaliao na decomposio dos resduos a serem adicionados no solo.
O mtodo dinmico de extrao de artrpodes mais indicado para o
estudo da mesofauna edfica o do funil de Berlese-Tullgren (AQUINO et al.,
2006). Maral (2009), utilizando o mtodo anteriormente citado, avaliou durante um ano, bimestralmente, a mesofauna em rea de cultivo de cana-de-acar,
submetida aos tratamentos:

Palha + vinhaa;

Sem palha e sem vinhaa;

Palha sem vinhaa;

Sem palha e sem vinhaa; e,

Mata nativa.

Os autores observaram que houve predominncia dos grupos acariforme


> acari parasitiforme > formicidae > collembola arthopleona > protura > outros >
collembola symphypleona.

107

PROTOCOLO XV
EXTRAO DA MESOFAUNA EDFICA PELO MTODO
DO FUNIL DE BERLESE-TULLGREN MODIFICADO
1. Material
a)

Vidraria: frasco de vidro (100 mL) e placa de Petri (90 mm);

b) Equipamentos: mesa extratora, microscpio estereoscpio (lupa) e microscpio tico3;


c)

Soluo preservativa (Tabela 22); e,

d) Outros: funil de Berlese-Tullgren, modelo da UFPR: dimenses: dimetro (7,5 cm), profundidade (4,5 cm), comprimento (28,0 cm) e abertura (malha de 2,0 mm), lmpadas de 25 W, estilete entomolgico, pina
cirrgica, elstico de borracha, caixa plstica vazada e luva de proteo
(nitrlica descartvel).
Tabela 22. Soluo preservativa para artrpodos do solo.
Reagente

Quantidade (mL L-1)

lcool 70 %

700,0

Glicerina

20,0

gua q.s.p.

1.000,0

Fonte: Sautter (2001).

2. Metodologia
a)

Determinar previamente o nmero de amostras de solo a ser coletado


(no mnimo 10);

b) Realizar a amostragem, com o funil de Berlese-Tullgren, de forma representativa para a rea em estudo;
c)

Separar serapilheira do solo e coletar a amostra de solo na camada superficial (0,0 a 5,0 cm);

d) Revestir o funil de Berlese-Tullgren com saco plstico limpo e prend-lo


com elstico de borracha, para evitar perda de solo e, consequentemente,
de animais;
Informaes complementares disponveis em: http://ainfo.cnptia.embrapa.br/digital/bitstream/
CNPAB-2010/34090/1/cit017.pdf

108

e)

Transportar ao laboratrio o conjunto: funil de Berlese-Tullgren e solo,


cuidadosamente, acondicionando-o em caixa plstica vazada;

f)

Colocar as amostras coletadas com o funil de Berlese-Tullgren na mesa


extratora;

g)

Verificar se as lmpadas (25 W) esto dimensionadas e funcionando;

h) Identificar os frascos coletores, de acordo com as amostras do campo;


i)

Colocar um frasco coletor embaixo do funil de Berlese-Tullgren contendo


a soluo preservativa (Tabela 22) at 70,0 a 80,0 % do volume;

j)

A extrao dever durar cerca de uma semana. Nesse perodo, verificar


com frequncia o funcionamento das lmpadas e o nvel da soluo preservativa;

k) Fechar o local onde ser realizada a extrao para evitar que insetos sejam atrados pela luz durante o perodo noturno e prejudiquem o bom
andamento da extrao;
l)

Aps o perodo de extrao, recolher os frascos coletores;

m) Filtrar o sobrenadante com papel filtro de filtragem rpida, sem agitar a


amostra;
n) Transferir, com uma pina, o papel filtro para uma placa de Petri e quantificar os organismos na lupa ou microscpio;
o) Identificar os organismos extrados de acordo com a classe, ordem ou
famlia, segundo a Ficha de Avaliao (Tabela 23); e,
p) Para identificar as famlias de colmbolos, utilizar os Anexos 5 e 6.

1. Arthropoda

Filo

Subfilo
Hexapoda

Chelicerata

Subfilo

Identificao da amostra:

Leitura:

Coleta:

Amostra n.:

Arachnida

Classe

Subclasse
Acari

Tabela 23. Ficha de avaliao da mesofauna edfica.

Pseudoscorpiones

Aranae

Ordem

Acariforme

Parasitiforme

Superordem

Data

Continua.

Indivduos/
funil

109

2. Annelidae

Classe
Clitellata

Subfilo
Myriapoda

Tabela 23. Continuao.

Symphyla

Pauropoda

Chilopoda

Classe

Classe
Insecta

Classe
Entognatha

Hymenoptera

Diptera

Coleoptera

Ordem

Collembola

Protura

Diplura

Ordem

Formicidae

Famlia

Arthropleona

Symphypelona

Subordem

Continua.

110

Fonte: Maral (2009).

Total

Outros

Tabela 23. Continuao.


Subclasse
Oligochaeta

Ordem
Haplotaxida
Subordem
Tubificina
Famlia
Enchytraeidae

111

112

3. Clculo
O clculo para estimativa da densidade da mesofauna feito com base na
rea do crculo do funil de Berlese-Tullgren.
S = (.d2)/4
Onde:
: 3,14...;
d: dimetro do crculo 7,5 cm;
S: rea do crculo 44,18 cm2;
1 m2 = 10.000 cm2; e,
Fator de transformao: 10.000 cm2/44,18 cm2 = 262,35.

4. Resultados
Expressar os termos absolutos (indivduos/funil) e evitar extrapolar os
dados para nmero de organismo por hectare ou m2.

113

CAPTULO XVIII
MACROFAUNA
Diana Signor
Jair Alves Dionsio
A macrofauna edfica compreende os maiores invertebrados. Segundo
Lavelle et al. (1994), so organismos com dimetro corporal de 4,0 mm a 20,0 cm,
como minhocas, colepteros em estado larval e adultos, centopeias, cupins, formigas, piolhos de cobra, tatuzinhos e aracndeos.
De acordo com Gassen (1992), a fauna do solo pode ser classificada em
funo do habitat e dos hbitos alimentares em dois grupos:
1. Fauna do solo subterrnea: habita o horizonte A e raramente vem
superfcie. Apresenta um conjunto de hbitos e caractersticas comuns,
como movimentao e viso restritas, sensibilidades qumica e mecnica
muito desenvolvidas, fotofobia, corpo despigmentado, defesa pela produo de toxinas, resistncia ao gs carbnico, corpo coberto por estrutura cuticular hidrofbica, formando um plastro que permite a respirao e a osmose durante perodos de chuva. pouco afetada pelos eventos
climticos da atmosfera e pelo manejo da superfcie do solo, destacando-se nesse grupo os cors ou Diloboderus abderus (Coleoptera: Melonthidae), os cupins (Isoptera: Termitidae) e as minhocas (Oligochaeta), que
desempenham importante funo na decomposio de compostos orgnicos (LAMPARSKI; LAMPARSKI, 1987); e,
2.

Fauna de superfcie: habita o horizonte O (orgnico), vive sob resduos


orgnicos, movimenta-se com agilidade, apresenta acuidade visual,
sensores desenvolvidos e corpo pigmentado. afetada pela cobertura
vegetal e pelas prticas culturais. Pode penetrar no solo pelas rachaduras ou cavidades naturais. As espcies-praga alimentam-se de sementes ou plantas na regio do colo ou da coroa e, algumas vezes, da parte area. Nesse ambiente, ocorrem os predadores, os parasitoides, os
decompositores de material orgnico e se estabelecem os mais importantes eventos relacionados ao controle natural das populaes de
espcies-praga (GASSEN, 1992).

114

Organismos como trmitas, formigas, minhocas e larvas de colepteros


so denominados engenheiros do ecossistema, pois atuam na formao de galerias, ninhos, cmaras e bolotas fecais, que modificam as propriedades fsicas dos
solos onde vivem e a disponibilidade de recursos para outros organismos (WOLTERS, 2000). Por meio de suas aes mecnicas no solo, a macrofauna contribui
para a formao de microagregados estveis, que podem proteger parte da matria
orgnica de uma mineralizao mais rpida e constituem, tambm, uma reserva de
nutrientes potencialmente disponveis para as plantas (LAVELLE; SPAIN, 2001;
DECENS et al., 2003). Genericamente, um solo sob vegetao natural poder conter (ASSAD, 1997):

Trmitas: de 102 a 105 indivduos m-2;

Formigas: de 102 a 105 indivduos m-2; e,

Minhocas: de 1 a 5 (x102) indivduos m-2.

Em ambientes homogneos, a densidade da macrofauna edfica tende a


ser alta e a diversidade, geralmente, diminui. De modo geral, a estrutura da comunidade da macrofauna edfica apresenta-se estvel no sistema sob vegetao nativa; menos afetada pelas prticas de manejo dos solos mais conservacionistas e
estimulam a dinmica da matria orgnica no solo, como os sistemas de integrao
lavoura-pecuria e plantio direto (SILVA et al., 2006).
Os impactos diretos das prticas agrcolas na comunidade do solo correspondem ao mecnica da arao e da gradagem e aos efeitos txicos dos
agrotxicos. Os efeitos indiretos esto relacionados modificao da estrutura
do habitat e dos recursos alimentares. Assim, a retirada de serapilheira e ervas
daninhas, bem como a compactao do solo e as monoculturas provocam simplificao do habitat, tendo como consequncia a diminuio das comunidades do
solo (CORREIA; OLIVEIRA, 2000).
A comunidade da macrofauna edfica um parmetro sensvel ao impacto de diferentes tipos de sistemas de produo, o que possibilita o seu uso como
instrumento na determinao de opes de manejo sustentvel dos sistemas agropecurios (SILVA et al., 2006). Segundo Baretta et al. (2003), os grupos Acarina,
Hymenoptera, Isopoda e Collembola contribuem significativamente para discriminar sistemas de preparo e cultivo do solo. Esses autores, trabalhando com diferen-

115

tes sistemas de produo no cerrado, constataram que, no sistema plantio direto,


havia maior diversidade de grupos, fato explicado pelo aumento da diversificao
vegetal promovida pela rotao de culturas, o que garante condies favorveis ao
aumento da diversidade de grupos da macrofauna edfica; e, maior densidade de
predadores das ordens Arachnida e Chilopoda, que so capazes de promover o controle biolgico de pragas agrcolas.
A metodologia mais empregada para o estudo da macrofauna do solo tem
sido a do Programa de Biologia e Fertilidade dos Solos Tropicais (TSBF), da UNESCO (ANDERSON; INGRAM, 1993), no qual a amostragem feita em bloco de solo
(25 cm x 25 cm x 30 cm) ou por meio de armadilhas no solo, como exemplo a Pitfall
trapps, com ou sem uso de iscas. Para melhor compreenso dos aspectos ecolgicos
envolvidos entre os indivduos, so calculados os ndices: diversidade de Shanon,
equitabilidade de Pielou e riqueza de espcies, assim como o uso da anlise multivariada de dados.

116

PROTOCOLO XVI
MTODO DE EXTRAO DA MACROFAUNA EDFICA
(ANDERSON; INGRAM, 1993)
1. Material
a)

Vidraria: frasco de vidro (250 mL);

b)

Equipamentos: microscpio fotnico e microscpio estereoscpio (lupa);

c)

Soluo preservativa: lcool 70 % (Anexo 1); e,

d) Outros: p de corte, saco plstico, bandeja, pina cirrgica e luva de proteo (nitrlica descartvel).

2. Metodologia
2.1. Etapa de campo
a)

Realizar o reconhecimento da rea;

b)

Traar um transecto de, no mnimo, 50 a 100 m, quando possvel;

c)

Retirar entre 5 e 10 amostras (monlitos de 25 cm x 25 cm x 30 cm),


distantes, no mnimo, 10 m entre si;

d)

Para cavar o monlito, separar o bloco de solo de 25 x 25 cm rapidamente


com quatro ps retas;

e)

Fazer triagem da palhada ou da serrapilheira, manualmente, observar a


presena de animais e armazen-los em lcool 70 %;

f)

Identificar os frascos, com lpis, de acordo com a identificao do campo;

g)

Cavar um buraco ao redor do monlito para auxiliar a retirada do solo;

h) Retirar o solo de um lado (na frente) ou de dois lados (em forma de L) at


30 cm de profundidade. O solo do monlito ser retirado em trs camadas, de 10 cm cada uma; e,
i)

Colocar o solo de cada camada em saco plstico (50 L), previamente identificado, preserv-lo na sombra e encaminh-lo ao laboratrio para triagem. Se houver tempo e condies locais apropriadas, pode ser feita a
triagem no campo.

117

2.2. Triagem, quantificao, identificao e pesagem


a) Destorroar o solo, cuidadosamente, numa bandeja, separar os animais
manualmente com uma pina e transferi-los para frascos com lcool 70 %;
b)

Lavar bem os animais, numa bandeja plstica, com uma pisseta contendo
gua deionizada;

c)

Transferir os animais com uma pina, para o papel toalha;

d) Secar os animais por um minuto;


e) Realizar a contagem e a pesagem dos animais em balana de preciso
centesimal; e,
f) Identificar os organismos extrados (classe, ordem e/ou famlia), por
meio de lupa, segundo a Ficha de Avaliao (Tabela 24).
Tabela 24. Ficha de avaliao da macrofauna edfica.
Avaliador:
Amostra n.:

Data:

Coleta:

Leitura:

Coletor:
Grupo

Nome comum

Grupo funcional

1. Coleoptera

Besouros, larvas,
cors

Rizfagos, predadores,
detritvoros

2. Oligoqueta

Minhocas

Gefagos, detritvoros,
onvoros

3. Isoptera

Trmitas, cupins

Gefagos, detritvoros,
rizfagos

4. Formicidae

Formigas

Fitfagos, predadores,
detritvoros, onvoros

5. Chilopoda

Centopeias

Predadores

6. Diplopoda

Milipeias, piolho
de cobra

Detritvoros

7. Symphylla

Simflidos

Detritvoros, predadores

8. Aranae

Aranhas

Predadores

9. Hemiptera

Percevejos

Rizfagos

Indivduo
(nmero m-2)

Continua.

118

Tabela 24. Continuao.


10. Homoptera

Cigarras, outros

Rizfagos, detritvoros

11. Orthoptera

Grilos

Rizfagos

12. Lepidoptera

Borboletas,
mariposas

Fitfagos

13. Diptera

Moscas

Detritvoros, predadores,
parasitos

14. Blattaria

Baratas

Detritvoros, fitfagos,
onvoros

15. Isopoda

Tatuzinhos

Detritvoros

16. Dermaptera

Tesourinha

Detritvoros

17. Gasteropoda

Caracis

Fitfagos, detritvoros

18. Pseudoscorpionidae

Pseudoescorpies

Detritvoros, predadores

Fonte: Aquino (1999).

3. Resultados
Apresentar os dados obtidos em forma de tabela, conforme a Ficha de
Avaliao (Tabela 24), calculando a quantidade e, dentro do possvel, realizar a
identificao dos organismos da macrofauna edfica encontrados nas amostras,
conforme literatura especializada.
Expressar os resultados de densidade populacional (indivduo m-2) em
termos absolutos e relativos. Evitar extrapolar os dados para nmero de organismos por hectare ou m2.

119

CAPTULO XIX
MINHOCAS
Jair Alves Dionsio
Diana Signor
No mundo, so conhecidas em torno de 8.800 espcies de minhocas, embora seja estimada uma diversidade ainda maior (REYNOLDS; WETZEL, 2007).
Existem registros da presena de, aproximadamente, 310 espcies/subespcies de
minhocas catalogadas no Brasil (BROWN; JAMES, 2007).
As minhocas tm funo pedoecolgica essencial. De acordo com Edwards
e Bohlen (1996), realizam atividades que beneficiam as propriedades fsicas, qumicas e biolgicas do solo, aumentando a aerao, a estabilidade de agregados, a
infiltrao de gua, a mistura de materiais orgnico e mineral e a decomposio
dos resduos das plantas. Dessa forma, elevam a disponibilidade dos nutrientes, orgnicos e inorgnicos que, direta ou indiretamente, melhoram a produtividade do
solo. Esses efeitos frequentemente (superior a 70 % dos casos) levam a aumentos
no crescimento vegetal e na produtividade agrcola (BROWN et al., 2000). Tambm
no aspecto biolgico, trazem benefcios, pois dipersam micro-organismos na forma
de clulas e/ou esporos, pelo deslocamento na superfcie do solo e na construo
de galerias, como tambm pelos excrementos coprlitos, que podem ser liberados
dentro ou na superfcie do solo.
De acordo com a classificao ecolgica de Bouch (1977), as minhocas
edficas so classificadas em:

Epigeicas: vivem em grande parte acima do solo mineral, habitam


e se alimentam do horizonte orgnico, no constroem galerias, so
pigmentadas e de tamanho reduzido. Exemplos: Eisenia andrei e
Eudrilus eugenia;

Ancicas: cavam galerias no solo mineral, vm superfcie para se


alimentar de litter, que incorporam ao solo, constroem galerias verticais extensas e permanentes; possuem pigmentao dorsal e so
pouco conhecidas na Amrica Latina (RIGHI, 1999). Exemplos: Chibui bari, Lumbricus terrestres e Apporectodea longa; e,

120

Endogeicas: habitam o solo mineral, com preferncia por material


rico em matria orgnica. Exemplo: Pontoscolex corethurus (minhoca
mansa).

Segundo o hbito alimentar, as minhocas so consideradas onvoras, e


alimentam-se, principalmente, de detritos orgnicos em vrios estgios de decomposio, mas tambm integram a sua dieta:

Micro-organismos vivos: bactrias, fungos e protozorios;

Microfauna: nematoides e rotferos; e,

Fezes prprias ou de outros animais.

Assimilam menos de 10 % do material orgnico ingerido, restando nas


fezes muito material em vrios graus de processamento, assim como nutrientes
que esto prontamente disponveis s plantas.
Os coprlitos possuem secrees contendo humato de clcio, produzidos
no intestino das minhocas, bem como o clcio liberado pelas glndulas calcferas,
que servem de cimento para as partculas do solo (EDWARDS; BOHLEN, 1996).
Consistem em uma mistura heterognea de restos orgnicos e de partculas minerais. No entanto, a quantidade de excrementos varia de acordo com (ZOU, 1993;
TIUNOV; SCHEU, 2000):

Idade;

Tamanho;

Estrutura da populao;

poca do ano;

Qualidade da matria orgnica ingerida;

Temperatura;

Disponibilidade de gua; e,

Textura do solo.

A produo pode atingir de 1,5 a 120 t ha-1 ano-1 em regies temperadas e


de 50 a 2.600 t ha-1 ano-1 em regies tropicais (BAL, 1982; LEE, 1985).

121

As minhocas so lucfugas e dotadas de tigmotacismo positivo em todo o


corpo. Assim, sua locomoo s efetiva no meio de detritos vegetais ou no interior do solo (RUPPERT et al., 2005), pois constroem galerias ou bioporos dentro
do solo, que predominam nos horizontes superficiais, mas podem chegar at s
grandes profundidades nas formas horizontais e/ou verticais, com ramificaes,
mas tambm podem ser bloqueadas por razes e fezes do prprio animal.
Amynthas spp. e Pontoscolex corethrurus que ocorrem em reas com atividade antropognica, vivem em galerias superficiais, ou seja, de 0 a 20 cm de profundidade (RIGHI, 1997).
Diversos fatores ambientais podem influenciar a reproduo, o crescimento, a atividade mecnica e a atividade metablica desses animais, entre eles:

Umidade;

Aerao;

Temperatura;

Material alimentar; e,

pH.

Os agroecossistemas so caracterizados pela alta degradao provocada


pelo homem, em funo de tcnicas agrcolas como preparo do solo, cultivo, fertilizao e tratamentos com agrotxicos, como consequncia causam impactos deletrios na populao de minhocas.
A comunidade de minhocas presente em um determinado local funo
de (BROWN; DOMNGUEZ, 2010):

Condies edficas: tipo de solo, mineralogia, teor de matria orgnica, textura, estrutura, temperatura, umidade e valor de pH;

Vegetao: espcie e cobertura;

Topografia: posio fisiogrfica e inclinao;

Clima: precipitao, temperatura, umidade relativa do ar e vento;

Interaes com outros organismos edficos; e,

Condies histricas que originaram o solo e o local.

122

As comunidades de minhocas so mais expressivas em reas de acmulo


de matria orgnica. Freitas (2014), comparando sistemas de produo de hortas,
convencional e orgnico, em Canoinhas SC, obteve, respectivamente, densidades
populacionais de 35,3 e 362,7 animais m-2.

123

PROTOCOLO XVII
MTODO DE EXTRAO DE MINHOCAS DO SOLO
COM EXTRATO DE CEBOLA (STEFFEN et al., 2010)
1. Material
a) Equipamentos: microscpio estereoscpio (lupa), microscpio fotnico,
relgio, anel metlico (modelo da UFPR: 0,108 m de altura, 0,407 m de
dimetro e 0,1301 m2 de rea) e balana de preciso centesimal;
b)

Solues: extrato de cebola 17,5 % e lcool 70 % (Anexo 1); e,

c)

Outros: bquer de polietileno, galo de 5 L, pina metlica, pisseta, luva


de proteo (nitrlica descartvel), papel toalha e enxada.

2. Metodologia
2.1. Etapas de campo
a) Realizar o reconhecimento da rea;
b)

Traar um transecto na rea de amostragem, com, no mnimo, 50-100 m;

c)

Demarcar entre 5 e 10 amostras, distantes, no mnimo, 5,0 m entre si;

d) Para cada local de amostragem, limpar uma rea de aproximadamente 1


m2, com uma enxada, retirando a cobertura vegetal;
e) Fixar um amostrador (anel metlico) no solo e, cuidadosamente, com
uma enxada, inseri-lo a aproximadamente 5,0 cm;
f)

Adicionar lentamente a soluo de extrato de cebola 17,5 % dentro do


anel metlico;

g)

Aps a soluo infiltrar no solo, aguardar 10 minutos; e,

h) Com uma pina metlica, coletar as minhocas que foram expulsas das
galerias e transferi-las para um bquer contendo lcool 70 % e transport-las para o laboratrio.

2.2. Etapas de laboratrio


a)

Manter as minhocas em lcool 70 % por um perodo de 3 a 6 h;

b)

Com uma pisseta, contendo gua deionizada, lavar bem as minhocas; e,

124

c)

Sec-las em papel toalha por um minuto e, em seguida, realizar a contagem e a pesagem em balana de preciso centesimal.

3. Clculo
N ou biomassa fresca m-2 = mdia dos cinco anis (Rep.1+ ...+ Rep.5)/5 *fc1
1

fc 1 m2/rea do anel (0,1301 m-2) = 7,7

4. Resultados
Estimar a densidade populacional (Tabela 25) e a biomassa fresca (Tabela
26). De acordo com o Anexo 8, possvel realizar a identificao de algumas famlias de minhocas.
Tabela 25. Estimativa da densidade populacional de minhocas em diferentes solos.
Solo

Densidades (N m-2)
I

II

III

IV

Mdia

A
B
C
D
E

Tabela 26. Estimativa da biomassa fresca de minhocas em diferentes solos.


Solo
A
B
C
D
E

Biomassas (g m-2)
I

II

III

IV

Mdia

125

REFERNCIAS
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175,00 g em gua

50 mL em gua
7,00 g de farinha de trigo em gua
40,60 mL HCl concentrado em gua

0,25 M
17,50
0,10 %
50,00 %
7,00 %
0,50 N
10,00 %
5,00 %
3,00 %
1,00 M
0,50 M

Extrato de cebola3

Fenolftalena

Glicerol

HCl5

Hidrxido de potssio

Hipoclorito de sdio

KOH

NaCl

NaOH

Goma caseira

26,27 g

20,00 %

Dimetilsulfxido DMSO

EDTA Sdico

20,00 g

50,00 %

BaCl2.2H2O

20,00 g em gua

58,50 g em gua

3,00 g em gua

5,00 g em gua

10,00 g

0,10 g em lcool etlico 95,00 %

122,23 g em gua

0,05 g em gua

0,05 %

Azul de Bromotimol

736,8 mL de lcool etlico 95,00 % em gua

Dissolver1

70,00 %

Concentrao

lcool etlico

Soluo

Preparo de solues diversas.

ANEXO 1

ANEXOS

1.000

1.000

100

100

100

1.000

100

100

100

1.000

250

100

1.000

100

1.000

Continua.

Completar (mL)

142

116,00 %
60,00 %
0,50 %
0,85 %
5,0 %

Sacarose

Sacarose

Safranina

Salina (NaCl)

Tinta de caneta tinteiro azul

5,0 mL e 95 mL de cido actico

8,50 g de NaCl em gua

0,500 g em gua

600,00 g em gua

116 g em gua

Dissolver1

100

1.000

100

1.000

100

Completar (mL)

Usar gua deionizada; 2Dissolver em gua deionizada aquecida a 30 C; 3Pesar 175,00 g de cebola branca sem casca, bater no liquidificador com 500 mL de gua, durante um
minuto e completar com gua deionizada para um litro; 4Diluir a farinha de trigo em gua de torneira e aquecer a mistura at a fervura. Deixar esfriar e guardar em geladeira
at o uso; 5HCl concentrado (36,50 %; d = 1,19). Caso as especificaes sejam diferentes, corrigir o volume de cido a ser utilizado.

Concentrao

Soluo

Anexo 1. Continuao.

143

144

ANEXO 2
Teste de Gram em solubilidade com KOH (RYU, 1940)
a) Selecionar colnias bacterianas puras (isoladas) das placas de Petri em
meio de cultivo com no mximo 24 h;
b)

Limpar as lminas de vidro previamente com lcool etlico;

c)

Pingar na lmina de vidro trs gotas de KOH 3 % (Anexo 1);

d) Transferir, com a ala de semeadura, uma colnia ou parte dela para a


lmina de vidro;
e)

Misturar com a ala de semeadura at formar uma mistura homognea e


aguardar 30 segundos; e,

f)

Colocar a ala de semeadura sobre a mistura previamente obtida, erguer


1 a 2 cm e verificar se h formao de fios viscosos.

Interpretao das observaes:


Gram positiva, a soluo no rompe a parede celular e no forma


fios; e,

Gram negativa, a parede celular rompida, libera o DNA e forma


fios.

145

ANEXO 3
Determinao da capacidade de reteno de gua do solo
conforme Monteiro e Frighuetto (2000)
Dentre os fatores limitantes da atividade dos micro-organismos no solo,
tem-se a capacidade de reteno de gua, que extremamente varivel entre os
solos, em funo principalmente dos teores de argila e matria orgnica. Dessa forma, a determinao desse atributo fundamental para interpretao das anlises
microbiolgicas, porm, para que seja aplicado corretamente, necessrio que os
solos estejam nas mesmas condies de umidade, ou seja, na mesma capacidade
de reteno de gua. Os valores de capacidade de reteno de gua so variveis de
acordo com a metodologia, podendo ser superiores a 100 %.

1. Material
a)

Solo mido coletado da camada superficial (0 a 10 cm);

b) Vidrarias: funil plstico (dimetro 10 cm), pipetas* de 1 mL, frasco de


vidro de 150 mL, bquer de 200 mL;
c)

Equipamentos: balana analtica com preciso de dcimo de grama, estufa de secagem; e,

d) Outros: papel filtro quantitativo, faixa preta, filtragem rpida (dimetro


15 cm), suporte de madeira, filme plstico, esptula e luvas de proteo
(nitrlica descartvel).

2. Metodologia
a)

Para cada amostra, separar um conjunto formado por funil de vidro,


papel filtro e frasco de vidro e determinar a massa. Realizar a avaliao
em duplicata;

b) Acoplar, em um suporte de madeira, o funil contendo o papel filtro e


posicionar corretamente o frasco coletor abaixo do funil;
c)

Pesar 20,0 g de solo mido, obtido conforme o Captulo II (p. 14), previamente tamizado em peneira no 10 (abertura de 2,00 mm) e transferi-lo
com auxlio de uma esptula para o funil;

d) Em um bquer, pesar em balana analtica 100 g de gua destilada e adicion-la ao solo em pequenos volumes. Cobrir o funil com filme plstico
e deixar temperatura ambiente;

146

e)

No dia seguinte, retirar a gua retida na haste do funil, com batidas suaves no suporte de madeira e pesar o frasco coletor contendo a gua percolada; e,

f)

Para cada amostra, necessria a realizao da prova em branco (sem a


adio de solo).

3. Clculo
Determinao da capacidade de reteno (CR) de gua do solo (%)
CR (%) = [(100 - AP) + AS)]/SS x 100

Onde:
AP: gua percolada (g);
AS: gua existente no solo (g); e,
SS*: massa do solo seco (g), obtido aps a secagem do solo mido (20 g)
em estufa (105 C) at massa constante.

3.1. Calcular a capacidade de reteno de gua


estabelecida = 60 (%) da CR.
Capacidade de reteno estabelecida = CR X 0,6

3.2. Quantidade de gua a adicionar para atingir CR (60 %)


gua (mL) = CR (60 %) - AS

147

ANEXO 4
Padronizao de soluo de hidrxido de sdio 0,5 N
1. Introduo
O NaOH no padro primrio, porque higroscpio e sempre contm
uma quantidade indeterminada de gua e carbonato de sdio adsorvida no slido.
Isso significa que as solues de NaOH devem ser padronizadas com um reagente
padro primrio. O padro primrio mais utilizado nessa determinao o ftalato
cido de potssio ou biftalato de potssio HKC6H4(COO)2. Pela estequiometria, um
mol de biftalato neutraliza um mol de hidrxido de sdio.
As solues de hidrxido de sdio atacam o vidro e dissolvem a slica com
formao de silicatos solveis. A presena de silicatos solveis causa erros e as solues de hidrxidos devem ser conservadas em frascos de polietileno.

2. Material
a)

Equipamento: balana analtica, agitador magntico;

b) Vidraria: bureta de 25 mL, balo volumtrico de 100 mL, bqueres de


250 e 500 mL, funil de vidro, conta-gotas, Erlenmeyer de 250 mL, pipeta
de 10 mL;
c) Reagentes: KHC8H4O4, PM = 204,224 e NaOH, PM = 40,0; e,
d) Outros: pisseta, suporte universal, garras e conta-gotas.

3. Metodologia
3.1 Preparo da soluo de NaOH 0,5 M
Pesar aproximadamente 20,0 g de hidrxido de sdio em um bquer plstico de 500 mL e dissolver em gua destilada fervida (livre de CO2); transferir para
um balo volumtrico de 1.000 mL com auxlio de um funil e completar com gua
destilada e armazenar em um recipiente com tampa. Separar 100 mL em um bquer
de 250 mL, para a padronizao, ou seja, determinao da molaridade real.

148

3.2 Preparo da soluo de biftalato de potssio 0,5 M


a)

Pesar em triplicata 5,1056 g a 5,200 g de biftalato de potssio, seco por


2 h em estufa a 110 C, em um bquer de 100 mL, utilizando balana
analtica;

b)

Adicionar 25 mL de gua destilada, agitando com um basto de vidro at


a completa dissoluo. Com auxlio de um funil, transferir para um balo
de 50 mL e completar com gua destilada.

c) Transferir aproximadamente 25 mL da soluo para um bquer de 50


mL, em seguida pipetar 10 mL; e,
d)

Transferir, com auxlio de um funil, para um Erlenmeyer de 125 mL e adicionar duas gotas do indicador fenolftalena (1 %).

3.3 Titulao
A soluo de biftalato de potssio, aps adio do indicador, ser posicionada no sistema como titulado e o NaOH como titulante, a titulao terminar com
a mudana de cor de incolor para rosa avermelhada.

4. Clculo
Molaridade real do NaOH
m = (g/M)*v
Onde:
m: molaridade real do NaOH;
g: massa do biftalato de potssio (g);
M: massa molar do biftalato de potssio (g); e,
v: volume de NaOH gasto na titulao (L).
Anexo 4. Determinao da molaridade exata de uma soluo de NaOH.
Massa do HKC6H4(COO)2 (g)
1.
2.
3.
Molaridade real (mdia de trs repeties)

Volume de NaOH (mL)

Molaridade real

149

ANEXO 5
Soluo DESS (250 mL)
a) Pesar 26,23 g de EDTA sdico (com peso molecular de 372, 24 g mol-1,
certificar-se de que o EDTA seja dissdico, a massa pode variar, dependendo do peso molecular), passar para um bquer e acrescentar gua
deionizada at completar 50 mL;
b) Ajustar o pH da soluo com NaOH (hidrxido de sdio) 1 molar (o pH
inicial da soluo est em torno de 3 a 4), adicionar a soluo at atingir
pH 7,5 (consumir aproximadamente 50 mL, o EDTA comear a dissolver lentamente, pode-se aquecer a 30 C para facilitar a dissoluo);
c) Depois de dissolvido todo o EDTA, acrescentar gua deionizada at
200 mL;
d) Acrescentar 50 mL de soluo DMSO a 20 % (Anexo 1);
e)

Agitar manualmente durante alguns minutos;

f)

Adicionar NaCl at a saturao (formao de cristais no fundo do recipiente); e,

g)

Passar a soluo para um frasco, tomando o cuidado de no verter os cristais precipitados no fundo, identificar e armazenar em lugar adequado.

150

ANEXO 6
Chave pictria para identificao de famlias (Collembola,
Entognatha) (GISIN, 1960)
1.

Corpo comprido. Os segmentos do trax e abdmen visivelmente divididos (no mximo, os 2-3 fundidos) (Subordem Arthropleona)..................2
-

Corpo arredondado. Trax e os primeiros segmentos do abdmen


unidos (Subordem Symphypleona)....................................................5

2.

Trax I desenvolvido, com, no mnimo, uma pequena seta dorsal (Seo


Poduromorpha)............................................................................................3

Trax I totalmente desprovido de setas e/ou pelos. Tergito do Trax I no


desenvolvido (Seo Entomobryomorpha).................................................4

3.

Sem pseudoceles, maioria pigmentados. Com ou sem ocelos......Poduridae


-

Com pseudoceles (geralmente poros na pele, nos vrios segmentos do corpo). Maioria sem pigmentao, brancos. Sempre sem ocelos....................................................................................Onychiuridae

4. Corpo sem escamas. Com setas, em ponta. Sem pelos em forma de


clava, na face dorsal. Abd. III e IV no diferem muito em comprimento.................................................................................................Isotomidae
-

5.

Corpo com escamas, ou, quando sem, pelo menos pelos em forma de
clava, principalmente na regio dorsal do trax. Abd. IV geralmente
mais longo que Abd. III. Frcula bem desenvolvida...Entomobryidae

nica famlia de Symphypleona............................................Smynthuridae

151

ANEXO 7
Chave pictria para identificao de famlias
(COLLEMBOLA; SAUTTER, 1994)

152

ANEXO 8
Chave para identificao de algumas famlias de
Oligochaeta (TALAVERA, 1990)
1.

Prstatas ausentes. Poros masculinos preclitelares..................Lumbricidae

Prstatas presentes. Poros masculinos no preclitelares..........................2

2. Estrutura prosttica do tipo racemosa. Poros masculinos posclitelares.........................................................................................Megascolecidae


Estrutura prosttica do tipo tubular. Poros masculinos em outra posio.....3

3.

Sistema excretor meronefreniano.........................................Octochaetidae

Sistema excretor holonefreniano................................................................4

4.

Glndulas calcferas ausentes. Poros masculinos na margem posterior do


clitelo...................................................................................Acanthodrilidae

Glndulas calcferas presentes. Poros masculinos geralmente intracelulares..........................................................................................Ocnerodrilidae

PARCERIA