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FEDERICO VILLARREAL
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y
MATEMTICA
ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGA
ROMERO
CARHUAVILCA,
Biologa Molecular
B
Milagros Quintana
2016
Daisy
Prctica N1:
Tcnicas de Aislamiento de cidos Nucleicos: Preparacin de
muestras
Cuestionario:
1. Explique en qu consiste la sonicacin. En qu tipo de
muestras es empleada?
La sonicacin es el proceso de convertir una seal elctrica en una vibracin
fsica que puede ser dirigida hacia una sustancia. Los sonicadores son
equipos vitales de laboratorio y se utilizan para muchos propsitos.
La sonicacin se realiza generalmente para separar compuestos o clulas
para su examen ms detallado. La vibracin tiene un efecto muy poderoso
en las soluciones, haciendo que sus molculas se separen y las clulas se
rompan. Un primer ejemplo est en las pruebas de ADN, donde las clulas
que pueden contener informacin del ADN son sometidas a la sonicacin
para poderlas romper para que as liberen las protenas del ADN para poder
ser probadas.
2. Qu consideraciones deben tenerse para extraer ADN de
bacterias Gram positivas? En qu difiere de un protocolo de
extraccin de ADN de Gram negativas?
Una bacteria gram positiva posee una pared gruesa de peptidoglicano,
mientras que la gram negativa posee una pared fina de peptidoglicano
seguida hacia
dominio
basolateral,
dominio
apical,
etc.),
complejos
1. HOMOGENIZACION
Se trata de romper las clulas con la ayuda de un mbolo rotatorio que
se ajusta perfectamente a las gruesas paredes de un tubo de cristal
especial, el homogenizador. Clulas anexas: primero se deben romper
conexiones con otras clulas. Clulas no anexas: pueden separarse teniendo
en cuenta forma, densidad o caractersticas que puedan marcarse. Existen
dispositivos de homogenizacin en los que est calibrada la separacin
entre el mbolo y la pared de cristal para producir homogenizados con un
tamao de partcula determinado. Consiste en el procesamiento del tejido y
posteriormente de las clulas con el fin de obtener una mezcla fluida en la
cual estn todos los componentes celulares, para lo cual podemos recurrir a
diversos mtodos fsicos.
1.1. SHOCK OSMOTICO
La clulas se hacen estallar al someterlas a un medio hipotnico, lo cual
hace que la membrana no resista la presin osmtica. Puede ocasionar el
dao a las membranas de algunas organelas.No se recomienda porque en
algunas Organelas se lesiona la membrana. Es utilizado para el aislamiento:
Mitocondria y Cromosomas Mitticos
1.2. MORTERO Y MANO
Es un mtodo convencional de rompimiento por friccin. Pueden
emplearse materiales abrasivos como cuarzo, vidrio molido, arena, o
materiales silceos. La masa celular contenida en un volumen de buffer se
mezcla con un volumen de medio moledor (0.5 1). La friccin sobre las
clulas genera calor que puede afectar la actividad que se desea estudiar.
Actualmente se dispone de homogenizadores ms sofisticados que emplean
el mismo principio, pero que permiten controlar el nivel de friccin y la
temperatura del proceso, son conocidos como potters. Los principales
problemas de esta tcnica son: la eficiencia baja cuando se usan pequeas
cantidades de medio moledor cuando es baja la concentracin celular; la
friccin genera calor y pueden presentarse alteracin en las protenas
1.3. SONICACION
Consiste en la aplicacin de ultrasonidos a una suspensin celular. La
intensa
agitacin
producida
destruye
las
membranas
celulares.
asimismo
complejos
las
proteicos.
sobrecalentamiento
estructuras
Se
de
suele
las
subcelulares
aplicar
muestras
en
incluso
frio
para
que
podra
solubilizar
evitar
el
provocar
la
burbujas
pulgada2.
1.5. CONGELAMIENTO - DESCONGELAMIENTO
Requiere de periodos prolongados de tiempo (hasta 36 horas) para el
congelamiento y descongelamiento. El lquido al congelarse a -56 C forma
cristales muy finos que rompen la clula cuando esta se descongela
rpidamente a 37C. El lquido al congelarse (-56C) provoca la formacin
Tris-HCl 1M pH 8
EDTA 0.5M
SDS 10%
NaCl 5M
Proteinasa K 20 mg/ml
Etanol absoluto
Procedimiento:
Realizar los clculos adecuados para preparar los siguientes buffers y
soluciones a partir de las soluciones stocks anteriormente citados en
materiales y reactivos:
1. 10 ml Buffer TE (Tris-HCl 10mM, pH 8; EDTA 1 mM)
C o . V o=C f . V f
1000 mM .V o=10 mM . 10 ml
Tris-HCl 10mM
C o . V o=C f . V f
V o=0.1ml
500 mM .V o=1 m M .10 ml
EDTA 1 mM
V o=0.02ml
C o . V o=C f . V f
1000 mM .V o=25 mM . 10 ml
Tris-HCl 25mM
V o=0.25 ml
C o . V o=C f . V f
EDTA 20mM
500 mM .V o=20 mM . 10 ml
V o=0.4 ml
C o . V o=C f . V f
Tris-HCl 25mM
1000 mM .V o=50 mM . 2 ml
V o=0.1ml
C o . V o=C f . V f
500 mM .V o=1 mM . 2ml
EDTA 1mM
5.
M=
m
PM .V
M=
m
77,08 x 0.01
5 ml Buffer de lisis para aislar ADN E. coli (High TE; NaCl 0.15 M;
SDS 0.2%)
M =7,708 g
C o . V o=C f . V f
1000 mM .V o=25 mM . 5 ml
Tris-HCl 25mM
V o=0.125ml
C o . V o=C f . V f
500 mM .V o=20 mM . 5 ml
EDTA 20mM
C o . V o=C f . V f
V o=0.2ml
5000 mM .V o=0.15 M . 5 ml
NaCl 0.15M
V o=0.15 ml=150 uL
10 . V =0.2 . 5 ml
V =0.1 ml
SDS 0.2 %
C o . V o=C f . V f
1000 mM .V o=100 mM . 30 ml
Tris-HCl 100mM
V o=3 ml
C o . V o=C f . V f
500 mM .V o=5 mM . 30 ml
EDTA 5mM
V o=0.3 ml
C o . V o=C f . V f
500 mM .V o=2000 mM . 30 ml
V o=1,2 ml
NaCl 200mM
10 . V =0.2 . 30 ml
SDS 0.2 %
V =0.6 ml
20
mg
mg
x V =0.1
X 30 ml
ml
ml
Proteina
C o . V o=C f . V f
Tris-HCl 25mM
1000 mM .V o=200 mM . 5 ml
V o=1 ml
C o . V o=C f . V f
500 mM .V o=25 mM . 5 ml
EDTA 25mM
V o=0.25 ml
C o . V o=C f . V f
5 M . V o=0.25mM .5 ml
NaCl 0.25M
V o=0,25 ml
10 . V =0.5 .5 ml
SDS 0.5 %
V =0.25 ml