CAPTULO 2.3.2.

BRONQUITIS INFECCIOSA AVIAR

RESUMEN
La bronquitis infecciosa aviar (BIA) est causada por el virus coronavirus de la bronquitis infecciosa
(IBV). El virus causa la infeccin principalmente en los pollos y es un patgeno importante de las
aves de abasto y de las ponedoras. La BIA es una enfermedad aguda y contagiosa que se
caracteriza fundamentalmente por sntomas respiratorios en pollos de cebo. En las gallinas se
observa a menudo una disminucin de la puesta y de su calidad. Algunas cepas del virus son
nefropatgenas y producen nefritis intersticial y mortalidad. La gravedad de la enfermedad
respiratoria inducida por el IBV se ve incrementada por la presencia de patgenos bacterianos,
desembocando en aerosaculitis crnica y complicada. El diagnstico de la BIA requiere el
aislamiento del virus o la demostracin del cido nucleico vrico de las bandadas enfermas. Puede
ser til la demostracin de un aumento de la respuesta de los anticuerpos sricos. El uso
extendido de vacunas vivas e inactivadas puede complicar tanto la interpretacin del aislamiento
del virus como los hallazgos serolgicos. La presencia de cepas antignicas variables puede
anular la inmunidad inducida por la vacunacin.
El diagnstico requiere pruebas de laboratorio. Se prefiere el aislamiento y la identificacin del
virus. Generalmente se utilizan las tcnicas de la reaccin en cadena de la polimerasa de
transcripcin inversa (RT-PCR para identificar el genotipo del IBV. Para el diagnstico serolgico,
generalmente se utilizan las pruebas de inhibicin de la hemoaglutinacin (IH) para determinar el
serotipo y los inmunoensayos (ELISA) para un anlisis general. Las pruebas complementarias
incluyen la microscopa electrnica, el uso de anticuerpos monoclonales, la neutralizacin vrica
(NV), las pruebas histoqumicas o de fluorescencia y los ensayos de desafo para la inmunizacin
en pollos.
Identificacin del agente: Para la forma respiratoria ms comn, el aislamiento ms eficaz del
IBV es el que se hace a partir de la mucosa traqueal y de los pulmones entre varios das y una
semana despus de la infeccin. Para otras formas de la BI, las mejores fuentes de virus son el
rin, el oviducto, las amgdalas cecales del tracto intestinal, o los tejidos del proventrculo,
dependiendo de la patognesis de la enfermedad.
Para el aislamiento del virus, pueden utilizarse embriones de pollo libres de patgenos especficos
o cultivos de rganos traqueales (COT) de embriones. Despus de la inoculacin de la cavidad
alantoidea, el IBV produce embriones enanos o deformados, distrofia del plumn, o depsitos de
ureato en el mesonefros del rin, generalmente dentro de los tres pases seriados. El aislamiento
en COT tiene la ventaja de que el IBV produce en la inoculacin inicial una paresia de los cilios
traqueales.
La RT-PCR se est utilizando cada vez ms para identificar el genotipo de la glicoprotena de la
espcula (S) de las cepas de campo del IBV. La genotipificacin en la que se utilizan cebadores
especficos para la subunidad S1 del gen S o la secuencia del mismo gen, generalmente
proporciona hallazgos similares, pero no siempre idnticos, mediante la IH o la serotipificacin por
NV. Alternativamente, se pueden utilizar pruebas de NV o de IH en las que se usan antisueros
especficos para identificar el serotipo.
Pruebas serolgicas: Pueden utilizarse kits comerciales ELISA para controlar la respuesta de los
anticuerpos sricos. Los antgenos utilizados en los kits son en general de reaccin cruzada entre
los serotipos y permiten el control serolgico general de las respuestas vacunales y de los desafos
de campo. La prueba de la IH se utiliza para identificar las respuestas de los serotipos especficos
a la vacunacin y a los desafos de campo, especialmente en pollos jvenes de engorde. Debido a
las mltiples infecciones y a las vacunaciones, los sueros de las reproductoras y de las ponedoras

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contienen anticuerpos de reaccin cruzada y los resultados de la prueba de la IH no pueden

utilizarse con un alto grado de confianza.
Requisitos para las vacunas y el material de diagnstico: Se dispone de vacunas vivas
atenuadas y de vacunas inactivadas en emulsiones con aceite. Las vacunas vivas atenuadas por
pasos seriados en embriones de pollo o por tratamiento trmico confieren mejor inmunidad local
del tracto respiratorio que las vacunas inactivadas. El uso de vacunas vivas conlleva un riesgo de
patogenicidad residual asociada con el pase de la vacuna en aves. Sin embargo, por lo general,
una aplicacin masiva adecuada da por resultado una aplicacin segura de las vacunas vivas.
Las vacunas inactivadas se inyectan en una nica dosis, y a menos que se hayan administrado
previamente una o ms vacunas vivas primarias del IBV, no confieren proteccin. Ambos tipos de
vacunas estn disponibles conjuntamente con la vacuna contra la enfermedad de Newcastle; en
algunos pases se dispone de vacunas inactivadas multivalentes que incluyen los antgenos de la
enfermedad de Newcastle, de la bursitis infecciosa, del reovirus y del sndrome 76, que provoca un
descenso en la produccin de huevos.

A. INTRODUCCIN
La bronquitis infecciosa aviar (BIA) se describi inicialmente en los aos treinta en los EE.UU. como una
enfermedad respiratoria aguda presente sobre todo en pollos jvenes. Se estableci su etiologa vrica y al
agente se le denomin virus de la bronquitis infecciosa aviar. El virus (IBV) es un miembro del gnero
Coronavirus, de la familia Coronaviridae, del orden Nidovirales. El IBV y otros coronavirus aviares de los patos y
los faisanes se clasifican como coronavirus del grupo 3, con coronavirus de mamferos incluidos en los grupos 1,
2 y 4 (perteneciendo al grupo 4 el coronavirus del sndrome respiratorio agudo y severo (SARS), de identificacin
ms reciente (6). Los coronavirus tienen un genoma de ARN de cadena nica, no segmentado, y con polaridad
de mensajero.
La BI afecta a pollos de todas las edades, los cuales, con la excepcin de los faisanes (10) y las gallinas de
guinea, son la nica especie descrita como receptora de infecciones naturales. Esta enfermedad se transmite va
aergena, por contacto directo entre los pollos e indirectamente por la propagacin mecnica (mediante los
utensilios para las aves de corral contaminados o el material de embalaje de huevos, abono utilizado como
fertilizante, visitas a las granjas, etc.) La BIA se encuentra extendida por todo el mundo y presenta varias formas
clnicas, siendo la forma principal una enfermedad que se desarrolla despus de la infeccin de los tejidos del
tracto respiratorio, seguido de la inhalacin o la ingestin. La infeccin del oviducto puede originar lesiones
permanentes en las aves inmaduras y en las gallinas, y puede dar lugar al cese de la puesta de huevos o la
produccin de huevos con cscaras de paredes finas y prdida de pigmentacin. La BI puede ser nefropatgena,
causando entonces nefritis aguda, urolitiasis y mortalidad (11). Despus de una recuperacin aparente, la nefritis
crnica puede producir la muerte en una fase posterior. Se ha informado de que el IBV produce la enfermedad
en el proventrculo (49). Las cepas vacunales y de campo del IBV pueden persistir en las amgdalas cecales del
tracto intestinal y excretarse en las heces durante semanas o durante un perodo ms largo en pollos
clnicamente normales (2). Para una revisin en profundidad de la BI, vase Cavanagh & Naqi (11). Tambin
est disponible una discusin detallada sobre los ensayos para la deteccin del antgeno del IBV, del genoma y
de anticuerpos preparados por De Wit (24).
No ha habido descripciones de infeccin humana por el IBV.

B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
La confirmacin del diagnstico se basa en la demostracin del virus, algunas veces en el aislamiento apoyado
en ocasiones por datos serolgicos. Se hace un uso muy amplio de vacunas vivas y de vacunas inactivadas, lo
cual puede complicar el diagnstico por mtodos serolgicos, porque los anticuerpos debidos a la vacunacin y a
la infeccin natural no siempre pueden distinguirse. La persistencia del virus de vacunas vivas tambin puede
equivocar los ensayos de recogida de la cepa de campo del agente causal.

1.

Identificacin del agente

a)

Muestreo
Se deben obtener muestras apropiadas para la forma de BI observada tan pronto como sean evidentes los
sntomas de la enfermedad clnica. Las muestras deben colocarse en medio de transporte fro y deben

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congelarse lo antes posible. Debe mantenerse la cadena de fro desde las aves hasta el laboratorio. Para
enfermedades respiratorias agudas, los frotis del tracto respiratorio superior en el caso de aves vivas, o los
tejidos traqueales o pulmonares en el caso de aves muertas, se deben recoger y colocar en medio de
transporte que contenga penicilina (10.000 Unidades Internacionales [UI]/ml) y estreptomicina (10 mg/ml),
guardarlos en hielo y luego congelarlos. Para aves con nefritis o problemas en la produccin de huevos,
deben recogerse las muestras de los riones o del oviducto respectivamente, adems de las muestras
respiratorias. En algunos casos puede ser deseable la identificacin del IBV por la reaccin en cadena de la
polimerasa (RT-PCR) sin el aislamiento del virus. En este caso, los frotis del tracto respiratorio o de la
cloaca, pueden entregarse solos sin colocarlos en medio de transporte lquido (8). En situaciones en las
que se sospeche una nefritis causada por la BI, las muestras de rin tambin deben seleccionarse de las
canales para el examen histopatolgico, as como para el aislamiento del virus. Tambin deben someterse
a examen serolgico las muestras de sangre de las aves gravemente afectadas as como de pollos
convalecientes. Se ha descrito una tasa alta de aislamiento del virus del ganglio cecal y de las heces (2).
Sin embargo, los aislamientos del tracto intestinal pueden no tener relevancia en la infeccin final o en la
enfermedad clnica. Puede facilitarse el aislamiento de IBV utilizando pollos libres de patgenos especficos
testigo (SPF), puestos en contacto una o ms veces con aves de corral comerciales (25).

b)

Cultivo
Las suspensiones de tejidos (1020% p/v) se preparan en solucin salina tamponada con fosfato (PBS), o
en caldo nutritivo para inoculacin de huevos, o en medio de cultivo para inoculacin de cultivos de rganos
traqueales (TOC) (17). Las suspensiones se clarifican mediante centrifugacin a baja velocidad, y filtracin
en filtros bacteriolgicos (0,2 ), antes de inocular en huevos o en los TOC.
Los huevos embrionados de pollo y los TOC se utilizan para el aislamiento primario del IBV.
No se recomiendan los cultivos celulares para el aislamiento primario dado que a menudo es necesario
adaptar los aislamientos del IBV al crecimiento en embriones de pollo antes de que se produzca el efecto
citoptico (ECP) en las clulas de rin de los embriones de pollo.
Los huevos embrionados que se utilizan en el aislamiento del virus deben proceder de pollos SPF o de
reproductoras que no hayan sido infectados ni vacunados con el IBV. Por lo general, la muestra de
sobrenadante de 0,1-0,2 ml se inocula en la cavidad alantoidea de los embriones de 911das. Los huevos
se miran al trasluz diariamente durante 7 das y la mortalidad dentro de las primeras 24 horas se considera
inespecfica. Generalmente, la inoculacin inicial tiene efectos macroscpicos limitados en los embriones, a
menos que la cepa derive de una vacuna que ya est adaptada al huevo. Normalmente, los lquidos
alantoideos de todos los huevos se juntan 3 das despus de la infeccin; este depsito se diluye 1/5 o 1/10
con caldo con antibiticos y se pasa a otro grupo de huevos, hasta un total de 3 o 4 pases. Normalmente,
una cepa de campo inducir cambios observables en el embrin, que consisten en la aparicin de
embriones enanos o deformados, con distrofia en las plumas y depsitos de ureato en el mesonefros
embrionario en los pases segundo al cuarto. Puede ocurrir la muerte de embriones en pases posteriores
cuando la cepa empieza a estar ms adaptada al huevo. Otros virus, sobre todo los adenovirus, que son
comunes en el tracto respiratorio, pueden producir tambin lesiones embrionarias indistinguibles de las del
IBV. El lquido alantoideo repleto de IBV no debera aglutinar eritrocitos, y el aislamiento de IBV debe
confirmarse por serotipificacin o genotipificacin. Los lquidos alantoideos infecciosos se guardan a 20C
o a una temperatura inferior para un perodo corto de almacenamiento y a -60C para un almacenamiento a
largo plazo, o a 4C despus de su liofilizacin.
Para aislar el IBV directamente del material de campo (17) se pueden utilizar los TOC a partir de embriones
de 20 das. Es aconsejable un cortador automtico de tejidos para la produccin a gran escala de secciones
de corte o de anillos de la trquea por esta tcnica (21). Los anillos son de un grosor comprendido entre
0,5 y 1,0 mm y se mantienen en medio de Eagle con cido N-2-hidroxietilpiperazina N-2-etanosulfnico
(HEPES) en frascos rotatorios (15 rev/hora) a 37C. La infeccin de cultivos traqueales produce paresia de
los cilios en 24-48 horas. La cilioparesia puede producirse por otros virus, y los casos sopechosos de IBV
se deben confirmar mediante la serotipificacin o la genotipificacin.

c)

Mtodos de identificacin
Las pruebas iniciales realizadas sobre los aislamientos del IBV estn dirigidas a descartar otros virus de
consideracin diagnstica. Se recogen las membranas corioalantoideas de los huevos infectados, se
homogeneizan y se prueban para el grupo 1 de adenovirus aviar por inmunodifusin o por la PCR. Son
comunes las infecciones por adenovirus aviar del Grupo 1 de los pollos comerciales, y el virus
generalmente produce embriones enanos que no se pueden distinguir de los embriones infectados por el
IBV. Es ms, el lquido alantoideo recogido no hemoaglutina (HA) los eritrocitos de los polluelos. Para la
identificacin de un aislamiento de IBV como tal, normalmente se utilizan pruebas basadas en la gentica
(RT-PCR o RT-PCR-RFLP [polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restriccin]. Pueden utilizarse
otras tcnicas, por ejemplo, se pueden probar para antgeno del IBV las clulas presentes en el lquido

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alantoideo de huevos infectados mediante pruebas de la inmunofluorescencia directa (12), y la microscopa

electrnica directa con tincin negativa para revelar la presencia de partculas con la morfologa tpica de
los coronavirus en concentrados del lquido alantoideo o de los TOC. La presencia del IBV en el lquido
alantoideo infeccioso se puede detectar por amplificacin con RT-PCR y mediante una prueba de
hibridacin puntual utilizando una sonda de ADN (32). Se ha descrito la tincin directa por
inmunofluorescencia de los TOC infectados para la deteccin rpida de la presencia del IBV (3). En las
membranas corioalantoideas infectadas se puede utilizar la inmunohistoqumica, con un anticuerpo
monoclonal especfico (MAb) de grupo, para identificar el IBV (43).

d)

Identificacin del serotipo

Es comn la variacin antignica entre las cepas de IBV (11, 16, 23, 28, 31), pero en la actualidad no hay
acuerdo sobre un sistema de clasificacin definitivo. Sin embargo, las relaciones y diferencias antignicas
entre las cepas son importantes, pues las vacunas basadas en un serotipo particular pueden mostrar una
escasa o nula proteccin frente a los virus de un grupo antignico distinto. Como consecuencia de la
aparicin regular de las variantes antignicas, los virus, y por lo tanto, la enfermedad y las vacunas, pueden
ser muy diferentes en sitios geogrficos distintos. Es necesaria una valoracin continua de los virus
presentes en el ambiente natural para producir vacunas que sean eficaces de cara a las variantes
antignicas que surjan. La serotipificacin de aislamientos y de cepas de IBV se ha realizado utilizando
pruebas de inhibicin de la hemoaglutinacin (IH) (1, 36) y la neutralizacin del virus (NV) en embriones de
polluelos (23), en los TOC (22) y en cultivos celulares (29). Tambin se ha empleado la neutralizacin de
focos fluorescentes para diferenciar cepas (19).
Los MAb, que normalmente se utilizan en enzimoinmunoensayos (ELISA), han resultado tiles para agrupar
y diferenciar las cepas del IBV (30, 38). Las limitaciones de la definicin del serotipo de Ia BIA mediante
anlisis por MAb derivan de la falta de disponibilidad de MAb o de hibridomas y de la necesidad de producir
nuevos MAb con especificidad apropiada al mismo ritmo con el que emergen los nuevos serotipos variantes
de BIA (34).

e)

Identificacin genotpica
Los mtodos de genotipificacin de la RC-PCR han sustituido mayoritariamente a la IH y la NV para
determinar la identificacin de una cepa de campo.
Se han investigado las bases moleculares de la variacin antignica, generalmente mediante secuenciacin
de los nucletidos del gen que codifica la protena de las proyecciones o espculas (S) o, ms
especficamente, por secuenciacin de los nucletidos del gen que codifica la subunidad S1 de la protena
S (5, 40), que es donde se encuentra la mayora de los epitopos a los que se unen los anticuerpos
neutralizantes (39). No se ha detectado una correlacin exacta con los resultados de la IH o la NV, pues,
mientras los distintos serotipos suelen tener grandes diferencias (2050%) en la secuencia deducida de
aminocidos de la subunidad S1 (40), otros virus que son claramente distintos en las pruebas de
neutralizacin solo muestran un 23% de diferencia en la secuencia de aminocidos (5). No obstante, en
general hay una buena correlacin entre los datos representados por la secuencia de S1 y el serotipo por
NV, y eventualmente ser posible seleccionar cepas vacunales teniendo en cuenta los datos de las
secuencias.
Laa principales ventajas de los mtodos de genotipificacin son: un tiempo rpido de respuesta y la
habilidad para detectar una variedad de genotipos dependiendo de las pruebas utilizadas. La RFLP RTPCR diferencia los serotipos del IBV basados en patrones nicos de las bandas por la electroforesis que
forman los fragmentos de S1 digeridos por los enzimas de restriccin tras la amplificacin del gen por la RTPCR (33, 41). El procedimiento RFLP RT-PCR puede utilizarse en conjuncin con una sonda de ADN
marcado con biotina para primero detectar el IBV en fluidos de huevo recogidos despus de la inoculacin
de huevos con muestras clnicas (32). Mediante la prueba de la RFLP RT-PCR se pueden identificar todos
los serotipos conocidos del IBV as como las variantes vricas.
Puede utilizarse el genotipo especfico S1 de RT PCR para identificar serotipos especficos del IBV (35).
Los cebadores especficos del gen S1 para serotipos de Massachussets (Mass), Connecticut, Arkansas y
JMK se utilizan en conjuncin con un juego de cebadores universal que amplifica todos los serotipos del
IBV. Tambin se han elaborado los cebadores para los serotipos DE/072/92 y California. Puede que otras
variantes de serotipos resulten ser del IBV si se utilizan cebadores universales, pero no puede identificarse
el serotipo especfico. Se pueden identificar las infecciones causadas por mltiples serotipos de IBV.
La secuenciacin de los nucletidos de un fragmento del gen S1 relevante para diagnstico es la tcnica
ms utilizada para la diferenciacin de las cepas del IBV y se ha convertido en el mtodo de
genotipificacin preferido en muchos laboratorios. La secuenciacin de los nucletidos tambin prueba que
la recombinacin entre las cepas de BI ocurre con frecuencia (7, 50). La secuenciacin de los ciclos del
producto de la RT-PCR correspondiente a la regin amino-terminal hipervariable del S1 puede utilizarse en

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diagnstico para identificar los asilamientos de campo previamente reconocidos, as como sus variantes
(37). La comparacin y el anlisis de secuencias de aislamientos de campo desconocidos y de sus
variantes, tambin desconocidas, con cepas de referencia para establecer su posible relacin constituyen
ventajas significativas de la secuenciacin.
Recientemente, se ha comprobado que los coronavirus aislados en pavos y faisanes son genticamente
similares al IBV, mostrando una identidad nucleotdica de aproximadamente el 90% en la regin II muy
conservada del extremo 3 no traducible (UTR) del genoma del IBV (9, 10). No se ha establecido el posible
papel de estos coronavirus en las infecciones por IBV.
Las pruebas de la RT-PCR se utilizan principalmente para la identificacin del virus y su aplicacin para el
avance del conocimiento en las investigaciones epidemiolgicas durante los brotes del IBV. Sin embargo,
las pruebas de la RT-PCR, tal como existen ahora, no proporcionan informacin sobre la patogenicidad
vrica.

Procedimiento de la prueba RT-PCR

i)

Extraccin de ARN vrico

Puede utilizarse cualquier mtodo de extraccin de ARN. Estn disponibles muchos protocolos en
revistas, libros y en la Red. Sin embargo, para extraer ARN de alta calidad del lquido alantoideo se
recomienda el Mini kit Qiagen Viral RNA (www.qiagen.com). Este Mini kit est recomendado para
extraer el ARN del IBV de tejidos o frotis. Todos los ARN extrados deben almacenarse entre 20C y
80C, hasta que sean probados. Para un almacenamiento largo, se aconseja guardar el ARN a
80C.

ii)

Oligos comerciales
Los ligos comerciales pueden comprarse a travs de cualquier proveedor comercial. Operon
(www.operon.com) ha estado fabricando ligos comerciales de calidad durante varios aos. El gen
diana para la caracterizacin del IBV es la subunidad S1 del gen de la glicoprotena de las espculas.
Un par de cebadores comnmente utilizado para la amplificacin de cepas del IBV de diferentes
genotipos es el ligo S15 mod (directo): 5-TGA-AAA-CTG-AAC-AAA-AGA-3 y CK2 (inverso): 5CNG-TRT-TRT-AYT-GRC-A-3 (26). El amplicn S15mod/CK2 del ligo tiene una longitud de
aproximadamente 700 pb empezando desde el comienzo del gen S1 y extendindose por las dos
regiones hipervariables utilizadas para la genotipificacin.

iii)

Reaccin en cadena de la polimerasa con transcripcin inversa

Estn disponibles en el mercado muchos kits de la RT-PCR de uno y dos pasos de fabricantes de los
que se afirma que poseen una gran sensibilidad y fidelidad de los enzimas. El kit de RT-PCR ms
recomendado es el kit bsico, de dos pasos, para ARN de Applied Biosystems
(http://www.appliedbiosystems.com). La transcripcin inversa se realiza de acuerdo a las instrucciones
del fabricante. La preparacin de la RT se lleva a cabo utilizando hexmeros aleatorios (suministrados
con el kit) o con el cebador inverso de PCR, en este caso CK2 (35). Un ciclo de RT se realiza con los
siguientes parmetros: 25C durante 10 minutos, 42C durante 25 minutos, 95C durante 5 minutos y
se mantiene a 4C. El volumen de reaccin total de la RT se aade a la muestra base de reaccin
para la PCR. La PCR se realiza utilizando los siguientes parmetros: 95C durante 2 minutos,
45 ciclos de 95C durante 30 segundos, 52C durante 30 segundos, 68C durante 30 segundos,
extensin final de 68C durante 12 minutos, y se mantiene a 4C. Las muestras se concentran en un
evaporador durante toda la noche o mediante el uso de centrifugado al vaco. Las muestras secas se
resuspenden en 12 l de agua tratada con DEPC y 6 l de tampn de carga antes de la electroforesis
en un gel de agarosa al 1,8% que contenga bromuro de etidio. Los geles se visualizan con una caja
con luz UV. Las bandas se comparan con una escalera de 100 pares de bases disponible en el
mercado y con un control positivo de IBV.

iv)

Secuenciacin del gen S1

Se suprimen del gel de agarosa las bandas visualizadas que sean de tamao similar al control
positivo. El producto de la PCR se separa del gel de agarosa utilizando el kit Qiagen Gel Extraction
(www.qiagen.com) u otro kit de extraccin de gel comercializado. Los productos de la PCR purificados
se corren en un segundo gel de agarosa al 1,8% con bromuro de etidio para determinar la cantidad de
producto presente. Se necesitan aproximadamente 20 l (10 ng/l) del producto de la PCR para la
secuenciacin. La secuenciacin se puede realizar en el Sequencing & Genotyping Center de la
Universidad de Delaware, Newark, DE (http://www.udel.edu/dnasequence) o en otra universidad o
instalacin de secuenciacin comercial. Los cromatogramas de secuencia se editan utilizando el
software de anlisis ADNStar o el programa 4peaks de uso libre en la Red
(http://mekentosj.com/4peaks/) o chromas lite (http://www.technelysium.com.au/chromas_lite.html).
Las secuencias de aislamientos del IBV editadas se caracterizan mediante el uso de BLASTn para
nucletidos o BLASTp para el anlisis de proteinas (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).

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2.

Pruebas serolgicas

Se han descrito varias pruebas. Las que se consideran aqu comprenden la NV (23), la inmunodifusin en gel de
agar (IGDA) (48), la IH (1) y los ELISA (42). Cada prueba tiene sus ventajas e inconvenientes respecto a la
realizacin, la especificidad, la sensibilidad y el coste. En general, para pruebas serolgicas rutinarias, las
pruebas de la NV son demasiado costosas y poco prcticas y las de tipo IGDA carecen de sensibilidad. Las
pruebas ELISA e IH son muy adecuadas para la serologa de rutina. Los ELISA son tiles para el control general
de la exposicin al IBV y pueden detectar las respuestas de anticuerpos a todos los serotipos. Cuando la IH se
utiliza en sueros de pollos jvenes en crecimiento tales como pollas y pollos para carne (broilers), puede
proporcionar informacin sobre el estado de los anticuerpos especficos de serotipo en la bandada. El control
regular de los sueros de las poblaciones aviares respecto a los ttulos de anticuerpo contra BIA puede servir de
ayuda para indicar el nivel de respuesta a la vacuna o al desafo natural. Debido a que los sueros de pollo de
ms edad, contienen anticuerpos que presentan fuerte reaccin cruzada contra cepas antignicamente no
relacionadas, no se puede utilizar el serodiagnstico de brotes sospechosos de la enfermedad con un grado alto
de seguridad.

a)

Neutralizacin del virus

En las pruebas de NV, todos los sueros se deben calentar primero a 56C durante 30 minutos. El virus se
mezcla con suero y se incuba durante 3060 minutos a 37C o a temperatura ambiente. El sistema ms
empleado son los embriones de pollo, pero los anticuerpos tambin pueden medirse utilizando los TOC o
cultivos celulares. Se han empleado dos mtodos para estimar los anticuerpos neutralizantes. Uno emplea
una concentracin constante de suero que reacciona con varias diluciones de virus (el mtodo alfa) y otro
emplea una cantidad constante de virus y varias diluciones de suero (el mtodo beta).
En el mtodo alfa, se enfrentan diluciones decimales de virus adaptado al huevo con una dilucin fija de
antisuero (normalmente 1/5) y las mezclas se inoculan en grupos de cinco a diez huevos. En paralelo, se
titula el virus solo. Se calculan los puntos finales por el mtodo de Krber o por el de Reed y Muench. Los
resultados se expresan como un ndice de neutralizacin (NI) que representa la diferencia en log10 de los
ttulos del virus solo y de los de las mezclas virus/antisuero. Los valores de NI pueden alcanzar 4,57,0 en
el caso de mezclas homlogas de virus/suero; valores < 1,5 son inespecficos, y un virus heterlogo puede
dar valores tan bajos como 1,5.
El mtodo beta es la prueba de neutralizacin utilizada con ms frecuencia para el ensayo de anticuerpos
con embriones de pollo. Se enfrentan diluciones dobles o cudruples de antisuero con un volumen igual de
una dilucin de virus, que normalmente se fija en 100 o 200 EID50 (dosis infecciosas medias para
embriones) por 0,05 ml, y se inoculan 0,1 ml de cada mezcla en la cavidad alantoidea de cinco a diez
huevos embrionados. Simultneamente, se realiza un control de titulacin de virus para confirmar que la
dilucin fijada de virus en las mezclas virus/suero est entre 101.5 y 102.5 EID50. Como antes, se determinan
los ttulos de los sueros a punto final por el mtodo de Krber o por el de Reed y Muench, pero aqu se
expresan como recprocos de los log2 de las diluciones. Este mtodo de virus fijo/suero variable tambin se
puede emplear para pruebas de neutralizacin en cultivos de rganos traqueales utilizando cinco tubos por
dilucin de suero, como suele ser convencional con otros virus (22). Los resultados se calculan segn Reed
y Muench y los ttulos vricos se expresan como dosis cilioestticas medias por unidad de volumen (log10
CD50). Los ttulos del suero se expresan de nuevo como recprocos de los log2 de las diluciones. Esta
prueba es ms sensible que otras, pero los aspectos tcnicos limitan una adopcin ms extendida.

b)

Inhibicin de la hemoaglutinacin
Se ha descrito un protocolo estandarizado para la prueba IH con IBV (1), y el procedimiento que se detalla
a continuacin est basado en dicho estndar. Cepas y aislamientos de IBV aglutinarn eritrocitos de pollo
(RBC) despus de un tratamiento con neuraminidasa (44, 45). La cepa seleccionada para la produccin de
antgeno puede variar, en funcin de las necesidades del diagnstico. El antgeno para la prueba IH se
prepara a partir de los lquidos alantoideos repletos de IBV. Los procedimientos para las pruebas HA e IH
se realizan a 4C.
Para las pruebas de HA e IH, los procedimientos se llevarn a cabo a 4C.

Prueba de la inhibicin de la hemoaglutinacin

i)

Se coloca 0,025 ml de PBS, pH 7,07,4, en cada pocillo de una placa de microtitulacin de plstico
con fondo en U o en V.

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ii)

Se coloca 0,025 ml del antgeno vrico en el primer pocillo. Para una determinacin ajustada del
contenido HA, esto se debe hacer a partir de una serie inicial de diluciones de pequeo rango, es decir
1/3, 1/4, 1/5, 1/6, etc.

iii)

Se hacen diluciones dobles de volmenes de 0,025 ml del antgeno vrico a los largo de la placa.

iv)

Se coloca 0,025 ml adicionales de PBS a cada pocillo.

v)

Se deposita en cada pocillo 0,025 ml de una solucin al 1% (v/v) de RBCs de pollo.

vi)

Se mezcla, golpeando la placa muy suavemente, y se deja que los RBC sedimenten durante
40 minutos a 4C, cuando los RBC control formen un botn definido por sedimentacin.

vii)

La HA se determina inclinando la placa y observando la presencia o ausencia de desplazamiento de

los RBC sedimentados en forma de lgrima. La titulacin debe leerse como la dilucin mayor que da
una HA completa sin ese tipo de desplazamiento; esto representa el 100% de HA y 1 unidad de HA
(HAU) y se puede calcular de modo ajustado el valor de las diluciones iniciales.

Prueba de la inhibicin de la hemoaglutinacin

La prueba IH se utiliza en el diagnstico y en el control rutinario de las respuestas a la vacuna de

poblaciones aviares.
i)

Se coloca 0,025 ml de PBS en cada pocillo de una placa de microtitulacin de plstico con fondo en U
o en V.

ii)

Se coloca 0,025 ml del suero (5) en el primer pocillo.

iii)

Se hacen diluciones dobles de volmenes de 0,025 ml suero a los largo de la placa.

iv)

Se aade a cada pocillo 0,025 ml con 4 HAU de antgeno vrico y se deja durante 30 minutos.

v)

Se aade a cada pocillo 0,025 ml de una solucin al 1% (v/v) de RBC de pollo y, despus de mezclar
cuidadosamente, se deja durante aproximadamente 40 minutos que sedimenten los RBC, a cuyo
tiempo los RBC control forman por sedimentacin un botn definido.

vi)

El ttulo por IH es la dilucin ms alta de suero que origina la inhibicin completa de 4 HAU de
antgeno. La aglutinacin se determina de modo ms exacto inclinando la placa. Solamente se
considera que muestran inhibicin los pocillos donde los RBC se desplazan del mismo modo que en
los pocillos control (que contienen slo 0,025 ml de RBC y 0,05 ml de PBS).

vii)

La validez de los resultados se contrasta contra un suero control negativo, que no debera de dar un
ttulo >22, y con un suero control positivo, cuyo ttulo debera estar dentro de una dilucin del ttulo
conocido.

viii) Por lo general, los sueros se consideran positivos si tienen un ttulo de 24 o superior. Sin embargo,
debe tenerse en cuenta que, incluso en poblaciones SPF, una pequea proporcin de pjaros puede
mostrar un ttulo inespecfico de 24, aunque normalmente se trata de aves con ms de 1 ao de edad.

c)

Enzimoinmunoensayo
La tcnica ELISA es un mtodo serolgico sensible y que suministra las reacciones ms rpidas y los ttulos
de anticuerpos ms altos que otras pruebas (42). Carece de especificidad de cepa o de tipo, pero es valioso
para analizar respuestas a la vacunacin en condiciones de campo. Existen preparaciones comercializadas
de ELISA -que se basan en estrategias diferentes para la deteccin de anticuerpos contra IBV.
Normalmente dichas pruebas se han evaluado y validado por el fabricante, y, por lo tanto, es importante
para su uso seguir cuidadosamente las instrucciones que se especifican. Los enzimoinmunoensayos se
utilizan ampliamente para identificar poblaciones infectadas por IBV en pollos para carne mediante el
reconocimiento de ttulos elevados de anticuerpos. Si en la granja se vuelve a presentar la IB en la
siguiente poblacin de aves, se realizan intentos para aislar el virus y se establece su genotipo por
secuenciacin de RFLP o S1.

d)

Inmunodifusin en gel de agar

La prueba de la IGDA se puede utilizar en el diagnstico (48). El antgeno se prepara a partir de un
homogeneizado de las membranas corioalantoideas de embriones de pollo infectados. Para producir
antgeno, a menudo se utiliza la cepa Beaudette, que es letal para los embriones. La prueba carece de
sensibilidad y proporciona resultados poco fiables, ya que la presencia y la duracin de los anticuerpos
precipitantes puede variar en las aves individualmente.

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

Captulo 2.3.2. Bronquitis infecciosa aviar

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIALE DE DIAGNSTICO

Todas las vacunas comerciales vivas e inactivas deben estar autorizadas. Las cepas utilizadas en vacunas de
virus vivos, generalmente requieren atenuacin. Actualmente, muchos pases slo permiten vacunas vivas del
tipo Massachussets, tales como la H 120. Algunos pases tambin pueden tener vacunas autorizadas contra
otras cepas vivas tales como la Connecticut, la Arkansas, o la Delaware 072 (USA) o la 4/91 (Reino Unido). Las
vacunas vivas pueden presentarse en aerosoles, en agua potable, o por va intraocular.
La eficacia de las vacunas inactivadas depende en gran medida de la preparacin y administracin adecuada de
una vacuna viva. Las vacunas inactivadas deben administrase a las aves de forma individual, por medio de una
inyeccin intramuscular o subcutnea. Pueden utilizarse cepas variantes en la preparacin de vacunas
autgenas inactivadas para controlar la BI en las ponedoras y en las reproductoras.
Las vacunas vivas producen una mejor inmunidad local en el tracto respiratorio y tambin pueden proteger frente
a un espectro ms amplio de antgenos de cepas naturales (18).
Sin embargo, las vacunas vivas no pueden proteger a las bandadas de ponedoras frente al desafo con cepas de
serotipos variantes, especialmente comn en granjas con aves de edades distintas, donde los descensos de la
produccin no son corrientes a una edad tan temprana como las 40 semanas de vida (27). Las vacunas vivas
conllevan el riesgo de una patogenicidad residual asociada con el pase de la vacuna en bandadas. Sin embargo,
el empleo de tcnicas apropiadas de distribucin masiva (por ejemplo, aerosoles o agua potable) para asegurar
una cobertura y una distribucin uniforme de la vacuna en la poblacin, y evitar el pase de la vacuna en aves. Sin
embargo, con la aplicacin masiva adecuada de las tcnicas (p. ej., aerosol y agua potable) se puede conseguir
una distribucin uniforme de las vacuna en la bandada y evitar el pase de la vacuna. Adems, el uso de las
vacunas a las dosis recomendadas por los fabricantes ayudar a evitar su reversin durante los pases que
puede provocarse por la aplicacin de dosis fraccionadas.
Hay perspectivas para la obtencin de vacunas diseadas por ingeniera gentica (4), y se estn desarrollando
sistemas de vacunacin in ovo (47).
En el captulo 1.1.8. Principios de produccin de vacunas veterinarias, se presentan las directrices para la
produccin de vacunas veterinarias. Las normas dadas aqu y en el captulo 1.1.8. son de carcter general. En
los pases en que se producen las vacunas contra la BIA, hay que cumplir estndares nacionales e
internacionales. La autoridad que concede el permiso de produccin debe suministrar informacin y apoyo sobre
los requisitos particulares. A menudo, estos se presentan en trminos generales de aplicacin a todas las
vacunas -para aves y mamferos, vivas o inactivadas, vricas y bacterianas. Puede haber tambin requisitos
especficos que se aplican a las vacunas contra la BIA, vivas y atenuadas. Como ejemplos, se indican las
referencias de la normativa aplicable en Europa y en EE.UU. (1315, 46).
Contina aumentando la lista de agentes exgenos que deben estar ausentes. Los fabricantes deben conocer
los que sean de aplicacin actual en su pas. Las adiciones ms recientes a la lista son el virus de la nefritis aviar
y el neumovirus aviar.
En las vacunas contra la BIA, existen diferencias importantes entre los diversos pases en lo que respecta al
virus de desafo que se emplea en las pruebas de potencia y en su validacin. Tradicionalmente, se ha utilizado
para las pruebas de desafo la cepa virulenta M-41 (Mass 41) del tipo Massachusetts, tanto para vacunas vivas
como inactivadas. Aunque este tipo es todava comn, en muchos pases no es a menudo el tipo nico o el
dominante, y puede ser aconsejable preparar vacunas de otros tipos. Es lgico que los desafos se realicen con
el mismo tipo que est presente en la vacuna. Establecer criterios para validar el virus de desafo puede ser ms
difcil para otros tipos que no sean el Massachusetts debido, en general, a su menor virulencia. Normalmente, se
piensa que las vacunas inactivadas protegen contra el descenso de la produccin de huevos. El virus de desafo
tradicional M-41, como se describe en este captulo, causa un descenso de al menos el 67% en controles no
vacunados, pero cuando se usan otros tipos, se pueden considerar satisfactorios unos descensos mucho
menores, dependiendo de la evidencia publicada sobre los efectos de estas cepas en condiciones de campo.
Hay tambin una tendencia a relajar los criterios para desafos con el tipo Massachusetts, y la Farmacopea
Europea define ahora que un descenso satisfactorio con los tipos Massachusetts es de al menos el 35%, y, para
tipos no Massachussets, de al menos el 15%, con tal de que el descenso sea proporcionado a la evidencia
documentada (15).

1.

Control de inculo

a)

Caractersticas del inculo

Para cualquier tipo de vacuna que se produzca se debe emplear un sistema de lotes de inculo (inculo
original). Cada virus debe designarse segn la cepa y el origen, y debe estar libre de contaminacin con

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

Captulo 2.3.2. Bronquitis infecciosa aviar

otras cepas de IBV y de agentes extraos. Se debe disponer de servicios de conservacin separados para
las cepas de virus utilizadas como vacuna y las utilizadas para el desafo.
En vacunas con virus vivos, muchos pases slo permiten cepas del tipo Massachusetts. Algunos pases
permiten otras cepas, normalmente teniendo en cuenta que tales cepas ya estn presentes en sus
poblaciones nacionales. El tipo antignico incorporado, tanto en las vacunas vivas como en las inactivadas,
requiere justificacin, si existe duda respecto a su existencia en un pas.

b)

Mtodo de cultivo
Todos lo virus de inculo se crecen en el saco alantoideo de embriones de pollo en desarrollo o en cultivos
celulares adecuados. Los huevos deben proceder de una poblacin SPF.

c)

Validacin como vacuna

Pureza

Cada lote de siembra debe estar libre de contaminacin por bacterias, hongos, micoplasmas y virus.
Para la deteccin de virus extraos, el inculo se trata primero con un antisuero monoespecfico de ttulo
elevado, preparado contra la cepa examinada o contra una de idntico tipo. Esta mezcla se cultiva de varios
modos, designados para confirmar la ausencia de virus que por experiencia previa puedan se
contaminantes potenciales. El antisuero no debe contener anticuerpos contra adenovirus, virus de la
encefalitis aviar, rotavirus aviares, virus de la anemia de los pollos, viruela aviar (poxvirus aviar), virus de la
laringotraqueitis infecciosa, virus de la influenza A, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la
enfermedad bursal infecciosa, virus de la leucosis, reovirus, virus de la enfermedad de Marek, herpesvirus
del pavo, virus asociados a los adenovirus, virus del sndrome 76 de descenso de la postura (produccin de
huevos) (EDS76), virus de la nefritis aviar, neumovirus aviar o virus de la retculo-endoteliosis. El inculo
suministrado a cada unidad del sistema de cultivo debe contener una cantidad de IBV neutralizado que
tenga una infectividad inicial de al menos diez veces la dosis mnima de campo. Estos sistemas incluyen:
1.

Embriones de pollo SPF, incubados durante 911 das, inoculados en el saco alantoideo y en la
membrana corioalantoidea (dos pases).

2.

Cultivos de fibroblastos de embrin de pollo, para los subgrupos A y B del virus de la leucosis. La
prueba COFAL (prueba para la leucosis aviar utilizando la fijacin de complemento) o el ELISA tipo
sndwich de doble anticuerpo, para el antgeno de la leucosis especfico de grupo, se llevan a cabo
en extractos celulares recogidos a los 14 das. Para el virus de la retculo-endoteliosis, se realiza una
prueba de inmunofluorescencia sobre cubres en cultivos despus de dos pases.

3.

Cultivos de rin de pollo SPF que se examinan para ECP, inclusiones celulares y agentes
hemoadsorbentes, y que se cultivan hasta durante 20 das de incubacin total, con pases realizados
al menos cada 5 das.

4.

Pollos SPF de edad mnima de vacunacin que se inoculan intramuscularmente con 100 dosis de
campo y en la conjuntiva con 10 dosis de campo; esto se repite 3 semanas ms tarde, cuando los
pollos se inoculan tambin en la base de la pata e intranasalmente con diez dosis de campo. Las
observaciones se hacen en conjunto durante 6 semanas, y se recoge el suero para pruebas de
encefalomielitis aviar, bursitis infecciosa, enfermedad de Marek, enfermedad de Newcastle e
infeccin por Salmonella pullorum.

Potencia

Las vacunas dirigidas a proteger contra la prdida de produccin de huevos deben probarse en cuanto a
duracin de la respuesta del anticuerpo. Los ttulos medios de IH deben ser >6 log2 hasta por lo menos las
60 semanas de edad. Las pruebas serolgicas deben hacerse a intervalos frecuentes para comprobar que
los ttulos no han aumentado debido a una respuesta secundaria por infeccin con un IBV extrao.
Las vacunas dirigidas a proteger contra la forma respiratoria de la enfermedad en pollos para carne
(broilers) o en pollos de cra, deben probarse tambin en cuanto a la duracin de la respuesta del
anticuerpo; en el caso de pollos para carne (broilers), esto debe hacerse hasta la edad normal del sacrificio,
y en casos de pollas de cra hasta la edad en que se debera administrar una vacunacin de refuerzo (a
menudo a las 1618 semanas).

Inocuidad

Las pruebas sobre el inculo de virus deben incluir una prueba de la capacidad potencial para revertir la
virulencia. Las vacunas vivas y las inactivadas deben ensayarse para inocuidad como se indica en la
seccin C.4.b.

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

Captulo 2.3.2. Bronquitis infecciosa aviar

Eficacia

Para demostrar la eficacia, se debe hacer un ensayo de la vacuna con el inculo primario y con el inculo
de trabajo despus de cinco pases del inculo primario, y realizar pruebas para demostrar su efecto
protector.
Para las vacunas vivas, se vacuna un mnimo de diez pollos SPF de 34 semanas con la dosis
recomendada, va intranasal o intraocular. Se mantienen por separado diez pollos control no vacunados de
la misma edad y origen. Despus de 3-4 semanas, todas las aves de ambos grupos se inoculan en desafo,
va intranasal o intraocular, con 103.0103.5 EID50 de la cepa virulenta Massachusetts M-41. Despus de 4
5 das del desafo, se toma un frotis traqueal de cada ave y se coloca en 3 ml de caldo con antibiticos.
Cada lquido se prueba para IBV inoculando (0,2 ml) cinco huevos embrionados de 911 das de
incubacin. Una prueba alternativa a la de tomar frotis consiste en sacrificar las aves a los 46 das de la
inoculacin de desafo y examinar microscpicamente los anillos traqueales para actividad de los cilios (20).
La incapacidad de resistir un desafo se refleja en la prdida de la movilidad de los cilios. La vacuna viva es
adecuada para su empleo si, despus del desafo, al menos el 90% de las aves vacunadas no muestran
evidencia del IBV en sus trqueas, mientras que en el 90% o ms de las aves control debera de haber
evidencia de la presencia del virus.
Para valorar una vacuna inactivada dirigida a proteger aves ponedoras, se vacunan 30 o ms pollos SPF
segn se recomiende, a la edad ms temprana permitida. Si se realiza antes una vacunacin primaria con
vacuna viva, a un grupo adicional de aves se administra solo la vacunacin primaria. En ambos casos,
estas vacunaciones primarias no deben hacerse despus de las 3 semanas de edad. La vacuna inactivada
se administra 46 semanas despus de la vacuna viva primaria. Otro grupo control de 30 aves se deja sin
vacunar. Todos los grupos se mantienen por separado hasta 4 semanas antes de la produccin mxima de
huevos, y luego se mantienen juntos. Se controla la produccin individual de huevos y, una vez que se
normaliza, todas las aves reciben una inyeccin de desafo y se registra la produccin de huevos durante
otras 4 semanas. El inculo de desafo debe ser lo bastante fuerte como para asegurar una prdida de
produccin en las 3 semanas siguientes al desafo. La prdida en el grupo control debe ser por lo menos
del 67%; el grupo que recibi la vacunacin primaria con virus vivos y despus la vacuna inactivada debe
mantener el nivel de produccin previo, y el grupo que slo recibi la vacunacin primaria debe mostrar una
prdida intermedia de produccin. Se toman sueros de todas las aves al mismo tiempo que se vacuna,
4 semanas despus, y en el desafo; no debera haber respuesta en las aves control.
Para evaluar una vacuna inactivada diseada para proteger las aves contra la enfermedad respiratoria, se
vacunan 20 pollos SPF de 4 semanas tal como se recomienda. Junto con este primer grupo, se mantiene
otro de 20 aves de la misma edad y origen como control. Se determinan las respuestas de anticuerpos
4 semanas despus; no debera haber respuesta en las aves control. A continuacin todas las aves se
inoculan en desafo con 103 CID50 (50% de dosis infectiva en pollo) de virus virulento, se sacrifican 47 das
despus y se examinan secciones traqueales para observar la movilidad de los cilios. Al menos el 80% de
los controles no vacunados deben mostrar un cilio completo, mientras que los cilios traqueales deben
permanecer sin ser afectados en un porcentaje similar de las aves vacunadas.
En algunos pases hay vacunas disponibles, tanto vivas como atenuadas, que contienen tambin el virus de
la enfermedad de Newcastle, el de la bursitis infecciosa, reovirus y el virus EDS76. La eficacia de los
diferentes componentes de estas vacunas se debe establecer de forma independiente y luego en forma
conjunta, para determinar si existe interferencia entre los diferentes antgenos.

2.

Mtodo de produccin

Todas las cepas de virus destinadas a vacunas vivas se cultivan en el saco alantoideo de embriones de pollo
SPF o en cultivos celulares adecuados. Para las vacunas inactivadas, se pueden utilizar huevos de gallina de
poblaciones sanas que no sean SPF. El lquido reunido se clarifica y se titula para infectividad. Para vacunas
vivas este lquido se liofiliza en viales, y para vacunas inactivadas se mezcla con aceite mineral de grado alto
hasta formar una emulsin a la que se aade un conservante.

3.

Control del proceso

El contenido antignico necesario se basa en las pruebas iniciales con lotes de vacunas de eficacia demostrada
en ensayos de laboratorio y de campo. Las titulaciones sobre infectividad se realizan en embriones de pollo.
Las vacunas vivas deben contener por lo menos 103.5 EID50 por dosis y por ave hasta la fecha de caducidad
indicada, y no menos de 102.5 EID50 por dosis y por ave despus de una incubacin a 37C durante 7 das a la
fecha del envasado. Para las vacunas inactivadas, el agente inactivante y el proceso de inactivacin deben ser

10

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

Captulo 2.3.2. Bronquitis infecciosa aviar

eficaces durante la produccin tanto sobre el IBV como sobre los contaminantes potenciales. Con la utilizacin
de beta-propiolactona o formalina, cualquier virus vivo de la leucosis o cualquier especie de Salmonella deben
eliminarse; y con otros agentes inactivantes, se debe hacer inactivo el espectro completo de posibles
contaminantes. Es importante asegurar la homogeneidad de las suspensiones antes de los procesos de
inactivacin y, despus de la inactivacin, se debera llevar a cabo una prueba de inactivacin en cada lote de la
masa del material cosechado, as como en el producto final.
Las pruebas de inactivacin deben ser apropiadas para la vacuna particular y deben comprender dos pases en
cultivos celulares, en embriones o en pollos, inoculando 0,2 ml y haciendo diez rplicas en cada pase.

4.

Control de lotes

a)

Esterilidad
Cada lote de vacuna viva debe probarse para ausencia de agentes extraos como en el inculo de virus
(vase el captulo 1.1.9.).

b)

Inocuidad

Para vacunas vivas

Se ha de utilizar no menos de diez pollos de una poblacin SPF que sean de la edad mnima para la
vacunacin que se establezca en el prospecto. Se administra a cada pollo, por va intraocular, diez dosis de
la vacuna una vez reconstituida para obtener una concentracin adecuada para la prueba. Se obserban los
pollos durante 21 das. Para vacunas dirigidas a pollos de 2 o ms semanas de edad, se utilizan los pollos
inoculados segn la "prueba para agentes extraos utilizando pollos" (vase la seccin C.1.c.4.). Si durante
el perodo de observacin ms de dos pollos mueren por causas no relacionadas con la vacuna, se repite la
prueba. La vacuna supera la prueba si ningn pollo muestra sntomas clnicos serios, particularmente
signos respiratorios, y si no muere ningn pollo por causas atribuibles a la vacuna.

Para vacunas inactivadas

Se inolculan diez pollos de 1428 das de edad, de una poblacin SPF, con una dosis doble de vacuna por
la va recomendada. Se observan los pollos durante 21 das. Se verifica que no ocurren reacciones
anormales locales o sistmicas.

c)

Potencia
La prueba de potencia se establece a partir de los resultados de las pruebas de eficacia del inculo primario
de virus. Las vacunas vivas se prueban para comprobar su potencia mediante la titulacin de la infectividad,
y las inactivadas se prueban midiendo la produccin de anticuerpos. La prueba de potencia para un lote de
vacuna inactivada consiste en vacunar 20 pollos SPF de 4 semanas de edad y demostrar que cuatro
semanas despus su ttulo IH medio no es inferior a 6 log2.

d)

Duracin de la inmunidad
Debe mostrarse que la vacuna tiene la potencia necesaria para lograr la duracin pretendida de inmunidad
al final del perodo de caducidad.

e)

Estabilidad
Se deben probar al menos tres lotes en esta prueba y deben dar resultados satisfactorios pasados 3 meses
de la fecha de caducidad.
La estabilidad de una vacuna viva debe medirse por el mantenimiento de un ttulo de infectividad adecuado.
La estabilidad de una vacuna inactivada debe medirse a intervalos mediante pruebas de potencia de los
lotes. Debera determinarse a travs del perodo de validez la concentracin y persistencia del conservante.
No debera producirse ningn cambio fsico en la vacuna y debera adquirir su estado inicial de emulsin
despus de una agitacin rpida.

f)

Conservantes
Existen unos niveles mximos para el empleo de antibiticos, conservantes, y agentes inactivantes
residuales.

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

11

Captulo 2.3.2. Bronquitis infecciosa aviar

g)

Precauciones (riesgos)
No se conoce que el IBV represente por s mismo, un peligro para el personal empleado en la produccin o
prueba de las vacunas. Sin embargo, los agentes indeseables pueden ser peligrosos y las fases iniciales de
la manipulacin de un nuevo inculo de virus deben realizarse en una cabina de seguridad. Una precaucin
deseable en la produccin de todas las vacunas es tomar medidas para reducir la exposicin del personal a
aerosoles de protenas extraas. En este trabajo nunca se debe emplear a personas que sean alrgicas a
los componentes del huevo.

5.

Pruebas sobre el producto final

a)

Inocuidad
En cada lote del producto final se debe realizar una prueba de inocuidad, como en la seccin C.4.b.

b)

Potencia
En cada lote de producto final se debe realizar una prueba de potencia, como en la seccin C.4.c., en la
fecha de produccin y al final del perodo de caducidad indicado.

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