Diferentes roles de Susceptibilidad Mejorada a la

Enfermedad 1 (EDS1) unido y disociado a Deficiente en

Fitoalexinas 4 (PAD4) en la inmunidad de Arabidopsis
Resumen
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EDS1 es un regulador importante de la inmunidad basal y activada

por receptores. La EDS1 de Arabidopsis interacta con dos
protenas relacionadas, PAD4 y Gen Asociado a la Senescencia101
(SAG101), cuyas actividades combinadas son esenciales para la
sealizacin de defensa. Los diferentes tamaos y distribuciones
intracelulares de los complejos EDS1-PAD4 y EDS1-SAG101 en
tejidos de las hojas en Arabidopsis sugieren que cumplen
funciones no redundantes.
La naturaleza y relevancia biolgica de las interacciones de EDS1
con PAD4 y SAG101 fueron exploradas utilizando ensayos de
levaduras tri-hbridas, anlisis in vitro de protenas recombinantes
purificadas de Escherichia coli, y caracterizacin de plantas
transgnicas de Arabidopsis expresando una protenas mutante de
eds1 que no logra unirse a PAD4 pero retiene la interaccin con
SAG101.
EDS1 forma complejos molecularmente distintos con PAD4 o
SAG101 sin factores adicionales. La prdida de interaccin con
EDS1 reduce la acumulacin post-transcripcional de PAD4,
consistente con la asociacin fsica de EDS1 que estabiliza PAD4.
Las formas disociadas de EDS1 y PAD4 son completamente
competentes en la muerte celular gatillada por receptores en el
foco de infeccin. Por otra parte, el complejo EDS1-PAD4 es
necesario para la resistencia basal involucrando la movilizacin de
las defensas de cido saliclico.
Configuraciones moleculares diferentes de EDS1 y PAD4 tienen
funciones distintas en la inmunidad innata de la planta.

Introduccin
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Para sobrevivir, las plantas necesitan ser capaces de responder a

numerosos tipos de estrs del ambiente y reprogramar su
metabolismo y crecimiento de manera correcta. EDS1 de
Arabidopsis ha emergido como un regulador de estrs bitico
importante. Estudios mutacionales identificaron EDS1 como un

componente esencial de la inmunidad basal en respuesta a

patgenos biotrficos virulentos y de la inmunidad gatillada por
efectores (ETI) condicionada por receptores TIR-NB-LRR que
reconocen efectores especficos de patgenos. En la respuesta
inmune basal, EDS1 coopera cercanamente con el gen PAD4 en la
estimulacin de la produccin de la hormona de defensa; cido
saliclico (SA) y otros procesos que limiten el crecimiento del
patgeno. La acumulacin de SA es requerida para la inmunidad
sistmica (SAR), inducida en tejidos distantes mediante seales
emitidas por las clulas locales afectadas por el estrs. El rol del
SA en el reforzamiento de la resistencia alrededor del foco de
infeccin parece ser mediado en parte por la restriccin de la
iniciacin de la muerte celular programada por parte del husped.
Anlisis ms a fondo de mutantes de Arabidopsis revelaron que
EDS1 y PAD4 tambin contribuyen a la resistencia condicionada
por otros tipos de receptores intracelulares o protenas sensoriales
que reconocen patgenos. Adems, EDS1 y PAD4 traducen seales
de estrs foto-oxidativas llevando a la muerte celular y la
disminucin de la tasa de crecimiento de la planta. Estas
caracterstica sugieren que la protena EDS1, generalmente en
conjunto con PAD4, sirven como un nodo regulatorio para la
coordinacin de respuestas a mltiples estmulos de estrs
ambiental. Todava no est claro si diferentes estmulos reclutan
complejos EDS1 particulares.
EDS1 puede formar dmeros homomricos e interactuar con PAD4
y otra protena relacionada, SAG101, en levaduras y extractos de
tejidos foliares de Arabidopsis. Juntos, EDS1, PAD4 y SAG101
constituyen una familia de protenas especficas de pantas que
tienen homologa con las lipasas eucariticas en sus terminales N
y un dominio nico en sus terminales C. Anlisis de mutantes
dobles pad4 sag101 mostraron que las funciones combinadas de
PAD4 y SAG101 son esenciales para la sealizacin de EDS1 en la
resistencia mediada por TIR-NB-LRR. La cooperacin ms que la
redundancia entre PAD4 y SAG101 es apoyada genticamente por
la susceptibilidad extrema del fenotipo de pad4 sag101
comparadas con eds1 y, a nivel molecular, por los patrones de
distribucin intracelular de los complejos EDS1-PAD4 y EDS1SAG101 en Arabidopsis. Mientras que los dmeros EDS1 son
mayoritariamente citoplasmticos, los complejos heteromricos
EDS1-PAD4 se acumulan en el ncleo y citoplasma y los complejos

EDS1-SAG101 se encuentran confinados en el ncleo. La

coordinacin entre las piscinas de EDS1 citoplasmtico y nuclear
va la maquinaria de trfico a travs de poros nucleares es
necesaria para permitir la resistencia completa de la planta.
Aqu se reporta el anlisis de la arquitectura molecular de
complejos individuales de EDS1 en levadura, Escherichia coli y
tejidos vegetales, adems de la caracterizacin de un mutante
eds1 que es incapaz de interactuar con PAD4 pero retiene la
habilidad de formar dmeros homomricos y asociarse a PAD4. Se
provee evidencia de que EDS1 utiliza distintos determinantes
estructurales para interactuar con PAD4 y SAG101 y que las
asociaciones de EDS1 por separado con cada protena en vez de
un complejo ternario pueden explicar la cooperacin entre PAD4 y
SAG101 en la sealizacin de EDS1. De improviso, se identific un
rol para EDS1 no asociado a PAD4 en la muerte celular gatillada
por TIR-NB-LRR que no se compensa con SAG101. A su vez, el
complejo EDS1-PAD4 es necesario para impulsar la inmunidad
basal y la SAR completa. Se concluye que configuraciones
diferentes de EDS1 y PAD4 tienen funciones distintas en la
sealizacin inmune de la planta.

Materiales y Mtodos
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Esto te lo dejo a ti jajaja ^^

Resultados
EDS1 se asocia exclusivamente con PAD4 o SAG101
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PAD4 y SAG101 interactan con EDS1 en levadura. Se investig la

naturaleza de la asociacin de EDS1 con sus dos protenas y si las
tres protenas podran coexistir en un complejo ternario, ya que
esto podra explicar su cooperacin. Previamente, se encontr que
porciones individuales de EDS1 y un mutante con prdida de
funcin eds1 perdan su interaccin con PAD4 en un ensayo de
doble hbrido en levadura. Los mismos constructos de EDS1
tambin fallaron al interactuar con SAG101 en levadura, lo que
sugiere que la asociacin de EDS1 con cualquier protena no puede
ser llevada a cabo por un solo dominio de EDS1. En un ensayo
trihbrido de levadura, diferentes combinaciones de EDS1, SAG101

y PAD4 fueron expresadas como fusiones con un dominio de unin

al ADN (carnada) o un dominio de activacin (presa) y la provisin
de la tercera protena como un componente libre bajo en control
de un promotor condicional de metionina. Al no aplicar Met al
medio, se induce la expresin de la protena libre. La interaccin
entre carnada y presa fue cuantificada mediante la actividad de la
-galactosidasa del reportero (Figura 1). Se examin si la
dimerizacin EDS1-EDS1 se vea afectada por la presencia de
PAD4 libre o SAG101. Ninguno de los dos componentes libres
impeda o alteraba la formacin de los dmeros homomricos de
EDS1. Cuando las interacciones EDS-SAG101 o EDS1-PAD4 fueron
examinadas, se encontr que la adicin de EDS1 libre reduca la
formacin de ambos heterocomplejos. Juntos, estos datos sugieren
una preferencia de EDS1 para unirse a s misma por sobre PAD4 o
SAG101 en levadura.
Luego se examin si SAG101 compite con PAD4 para unirse a
EDS1 induciendo la produccin de SAG101 libre en el ensayo de
interaccin EDS1-PAD4. La asociacin de PAD4 con EDS1 se vio
reducida levemente en presencia de SAG101 libre (Figura 1a), lo
que sugiere una unin ms fuerte entre EDS1 y SAG101 que entre
EDS1 y PAD4. Notablemente, la interaccin de EDS1-SAG101 se
vio favorecida por la presencia de PAD4 libre (Figura 1a). Por lo
tanto, PAD4 no compite con SAG101 para la unin a EDS1, pero
tiende a promover la asociacin de EDS1-SAG101. Debido a que
SAG101 no interacta directamente con PAD4 en ensayos
dihbridos de levadura, se examin si EDS1 puede actuar como
puente entre PAD4 y SAG101 para formar un complejo ternario
expresando
PAD4
y
SAG101
como
carnada
y
presa
respectivamente en la presencia de EDS1 libre. No se detect un
complejo ternario PAD4-EDS1-SAG101 en el ensayo (Figura 1b).
Para seguir investigando esto, se expresaron los 3 componentes
como protenas solubles y recombinantes en E. Coli y se realiz
una co-purificacin con una marca His proveniente de lisatos de
clulas mezcladas. PAD4 y SAG101 nativos co-purificaron con la
protena EDS1:His pero PAD4 no co-purific con SAG101:His en la
presencia de EDS1 (Figura 2). En conjunto, estos datos muestran
que EDS1 no acta como puente entre PAD4 y SAG101. Se
concluye que la sealizacin en la resistencia se lleva a cabo de
manera ms probable mediante complejos separados de EDS1 con
SAG101 o PAD4.

Los
complejos
EDS1-PAD4
estequiometrias diferentes
-

EDS1-SAG101

tienen

Se consider si el peso molecular aparentemente superior de los

complejos EDS1-PAD4 en extractos celulares de plantas se podran
atribuir a diferentes protenas o a una configuracin molecular
intrnseca distinta del complejo entre EDS1-PAD4 comparada a la
de EDS1-SAG101. Se investig mediante cromatografa de
exclusin por tamao la estequiometria de las asociaciones EDS1PAD4 y EDS1-SAG101 en protena recombinantes purificadas de E.
coli. Mientras que EDS1 y SAG101 pudieron ser purificadas en
cantidades relativamente altas (Figura 2), PAD4 slo se solubiliz
en pequeas cantidades si se co-expresaba con EDS1 (Figura 3b).
La protena EDS1:His expresada por si sola migr hasta un tamao
aproximado de 142 kDa (Figura 3), equivalente a un dmero de
EDS1 (EDS1:His = 72.9 kDa). Por lo tanto, la EDS1 recombinante
normalmente forma dmeros. En contraste, SAG101:His expresada
por si sola migraba como monmero hacia su masa terica de 63.2
kDa (Figura 3c). Las protenas SAG101:His y EDS1 formaban un
complejo con el tamao calculado de 130 kDa, consistente con la
SAG101 monomrica asociada a monmeros de EDS1 (Figura 3d).
Para investigar la asociacin de PAD4 con EDS1, se recolectaron
fracciones filtradas en gel de PAD co-purificada con EDS1:His y se
detect la protena PAD4 (60.9 kDa) utilizando un anticuerpo
monoclonal contra PAD4. La mayora de la protena EDS1 eludi
como dmero (Figura 3b), consistente con una interaccin dbil
entre EDS1 y PAD4, que tambin se haba identificado en levadura
(Figura 1). El complejo EDS1-PAD4 migr a un peso molecular
calculado entre 210-266 kDa, lo que sugiere un arreglo
oligomrico de EDS1-PAD4, posiblemente entre dmeros de EDS1
con monmeros de PAD4, ya que PAD4 no se asocia consigo
misma. Se concluye que EDS1 naturalmente forma homodmeros
consigo misma y puede formar heterodmeros con SAG101 y un
complejo oligomrico con PAD4 en ausencia de otras protenas.
Estos datos refuerzan la idea que EDS1 se asocia de manera
diferente con PAD4 y SAG101.

Aislacin de una variante estable de EDS1 que no se une a

PAD4

De los datos obtenidos arriba, se hipotetiza que los complejos

EDS1-PAD4 y EDS1-SAG101 tienen distintas funciones en la
resistencia. Para calcular la importancia de la interaccin entre
EDS1-PAD4, se examin para variantes de ED1 que no lograban
unirse a PAD4 en un ensayo dihbrido de levadura. El cDNA de
EDS1 fue aleatoriamente mutagenizado por PCR propenso a
errores y las secuencias amplificadas de EDS1 fueron fusionadas al
dominio de activacin B42 (Pb42AD) y transformadas a levaduras
expresando PAD4 fusionada al dominio de unin al ADN LexA
(pLexA). Las interacciones entre las protenas de fusin LexA:PAD4
y B42:EDS1 fueron monitoreadas por la actividad del reportero de
-galactosidasa, como fue descrito previamente (Figura S1a). De
los clones que perdieron su actividad de reportero, se
seleccionaron variantes de EDS1 de cadena completa
monitoreando sus tamaos en un Western Blot con sondas de
anticuerpos anti-HA. Muchas de las protenas EDS1 que no
interactuaban con PAD4 presentaban mltiples mutaciones. Tres
clones independientes con cambios en un aminocido fueron
seleccionados y expresados en E. coli para una caracterizacin
ms detallada. De los tres mutantes, eds1 E582G y eds1C547R solo
pudieron ser purificados desde E. coli en cantidades bajas
comparadas con la EDS1 nativa (Figura S2). Se razon que estas
mutaciones probablemente reducan la estabilidad proteica de
EDS1, y esto explicara la aparente prdida de interaccin en
levadura. En apoyo a esta idea, ambas variantes retuvieron la
interaccin con PAD4 en E. coli (Figura S2) y fueron excluidas de
los anlisis subsiguientes. La tercera mutacin (eds1 L262P) no redujo
la estabilidad de EDS1 en E. coli (Figura 4a). Adems, PAD4 no
pudo co-purificar con una fusin eds1L262P:His, sugiriendo que
eds1L262P es un mutante de prdida de interaccin bona fide. Se
examin si eds1L262P se vea afectada al intentar unirse a SAG101
realizando una co-purificacin de E. coli en presencia de SAG101
nativo. A diferencia de PAD4, cantidades similares de SAG101 se
unieron a las protenas EDS1:His y eds1L262P:His (Figura 4b).
Adems, la formacin de dmeros homomricos de EDS1 no se
impidi en el mutante eds1L262P (Figura 4c). Por lo tanto, la
asociacin de EDS1 con PAD4 depende de determinantes
estructurales diferentes de los que utiliza para unirse a s misma o
a SAG101.

Una disrupcin en la interaccin

acumulacin de PAD4 en hojas
-

EDS1-PAD4

reduce

la

Para medir las consecuencias de la interrupcin de la asociacin

EDS1-PAD4 en la planta, se transform de manera estable el
mutante nulo eds1-1 de Arabidopsis con la variante eds1 L262P bajo
control del promotor nativo de EDS1 y se fusion a una marca en
el terminal N 3xHA (HA:eds1L262P). Como referencia, eds1-1
tambin fue transformada con una EDS1 WT bajo el promotor
EDS1 y con la misma marca en el terminal N (HA:EDS1). Una lnea
de HA:EDS1 expresando niveles similares a la WT de la protena
EDS1 se utiliz como control en experimentos subsecuentes
(Figura 5a,b). Se seleccionaron 4 lneas transgnicas homocigotas
HA:eds1L262P y se examin la expresin de las protenas EDS1 y
PAD4 en extractos totales de hojas de plantas sanas. Las lneas 1-3
acumularon cantidades similares de eds1L262P, aunque a niveles un
poco ms reducidos en comparacin con la WT y con la lnea de
control HA:EDS1, mientras que la lnea 4 de HA:eds1L262P
present cantidades mucho ms bajas de eds1 L262P (Figura 5a).
Hubo una seal dbil de PAD4 en los extractos, probablemente
debido a los niveles de equilibrio de PAD4. PAD4 no se detect en
la WT y no se observ una seal clara de PAD4 en las lneas
transgnicas (Figura 5a). Para una mejor deteccin de la protena
PAD4, se infectaron las plantas con H. arabidopsidis virulento, el
cual induce la expresin de PAD4. No se logr detectar una seal
especfica de PAD4 en los extractos totales infectados. Por lo tanto,
debido a que EDS1 y PAD4 se localizan en el citoplasma y el
ncleo, se realiz una separacin de protenas enriquecidas de
ncleo vs protenas drenadas de ncleo. Una seal especfica de
PAD4 fue detectada en las fracciones enriquecidas de ncleo de la
WT y HA:EDS1, y la seal fue fuertemente reducida en eds1-1 y
HA:eds1L262P (Figura 5b). La distribucin de EDS1 entre las
piscinas nucleares y no nucleares no fue afectada por la mutacin
L262P
(Figura 5b). Para examinar si la protena PAD4 que permaneca
en las lneas HA:eds1L262P podra interactuar con la protena
HA:eds1L262P, se realiz una co-inmunopurificacin (co-IP) de los
tejidos infectados utilizando anticuerpos contra la marca HA. Las
fracciones inmunopurificadas fueron examinadas para comprobar
la presencia de las protenas HA:EDS1 o HA:eds1 L262P y PAD4 nativa
con un Western Blot utilizando anticuerpos especficos para EDS1

o PAD4. Cantidades de HA:EDS1 inmunopurificada (Figura 5c) en

las diferentes muestras correspondieron a niveles de EDS1 en la
fraccin total (Figura 5b). PAD4 co-purific con HA:EDS1 pero no
co-purific con ninguna de las protenas HA:eds1 L262P (Figura 5c).
Debido a que la co-IP puede enriquecer protenas asociadas y en
este experimento facilit la deteccin de PAD4 en la lnea
HA:EDS1, se concluyen que la protena mutante eds1 L262P tambin
falla al interactuar con PAD4 en tejidos de plantas y que la prdida
de la interaccin EDS1-PAD4 reduce la acumulacin de la protena
PAD4 en hojas infectadas. Se razon que las cantidades
disminuidas de PAD4 en las lneas HA:eds1L262P se atribuye
probablemente a la prdida de un efecto estabilizante directo de
EDS1, ya que la acumulacin de PAD4 recombinante tambin
requiere de la co-expresin de EDS1 en E. coli (Figura 3b). Para
comprobar esta hiptesis, se midieron los niveles de mRNAs de
PAD4 mediante RT-PCR en tejidos de hojas de las lneas 1 y 2 de
HA:EDS1 y HA:eds1L262P antes y despus de la infeccin con H.
arabidopsidis. Este anlisis mostr que la prdida de la asociacin
EDS1-PAD4 no comprometa la expresin basal del mRNA de PAD4
(Figura S3). Sin embargo, redujo la acumulacin de transcriptos de
PAD4 inducidos por patgenos al mismo nivel que la mutante
eds1-1 (Figura S3). Se concluye que al interrumpir la asociacin
entre EDS1 y PAD4 reduce la acumulacin basal de PAD4 a nivel
post-transcripcional en tejidos sanos y que esto lleva a una
expresin gentica reducida de PAD4 durante la infeccin por
patgenos.
La prdida de la interaccin EDS1-PAD4 provoca un
desequilibrio en la resistencia basal pero no la gatillada por
TIR-NB-LRR
-