COPROCULTIVO

OBJETIVO
Identificar las posibles especies patgenas de microorganismos presentes en las vas
gastrointestinales (Heces) a travs del coprocultivo y de sus reacciones bioqumicas.

FUNDAMENTO
La porcin inferior del intestino tiene una flora bacteriana normal excesivamente amplia.
Los microorganismos con mayor prevalencia son los anaerobios (Bacteroides, bcilos
gram positivos, Estreptococos), microorganismos entricos gran negativos y Enterococcus
faecalis. Cualquier intento por aislar bacterias patgenas de las heces implica la
separacin de las especies patgenas, usualmente a travs del empleo de medios
selectivos diferenciales y de cultivos enriquecidos.
Las principales causas de trastornos gastrointestinales agudos incluyen a los virus, las
toxinas (de: Estafilococos, Vibriones, Escherichia coli ), bacilos entricos gran negativos
invasores, los fermentadores lentos de la lactosa, la Shigella, la Salmonella y la
Campilobacterias. La importancia relativa de estos grupos tiene grandes discrepancias en
las distintas partes del mundo.
Las heces y los raspados rectales son los especmenes de que se dispone con mayor
facilidad. Debe anotarse, en el examen macroscpico la presencia de sangre, moco o
helmintos en la inspeccin inicial.
Se suspenden los especmenes en un caldo selectivo como el Caldo de Tetrationato y se
cultivan sobre medios ordinarios as como en medios selectivos diferenciales, por ejemplo
Agar EMB, Agar McConkey, Agar S-S, para permitir la separacin de los bacilos gran
negativos que no fermentan la lactosa de otras bacterias entricas comunes.
Los frotis teidos pueden revelar una prevalencia de leucocitos y de ciertos
microorganismos anormales como Cndida o estafilococos, pero no pueden utilizarse
para diferenciar las bacterias entricas patgenas de las de la flora normal, por lo que
deben realizarse otro tipo de pruebas para discriminar los tipos de bacterias presentes en
la muestra como son las pruebas bioqumicas.

Entre las enfermedades que afecta el Sistema Digestivo tenemos:

Obtencin de la Muestra:
a. Para nios/as
Para bebs y nios pequeos que usan paales:
Se puede cubrir el paal con un envoltorio plstico. Si se coloca correctamente el
envoltorio plstico, separando las heces de la orina, se puede evitar que stas se mezclen
con el fin de obtener una muestra mejor.
b. Para adultos
Hay muchas maneras de recolectar las muestras. Se pueden
recoger las heces con la ayuda de un envoltorio plstico que se
coloca suelto sobre el inodoro y se sostiene en su lugar con el
asiento. El equipo para recoleccin de la muestra trae una gasa
especial que se usa para recogerla.

Recogida de la muestra
Se recogern las heces en un frasco limpio con cierre hermtico, no es necesaria la
esterilidad. El anlisis se har en las 12 horas siguientes a la deposicin, guardando la
muestra en el frigorfico a 4-10 C. Si el anlisis se pospone ms de 24 horas se aadir
un volumen igual al de las heces de una solucin acuosa al 5% de formol comercial.

Volumen de la Muestra
Heces pastosas: muestras del tamao de una nuez son muy adecuadas pues
permitenrealizar la mayora de los estudios.
Heces lquidas entre 5 y 10 ml

Condiciones para la toma de muestras

- Heces que no tengan ms de media hora de obtenidas, o muestras tomadas
directamente del recto con un hisopo de algodn.
- Cuando las siembras no se pueden efectuar de inmediato o la muestra demora en llegar
al laboratorio, se aconseja emulsionar aproximadamente 1g de heces en 1 ml de un
lquido conservador, o bien, depositar en ste el hisopo rectal.

- Evitar contaminacin por material no estril.

- Uso de contenedores y medios de transporte apropiados.
- Informar si est tomando antibiticos
- Etiquetar muestra adecuadamente.
- Temperatura de conservacin: 4C para evitar la proliferacin bacteriana

Medio de transporte
Para bacterias. (Cary-Blair o solucin de glicerol tamponado)
Gelatina: Cary Blair
El tubo del medio de transporte deber permanecer refrigerado (4C) hasta el momento
de la obtencin de la muestra.
Impregne la torula steril con deposicin, introducindola a travs del canal 2,5cns y
rtela o impregne la trula del receptculo que contiene la deposicin (no se recomienda
recolectar deposicin en el tubo con el medio de transporte, quedando incluida en este,
corte el mango de madera sobrante de la trula y cierre hermticamente con la tapa.
Si la lleva antes de dos horas al laboratorio, puede permanecer a temperatura ambiente
en el medio de transporte. Si la demora es ms de dos horas, mantenga en el medio de
transporte a 4C para evitar el sobrecrecimiento de la flora normal que puede enmascarar
o destruir a los enteropatgenos.
El fro puede afectar la viabilidad de Shigellaspp.
Para el estudio de toxinas de Clostridium difficile la muestra se puede mantener hasta 48
horas

Sin medio de trasporte:

Receptculo estril: frasco boca ancha.
Introduzca la trula con deposicin directamente en el frasco de boca ancha, ms o
menos 1 o 2 grs de la muestra.
La muestra debe enviarla al laboratorio antes de una hora de su obtencin a temperatura
ambiente.

Examen macroscpico de la muestra

Se comprueba:
Consistencia:

Color: Caf, marrn, negro, amarillo.

Presencia de moco, pus, sangre, restos de alimentos sin digerir.

Examen Microbiolgico en fresco

Colocamos una gota diluida en agua destila

de la muestra en un portaobjetos y colocamos
un cubre encima.
Se realiza una dilucin en un tubo de ensayo
con una pequea cantidad de heces recogida
con la ayuda de un asa de siembra
desechable y se le aade un poco de agua
destilada, se agita un poco y se obtiene una
gota de esta dilucin. Dicha gota la colocamos
en un portaobjetos y aadimos una gota de
Lugol donde colocaremos un cubreobjetos
encima para su posterior observacin al
microscopio.
Otro mtodo de observacin es realizando el mismo procedimiento pero sustituyendo el
lugol por el negro sudan. Esta tincin est indicada para la observacin de grasa.

Procesamiento de las Muestras:

Heces Lquidas : No necesitan procesamiento

Heces slidas: Hay que licuarlas.
Se toma 5ml de suero fisiolgico
Se adiciona los 5ml a la muestra de Heces.
Mover con un baja lenguas las heces hasta que haya
quedado lo suficientemente lquida para tomar una
alcuota o llevar a centrifugacin.
Los restos se llevan al contenedor biolgico

Hisopos rectales

Para conocer la etiologa en el caso de una gastroenteritis aguda se debe utilizar una
muestra de materiafecal. Los hisopos rectales solo se aceptarn en casos en que no se
puedan obtener heces, por ejemploen neonatos o adultos debilitados, o internados en
unidades de cuidados intensivos. Se ha demostradoeficaz en el aislamiento de Neisseria
gonorrhoeae, Campilobacter spp, Shigellaspp, C. difficile, virus del Herpes simplex y en

portadores anales de Streptococcus pyogenes. No es vlido para la bsquedade

antgenos.
Obtencin de la muestra: Para realizar la toma se introduce el hisopo sobrepasando el
esfnter anal y se rota para hacer la toma de las criptas anales, mantener all durante 30
segundos para que se absorban los microorganismos y retirar. Una vez realizado se
introduce en un medio de transporte adecuado (Stuart, Cary-Blair, para anaerobios en el
caso de C. difficile), pues as se protege a las bacterias de la desecacin y se enva
rpidamente al laboratorio.
Realizacin de medios de cultivo

Se pone una gota de la alcuota segn lo que se quiera

descartar:

Agar sangre:
El agar sangre, es un medio enriquecido, diferencial,
usado para aislar microorganismos fastidiosos y
detectar actividad hemoltica. La -hemolisis, se
manifiesta como una lisis y digestin completa de los
eritrocitos que rodean la colonia, por ejemplo algunas
bacterias del genero Clostridium. La -hemolisis , aparece solo como lisis parcial (los
eritrocitos, no son lisados completamente o la digestin no fue completa), por tanto la
hemoglobina aparece como una halo verdoso alrededor de la colonia.

Agar chocolate
Es un tipo de agar sangre, donde las clulas sanguneas han sido lisadas por
calentamiento a 56 C. El agar chocolate se usa para cultivo de bacterias respiratorias
fastidiosas como por ejemplo Haemophilus influenzae. No contiene chocolate, solo es
llamado as por la coloracin.

Agar MacConkey
Es un medio selectivo y diferencial utilizado para la recuperacin de enterobacterias y
bacilos Gram negativos entricos relacionados. Contiene sales biliares y cristal violeta que
inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y de algunas Gram negativas exigentes.
La lactosa es la nica fuente de carbono. El indicador es el rojo neutro. Las bacterias
fermentadoras de lactosa formas colonias de diferentes tonos de rojo. Los fermentadores
fuertes de lactosa pueden provocar la precipitacin de las sales biliares por la gran
cantidad de cidos formados, lo que se observa fcilmente en el medio por la aparicin de

zonas opacas alrededor de las colonias. Las bacterias que no fermentan la lactosa forman
colonias incoloras o transparentes.

Agares selectivos tenemos:

Agar Manitol salado

Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciacin de
estafilococos. Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patognicos a partir
de muestras clnicas, alimentos, productos cosmticos y otros materiales de importancia
sanitaria.
Tambin, este medio puede utilizarse para el cultivo de especies halfilas de Vibrio, si no
se dispone de medios apropiados (TCBS Medio, Medio Marino, etc.), aunque algunas
especies pueden no desarrolla

ABA:
Agar sangre con 20 g/ml de ampicilina es til para el aislamiento de todas las especies de
Aeromonas excepto A. Trota que es sensible a la ampicilina. Las especies de relevancia
clnica son beta- hemolticas; a las colonias beta-hemolticas en agar sangre se les realiza
oxidasa e indol, cualquier colonia que da ambas pruebas positivas debe someterse a
identificacin definitiva.

Agar Campy con sangre

Medio selectivo para el aislamiento de especies de Campylobacter. El medio est
suplementado con sangre y con cefoperazona, vancomicina y anfotericina B para inhibir
el desarrollo de la mayora de las bacterias Gram negativas, Gram positivas y levaduras,
respectivamente.

Agar desoxicolato-citrato (ADC)

Medio altamente selectivo para el aislamiento de Salmonella y Shigella. El desoxicolato
sdico inhibe o suprime considerablemente el crecimiento de coliformes y bacterias Gram
positivas. Sin embargo, en ocasiones crecen coliformes, y cuando se encuentran en

grandes cantidades producen cido a partir de la lactosa, precipitan la sal biliar y dan un
medio rojo que hace difcil la deteccin de patgenos. Incluye rojo neutro como indicador.
Las colonias de Salmonella y Shigella son incoloras.

Agar EMB (eosina, azul de metileno, eosin-methylen blue, Agar de Levine)

Es un medio diferencial y selectivo para aislar y detectar enterobacterias en muestras
mixtas. Los colorantes de anilina (eosina y azul de metileno) inhiben el desarrollo de
bacterias Gram positivas y a las Gram negativas exigentes. Tambin se combinan
precipitando a pH cido, actuando como indicadores de produccin de cidos. El medio
incluye lactosa, lo que permite la diferenciacin de los fermentadores de lactosa de los no
fermentadores. Los fermentadores fuertes de lactosa, sobre todo Escherichia coli,
producen colonias de color negro verdoso con brillo metlico. Los productores ms
dbiles de cidos, forman colonias de color violeta. Los no fermentadores de lactosa
forman colonias transparentes.

Agar sangre con estra estafiloccica

Muchas bacterias y levaduras sintetizan y secretan NAD (factor V) durante el crecimiento,
tal es el caso de Staphylococcus aureus. En cultivos mixtos, las especies de Haemophilus
que requieren este factor pueden crecer como colonias puntiformes alrededor de las
colonias de estos otros microorganismos (satelitismo). Esto proporciona una tcnica para
detectar especies de Haemophilus en muestras mixtas y una prueba presuntiva para la
identificacin del gnero. La tcnica consiste en sembrar una posible colonia de
Haemophilus en estra (como un csped) en agar sangre. Posteriormente, se hace una
nica estra sobre la placa con un cultivo de S. aureus. A las 24 horas pueden observarse
las pequeas colonias grises de Haemophilus dentro del rea hemoltica adyacente al
crecimiento de los estafilococos.
Agar triptona-soja (TSA)
Medio rico de uso general para el crecimiento de una amplia variedad de
microorganismos. Se produce por digestin enzimtica de la soja y de la casena. Con
frecuencia se utiliza como agar base para otros tipos de medios, como agar sangre, por
ejemplo. En este medio pueden crecer algunos microorganismos exigentes como ciertas
especies de Brucella, Corynebacterium, Listeria, Neisseria y Vibrio.

Caldo selenito
Caldo con selenito sdico que en ocasiones se suplementa con cistena, diseado para el
enriquecimiento de salmonelas. El selenito inhibe el crecimiento de coliformes y

enterococos en las primeras 12 horas de incubacin mientras que Proteus y Salmonella

no son inhibidos.

Agar Mac Conkey + Sorbitol:

Es una variante del tradicional de agar MacConkey utilizado en la deteccin de E. coli
O157: H7 Tradicionalmente, agar MacConkey se ha utilizado para distinguir aquellas
bacterias que fermentan la lactosa a partir de los que no lo hacen. Esto es importante
porque las bacterias del intestino, tales como Escherichia coli , tpicamente pueden
fermentar la lactosa, mientras que los patgenos intestinales importantes, tales como
Salmonella enterica y la mayora de Shigellas son incapaces de fermentar la lactosa.
Shigella sonnei puede fermentar la lactosa, pero slo despus de incubacin prolongada,
por lo que es referido como un fermentador tarda-lactosa.

Agar CIN (cefsulodina, irgasn, novobiocina)

Medio selectivo para Yersinia. Contiene manitol y rojo neutro como indicador. Las colonias
de Yersinia presentan un borde transparente con un amplio centro rojo muy intenso. No es
totalmente especfico para Yersinia, ya que pueden crecer otros bacilos Gram negativos,
en particular Citrobacter freundii, que presenta colonias semejantes a las de Yersinia.

Agar bilis esculina con azida

Es usado para aislar Enterococcus as como Streptococcus

Agar XLD:
Xilosa lisina desoxicolato agar (agar XLD) es un selectivo medio de cultivo utilizado en el
aislamiento de Salmonella y Shigella especies a partir de muestras clnicas y de
alimentos. Tiene un pH de aproximadamente 7,4, dejndolo con un rosa brillante o
aparicin de color rojo debido a la roja indicadora fenol. Azcar de fermentacin reduce el
pH y el indicador rojo fenol registra esto cambiando a amarillo. La mayora de las
bacterias del intestino, incluyendo Salmonella, pueden fermentar el azcar xilosa para
producir cido; colonias de Shigella no pueden hacer esto, por lo que permanecer en
rojo. Despus de agotar el suministro de xilosa colonias de Salmonella se descarboxilar
lisina, aumentando el pH de nuevo a alcalino y imitando las colonias de Shigella rojos.
Salmonella metabolizar tiosulfato para producir sulfuro de hidrgeno , lo que conduce a la
formacin de colonias con el centro negro y les permite diferenciarse de las colonias de
Shigella del mismo color.

Otras enterobacterias tales como E. coli fermentar la lactosa y la sacarosa presente en el

medio en una medida que impida la reversin pH por descarboxilacin y acidificar el
medio convirtindolo amarillo.
Especies de Salmonella: colonias rojas, algunas con centro negro. El agar en s se
volver de color rojo debido a la presencia de colonias de tipo Salmonella.
Especies de Shigella: colonias rojas.
Coliformes : amarilla a colonias de color naranja.
Pseudomonas aeruginosa :, colonias de color rosa y planas en bruto. Este tipo de colonia
puede ser fcilmente confundido con Salmonella debido a la similitud de color.

Agar SS: Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas
especies de Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se
sospeche su presencia. La selectividad, esta dada por la sales biliares y el verde brillante,
que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayora de los coliformes y el
desarrollo invasor del Proteus spp. Es diferencial debido a la fermentacin de la lactosa, y
a la formacin de cido sulfhdrico a partir del tiosulfato de sodio. Los pocos
microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar, acidifican el medio
haciendo virar al rojo el indicador de pH, obtenindose colonias rosadas o rojas sobre un
fondo rojizo.
Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen bien
en el medio de cultivo, y producen colonias transparentes.
La produccin de cido sulfhdrico se evidencia como colonias con centro negro debido a
la formacin de sulfuro de hierro.
Para aumentar la selectividad, se recomienda incubar previamente la muestra en Selenito
cald

Agar TCBS: Medio selectivo para el aislamiento y cultivo de Vibrio cholerae, Vibrio
parahemolyticus y otras especies de Vibrio a partir de heces, Tambin es conocido como
Agar Tiosulfato Citrato Bilis Sacarosa, o como Agar Selectivo para Vibrios. Esta inhibicin
se basa en las altas concentraciones de tiosulfato y citrato, la presencia de bilis y un pH
fuertemente alcalino. La degradacin de la sacarosa es variable entre las especies de
Vibrio y las colonias son verdes para las cepas que no la utilizan y amarillas para aquellas
que producen cido a partir de este azcar. Esto es debido al viraje del color de los
indicadores de pH azul de timol y azul de bromotimol, del color azul al amarillo en medio
cido.

Agar THM
Haemophilus Test Medium Agar (HTM Agar) est diseado para su uso en el
procedimiento de prueba de sensibilidad por medio del mtodo de difusin en disco para
Haemophilus spp ste medio es agar o caldo Mueller Hinton suplementado con factor X
(hemina o hematina), factor V (nicotinamida adenina dinucletido, o NAD) y extracto de
levadura. Una ventaja importante del agar HTM en comparacin con el agar chocolate
Mueller Hinton es la claridad ptica, lo que permite las mediciones de dimetro de zona
desde el fondo de la placa, como es el procedimiento de prueba estndar para los
organismos no exigentes en agar Mueller Hinton. Adems, el agar HTM contiene niveles
bajos
de
timidina
y
es,
por
consiguiente,
adecuado
para
analizar
trimetoprima/sulfametoxazol
Siembra e inoculacin de placas

Se procede a realizar la siembra, en estra mltiple, con la

ayuda de un asa de siembra, tomando una pequea
cantidad de inculo de las heces, previamente diluido en
suero, teniendo en cuenta de trabajar en condiciones lo
ms aspticas posibles. Se tapa la placa y se mete en la
estufa en un periodo de 24-48 horas A 37C.

Examen morfolgico del crecimiento de las colonias cultivadas macroscpicamente y al

microscopio.
Las caractersticas fsicas de las colonias son de gran ayuda en la identificacin. Cada
microorganismo crece de manera diferente formando colonias de distinto color, forma,
tamao, textura, olor, brillo, etc. Existen colonias ms o menos elevadas, con bordes
enteros, estrellados, deflecados, y un largo etc. El tiempo de incubacin necesario para
que aparezcan las colonias tambin puede tener valor en la identificacin. Las
caractersticas de las colonias tampoco ofrecen un diagnstico por si solas, pero dirigen
los esfuerzos hacia un grupo ms o menos amplio de microorganismos.
Hay colonias muy caractersticas, casi exclusivas de determinadas bacterias. Es el caso
de las especies de Proteus, que se extiende ampliamente por la placa formando un velo
muy caracterstico.

Examen microscpico

Una vez transcurrido el tiempo necesario se procede a sacar el medio de cultivo, la placa
de Petri y se obtiene una pequea muestra con la ayuda del asa de siembra y se coloca
en un porta previamente humedecido con una gota de agua destilada. Para poder fijar la

muestra lo podremos realizar con calor, por lo que se pasa a realizarlo con el mechero y
cuidando de no quemarnos lo haremos con la ayuda de una pinza de madera.
A continuacin se procede a teir la muestra.
Tincin azul de metileno:
El procedimiento es bastante sencillo. Primero se ha de fijar la muestra pasando el porta
por el mechero varias veces. Luego se tie con el azul de metileno cubrindola entera.
Pasado 5 min. Se lava con agua destilada se deja secar y se proceder a observar en el
microscopio con aceite de inmersin y en el objetivo de 100x.
Esto nos permite comprobar la presencia o ausencia de leucocitos. As:
Presencia de leucocitos: La infeccin ha cursado con inflamacin intestinal. Se trata por
tanto de microorganismos invasivos como Salmonella, Shigella.
Ausencia de leucocitos: Significa que no ha habido inflamacin por lo que la infeccin
puede ser debida a virus (Rotavirus) o a bacterias productoras de toxinas (Vibrio
cholerae).

Para realizar la tincin de Gram:

Primero se realiza un frotis con la muestra en un portaobjetos.( Realizamos 3 frotis con
tres colonias aisladas). Se fija la muestra en el mechero y se coloca despus en la cubeta
para proceder a teirla.
Se cubre la muestra con 1 minuto de cristal violeta, 1 min de lugol, 30 seg y 1 min de
fucsina bsica, y se lava con agua destilada entre colorante y colorante adems del
alcohol y se deja secar.
Esta tincin nos sirve para distinguir entre las bacterias Gram + y Gram segn sea la
composicin de su pared y apreciar visualmente su forma y organizacin. O si se
observan microorganismos Bacilos.

Realizacin de pruebas bioqumicas

Triple azcar hierro T.S.I.

En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes
adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos
de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la
produccin de cido sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ ,

los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de color
negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance
osmtico.
Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del
indicador rojo de fenol,el cual vira al color amarillo en medio cido. El tiosulfato de sodio
se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de hierro
proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro.

LIA
Es un medio que sirve para demostrar la produccin de dos enzimas: la lisina
descarboxilasa y la lisina desaminasa, adems la presencia de sales de hierro sirve para
detectar la produccin de H2S por algunos microorganismos.
La descarboxilacion de la lisina ocurre en ambiente anaerbico o sea en el fondo del tubo
y se pone de manifiesto por la alcalinizacin del medio produciendo un viraje del indicador
prpura de bromocresol. La presencia de glucosa en los componentes del LIA determina
primero una reaccin de fermentacin, produciendo acidificacin y cambio de color del
medio a amarillo y el pH favorable para la reaccin de descarboxilacion que ocurre
despus, volviendo a su color violeta
original la parte del fondo del tubo.
La desaminacion de la lisina que se puede producir por los gneros Proteus y
Providencia tiene lugar en la parte superior del tubo produciendo acido a cetocarbonico
que al combinarse con la sal de hierro y en presencia de oxigeno forma un color violeta
rojizo. La produccin de H2S se evidencia por la presencia de un precipitado negro por
utilizacin de las sales de hierro.

Citrato
El citrato de sodio es una sal del acido ctrico, un compuesto orgnico simple que
constituye uno de los metabolitos del ciclo de los cidos tricarboxilicos. Generalmente los
microorganismos que emplean el citrato como nica fuente de carbono, utilizan sales de
amonio como nica fuente de nitrgeno. El metabolismo del citrato realizado, por algunas
bacterias se realiza por el ciclo de krebs y requiere el desdoblamiento del citrato por la
enzima citritasa (citrato-oxalacetato-liasa o citrato desmolasa) en presencia de magnesio
o manganeso y de transportadores como citrato permeasas.

La citritasa acta sobre el citrato produciendo acido oxalacetico y acetato; productos que
son convertidos enzimaticamente a piruvato y dixido de carbono. Durante esta reaccin

el medio comienza a alcalinizarse por el CO2 que se genera, el cual se combina con el
agua y el sodio para formar Carbonato un producto alcalino, este carbonato da la
alcalinidad que produce el cambio de color del indicador de pH del medio de verde a azul
Prusia oscuro (indicador: azul de bromotimol, amarillo a pH< de 6.0 y azul a pH > de 7.6).
El medio incluye citrato como nica fuente de carbono y fosfato de amonio como nica
fuente de nitrgeno.

SIM ( SULFURO-INDOL-MOTILIDAD)
El indol, es uno de los productos de la degradacin metablicas del amino acido
triptofano. Las bacterias que producen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y
desaminar el triptofano con produccin de Indol, acido piruvico y amoniaco. La prueba del
indo esta basada en la formacin de un complejo rojo cuando el Indol reacciona con el
grupo aldehdo p-dimetilaminobenzaldehido. Este es el principio activo del reactivo de
Kovacs.

Prueba KIA
Sembramos en picadura dos tubos con el medio KIA e incubamos a 37C durante 18-24
horas. Observar. Con la prueba bioqumica del KIA hemos detectado la capacidad que
tienen las enterobactericeas para metabolizar o no la glucosa y/o lactosa, produccin de
gas y de cido sulfhdrico.

B-GALACTOSIDASA
Nos indica si la bacteria en su metabolismo fermenta la lactosa. Esta prueba la
realizaremos preparando una suspensin densa del microorganismo en un tubo donde
aadiremos una gota de tolueno y mezclaremos para despus aadir el disco de ONPG.
Incubaremos a 37C y leemos antes de 24h el resultado.

OXIDASA
Esta prueba nos indica si el microorganismo contiene la enzima citocromo oxidasa
descartando que fuera un microorganismo anaerobio estricto pudiendo ser aerobio o
anaerobio facultativo. Se procede a impregnar una tira reactiva con una muestra de la
colonia crecida en la placa de Agar Sangre y observar la reaccin que produce cambiando
de color.

CATALASA
Para esta prueba se toma una colonia del microorganismo joven y se coloca sobre un
portaobjetos donde aadiremos una gota de perxido de hidrgeno observando si
produce o no burbujas.

UREASA
Esta prueba se realiza sembrando el microorganismo en medio Christensen en tubo
inclinado por la superficie en zigzag. El resultado se observa despus de una incubacin a
37C con un cambio de color del indicador.
Antibiograma

Una
vez
que
realizamos
nuestra
identificacin de bacterias en nuestros
aislamientos se realiza el ANTIBIOGRAMA
para la prueba de susceptibilidad de la
bacteria frente a antibiticos para un
tratamiento adecuado e ptimo.
El sembrado se realiza por agotamiento, se
deja secar 4-5 luego se colocan los discos
de antibiticos con unas pinzas en el medio
Mueller Hinton.

Infecciones de Vas Areas Superiores

Las infecciones respiratorias agudas que comprometen las vas areas superiores (IVAS)
son en general de escasa gravedad y tienden a ser autolimitadas, pero, por su gran
frecuencia, son la principal causa de absentismo escolar y laboral y, aunque una gran
mayora de los enfermos se autotrata, constituyen tambin la principal causa de consulta
mdica. El 90% de estos episodios son de origen viral y el resto a otros agentes,
comoStreptococcus
pneumoniae, Haemophilus
influenzae, Mycoplasma
pneumoniae,Chlamydia pneumoniae y Streptococcus spp. Si bien las infecciones de la va
area superior producidas por bacterias tienden a tener como grupo algunas diferencias,
en la prctica clnica resultan indistinguibles de las infecciones virales en el caso
individual. El gran nmero de agentes causales posibles determina que cada
microorganismo produzca slo una escasa proporcin de las IVAS. Este hecho, junto con
la frecuente mutacin que presentan algunos virus, hace prcticamente imposible
desarrollar vacunas que puedan prevenir eficazmente este tipo de enfermedades.
Las IVAS pueden afectar a cualquier individuo, pero son ms frecuentes e intensas en
nios, probablemente debido a la ausencia de inmunidad especfica. A medida que el
individuo envejece y se inmuniza por las infecciones que sufre, las IVAS son menos
frecuentes. Hacen excepcin a este hecho las mujeres en edad frtil y las personas que
trabajan con nios pequeos (guarderas, hospitales peditricos, parvularios, etc.),
seguramente debido al mayor contacto con nios enfermos.
Las IVAS son ms frecuentes en invierno debido a la mayor probabilidad de transmisin,
ya que las personas permanecen mayor tiempo en ambientes cerrados con mayor
hacinamiento y las microgotas contagiosas mantienen su humedad por ms tiempo en el
ambiente fro. No se ha demostrado que el fro sea causa directa de las IVAS y la
asociacin entre un enfriamiento previo y la infeccin que los pacientes frecuentemente
relatan correspondera a que la persona ya contagiada e infectada, aunque asintomtica
todava,es ms sensible al fro que lo normal por una falla de la termorregulacin
provocada por el virus.
El diagnstico de las infecciones respiratorias agudas de etiologa viral se orienta por el
cuadro clnico y se puede confirmar por medio de exmenes de laboratorio: deteccin de
antgenos en muestras respiratorias, serologa (produccin de anticuerpos clases Ig G e
Ig M), cultivos especiales y tcnicas de amplificacin de cidos nucleicos (reaccin de la
polimerasa en cadena o PCR). Sin embargo, la elevada prevalencia de las infecciones
respiratorias virales, su bajo riesgo de complicaciones, evolucin autolimitada y la
ausencia de terapias especficas determinan que los clnicos rara vez requieran identificar
el agente causal para el manejo adecuado de los enfermos.
Entre las principales enfermedades tenemos:
FARINGITIS

La faringitis es la inflamacin de la mucosa que reviste la faringe. Generalmente le

acompaan sntomas como deglucin difcil, amgdalas inflamadas y fiebre ms o menos
elevada. Las posibles causas de la faringitis son las infecciones vricas, infecciones
bacterianas o reacciones alrgicas. Los principales agentes causantes bacterianos son
Streptococcus pyogenes y Haemophilus influenzae,
Varios datos clnicos son sugerentes de infeccin por estreptococo:
- Cefalea.
- Mayor malestar general, con fiebre alta.
- Abdominalgia incluso con vmitos.
- Amgdalas aumentadas de tamao con un exudado blanco grisceo y criptas necrticas.
- Adenopatas cervicales (son prcticamente constantes).
- Puede aparecer un exantema escarlatiniforme.
LARINGITIS AGUDA
La laringitis es la inflamacin de la mucosa larngea y de las cuerdas vocales y cursa con
disfona y tos seca (sin fiebre). La mayora de los casos son secundarios a cuadros
catarrales vricos, pero hay que descartar:
SINUSITIS
La sinusitis, o rinosinusitis, es una respuesta inflamatoria de la mucosa de la nariz y de los
senos paranasales que puede deberse a una infeccin por agentes bacterianos, virales u
hongos; o un cuadro alrgico; o a una combinacin de estos factores.
Se caracteriza por rinorrea (secrecin por la nariz), obstruccin nasal y dolor facial; puede
haber hiposmia o anosmia, tos, fiebre, fatiga, dolor dentario, halitosis y malestar tico.
Generalmente est precedida de una rinitis, por cuya razn se prefiere el uso del trmino
rinosinusitis
Si la infeccin es de origen bacteriano, los tres agentes causales ms comunes son el
Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae y Moraxella catarrhalis.5 En el
pasado, el Haemophilus influenzae era el agente bacteriano ms frecuente causante de
infecciones de los senos paranasales. Sin embargo desde la introduccin de la vacuna
contra Hib ha habido una disminucin drstica en infecciones causadas por H. influenza
tipo B y ahora se ven con ms frecuencia las cepas no-tipables de la bacteria. Otras
bacterias patgenas incluyen el Staphylococcus aureus y otras especies de
estreptococos, bacterias anaerobias y, con menos frecuencia, bacterias gram negativas
RINITITIS
La rinitis bacteriana aguda de origen primitivo es rara, siendo lo ms frecuente que este
cuadro se produzca como consecuencia de la sobreinfeccin de una rinitis vrica, siendo
en la prctica muy difcil diferenciar un coriza sobreinfectado de una rinitis bacteria aguda

primitiva. Prcticamente slo en recin nacidos y lactantes aparecen rinitis bacterianas de

origen primario. A veces, es difcil de diferenciarla de la vrica.
Existen bacterias que viven como saprofitas. A expensas de influencias exteriores y por
variaciones en la condicin del organismo husped, estos saprofitos pueden hacerse
patgenos, sin que ningn virus o un mecanismo alrgico preparen el terreno para la
infeccin, si bien se piensa que se produce en una situacin de disminucin de las
defensas del husped.
Los grmenes productores ms frecuentes son streptococos, haemophilus influenzae y
neumococos.
DIFTERIA
Es una enfermedad infecciosa aguda epidmica, debido a la exotoxina proteica producida
por Corynebacterium diphtheriae (bacilo de Klebs-Lffler). Se caracteriza por la aparicin
de falsas membranas (pseudomembranas) firmemente adheridas, de exudado fibrinoso,
que se forman principalmente en las superficies mucosas de las vas respiratorias y
digestivas superiores.
La difteria es una enfermedad causada por el efecto de la exotoxina de las cepas
toxignicas de C. diphtheriae, que usualmente afecta las amgdalas, garganta, nariz,
miocardio, fibras nerviosas o piel. Se trata de una exotoxina de tipo A/B. La subunidad B
es reconocida por receptores de membrana, lo que provoca que la subunidad A entre en
la clula mediante protelisis. Una vez all la subunidad A ADP-ribosila el factor de
elongacin e E2F, inutilizando la maquinaria de traduccin. La subunidad B es exocitada.
Ataca sobre todo a los nios menores de cinco aos y a adultos mayores de 60 aos.
Esta enfermedad infecciosa provoca, entre otros sntomas, ardor en la garganta al pasar
la comida, dificultad al respirar y/o estados de shock inminente (piel fra, inquietud, fiebre,
exudado mucoso grisceo).Puede ser mortal.
TOS FERINA
Es una enfermedad infecciosa aguda sumamente contagiosa de las vas respiratorias
altas causada por la bacteria gramnegativa Bordetella pertussis, se caracteriza por
inflamacin traqueobronquial y accesos tpicos de tos violenta y espasmdica con
sensacin de asfixia que terminan con un ruido estridente durante la inspiracin (estridor
inspiratorio).3 B. parapertussis y otros microorganismos causan una enfermedad similar
pero ms leve a la que se denomina sndrome coqueluchoide. 4 Este trmino se prefiere
cuando el diagnstico es exclusivamente clnico y la enfermedad puede deberse a otros
agentes virales o bacterianos.
Las complicaciones pueden incluir compromiso del sistema nervioso y el miocardio. La
aparicin de la tos ferina es posible a cualquier edad pero los ms afectados son los nios
menores de cinco aos

ENFERMEDAD DE VINCENT
La angina de Vincent o gingivitis ulcerativa/ulcerosa necrotizante es una infeccin
polimicrobial de las encas y las papilas interdentales, que produce inflamacin, sangrado,
tejido ulceroso y necrtico acompaado por fiebre, amigdalitis, linfadenopata y halitosis.
Los principales organismos causantes de la angina de Vincent incluyen bacterias
anaerobias como Bacteroides y Fusobacterium,2 as como las espiroquetas (Borrelia y
Treponema). La infeccin se implanta por razn de una sobrepoblacin de
microorganismos debido a una variedad de razones, incluyendo una mala higiene, dieta,
estilo de vida, el tabaquismo y otras infecciones pre-existentes. La enfermedad es ms
frecuente en la poblacin joven.
Flora normal del tracto respiratorio superior

Tipo de Muestras

Existe una gran variedad de tipos de muestras procedentes de diferentes zonas del tracto
respiratorio inferior que se pueden someter a estudio microbiolgico. Estas muestras se
obtienen por:

EXUDADO NASAL
Reclinando hacia atrs ligeramente la cabeza del paciente introducir el hisopo en la fosa
nasal

Con el hisopo previamente embebido en suero fisiolgico estril, tomar muestra profunda
de ambas fosas nasales girando ligeramente
Regularmente basta con una sola muestra.
Envo inmediato al laboratorio (no superior a 2 horas).
Se deber consignar en la solicitud si hay lesiones o costras a nivel nasal.(muy
importante)
EXUDADO FARNGEO
Condiciones Previas (indicaciones al paciente):
El paciente deber presentarse sin aseo bucal
Sin enjuagarse la boca y sin comer ni beber nada un mnimo de 8 horas antes
Esto para evitar arrastrar la bacteria durante la deglucin y obtener as una muestra
alterada.
Cultivo Corriente
Bajo visin directa y con la ayuda del baja lenguas, se deprime la lengua con suavidad.
Se tocar con el hisopo en todas las partes con exudado (membranas o inflamacin).
Se deben frotar la mucosa por detrs de la vula, entre los pilares amigdalinos y la
faringe posterior.
En lo posible no tocar la mucosa oral, lengua, vula ni dientes.
Deben evitarse las condiciones ambientales adversas, como exposicin al fro o calor

extremos.
Los medios de transporte de Stuart, etc. son los que se usan con ms frecuencia.
Cultivo para Corynebacterium difteriae
Deprimir la lengua con bajalenguas. Si se advierte la presencia de pseudomembrana,
tomar dos muestras con torula del borde de la misma sin romper. Poner ambas trulas
en un tubo estril. Si el transporte de las muestras es superior a cuatro horas, se
recomida enviarlas en un tubo con silica gel.
Una de ellas debe ser usada para la tincin de Gram.
cutnea tomar de la zona de la piel afectada adems
tincin gram si se observan bacilos gram positivos
laboratorio debe de entregar un informe preliminar
difteromorfos.

En caso de sospecha de difteria

de una muestra farngea. Hacer
de morfologa caracterstica, el
que diga bacilos grampostivos

HISOPADO NASOFARINGEO
Poner la cabeza del paciente en un ngulo de + 70 grados.
Introducir trula de dacron en ambas fosas nasales, deslizndola por la mucosa del piso
de la fosa nasal hasta tocar la pared posterior de la faringe; frotar la faringe haciendo girar
la trula para obtener una buena cantidad de clulas epiteliales.
Nota: No introducir la trula hacia arriba siguiendo la forma de la nariz; la trula debe
dirigirse hacia atrs siguiendo el piso de la nariz.
Retirar la trula y ponerla en el tubo de medio de transporte (MTA, MTV) o culturette
segn el examen y laboratorio de destino.
Nota: Para IFD o cultivo: Si la trula de dacrn no cabe entera en el frasco de MTA o MTV,
debe cortarse o quebrarse con la ayuda de una tijera. Para Test Pack: Al usar la minitip
culturette no olvide quebrar la ampolla que trae el sobre. 4.
Mantenga muestras a 4 grados C hasta que sean recogidas por el servicio de transporte.

Procesamiento de la Muestra: Segn el tipo de Mx.

 Interpretacin de la Tincin Gram

Se describe los hallazgos de clulas inflamatorias y de alteracin de la flora habitual,

como es el caso del aumento de bacilos gramnegativos fusiformes y espiroquetales que
orientan el diagnstico hacia una Angina de Vincent; as mismo reportar la presencia de
clulas levaduriformes, hifas y pseudohifas.
Interpretacin de los cultivos

Se Inspecciona las placas de AS en busca de colonias pequeas de 1 a 1,5 mm de

dimetro, rodeadas de un halo de hemlisis completa (beta-hemlisis).
A partir de las colonias sugestivas realizar extendidos para teir al Gram; si se observan
cocos grampositivos dispuestos en cadenas, se repican de 4 a 6 colonias en AS y en
tubos de caldo Todd-Hewitt e incubar a 36 C por 24 h.

Realizar pruebas de identificacin

Prueba de la Bacitracina
Para diferenciar S. pyogenes de otros beta-hemolticos, se pueden utilizar diferentes
pruebas, siendo la de uso comn la prueba de la bacitracina .
Esta prueba se basa en la susceptibilidad de S. pyogenes frente a una concentracin
relativamente baja de bacitracina. Para ello se inocula la cepa pura en AS, mediante
hisopo estril extendiendo en cuatro direcciones; se coloca el taxo A (bacitracina 0,04 U) y
el disco de trimetoprim-sulfametoxazol (SXT) sobre el cultivo. Al cabo de 18-20 h de
incubacin a 36C, se detectar la presencia de un halo de inhibicin del crecimiento de
cualquier tamao, que indica la susceptibilidad del microorganismo.
Esta tcnica tiene un 5% de falsos negativos y entre 10 y 20% de falsos positivos ya que
otros Streptococcus (grupos C y G) tambin pueden dar sensibles.
Hidrlisis de PYR:
Otra prueba disponible en muchos laboratorios es la hidrlisis del PYR, sta se
fundamenta en la actividad de la enzima pirrolidonil aminopeptidasa producida por S.
pyogenes, sobre un sustrato el L-pirrolidonil-beta-naftilamida (PYR), con formacin de
beta-naftilamida libre, que se combina con el reativo cinamaldehdo formando un producto
final de color rojo.
Los laboratorios que utilizan las pruebas bacitracina o PYR deben informar: Hubo
desarrollo presuntivo de Streptococcus pyogenes
Carbohidrato de Lancefield:
La identificacin definitiva se lleva a cabo mediante la deteccin del antgeno especfico
de grupo, tambin llamado carbohidrato de Lancefield; sta se realiza a travs de
mtodos de aglutinacin con partculas de ltex o coaglutinacin, directamente sobre la
colonia aislada. Solo los estreptococos beta-hemolticos, A , B , C , F , G y los alfa o no
hemolticos del grupo D pueden clasificarse con esta prueba. Para su realizacin se
procede a una extraccin previa de los antgenos de pared, que dependiendo del mtodo,
se emplear: cido, calor o enzimas. Luego se hace reaccionar la cepa pura de 24 h de
desarrollo con cada uno de los antisueros para cada serogrupo. La reaccin positiva se
evidenciar dependiendo de la interpretacin de cada protocolo: ya sea por aglutinacin,
coaglutinacin, entre otros.
El informe al mdico tratante debe incluir la identificacin del paciente, tipo de muestra
recolectada, estudio microbiolgico realizado, fecha de recepcin de la muestra, emisin
de los resultados y cualquier otro dato que el bioanalista considere necesario, por
ejemplo, las condiciones en que se traslad la muestra o las caractersticas de la misma,
hora de llegada al laboratorio, entre otros .

Antibiograma : En los casos que se aplique.