Tema 13

Cmo se clona un gen?

Cmo se clona un gen?

Aislamiento de genes

La construccin de una genoteca

El escrutinio de una genoteca

La fuente de ADN
ADN genmico
cDNA
Otras genotecas
RT-PCR
Genotecas substractivas
Phage display
Complementacin de mutaciones
Escrutinio con sondas de cidos nucleicos
Escrutinio con anticuerpos
Clonacin posicional
Paseos y saltos cromosmicos
La tcnica de amplificacin de exones

Genomas secuenciados

Genotecas: consideraciones previas

Qu genoteca? Depende de:

Mtodo de escrutinio
cidos nucleicos
Anticuerpos
Otro tipo de informacin

Fuente de ADN
Vector utilizado
Tamao del genoma
Tamao de la genoteca

Genotecas

Genotecas de ADN genmico

Genotecas de cDNA
Genotecas de expresin
Genotecas basadas en la PCR
RT-PCR
Substractivas
Minigenotecas
Genotecas para la bsqueda de interacciones de protenas
Genotecas para la bsqueda de interacciones de
molculas (phage display)

Digestin parcial

Clonacin en lambda

Clonacin en lambda

Clonacin en csmidos

Columnas de oligo(dT)

Sntesis de cDNA

Clonacin de cDNA

Genotecas de expresin

Genotecas de expresin

EcoRI methylase

Add EcorRI adapters

Genotecas de expresin

Genotecas basadas en la RT-PCR

Genotecas substractivas

Phage display

Tcnica para identificar pptidos o protenas

capaces de unirse a otras molculas
Secuencias de ADN (aleatorias o no), se unen
en fase al gen 3 de M13 que codifica la protena
de la cpsida pIII, dando lugar a protenas de
fusin en las que la secuencia recombinante se
encuentra en el exterior de la cpsida del fago
El resultado es la creacin de una genoteca
de ligandos, que permite la seleccin de
secuencias de ADN cuyo producto
interacta con otras molculas
El escrutinio se denomina panning (hacer una
panormica): los fagos se depositan en un
soporte slido, y ste se incuba con una placa
que contiene la molcula que queremos probar.
Despus de eluir los fagos no pegados, se
eluyen en otras condiciones los que s se han
quedado unidos. Tras varios ciclos de panning
se obtiene una poblacin de fagos nicos, de
los que se extrae el ADN y se secuencia.
Se ha utilizado para identificar pptidos que se
unen a receptores, sustratos, inhibidores,
eptopos, anticuerpos mejorados, interacciones
entre protenas, enzimas mejoradas,.

El escrutinio de una genoteca

Complementacin de mutaciones
Escrutinio con sondas

Homlogas o heterlogas
De ADN o ARN
Oligonucletidos

Escrutinio con anticuerpos

Clonacin posicional

Paseos y saltos cromosmicos

La tcnica de amplificacin de exones

Uso de genomas clonados

Complementacin de mutaciones

Complementacin de mutaciones

Hibridacin de colonias

Escrutinio con sondas de cidos nucleicos

Condiciones de hibridacin

Hibridaciones restrictivas (high stringency)

Hibridacin a altas temperaturas (65-68C)
Lavados de la sonda a altas temperaturas

Hibridaciones laxas (low stringency)

Hibridacin a bajas temperaturas (45-60C)
Varios lavados y exposiciones, incrementando 2-5C
la temperatura en cada uno de los lavados, para
eliminar las secuencias menos especficas

Uso de oligonucletidos degenerados

Oligonucletidos degenerados

Escrutinio con anticuerpos

(genotecas de expresin)

Clonacin posicional:
Mapa gentico de marcadores moleculares

Cromosoma 1

Marcadores genticos

Marcadores RH
Marcadores RFLP
Marcadores EST

Paseo cromosmico
Se construye una genoteca de ADN
genmico en BACs o el vector P1.
Estos clones, que llevan cada uno
un fragmento de ADN genmico de
unas 250 Kb, se ordenan sobre un
filtro de nylon de manera que
puedan ser hibridados con una
sonda conocida. Los clones que
muestran seal de hibridacin son
aislados y caracterizados de
acuerdo a su patrn de restriccin.
Posteriormente, se prepara una
nueva sonda a partir del extremo
ms distante del lugar inicial. Esta
sonda se utiliza entonces para
hibridar de nuevo la genoteca, y el
proceso se repite hasta que se
obtiene un conjunto de clones que
se extienden a lo largo de toda la
regin de inters

Paseo cromosmico

Mapa de contigs y necesidad de saltos

El resultado es un mapa de contigs, pero el

paseo cromosmico se puede ver interrumpido
porque se encuentra una regin de ADN
repetitivo, lo que provoca que el escrutinio de la
genoteca con la sonda seleccionada nos de una
seal de hibridacin con cientos o miles de
clones. Es necesario hacer un salto. Para ello
tenemos que volver al ltimo clon que nos
permiti disear una sonda de secuencia nica
(clon 13 en este caso).

Saltos cromosmicos
Sitio de restriccin

Oligo especfico

En la regin ms alejada de donde iniciamos el paseo cromosmico tenemos una secuencia nica (que ya
hemos utilizado para obtener el clon 14 del escrutinio), y adems conocemos varios sitios de restriccin a su
alrededor. Estas dos informaciones nos permiten disear una estrategia para llevar a cabo el salto
cromosmico: 1) La secuencia nica nos permite disear un oligonucletido especfico, y 2) los sitios de
restriccin que se encuentran junto a esta secuencia van a ser el punto de apoyo para realizar el salto.

Saltos cromosmicos

De todas las molculas circulares obtenidas

al menos una contendr la secuencia
complementaria a la de nuestro oligo
especfico. Si tenemos suerte, alguno de los
oligonucletidos inespecficos se unir al
ADN molde en la orientacin apropiada,
permitiendo la amplificacin por PCR de uno
o varios fragmentos de ADN.

Seleccin de fragmentos positivos

Los oligos inespecficos se pueden combinar en cualquier

lugar del genoma para amplificar un fragmento de ADN, lo
que da lugar a falsos positivos. Para eliminar estos falsos
positivos se transfiere a un filtro el gel resultante de la
amplificacin por PCR y ste se hibrida con nuestra sonda
conocida (extremo del clon 13). Estos fragmentos de ADN
amplificado que hibridan con la sonda se clonan, secuencian,
y se comparan con la secuencia conocida. Leyendo hasta el
sitio de restriccin de la enzima utilizada, todas las
secuencias deben ser iguales. A partir de ese punto, (ya que
hemos hecho una digestin parcial), la secuencia de cualquier
fragmento obtenido nos llevar a una secuencia que en
realidad se encuentra a cientos de Kb del sitio original en el
genoma (todo el crculo). En esta secuencia deberamos
identificar secuencias nicas para continuar con el paseo
cromosmico o probar con otras enzimas de restriccin para
llevar a cabo nuevos saltos.

La tcnica de amplificacin de exones

Paseos, saltos cromosmicos y

amplificacin de exones

Genomas secuenciados
Tericamente, podemos amplificar por PCR cualquier gen
en el que estemos interesados, NGF (nuestro gen favorito)
Problemas:
Que est o no anotado (y con qu nivel de fiabilidad)
Puede ser demasiado grande para obtenerlo como un
nico producto de PCR
Introduccin de mutaciones por las polimerasas
Determinacin y/o eliminacin de intrones
Problemas de modificaciones de nucletidos
Proyectos Genoma

Clones/no clones
Subclonacin