EXPERIMENTO N 1: ESTUDIO DE LA SUCCINATO DESHIDROGENASA

a) Fundamento:
Las transformaciones biolgicas de sustratos comprenden procesos de xido- reduccin y
transferencia de electrones a travs de una serie de sistemas enzimticos.
En las oxido reducciones se produce transferencia de e - . Algunas veces el transporte de e - es
realizada mediante la transferencia de atomos de hidrogeno o bien tomos de hidrogeno
y un electron. Las enzimas que realizan este tipo de reacciones son las deshidrogenasas
pudiendo ser piridin (NAD, NADH) o flavina (FAD) dependientes; adems existen los
citocromos que son de naturaleza ferroporfirnica y se encuentran ordenados de acuerdo a
su potencial de xido reduccin constituyendo la llamada Cadena de Transporte
Mitocondrial.
Algunos compuestos organicos coloreados, al aceptar hidrgenos se convierten en
leucoderivados. Tal es el caso del azul de metileno cuyo potencial de xido-reduccin es
+0.01 y el 2.6-diclorofenolindofenol cuyo potencial de xido-reduccin es +0.22.
La succinato deshidrogenasa (SDH) es una flavoproteina unida a hierro no hmico. El
metal tiene como finalidad actuar como enlace para conservacin de energa y desacoplar los
dos equivalentes reductores del ion hidrogeno aceptado por flavina y, finalmente estabilizar
la forma semiquinoide de la flavina.
Diversas sustancias pueden actuar inhibiendo los sistemas biolgicos de xido reduccin.
Por ejemplo, el malonato acta especficamente inhibiendo a la succinato deshidrogenasa
por un mecanismo competitivo; por lo tanto la prueba experimental con azul de metileno
ser negativa, sea no se decolora por no haber movilizacin de electrones. El cianuro, acta
impidiendo la reaccin de los citocromos, pues se combina especficamente con Fe +++ de la
citocromo oxidasa; por ello los citocromos permanecen reducidos e incapaces de seguir
actuando se bloquea la respiracin
b) Objetivo
-

Poner en manifiesto experimentalmente una de las etapas del metabolismo

intermediario y la accin de la succinato deshidrogenasa, haciendo uso de un aceptor
de electrones como es el azul de metileno.
Verificar la accin inhibitoria del malonato sobre la succinato deshidrogenasa y del
cianuro a nivel de la cadena respiratoria mitocondrial.

c) Procedimiento
1. Se procede a obtener material biolgico del cuy ; hgado, corazn y msculo
colocndolas en lunas de reloj

HGADO
2. Se procede rpidamente
a pesar:
Muestra

Hgado

CORAZN
Corazn

MSCULO
Msculo

Cantidad (gr)

10

2.3

3. Las muestras se pican en un mortero.

4. Se aade Sucrosa 0.25 M. y se homogeniza siempre teniendo una base de hielo

Muestra
Hgado
Corazn
Msculo

Sucrosa 0.25 M (ml)

100
20.7
100

5. Se procede a filtrar con una gasa

6. Se prepara el siguiente sistema de tubos para los tres casos

10

Tubo N
Succinato de sodio 0.1 M.
Buffer fosfato pH 7.4
Malonadi de sodio
Cianuro de potasio 0.1 M.
Agua destilada
Azul de metileno 0.05%
Extracto enzimatico
Aceite mineral

1
2.0
1.5
0.5
0.5
1.0

2
0.5
2.0
1.0
0.5
0.5
1.0

3
0.5
2.0
0.5
0.5
0.5
0.5
1.0

4
0.5
2.0
0.5
0.5
0.5
0.5
1.0

7. Cada tubo se coloca durante 10 minutos a bao Mara y observar el decoloramiento

d) Resultados:

HGADO

MSCULO

CORAZN

e) Discusin
Para qu se utiliza el azul de metileno?
El azul de metileno tiene como funcin aceptar electrones. Al ser un compuesto
orgnico coloreado al aceptar hidrgenos se conviereten en leucoderivado.
Porque el azul de metileno actua como aceptor final de electrones y no los otros
compuestos?
En el proceso de la cadena respiratoria mitocondrial los complejos se ordenan de
acuerdo al potencial de xido-reduccin. Mientras ms positivo el potencial es ms
oxidante.
Se ordenarian de la siguiente forma:

FADH2

Direccin de transporte de eCoQ

CoQ-Citc

CitoxidasaO2

-0.219

+0.045

+0.254

+0.29

+0.816

Azul de metileno
+0.01
Por lo tanto como el azul de metileno tiene un potencial de reduccin de +0.01 que es
mayor al potencial de los otros complejos, los electrones pasan directamente al azul de
metileno.
Cmo determino que el azul de metileno ha aceptado los electrones?
Mediante el cambio de coloracin
Azul de metileno azul
Oxidado

Azul de metileno incoloro

Reducido

Que sucede en el sistema de tubos? A que se deben las coloraciones que

presentan?
Tubo N 1: no se decolora sea no hay reduccin, debido a que no hay
sustrato( succinato de sodio 0.1 M)
Tubo N 2: si se decolora porque si hay presencia de sustrato (succinato de sodio 0.1 M)
Tubo N3: no se decolora porque hay presencia de un inhibidor competitivo (malonato
de sodio) por lo tanto no hay reduccin
Tubo N4: no se decolora porque hay un inhibidor (cianuro)

f) Conclusin
- Se comprob que el azul de metileno es un aceptor de electrones que se evidencio en el
cambio de coloracin de azul (oxidado) a incoloro (reducido).
-

Se verifico la accin inhibitoria del malonato y el cianuro sobre la succinato

deshidrogenasa a nivel de la cadena respiratoria mitocondrial ya que no se evidencio
cambio de color