4.

METODE DE CULTIVARE A BACTERIILOR

Cunoaterea necesitilor nutritive ale bacteriilor este foarte important n bacteriologia
medical, deoarece st la baza preparrii mediilor de cultur destinate izolrii diverselor specii
bacteriene din produsele biologice sau patologice.
La nceputurile dezvoltrii bacteriologiei, prepararea mediilor a fost artizanal, numeroi
bacteriologi intrnd n istoria microbiologiei prin mediile pe care le-au preparat i care le poart i
astzi numele. Astfel, amintim, de exemplu, mediul Loeffler pentru cultivarea bacilului difteric,
mediul Lwenstein-Jensen pentru bacilul lui Koch, mediul selectiv Wilson-Blair pentru salmonele i
multe altele.
Prin cercetarea necesitilor nutritive ale diferitelor specii s-au realizat medii adecvate pentru
aproape toate bacteriile de interes medical, speciile necultivabile fiind foarte puine, ca, de pild,
Mycobacterium leprae i unele spirochete printre care Treponema pallidum.
Cultivarea bacteriilor n scop diagnostic pune n esen dou probleme:
alegerea unui mediu de cultur optim, care s permit izolarea tuturor bacteriilor care ar
putea fi prezente n produsul de examinat i
obtinerea bacteriilor n culturi pure, pentru a putea fi identificate.

4.1. Conditii generale pentru cultivarea bacteriilor

Un mediu de cultur uzual trebuie s conin ap, substane organice, minerale, oligoelemente i
factori de cretere. Pentru satisfacea acestor necesiti se ultilizeaz diferite substraturi biologice
nutritive complexe care au n compoziia lor aceste ingredinente. Astfel:
- peptonele, care se obin prin hidroliza enzimatic sau acid a proteinelor de origine animal
(de exemplu fin de oase). Ele nu au o compoziie chimic foarte bine definit, iar prin coninutul n
peptide i aminoacizi constituie o surs universal de azot, pentru toate bacteriile cultivabile, fiind
folosite practic n prepararea tuturor mediilor de cultur,
- extractul de carne, ce se obine prin deshidratarea decoctului de carne de vit. Acesta
conine cantiti importante de creatin, xantin, hipoxantin, acid uric, acid adenilic, glicocol, uree,
glutamin ca surs de azot precum i glicogen, hexozofosfai, acid lactic etc. ca surs de carbon,
- extractul de drojdie, care se obine prin cultivarea controlat a drojdiilor i care conine
numeroase vitamine, mai ales cele din grupul B,
n afar de ingredientele mai sus menionate mai amintim:
- clorura de sodiu, care se adaug la mediile uzuale ntr-o concentraie de 0,9%. Pentru
cultivarea bacteriilor halofile concentraie poate crete pn la 10%,
- mono sau polizaharidele, unii alcooli (glicerin, manitol) pot nmbogi mediile, deoarece
constituie surse de carbon uor accesibile multor bacterii,
Cultivarea microbilor pe medii lichide. Mediile lichide se folosesc cel mai adesea pentru
nmulirea unor microbi care se gsesc n numr mic ntr-un anumit produs. Cel mai simplu mediu
folosit n laboratorul de bacteriologie este bulionul care se prepar din decoct de carne de vac,
pepton i clorur de sodiu. Cultivarea unui produs pe medii lichide are dezavantajul c nu permite
ns obinerea unei culturi pure.
Caracterele culturale ale microbilor pe medii lichide difer. Astfel, bacteriile aparinnd familiei
Enterobacteriaceae tulbur uniform mediul, altele, ca de pild bacteriile strict aerobe (Pseudomonas, Nocardia)
formeaz pelicule la suprafaa mediului. Altele formeaz agregate care se dezvolt sub form de grunji ce se depun pe

peretele eprubetei sau la fundul mediului (Streptococcus). Unele bacterii secret n mediu pigmeni difuzibili ca de
exemplu bacilul piocianic (Ps.aeruginosa).
Cultivarea bacteriilor pe medii solide. Introducerea mediilor de cultur solide a nsemnat
un progres uria n tehnicile de diagnostic, deoarece permite dezvoltarea distinct a microbilor, sub
form de colonii izolate. O colonie bacterian este o micropopulaie ce rezult din nmulirea unui
singur microb pe un mediu, vizibil n general cu ochiul liber.
Cel mai simplu mediu solid este geloza simpl, ce se obine prin adugarea la bulion a unei
substan gelificabile, care de regul este geloza, un polizaharid obinut din alga marin agar-agar.
La aceast mediu simplu se pot aduga diferite ingrediente (snge de oaie, ser, ascit, extract de
drojdie etc.) pentru a putea cultiva bacteriile pretenioase.
Caracterele culturale sunt foarte importante n identificarea microbilor. Ele se apreciaz fie cu
ochiul liber, fie cu ajutorul unei lupe. Elementele ce se descriu, n general, sunt dimensiunea,
forma, pigmentul, consistena, aderena la mediu, activitatea hemolitic i unele modificari pe care
microorganismele le produc n mediul respectiv.
Coloniile cu aspect neted, cu marginile regulate i care se suspend omogen n ser fiziologic
se numesc colonii de tip S (smooth), pe cnd coloniile aceleiai specii, cu suprafaa rugoas, relief
i margini neregulate i care aglutineaz sponatan n ser fiziologic - colonii de tip R (rough). n
general, cu unele excepii, coloniile S aparin tupinilor virulente, pe cnd cele R sunt nevirulente.
Cultivarea microbilor pe medii solide permite, de asemenea, numrtoarea de germeni ntr-un
anumit produs. Acest aspect este deosebit de important deoarece n multe infecii criteriul de
implicare etiologic este numrul bacteriilor n produsul de examinat (infecii urinare).
Medii speciale. Exist situaii n care izolarea unui microb necesit medii deosebite care s
favorizeze selectarea lui din produse intens contaminate.
Mediile de mbogire sunt medii lichide care permit nmulirea preferenial a unui microb
dintr-un amestec. Astfel sunt mediile cu coninut mare de clorur de sodiu (1-10%) n care se pot
dezvolta numai bacterii halofile ca, de exemplu, stafilococul (mediul Chapmann lichid) i
enterococul. Unele medii de mbogire au ca factor electiv anumite substane, ca, de exemplu,
selenitul acid de sodiu, care permite dezvoltarea salmonelelor din materiile fecale. Alte medii se
bazeaz pe propietatea unor germeni de a se dezvolta la un pH mai acid sau mai alcalin dect
majoritatea speciilor bacteriene de interes medical. Astfel, vibrionul holeric se dezvolt la un pH
alcalin (9) iar brucelele la la un pH acid (6).
Medii selective. Dac un mediu de mbogire se solidific, rezult un mediu selectiv care are
avantajul obinerii microbilor sub form de colonii izolate. Datorit acestor medii, izolarea i
identificarea bacteriilor este astzi mult simplificat. Mediile selective, care se bazeaz pe
particularitile metabolice ale unor specii microbiene sau mai ales pe rezistena natural a
acestora la antibiotice, sunt utilizate n mod curent n laboratoarele de bacteriologie, deoarece
permit, practic, izolarea dintr-un amestec de microbi, a oricrui microb n cultur pur.
Mediile de diagnostic sunt medii de cultur care evideniaz anumite proprieti fiziologice i
caractere biochimice ale tulpinilor bacteriene pe baza crora acestea pot fi identificate. Astfel, de
exemplu, numeroase specii bacteriene se recunosc pe baza zaharurilor pe care le fermenteaz.
Mediile de diagnostic cu zaharuri conin zaharul de cercetat i un indicator de pH. n cazul n care
bacteria nsmnat n acest mediu va fermenta zaharul, culoarea mediului se va schimba dup
cteva ore datorit scderii pH-ului.

5. INFLUENTA FACTORILOR FIZICI ASUPRA

BACTERIILOR

5.1. Temperatura
Temperarura optim de dezvoltare a bacteriilor este cea a habitatului lor natural. n funcie de
aceast temperatur, bacteriile se mpart n psihrofile, care se nmulesc optim la 20C dar i sub
aceast temperatur, mezofile, cu temperatura optim cuprins ntre 20-40C i termofile, care se
nmulesc optim la peste 45C. Bacteriile mezofile sunt cele patogene deoarece se nmulesc
la temperatura organismului, fiind denumite i bacterii homeoterme.
Limitele de temperatur n care aceste bacterii pot s creasc sunt ns mai mari i variaz de la
specie la specie. Astfel, gonococul i meningococul nu suport variaii mai mari de 1-2C fa de
temperatura optim, spre deosebire de enterobacterii, care cresc n limite foarte largi.
Microorganismele sunt sensibile la temperaturile ridicate, aplicaia practic a acestui aspect
fiind sterilizarea.
Temperaturile moderat sczute, ca, de pild, cea de +4 oC din frigidere, nu distrug bacteriile,
dar opresc n general nmulirea lor prelungindu-le viabilitatea. Din acest motiv, majoritatea
produselor biologice sau patologice destinate examenului bacteriologic se pstreaz n aceste
condiii. Totui, exist tulpini microbiene care se nmulesc i la temperatura frigiderului ca, de
exemplu, tulpinile criogene de Pseudomonas aeruginosa, ce se nmulesc la 0oC i tulpini din
familia Enterobacteriaceae (E.coli) care se n nmulesc la +5oC. Acest aspect trebuie luat n
calcul de ctre medicul bacteriolog, mai ales acolo unde implicaia etiologic a unui germene ntr-o
infecie se bazeaz pe criteriul numeric.
Congelarea. Dac o suspensie bacterian este supus ngheului la temperaturi nu prea mici
fa de 0oC, cristalizarea apei determin formarea unor spaii ce conin soluii concentrate de
saruri care nu cristalizeaz dect la temperaturi mult mai joase (-20C pentru NaCl de exemplu),
cnd solutiile devin saturate si pot cristaliza. Aceste concentratii ridicate de saruri minerale, la
care se adaug cristalele de apa, vor leza structurile bacteriene. Prin ngheare nu vor fi omorte
toate celulele unei suspensii, dar nghetul si dezghetul repetat scade foarte mult numarul de
bacterii viabile.
Conservarea prin congelare. Temperatura congelatoarelor casnice (-20C) nu este destul de
sczut pentru a permite conservarea bacteriilor. Temperatura optim este cea realizat de CO 2 (78C) sau de azotul lichid (-180C). Conservarea bacteriilor, a virusurilor prin congelare este
favorizat de adaosul de glicerol sau dimethilsulfoxid. Acesti agenti chimici induc o solidificare
amorfa, vitroas care nlocuiete solidificarea prin cristalizare.
Prin liofilizare (desicare brusc la -78oC), care este o metod de conservare a microbilor, se
extrage practic ntreaga ap liber din celulele bacteriene, ceea ce are ca urmare creterea stabilit ii
biopolimerilor i ncetarea metabolismului. Bacteriile liofilizate se pstreaz ani de zile.

5.2. pH-ul
Bacteriile se pot dezvolta n limite largi de pH, cele patogene pentru om dezvoltndu-se
optim la un pH de 7,2-7,4. Exist i excepii ca, de pild, bacteriile din genul Brucella care cresc la
un pH de 6,0 i vibrionul holeric la pH de 9,0. Lactobacilii, prezeni n flora vaginal normal se
dezvolt chiar i la un pH de 3,9.
Unele bacterii modifica prin procesele metabolice pH-ul mediului. Aceast modificare poate
opri nmultirea lor sau chiar distruge cultura. Din acest motiv, multe medii au n compoziia lor
soluii tampon care menin pH-ul n limite convenabile.
Modificarea de ctre o bacterie a pH-lui unui mediu poate avea valoare deosebit n
identificarea unui microb i poate fi sesizat prin adaugarea n mediu a unui indicator de pH. Foarte
multe bacterii se identific biochimic prin proprietatea lor de a fermenta diferite zaharuri. Aceast

capacitate se evidentiaza tocmai prin nsamntarea unei bacterii pe mai multe medii ce contin
fiecare alt zahar si un indicator de pH. n cazul fermentarii, acidifierea va determina schimbarea
culorii mediului.

5.3 Ultrasunetele
Ultrasunetele cu o frecventa peste 20.000 de cicli/s sunt bactericide. Bacteriile si virusurile
sunt distruse de ultrasunete ntr-un interval de o ora. Ultrasonarea microorganismelor se
foloseste mai putin pentru sterilizare, ct pentru a obtine diferite componente bacteriene sau
virale, cum sunt: enzime, pereti celulari, acizi nucleici bacterieni n scopul cercetarii acestora.

5.4. Presiunea hidrostatica

Bacteriile obisnuite sunt rezistente la presiunea atmosferica. Formele vegetative sufera
alterari la 300 de atm si sunt omorte la 600 de atmosfere, presiune ntlnit n oceane la o
adncime de 6000m. Cultivarea bacteriilor la presiuni mari induce cresterea lor filamentoas
scazndu-le capacitatea de diviziune. Totusi unele bacteria gram-pozitive pot rezista pana la
3000 de atmosfere cu conditia ca variatiile de presiune sa fie lente si da permita adaptarea
bacteriilor. Variatiile bruste de presiune duc la spargerea peretelui bacterian

5.5. Presiunea osmotica

Bacteriile se nmultesc optim pe medii izotonice, rezistenta lor la variatiile presiunii
osmotice fiind incomparabil mai mare dect cea a celulelor organismelor superioare. Aceasta
rezistenta se datoreaza peretelui celular. Bacteriile din genul Mollicutes, lipsite de actiunea
protectoare a peretelui celular, sunt foarte sensibile la variatii mici ale presiunii osmotice.
ntr-un mediu puternic hiperton, bacteriile vor pierde apa din citoplasma si vor muri. Acest
fenomen se numeste de plasmoliza.
Daca presiunea osmotic a mediului este foarte scazuta, apa va patrunde n celul, care se va
umfla devenind turgescent. Moartea bacteriei se produce prin plasmoptiza.
Cresterea presiunii osmotice a unui mediu prin adaus de NaCl sau zaharuri sta la baza
conservarii unor alimente.
Exista nsa bacterii osmofile, dintre care cele halofile sunt capabile sa se nmulteasca n
solutii hipersaline (bacteriile din genul Staphylococcus si Enterococcus). Pe baza acestei
proprietati se prepara unele medii de mbogatire si selective aa cum este mediul hiperclorurat
Chapmann pentru stafilococi. Acesta contine 7,5% NaCl spre deosebire de mediile obinuite care
contin doar 0,5 %. Dintre bacteriile osmofile mentionam si pe cele zaharofile, care sunt capabile
s se nmulteasc pe medii cu continut mare de glucide (6g%). Acest aspect este important pentru
unele medicamente, ca de pild, siropurile care, n ciuda coninutului ridicat de zaharoz, se pot
altera n urma contaminrii cu aceste bacterii.

5.6. Radiatiile
5.6.1. Razele neionizante
Razele ultraviolete. Puterea bactericid a razelor luminoase devine perceptibil la o lungime
de und de 330nm, crescnd pe msur scaderii lungimii de und a luminii UV. Timpul necesar
distrugerii microorganismelor depinde de intensitatea luminii, distanta de sursa de emisie i mediul
n care se gsesc microorganismele. Mecanismul bactericid al razelor UV const n inducerea
formrii n celula bacterian a unor dimeri de timin care interfereaz replicarea DNA. Alterarile altor
elemente structurale bacteriene sunt neglijabile.

Fotoreactivarea. Modificarile induse n celulele bacteriene prin razele UV sunt reversibile,

eficienta sterilizarii prin aceste raze nefiind prea performant. Astfel, dac se expune o cultur
bacterian care a fost iradiat cu raze UV la lumin vizibil, o parte din dimerii de timin se vor disocia i
bacteriile aparent omorte i reiau activitatea metabolic i nmulirea. Aceasta poate depi de sute
de ori activitatea iniial a culturii neiradiate.
n scop practic lampile cu vapori de mercur se folosesc pentru a reduce numarul de bacterii
existente n aer n salile de operatie, n laboratoare, n ncaperi n care sunt adapostite animale
de exprienta etc.
Efectul bactericid al razelor solare se datoreaza continutului n raze UV (300-400nm). n
conditii naturale efectul bactericid al luminii solare este mai mare n tarile sudice unde coninutul
n raze UV este mare. Semple i Greig au aratat n India (1909) ca bacilii tifici expusi pe lenjerie
alba la soare sunt distrusi n doua ore, pe cnd la ntuneric si pastreaz viabiliatea peste 6 zile.
S-a observat ns c expunerea la lumina puternic solar poate omor bacteriile chiar cnd
radiaiile UV sunt ecranate, datorit sensibilitii la lumin a unor substane necesare
metabolismului bacterian cum sunt riboflavina i porfiriniele. Astfel, expunerea la lumina solar a
fiolelor n care se afl BCG1 va avea ca urmare pierderea viabilitii i deci a eficienei vaccinului.
Sensibilizarea fotodinamic. Razele luminoase vizibile au o aciune bactericid slab, care
poate ns fi crescut pn la nivelul aciunii razelor UV dac sunt trecute prin coloranti fluorescenti
ca, de pild, eozina, rosu bengal etc.
5.6.2. Radiatiile ionizante
Mecanismul bactericid al acestor raze consta n formarea n celula a unor radicali cu viata
scurt si protoni. Acesti produsi vor altera bazele azotate i legturile dintre ele. Efectul bactericid al
razelor ionizante depinde de cantitatea de energie absorbit, temperatur, presiuea parial a
oxigenului, coninutul n substane organice, prezena unor substane protectoare ca alcoolii
alifatici sau substane bogate n grupri sulfhidrilice, specia microorganismului i coninutul n ap.
Sporii sunt n general mai rezisteni dect formele vegetative ale bacteriilor, excepie fiind o
bacterie nesporulat, Micrococcus radiodurans, care este cel mai rezistent microorganism la
radiaii. El rezist la doze de 200 de ori mai mari dect restul bacteriilor datorit faptului c este
echipat cu mecanisme deosebit de eficiente de reparare a alterrilor acizilor nucleici.