LA TINCIN DE GRAM

Es la tincin diferencial ms utilizada en Bacteriologa pues permite separar las bacterias en dos
grandes grupos, las Grampositivas y las Gram-negativas. La tincin de Gram requiere cuatro
soluciones:
1. Primer colorante. Es un colorante bsico que en contacto con las clulas cargadas
negativamente, reacciona con ellas colorendolas. El ms utilizado es el cristal violeta.
2. Solucin mordiente. Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las clulas. Los
mordientes empleados suelen ser sales metlicas, cidos o bases, como, por ejemplo, una
solucin diluida de yodo.
3. Agente decolorante. Es un disolvente orgnico, por ejemplo, alcohol acetona (1:1).
4. Colorante de contraste. Es un colorante bsico de distinto color que el primer colorante, como,
por ejemplo, la safranina. Los dos grupos bacterianos a los que anteriormente nos referamos
difieren en el color con el que finalmente aparecen. Las bacterias Gram positivas se teirn de azul
por el cristal violeta y no perdern esta coloracin durante los pasos sucesivos. Las bacterias Gram
negativas perdern la coloracin inicial del cristal violeta en los siguientes pasos y se teirn de
rosa debido a la safranina. La diferencia est determinada por la composicin de su envoltura
celular. Las bacterias gram positivas poseen una malla de peptidoglicano en su parte ms externa,
mientras que las bacterias gram negativas, recubriendo una fina capa de peptidoglicano, presentan
una membrana externa que envuelve toda la clula.
Prcticas de Microbiologa Clnica
El mtodo de tincin es el siguiente:
1. Se prepara el frotis, se seca y se fija.
2. Se cubre con cristal violeta durante un minuto.
3. Lavar suavemente con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.
4. Se traza con lugol un minuto. El lugol acta como mordiente aumentando la afinidad del
colorante por la bacteria.
5. Lavar con agua el exceso de lugol.
6. Se gotea alcohol-acetona de forma continua hasta que la preparacin deje de perder color y se
lava enseguida con agua abundante.
7. Se cubre la preparacin con un colorante de contraste, como la safranina, durante un minuto.
8. Se lava con agua y se seca al aire, observndose a continuacin con el objetivo de inmersin.
3) Observacin de las tinciones de bacterias al microscopio. Las bacterias Gram-positivas
presentarn una coloracin violeta mientras que las Gram-negativas la presentarn roja o rosa. La
identificacin de las bacterias Gram-positivas puede ser problemtica, solamente cuando las
bacterias Grampositivas se encuentran en crecimiento exponencial (cultivos jvenes) la reaccin es
clara; en fase estacionaria (cultivos viejos) las bacterias Gram-positivas pueden parecer Gramnegativas.

Tincin May-Grnwald/Giemsa
en frotis sanguneo

Componentes de la tincin:
Esta tcnica combina los principios de coloracin desarrollados por May Grunwald y Giemsa,
usando 2 soluciones colorantes:

Solucin May Grunwald: Contiene eosina (colorante aninico) y Azul de metileno

( colorante catinico), disueltos en metanol.

Solucin Giemsa: Contiene Eosina, Azul de metileno y productos de oxidacin de este

segundo compuesto.

Principio de la tincin
Los componentes celulares se clasifican por esta tincin en:

Componentes aninicos ( cidos): Al unirse a los tintes catinicos se tien en tonos azules.
Son llamados Basfilos. Ej: DNA, RNA, protenas, mitocondrias, ribosomas.

Componentes catinicos (bsicos): Se unen a Eosina, tiendo en variados tonos rojos y

naranja. Se les llama acidfilos o eosinfilos. Ej: Hemoglobina.

Fases de la tincin May Grunwald-Giemsa:

1 Fijacin: Sumergir los frotis secos por 2 minutos en solucin de May Grunwald.
2 Lavado y rehidratacin: Dejar por 1 minuto en agua destilada y escurrir el agua.
3 Tincin con Giemsa: Sumergir por 15 minutos en Giemsa. Luego retirar y escurrir.
Posteriormente se retiran los frotis montados y se dejan secar para su posterior lectura al
microscopio ptico con aumento 100X.

Observacin al microscopio
Una vez teidos los frotis y observados con objetivo de inmersin con aceite (aumento 100X) al
microscopio se puede distinguir:

Ncleos: Azul-prpura

Citoplasma: Violeta plido-marrn

Eritrocitos: Rosado

Grnulos de neutrfilos: Violeta-marrn

Grnulos de eosinfilos: Naranja

Grnulos de basfilos: Azul-negro

Grnulos de linfocitos: Prpura

Principales cuadros identificables

Anemia: Concentracin disminuida de eritrocitos en sangre. Debe ser complementado para

informarse con niveles de Fierro srico y hematocrito para conocer su causa.

Microcitosis: Disminucin del tamao normal de los eritrocitos, observable en anemia

ferropnica.

Hipocroma: Eritrocitos de tonalidad plida, con aumento de la claridad central.

Leucocitosis: Aumento de leucocitos en sangre, originada principalmente en caso de

infecciones.

Identificacin de cuadros malignos en frotis sanguneo

Si el Tecnlogo identifica en el paciente alguna clula sospechosa, como en el caso de observar
Blastos en sangre perifrica, y se sospecha de algn tipo de leucemia u otra enfermedad
hematolgica se informa al clnico para solicitar nuevamente un examen o indagar con otro tipo de
procedimientos, como mielograma o biopsia medular o linftica segn sea el caso. Estos datos
deben ser complementados con el estado del paciente y evaluacin gentica.
Es fundamental informar hallazgos de este tipo con la mayor precisin y rapidez posible
para atender de forma oportuna al paciente.
Parsitos identificables en frotis
Tambin se puede identificar por frotis enfermedades parasitarias como:

Enfermedad de Chagas

Malaria

Toxoplasmosis

Dengue

En este caso el Tecnlogo informa inmediatamente al mdico el hallazgo identificado y se

solicitan exmenes serolgicos para confirmar el cuadro que padece el paciente, para tomar
medidas rpidamente para iniciar un pronto tratamiento y cuidado en estos casos que pueden ser
muy graves.

USO Equipo para coloracin de bacilos cido-alcohol resistentes en muestras

clnicas y/o a partir de cultivos microbianos.
FUNDAMENTO La propiedad que presentan algunas bacterias de resistir la
decoloracin con cidos fuertes despus de ser coloreadas con solucin de
fucsina caliente, permite reunirlas bajo la denominacin general de bacterias
cidoresistentes o cido-alcohol resistentes. La cido-alcohol resistencia es
la capacidad de incorporar ciertos colorantes y retenerlos despus de
someterlos a la accin de cidos y alcohol y est determinada por la presencia
en la pared celular de los cidos miclicos que son cidos grasos de cadenas
ramificadas de alto peso molecular (60 a 70 tomos de carbono). Las
micobacterias son bacilos cido-alcohol resistentes, cortos, ligeramente curvos.
El gnero Mycobacterium, incluido en esta clasificacin, comprende especies
patgenas para el hombre, animales y especies saprfitas. El grado de cidoalcohol resistencia es variable entre las especies de este gnero y est
relacionado muchas veces con las condiciones culturales, no pudiendo
utilizarse esta diferencia para distinguirlos entre s. Los bacilos cido-alcohol
resistentes (BAAR) se observan de color rojo al ser coloreados con los
colorantes para Ziehl Neelsen, mientras que otros grmenes y clulas toman
distintos tonos de azul debido al azul de metileno que se utiliza como colorante
de contraste. La coloracin de Ziehl Neelsen consituye una tcnica sencilla
rpida y econmica, de baja sensibilidad pero es una valiosa herramienta para
detectar los casos de tuberculosis pulmonar.
Contenido y composicin Ziehl Neelsen
Equipo Cdigo B1446182
Fucsina para Ziehl Neelsen: Carbolfucsina: envase x 100 ml.
Decolorante para Ziehl Neelsen: solucin de alcohol cido: envase x 100 ml.
Azul de Metileno para Ziehl Neelsen: envase por 100 ml
Fijado del extendido:
Mediante calentamiento suave, flamendolo sobre la llama. Esto se efecta
pasando 3 veces el lado del portaobjeto que no tiene la preparacin sobre la
llama del mechero para que la misma adquiera una temperatura de
aproximadamente 80 C.
Coloracin: Colocar un pequeo trozo de papel de filtro un poco ms largo
que el tama- o del preparado sobre el portaobjeto.
Importante: el papel de filtro tiene que estar por encima del extendido. Cubrir el extendido con Fucsina para Ziehl Neelsen (carbolfucsina). Flamear por
debajo del portaobjeto hasta el desprendimiento de vapores blancos (evitar

que se produzca la ebullicin por exceso de calor). Dejar enfriar 5 minutos y

repetir el flameado hasta nuevo desprendimiento de vapores blancos. Dejar
enfriar 5 minutos. Cuando est frio, mediante el uso de pinzas, quitar y
descartar el papel de filtro. - Lavar con agua corriente. - Cubrir con Decolorante
para Ziehl Neelsen. Dejar 2 minutos. Realizar sucesivos lavados hasta que no
se desprenda mas colorante (aproximadamente 2 minutos; pero en el caso de
preparados ms gruesos, puede requerirse mayor tiempo). - Lavar con agua
corriente. - Cubrir con Azul de Metileno para Ziehl Neelsen. Dejar 30 segundos.
- Lavar con agua corriente durante 30 segundos. - Secar el extendido.
Interpretacin de los resultados Cubrir el extendido con una gota de aceite
de inmersin y observar al microscopio ptico, con aumento 1000X. Observar
al microscopio no menos de 100 campos. Los bacilos cido-alcohol
resistentes (BAAR) aparecen de color rojo sobre un fondo azul claro, mientras
que otros grmenes o clulas toman distintas tonalidades de azul.