Prctica 1.

Purificacin de lactato deshidrogenasa (LDH)

OBJETIVOS 1. Explicar esquemas simples de purificacin de enzimas. 2.
Explicar cmo el salting out con sulfato de amonio permite la separacin de
protenas. 3. Usar la centrifugacin para separar preparaciones biolgicas. 4.
Explicar cmo la dilisis permite el desalting. 5. Purificar la enzima LDH de
corazn bovino. INTRODUCCIN Generalmente es una prdida de tiempo
realizar estudios detallados de cmo las enzimas catalizan la conversin de
una sustancia en otra sino hasta que la enzima de inters es purificada de
entre otras enzimas y sustancias que forman parte del extracto crudo de las
clulas. La mezcla de cientos de enzimas liberadas de clulas de hgado,
levaduras o bacterias contienen material diverso, as como el producto de otras
enzimas. nicamente cuando se ha purificado una enzima hasta el punto de
que la actividad de otras no interfiere, podemos sentirnos seguros de que slo
es un tipo de enzima la que dirige la conversin de una sustancia A en una
sustancia B. Slo entonces, podemos aprender cmo trabajan las enzimas. (2)
La caracterizacin de las propiedades fisicoqumicas y bioqumicas de
protenas, y en general de otras biomolculas, depende de que los
investigadores tengan la certeza de que lo que estn evaluando corresponda a
un solo tipo de biomolcula, razn por la cual es necesario que los
investigadores establezcan procesos de purificacin y para ello, es necesario
que la biomolcula objetivo est claramente definida, de tal manera que se
organice una estrategia de los mtodos a emplear y el orden en que van a ser
utilizados (3). Para lograr los objetivos que se hayan establecido, la protena
objetivo tiene que ser separada de entre miles de protenas diferentes, por lo
cual se necesita explotar las diferencias de las propiedades fisicoqumicas de
las protenas. La Tabla 1 resume la relacin 15 entre las propiedades
fisicoqumicas de protenas y algunas metodologas bsicas que suelen ser
usadas para su purificacin. Propiedad Fisicoqumica * Consideraciones
Metodologas de purificacin Solubilidad Balance de aminocidos polares y no
polares, puentes disulfuro, protenas solubles, protenas de membrana. Uso de
ambientes salinos, precipitacin diferencial, uso de detergentes, uso de medios
reductores u oxidantes. Cromatografa de intercambio hidrofbico. Dilisis.
Carga Proporcin de aminocidos cargados, punto isoelctrico, pH del medio,
fuerza inica. Cromatografa de intercambio inico, cromatoenfoque o
isoelectroenfoque. Tamao Protenas globulares, protenas fibrosas, protenas
estructurales. Cromatografa de exclusin molecular, dilisis, centrifugacin
diferencial, centrifugacin al equilibrio. Estabilidad Termoestabilidad, pH. Hervir
muestras, acidificar o alcalinizar medios. Unin especfica Unin de ligandos,
sustratos, protenas u otras biomolculas. Cromatografa de afinidad, utilizacin
de quelantes, uso de sustratos. Tabla 1. Resumen de las principales
propiedades fisicoqumicas de las protenas que se ocupan para purificar
protenas. * Las metodologas de purificacin suelen considerar ms de una
propiedad fisicoqumica. Informacin bioqumica de la LDH La LDH es una
enzima que se encarga de la transferencia de electrones del NADH para
convertir piruvato a cido lctico durante condiciones bajas de oxgeno en
clulas de 16 msculos con trabajo activo, como las clulas del corazn. La

LDH tambin permite la reposicin del suministro de NAD+ facilitando una

produccin continua de ATP en la ruta de la gliclisis. En el hgado, la LDH lleva
a cabo la reaccin inversa, convirtiendo el lactato a piruvato, en donde provee
una fuente de carbono para la sntesis de la glucosa. Finalmente, la glucosa
producida por el hgado repone la fuente de carbohidratos almacenados en las
clulas musculares, completando el ciclo de Cori (Fig. 1). Figura 1. Esquema del
ciclo de Cori. Las flechas en rojo muestran el sentido de las reacciones
metablicas que tienen lugar en el ciclo en un estado de esfuerzo fsico. Las
verdes indican las reacciones que tienen lugar en reposo. Existen cinco
isoenzimas con diferentes puntos isoelctricos. Las isoenzimas se obtienen de
una combinacin de subunidades que forman un tetrmero cuya expresin en
diferentes tejidos produce distintos conjuntos de isoenzimas. La determinacin
de la actividad LDH en suero tiene una gran variedad de aplicaciones clnicas.
Por ser una enzima intracelular, su elevacin es ndice de dao tisular con la
consecuente liberacin de sta a la circulacin. La determinacin de la
isoenzima predominante en suero posibilita la identificacin del rgano
comprometido (4). 17 MATERIAL Y EQUIPO NECESARIO 1 Licuadora 1 Balanza
granataria 1 Parrilla de agitacin 1 Balanza de 2 platos 1 Contenedor con hielo
1 Barra magntica 1 Esptula 1 Bistur 1 Pincel 1 Jeringa y filtro de 0.4 m 1
Membrana de celulosa para dilisis (Spectra/Por MWCO 12-14,000, 16 mm de
dimetro) 2 Pinzas para sellar la membrana de dilisis 1 Matraz Erlenmeyer de
250 mL 5 Vasos de precipitado (1 de 100 mL, 2 de 250 mL, 1 de 500 mL y 1 de
2,000 mL) 1 Probeta de 100 mL 1 Liga y cedazo 1 Rack para micropuntas (200
a 1000 L) 1 Micropipeta P-1,000 1 Rack para tubos cnicos de 50 mL 6 Tubos
cnicos de 50 mL 6 Microtubos de 1.6 mL Fosfato de sodio 0.05 M, pH 7, 4 C
Bicina 0.03 M, pH 8.5, 4 C Agua destilada Solucin stock DTT 1 M Solucin
stock PMSF 100 mM Solucin stock Glicerol al 80% (p/v) Sulfato de amonio
PROTOCOLO Utilice bata y guantes en todo momento. Consiga un corazn
bovino. Es primordial que el rgano haya sido extrado el mismo da de la
prctica y se haya mantenido a 4 C. 1. Cortar 25 g de msculo cardiaco con
ayuda de un bistur. Agregar 75 ml de amortiguador Fosfato de sodio 0.05 M pH
7, PMSF 1 mM, a 4 C (Fig. 2). 2. Homogenizar en licuadora a mxima
velocidad: 3 ciclos de 1 min con 3 min de descanso en hielo (Fig. 3). 3. Pasar el
homogenizado por un cedazo, con ayuda de una esptula y evitando la
formacin de burbujas (Fig. 4). 18 4. Medir el volumen y tomar una alcuota de
500 L (homogenizado crudo, alcuota 0). 5. Despus de equilibrar los tubos,
centrifugar a 17,000 g, 4C, 20 min (Fig. 5-6). 6. Recuperar el sobrenadante,
medir su volumen y tomar una alcuota de 500 L (homogenizado postcentrifugado, alcuota 1). 7. Precipitar al 40% de sulfato de amonio (0.242
g/mL). Agregar el reactivo lentamente, estando la muestra en hielo, con
agitacin ligera (Fig. 7). 8. Incubar 15 min en hielo (sin agitacin). 9. Despus
de equilibrar los tubos, centrifugar a 15,000 g, 4 C, 15 min. 10. Recuperar el
sobrenadante, medir su volumen y tomar una alcuota de 500 L
(sobrenadante del 40%, alcuota 2) (Fig. 8-10). 19 11. Precipitar al 65% de
sulfato de amonio (0.166 g/mL). Agregar el reactivo lentamente, estando la
muestra en hielo, con agitacin ligera. 12. Incubar 15 min en hielo (sin

agitacin). Debido a la duracin de la clase, habitualmente en este punto se

termina la sesin y la muestra se almacena a 4 C hasta su procesamiento
posterior. 13. Despus de equilibrar los tubos, centrifugar a 15,000 g, 4 C, 15
min. 14. Decantar sobrenadante, medir el volumen y tomar una alcuota de
500 L (sobrenadante del 65%, alcuota 3) (Fig. 11). 15. Resuspender la pastilla
suavemente con 5 mL de amortiguador Bicina 0.03 M, pH 8.5, 4 C, con ayuda
de un pincel. Tomar una alcuota de 200 L (pastilla del 65% resuspendida y sin
dializar, alcuota 4). (Fig. 12). 16. Introducir el resto del resuspendido en la
bolsa de dilisis, previamente hidratada en agua destilada por al menos 10
min. (Fig. 13). 20 17. Dializar contra 1.5 L de amortiguador Bicina 0.03 M pH
8.5 a 4 C, en agitacin. Realizar 2 cambios de amortiguador con intervalos de
al menos 1.5 h (Fig. 14) 18. Al da siguiente, recuperar el dializado, agregar
DTT a una concentracin final de 1 mM y pasarlo por un filtro de 0.4 m. Tomar
una alcuota de 200 L (Pastilla del 65% resuspendida y dializada, alcuota 5).
(Fig. 15)
5) 19. Agregar glicerol a una concentracin final de 10% y almacenar a 4 C
junto con las alcuotas tomadas durante el procedimiento. Las alcuotas
recolectadas deberan ser evaluadas en busca de actividad enzimtica (ver
Prctica 2) el mismo da de su obtencin, pero debido a la duracin de cada
clase, este procedimiento se realizar ms adelante. RESULTADOS Observe y
documente los cambios fsicos de la muestra durante todo el proceso. Describa
la diferencia entre las pastillas obtenidas despus de cada centrifugacin. Para
cada paso de su purificacin, proporcione toda la informacin recolectada (mL
del homogenado crudo utilizado, mL de cada sobrenadante obtenido, gramos
de sulfato de amonio usado). CUESTIONARIO a. Si se sabe que la temperatura
ptima de actividad de la LDH bovina es de 37 C, por qu es importante
purificarla a 4 C? 21 b. Explica por qu se usaron 2 porcentajes de saturacin
de sulfato de amonio en el experimento. c. Explica por qu es importante
agregar el sulfato de amonio lentamente. d. Explica las interacciones fsicas de
las molculas que llevan a las protenas a precipitar en concentraciones altas
de sal. e. Cmo se puede determinar la presencia de LDH en cada una de las
alcuotas recolectadas durante el procedimiento experimental? Por qu se
deberan evaluar las alcuotas el mismo da de su obtencin? f. Investiga en las
bases de datos proporcionadas, la siguiente informacin sobre la lactato
deshidrogenasa: localizacin biolgica, cdigo EC y significado, estructura y
grupos funcionales del sustrato, secuencia primaria, peso molecular, pI,
porcentaje de aminocidos polares y no polares, aminocidos aromticos,
condiciones de actividad ptima: pH, temperatura, fuerza inica. Bases de
datos: http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/ http://www.brendaenzymes.org/ http://www.rcsb.org/ http://www.worthingtonbiochem.com/index/manual.html SOLUCIONES Fosfato de sodio 0.05 M, pH 7
(100 mL) PMFosfato de sodio 163.94 Disolver 0.8197 g de Fosfato de sodio en
80 mL de agua destilada, ajustar el pH a 7 agregando HCl 6 N. Aforar a 100 mL
y guardar a 4 C. Bicina 0.03 M pH 8.5 (5 L) PMBicina 163.17 22 Disolver
24.47 g de Bicina (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)glycine) en 1 L de agua destilada,
ajustar el pH a 8.5 agregando HCl concentrado. Ajustar el volumen a 5 L.

Guardar a 4 C. Solucin stock (solucin concentrada) DTT 1 M (1 mL) PMDTT

154.25 Disolver 0.15 g de DTT (Dithiothreitol) en 1 mL de agua Milli-QTM.
Guardar a -20 C. Solucin stock PMSF 100 mM (1 mL) PMPMSF 174.2
Disolver 17.42 mg de PMSF (Phenylmethanesulfonyl fluoride) en 1 mL de
isopropanol. Guardar a -20 C. Solucin stock Glicerol 80% (p/v) (10 mL)
Mezclar 8 g de Glicerol con 2 mL de agua Milli-QTM. Guardar a temperatura
ambiente.